Sử dụng kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại trực tràng (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THỊ KIM NGỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT
CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN
PHÂN TÍCH NƢỚC TIỂU HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN
UNG THƢ ĐẠI-TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành:

HÓA LÝ THUYẾT VÀ HÓA LÝ

Mã số chuyên ngành:

62 44 31 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2017
1


Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - HCM

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. Chu Phạm Ngọc Sơn
PGS.TS. Trần Lê Quan

Phản biện 1:

GS.TS. Nguyễn Sào Trung

Phản biện 2:

PGS.TS. Nguyễn Tiến Tài

Phản biện 3:

TS. Trần thị Như Trang

Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Nguyễn Tiến Tài
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Hà Thúc Huy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp
nhà nước, họp tại trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – HCM
vào lúc
giờ
ngày
tháng
năm

-

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
2. Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM

2


MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Ung thư đại-trực tràng trở thành một trong ba loại ung thư hàng

đầu ở cả nam giới và nữ giới [4]. Chẩn đoán phát hiện bệnh ở giai đoạn
sớm là yếu tố cực kỳ quan trọng. Phương pháp chẩn đoán ung thư đại-trực
tràng phổ biến nhất hiện nay là nội soi đại tràng sigma hoặc nội soi với sinh
thiết khối u. Đây là cách thức chẩn đoán xâm lấn phức tạp chi phí cao.
Trong nghiên cứu ung thư phương pháp nghiên cứu mới là phân tích phổ
đồ, kết hợp với xử lý thống kê dữ liệu phổ theo nguyên tắc Phân tích tổng
thể chất chuyển hóa (metabolomics). Một số công trình nghiên cứu gần đây
cũng sử dụng kỹ thuật NMR tuy nhiên mẫu nghiên cứu là mô hình động
vật (chuột) số lượng mẫu rất hạn chế không phù hợp với một kỹ thuật
thống kê.
2.

Mục tiêu đề tài
Luận án được thực hiện với số lượng mẫu lớn và mẫu là nước tiểu

của người. Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là: a/ Dựa trên phổ NMR, so
sánh bức tranh tổng thể các chất chuyển hóa trong mẫu nước tiểu của nhóm
bệnh nhân ung thư đại-trực tràng và nhóm người không bệnh. b/ Xác định
sự thay đổi chất chuyển hóa trong nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực
tràng. So sánh kết quả với các công trình nghiên cứu tương tự trên thế giới.
c/ Thiết lập mô hình phân biệt nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng

so với người không bệnh. Mô hình này được đề xuất là một công cụ hỗ trợ
chẩn đoán phát hiện sớm ung thư đại-trực tràng theo cách không xâm lấn.
3.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả thu được, ngoài việc cung cấp thêm dữ kiện khoa học về

sự rối loạn chuyển hóa chất trong quá trình tiến triển bệnh ung thư đại-trực
tràng còn hy vọng đưa đến một kỹ thuật chẩn đoán mới không xâm lấn
nhẹ nhàng cho bệnh nhân nhanh chóng và dễ dàng hơn các kỹ thuật hiện
đang áp dụng. Về mặt kinh tế có thể kết hợp chẩn đoán đồng thời nhiều
3


loại bệnh cùng với chẩn đoán ung thư đại tràng chỉ trong một lần phân tích
mẫu nước tiểu giúp tiết kiệm chi phí xét nghiệm. Về mặt xã hội phương
pháp chẩn đoán mới giúp mọi tầng lớp bệnh nhân đều có cơ hội tầm soát
phát hiện sớm bệnh ung thư đại tràng giảm gánh nặng cho gia đình và xã
hội về khoản chi phí lớn để điều trị bệnh ung thư.
4.

Tính mới của đề tài
Đề tài thực hiện theo phương pháp nghiên cứu tổng thể chất

chuyển hóa chưa có nghiên cứu tương tự tại Việt nam. Đề tài cho thấy khả
năng phát triển kỹ thuật NMR như một kỹ thuật chẩn đoán sàng lọc mới.
Mặc khác kết quả luận án này sẽ đóng góp vào thành tựu của các nghiên
cứu phân tích tổng thể chất chuyển hóa, đem đến sự thay đổi lớn về cách
tiếp cận y tế trong chăm sóc sức khỏe.
Chƣơng 1

1.1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Ung thƣ đại-trực tràng:
Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng hiện nay là:

Thử máu; Xét nghiệm chức năng gan; Sinh thiết; Siêu âm; CT Scan; MRI;
X quang phổi; PET Scan [4]. Ung thư đại-trực tràng được xếp thành 4 giai
đoạn theo 3 tiêu chí: mức độ khối u nguyên phát tình trạng hạch vùng tình
trạng di căn xa (theo UICC) [2]. Ở giai đoạn sớm chỉ cần phẫu thuật cắt bỏ
khối u là đủ. Ở giai đoạn muộn cần điều trị đa mô thức gồm hóa trị và xạ
trị. Một số xét nghiệm tầm soát hiện nay là: FOBT; FIT; Nội soi đại tràng
sigma; X quang [4].
1.2

Sinh hóa nƣớc tiểu
Các tính chất hóa lý như: số lượng, màu, mùi, tỷ trọng pH… thay

đổi theo điều kiện sinh lý và bệnh lý [1]. Thành phần vô cơ của nước tiểu
gồm các ion như: Na+, Cl-, Ca+2, NH4+, Mg+2, PO4-3, SO4-2…ít có giá trị xét
nghiệm lâm. Thành phần hữu cơ chứa chủ yếu là urea; acid uric, các
hormon, vitamin, enzym và đặc biệt là hàng trăm loại chất chuyển hóa bài
4


xuất ra nước tiểu. Khoảng 20-30 chất chuyển hóa thông thường đã được
nghiên cứu định lượng [32].
1.3

Phân tích tổng thể chất chuyển hóa (metabolomics)
Mục đích nghiên cứu nhằm so sánh bức tranh tổng quát về các chất

chuyển hóa của một cá thể này với một cá thể khác hay một tập hợp này
với một tập hợp khác. Từ đó nhận ra những đặc trưng khác biệt như kiểu so
sánh dấu vân tay (giai đoạn fingerprinting). Sau đó xác định chất chuyển
hóa nào trong số đó đóng vai trò chất đánh dấu sinh học gây nên sự khác
biệt (giai đoạn profiling). Biến số trong Phân tích tổng thể chất chuyển hóa
thường khoảng vài trăm biến. Số lượng mẫu (cỡ mẫu) nghiên cứu cũng
phải lớn tương ứng [62]. Ứng dụng quan trọng nhất của phương pháp phân
tích tổng thể chất chuyển hóa là nghiên cứu chất đánh dấu sinh học ung thư
[59, 64, 72] và thuốc điều trị ung thư [14, 30, 68, 72, 83].
1.4

Kỹ thuật cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Các tín hiệu trên phổ NMR thể hiện chính xác thành phần và cấu

trúc phân tử các chất chuyển hóa thông qua độ dịch chuyển hóa học và
hình dạng tín hiệu (mũi đơn hay mũi đa). Phần lớn các nghiên cứu đều
dùng phổ proton 1H-NMR-NOESY [10, 46, 75]. Sau khi ghi phổ việc nhận
danh phổ dựa trên phổ chuẩn của nước tiểu và phổ chuẩn của hàng trăm
chất chuyển hóa có sẳn trong các thư viện phổ như: BioMagResBank [71],
Human Metabolome Database () [3]... Cường độ tín
hiệu proton trong H2O rất lớn nên cần dùng kỹ thuật Xóa ghép mũi H2O.
Các phổ NMR khác như: phổ 13C-NMR có độ phân tán phổ rộng hơn nhiều
so với phổ 1H-NMR, tuy nhiên độ nhạy kém và thời gian ghi phổ kéo dài
[8]. Phổ 2D-NMR (NMR hai chiều) không bị chồng lấp tín hiệu cộng
hưởng nên có thể phát hiện và nhận danh nhiều chất chuyển hóa hơn so với
phổ 1D-NMR (NMR một chiều) nhưng thời gian thâu phổ kéo dài [37, 57,
67], phổ biến là các phổ : HSQC; TOCSY ; COSY; HMBC.

1.5

Phân tích dữ liệu đa biến (MVA)
5


Tùy theo mục đích nghiên cứu, có thể dùng nhiều kỹ thuật khác
nhau: 1- Kỹ thuật Phân tích cấu tử chính (Principal Component
Analysis – PCA) nhằm đánh giá khái quát về một tập hợp mẫu. Kỹ thuật
này không áp đặt bất kỳ tính chất nào cho tập hợp mẫu (unsupervised
modelling), cho phép nhận biết đúng bản chất của tập hợp mẫu (các mẫu
tương tự nhau hay khác biệt), phát hiện các xu hướng phân bố tự nhiên
trong tập hợp mẫu (sự phân nhóm các điểm lệch…); 2- Kỹ thuật Bình
phƣơng cực tiểu riêng phần (Partial Least Square - PLS) nhằm dự đoán
tính chất của một mẫu. Một tập hợp mẫu được phân nhóm một cách có định
hướng theo một tính chất đặc trưng đã biết trước (supervised modelling).
Sự phân nhóm tạo thành mô hình PLS. Khi đã có mô hình PLS có thể đưa
vào một mẫu mới, xem mẫu được phân bố vào nhóm nào trên mô hình. Từ
đó dự đoán tính chất đặc trưng của mẫu [17].
Dữ liệu đầu vào cần ở dạng bảng số - gọi là Bảng X. Với bảng X
gồm N dòng (N mẫu/phổ) và K cột (K khoảng chia phổ), có thể biểu diễn
dưới dạng N điểm phổ trong không gian K chiều. Nguyên lý kỹ thuật PCA
là làm giảm đáng kể số chiều của bộ dữ liệu mà vẫn mô tả gần đúng nhất sự
phân bố các mẫu. PCA lập không gian mới, mỗi chiều ứng với một biến ảo
mới, gọi là Cấu Tử Chính (PC). Mỗi PC là hàm số tuyến tính của các biến
số K ban đầu. Sự phân bố của tập hợp mẫu trong không gian PC mới gọi là
mô hình PCA. Trong không gian 3 chiều mới, ví dụ PC1-PC2-PC3, chiếu
tất cả điểm phổ lên mặt phẳng tọa độ tạo bởi PC1-PC2 như hình.

Hình 1.2: (a) PC1 và PC2 trong không gian; (b) Mặt phẳng PC1-PC2

6


Các mẫu có thành phần tương tự nhau sẽ có điểm phổ nằm gần
nhau trong mặt phẳng PC1- PC2. Tọa độ của mẫu trên một trục PC chính là
phương sai của mẫu theo phương tương ứng gọi là điểm số (Score). Mặt
phẳng tạo bởi PC1 - PC2 và hình chiếu các điểm phổ gọi là Biểu đồ điểm
số PC1-PC2. Các điểm lệch (outlier) là những điểm nằm tách biệt trên biểu
đồ gây ảnh hưởng lớn đến sự phân bố của mô hình làm cho mô hình bị
lệch về phía chúng.
Biểu đồ tải trọng một chiều trông như phổ 1H-NMR. Cường độ tín
hiệu thể hiện mức độ đóng góp của biến số tương ứng trên 1 cấu tử chính
gọi là tải trọng (loading). Tín hiệu có cường độ mạnh chính là những tín
hiệu chủ yếu gây ra sự phân nhóm các điểm phổ. Quan sát Biểu đồ một
chiều có thể xác định chất chuyển hóa nào (tương ứng với tín hiệu có
cường độ mạnh) đã góp phần quan trọng vào sự phân nhóm các mẫu. Biểu
đồ tải trọng hai chiều biễu diễn tải trọng của các biến số trên 2 cấu tử chính
như hình 1.4.

Hình1.4: Biểu đồ tải trọng một chiều và hai chiều
Nguyên lý kỹ thuật PLS: PLS cũng bắt đầu với bảng dữ liệu X.
Ngoài ra, cần một bảng thông tin thứ cấp, gọi là bảng Y. Mỗi dòng trong
bảng Y là một mẫu tương tự bảng X. Nhưng mỗi cột trong bảng Y là một
nhóm thông tin thứ cấp. Thông tin thứ cấp có thể là bất kỳ loại dữ liệu nào.
Giá trị biến Y không phải là đại lượng vật lý đo lường mà là một chỉ số.
Thông thường giá trị biến Y là 2 chỉ số 0 và 1. Kỹ thuật PLS tìm mối tương
7


quan tốt nhất giữa bảng X và Y, theo điều kiện áp đặt là thông tin trong

bảng Y. Vậy có thể sử dụng mô hình PLS để dự đoán thông tin bị thiếu của
một mẫu khác. Các mô hình PLS cũng như PCA gồm Biểu đồ điểm số và
Biểu đồ tải trọng.
Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1

Vấn đề y đức của nghiên cứu
Nghiên cứu này tuân thủ đúng y đức vì: Bệnh nhân được giải thích

rõ mục tiêu và đồng ý tham gia nghiên cứu; việc lấy mẫu nước tiểu không
gây nguy hiểm; Tên địa chỉ bệnh nhân được giữ bí mật; Bệnh nhân không
trả thêm phí…
2.2

Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Mẫu được thu thập tại Trung tâm Chẩn đoán Y khoa MEDIC từ

tháng 3/2013 đến tháng 10/2014 (18 tháng). Sau đó mẫu được phân tích
mẫu tại Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm-ĐHKHTN-ĐH QG TPHCM,
Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm-Sở KHCN TPHCM.
2.3

Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu là Nghiên cứu cắt ngang. Mẫu lấy trọn

tại một thời điểm. Dân số nghiên cứu là tất cả bệnh nhân đến khám vì bệnh
lý đại-trực tràng và được làm nội soi chẩn đoán. Tiêu chuẩn loại trừ là các
bệnh lý về rối loạn chuyển hóa gồm đái tháo đường suy thận mãn. Tiêu
chuẩn vàng là nội soi đại-trực tràng kết hợp sinh thiết sang thương. Cỡ mẫu
trung bình cho nghiên cứu cắt ngang tính toán được bằng 73 mẫu.

2.4

Chuẩn hóa quy trình

8


Hình 2.1: Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu
Bác sĩ phỏng vấn bệnh nhân để ghi nhận Bảng khảo sát thông in
(Phụ lục 1) lập Danh sách bệnh nhân (Phụ lục 2); thu thập kết quả nội soi
đại tràng và kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh; thu thập mẫu nước tiểu
theo Phương pháp lấy mẫu nước tiểu sạch giữa dòng, bảo quản ở -80o C
không quá 1 tháng đến khi đem phân tích.
Mẫu chuyển từ bệnh viện sang được xử lý theo các bước: Rã đông
mẫu nước tiểu đến nhiệt độ phòng trong 20 ÷ 30 phút; Ly tâm 6.000 vòng
/phút trong 5 ÷ 10 phút để tách cặn rắn; Chuyển 540 µl lớp dung dịch trong
vào ống nghiệm 1.500 µl; Bổ sung 60 µl dung dịch đệm (pH 7 4); Làm đều
9


mẫu bằng cách ngâm bồn siêu âm trong 3 phút rồi rút mẫu cho vào ống đo
NMR 5mm. [43 57]. Thiết bị phân tích là hệ NMR Bruker AVANCE III
500 Ultrashield Plus Cryo. Chu trình xung 1D-NOESY- PRESAT có xóa
ghép tín hiệu H2O. Số lần quét NS = 32. Tổng thời gian là 4 – 5 phút/mẫu.
Phổ 1H-NMR được xử lý trên phần mềm Topspin version 3.1 – Bruker. Sau
các bước xử lý trên phổ NMR được chuẩn hóa hay còn gọi là đồng bộ hóa
trước khi đưa vào phân tích thống kê đa biến: PCA PLS bằng phần mềm
AMIX version 3.9.12 - Bruker BioSpin.
Đồng bộ hóa gồm các bước : chia khoảng phổ 1H-NMR theo hình
chữ nhật; cắt vùng phổ cần quan sát 9.50 ppm - 0.50 ppm; chia nhỏ phổ

thành các khoảng có độ rộng 0.05 ppm; chọn kiểu tích phân: cường độ (tích
phân) từng khoảng phổ chia nhỏ được lấy theo tỷ lệ trên giá trị tổng cường
độ của phổ; xác định tỷ xích giữa các phổ (scaling) theo cường độ tổng
(scale to total intensity) ; gán cho tổng cường độ các phổ một giá trị bằng
nhau ; loại bỏ vùng phổ không phân tích từ 6.5 ppm - 4.5 ppm.
Phân tích thống kê đa biến: PCA PLS bằng tính năng của phần
mềm AMIX theo nguyên lý như mục 1.5
Đánh giá phương pháp NMR Độ Nhạy (Sensivity) và Độ Đặc Hiệu
(Specificity) đồng thời xác định giá trị tiên đoán dương giá trị tiên đoán
âm của phương pháp. Đánh giá sự phù hợp của phương pháp NMR so với
phương pháp tiêu chuẩn vàng bằng chỉ số Jacob Cohen’s Kappa.
Chƣơng 3
3.1

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Ghi phổ NMR
Để tăng giá trị của nghiên cứu mẫu được thu thập nhiều hơn cỡ

mẫu quy định. Tổng số mẫu thu thập được là 229 mẫu gồm 77 mẫu bệnh
và 152 mẫu lành. Ghi phổ được 77 phổ bệnh và 152 phổ lành tương ứng.

10


Hình 3.1: Phổ 1H-NMR 500MHz từ 9.5 – 0.0 ppm của mẫu lành mã số
0022 : 1-creatinine / creatine, 2- hippurate, 3- glycine, 4- citrate, 5trimethylamine N-oxide, 6- lactate, 7- alanine, 8- dimethylamine, 9- taurine

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR 500MHz từ 9.5 – 0.0 ppm của mẫu bệnh mã số
1126 : 1-creatinine / creatine, 2- hippurate, 3- glycine, 4- citrate, 5trimethylamine N-oxide, 6- lactate, 7- alanine, 8- dimethylamine, 9- taurine

Phổ thu được có sự tương đồng với phổ chuẩn mẫu nước tiểu đã
được công bố trong nhiều tài liệu [44, 61, 66, 79]. Điều này chứng tỏ rằng
quá trình thu thập bảo quản xử lý mẫu và ghi phổ NMR là phù hợp các
quy trình điều kiện chuẩn trong những nghiên cứu trên thế giới.
3.2

Nhận danh phổ NMR
Có 30 chất chuyển hóa chính trong thành phần 2 loại mẫu nước

tiểu được nhận danh và liệt kê trong bảng 3.2.
11


STT
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.

17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.

Bảng 3.2: Các chất chuyển hóa chính trên phổ 1H-NMR
Chất chuyển hóa
Vị trí cộng hưởng (ppm)
Creatinine
4.07(s), 3.05(s)
/ Creatine
4,02(s), 2.94(s)
Hippurate
8.52(m), 7.82(m), 7.63(m), 7.54(m), 3.95(m)
Glycine
3.57(s)
Citrate
2.69(d), 2.53(d)
Trimethylamine N-Oxide
3.26(s)
Lactate
4.11(d), 1.23(d)

Alanine
3.78(m), 1.47(d)
Dimethylamine
2.72(s)
Taurine
3.43(t), 3.27(t)
Methylsuccinate
2.61(m), 2.41(q), 2.21(q), 1.07(d)
Leucine
3.73(t), 1.71(m), 0.95(t)
/ Isoleucine
3.65(d), 1.95(m), 1.45(m), 1.25(m), 0.95(m)
Valine
3.60(d), 2.25(m), 1.03(d), 0.98(d)
Phenylacetate
7.38(m), 7.28(m), 3.53(s)
Acetate
1.91(s)
Phenylacetylglutamine
7.42(t), 7.38(t), 2.25(m), 2.11(m), 1.92(m)
Threonine
4.25(m), 3.58(d), 1.23(d)
P.Cresol
7.10(d), 6.79(d), 2.24(s)
Acetoacetate
3.43(s), 2.27(s)
Succinate
2.39(s)
Pyruvate
2.36(s)

Isocitrate
4.05(d), 2.99(m), 2.51(m)
Aspartate
3.90(m), 2.81(m), 2.69(m)
Trimethylamine
2.88(s)
Tyrosine
7.18(m), 6.89(m), 3.93(m), 3.18(m), 3.04(m)
Histidine
7.87(s), 7.08(s), 3.98(m), 3.24(m), 3.14(m)
Glutamate
3.75(m), 2.35(m), 2.12(m), 2.04(m)
Betaine
3.69(s), 3.20(s)
Serine
3.98(m), 3.93(m), 3.83(m)
12


29.
30.

Guanidoacetate
Methionine

3.79(s)
3.85(m), 2.63(m), 2.20(m), 2.11(m)

(s)-mũi đơn (d)-mũi đôi (t)-mũi ba (q)-mũi bốn, (m)-mũi đa
3.3 Mô hình PCA thể hiện xu hƣớng phân nhóm của tập hợp mẫu

Kết quả phân tích PCA thu được Biểu đồ điểm số theo PC1 và PC2
như hình 3.6:
VÙNG MẪU LÀNH

VÙNG MẪU BỆNH

Hình 3.6: Biểu đồ điểm số PCA theo PC1-PC2 thể hiện xu hướng
phân nhóm tập hợp mẫu -Dấu màu đỏ: mẫu bệnh Dấu màu xanh: mẫu lành
Nhận xét:
 Số cấu tử chính tối thiểu để đạt độ tin cậy 95% là 4 PC. Tổng mức độ giải
thích của các cấu tử chính quan trọng nhất là 59.04%.
 Vùng Biểu đồ điểm số về phía âm của trục PC1 có 139 điểm phổ của
mẫu lành (ký hiệu dấu màu xanh). Tuy nhiên có thêm 8 điểm lạc của mẫu
bệnh (ký hiệu dấu màu đỏ) âm tính giả mang mã số: 1317 1334 1069
1303, 1013, 1321, 1294, 1302.
 Vùng Biểu đồ điểm số về phía dương của trục PC1 có 69 điểm phổ của
mẫu bệnh (ký hiệu dấu màu đỏ). Tuy nhiên có thêm 13 điểm lạc của mẫu
lành (ký hiệu dấu màu xanh) dương tính giả mang mã số: 0085 0265
0206, 0115, 0214, 0188, 0287, 0117, 0238, 0221, 0169, 0244, 0171.
3.4 Mô hình PLS dùng chẩn đoán ung thƣ đại-trực tràng
13


Biểu đồ điểm số PCA chỉ mới là biểu đồ thể hiện sự phân bố tự
nhiên của tập hợp mẫu chưa phải biểu đồ dùng chẩn đoán sàng lọc bệnh.
Biểu đồ PLS dùng chẩn đoán sàng lọc bệnh phải được xây dựng trên bộ cơ
sở dữ liệu đã được khẳng định chắc chắn về tính chất đặc trưng của mẫu,
bằng một phương pháp phân tích khác đã cho kết quả biết trước. Các mẫu
bệnh hay lành, ngoài việc đã được khẳng định tình trạng bệnh theo kết quả
nội soi và giải phẫu bệnh (giá trị “0” và “1”) cũng cần là những mẫu đã

được phân bố chính xác trên Biểu đồ điểm số PCA . Vì vậy khi xây dựng
mô hình PLS cần loại bỏ 8 mẫu âm tính giả và 13 mẫu dương tính giả. Số
mẫu còn lại là: số mẫu lành = 139 mẫu số mẫu bệnh = 69 mẫu.
Kết quả phân tích PLS thu được Biểu đồ điểm số theo PLS1 và
PLS2 như hình 3.7:

Hình 3.7: Biểu đồ điểm số PLS theo PLS1-PLS2 dùng chẩn đoán
ung thư đại-trực tràng – Dấu màu đỏ: mẫu bệnh Dấu màu xanh: mẫu lành
Nhận xét:
 Số cấu tử chính tối thiểu để đạt độ tin cậy 95% là 4 PLS trong đó tổng
mức độ giải thích của các biến X là 46.93% tổng mức độ giải thích của các
biến Y là 88.03%.
 Với biểu đồ hình 3.7 dùng chức năng Prediction của phần mềm AMIX
có thể đánh giá phổ NMR của một hay nhiều mẫu nước tiểu mới xem có
14


thuộc mô hình không và phân bố vào vùng nào trên biểu đồ. Nếu điểm phổ
mới được phân bố trong vùng mẫu bệnh tức kết quả chẩn đoán sàng lọc
bằng phương pháp NMR nghi ngờ bệnh nhân bị ung thư đại-trực tràng. Nếu
điểm phổ mới được phân bố trong vùng mẫu lành tức kết quả chẩn đoán
sàng lọc bằng phương pháp NMR dự đoán bệnh nhân không bị ung thư đạitrực tràng.
3.5 Xác định chất đánh dấu sinh học ung thƣ đại-trực tràng
Quy luật biến đổi thành phần chất chuyển hóa của mẫu nước tiểu ung thư
đại-trực tràng được xác định bằng các Biểu đồ tải trọng PCA như hình 3.8

Hình 3.8: Các biểu đồ PCA thể hiện sự góp phần các chất chuyển hóa tạo
nên sự phân nhóm điểm phổ trên trục PC1.
A- Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2, B- Biểu đồ tải trọng hai chiều theo
PC1-PC2, C- Biểu đồ tải trọng một chiều theo PC1; Dấu màu đỏ: mẫu bệnh

- Dấu màu xanh: mẫu lành


Nhận xét Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B):
15


Trên Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) mỗi điểm ứng với một
khoảng chia phổ gồm 131 khoảng cạnh mỗi điểm có ghi giá trị độ dịch
chuyển hóa học (ppm). Hướng phân bố những khoảng giá trị độ dịch
chuyển hóa học trên Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) tương quan
hướng phân bố của các điểm phổ (mẫu) trên Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A).
Hình 3.9 thể hiện chi tiết Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) cho thấy
rõ các khoảng giá trị độ dịch chuyển hóa học nào (tức các chất chuyển hóa
tương ứng) đã gây ra sự phân nhóm điểm phổ (tức các mẫu) trên trục PC1
của Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A):

Hình 3.9-A: Trích Biểu đồ tải trọng hai chiều theo PC1-PC2
(hình 3.8 – B) - Phần nữa trái

16


Hình 3.9-B: Trích Biểu đồ tải trọng hai chiều theo PC1-PC2
(hình 3.8 – B) - Phần nữa phải -trên

Hình 3.9-C: Trích Biểu đồ tải trọng hai chiều theo PC1-PC2
(hình 3.8 – B) - Phần nữa phải-dưới



Hình 3.9-A thể hiện rõ các tín hiệu cộng hưởng tại 4.08 ppm 3.28 ppm
3.18 ppm 3.08 ppm 2.58 ppm 1.23 ppm 1.18 ppm…(± 0.025 ppm)
17


được phân bố ở nữa trái của Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B),
khiến các mẫu lành (dấu màu xanh) phân bố cùng trên nữa trái của
Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A).



Hình 3.9-B thể hiện rõ các tín hiệu cộng hưởng tại 7.63 ppm 7.53 ppm
7.43 ppm 7.38 ppm 7.33 ppm và tại 2.53 ppm 2.28 ppm 2.23 ppm
2.18 ppm 2.13 ppm…(± 0.025 ppm) được phân bố ở nữa phải - trên
của Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B), khiến các mẫu bệnh (dấu
màu đỏ) phân bố cùng ở nữa phải - trên Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A).



Hình 3.9-C thể hiện rõ các tín hiệu cộng hưởng tại 3.83 ppm 3.73 ppm
3.53 ppm, 3.48 ppm, 3.43 ppm…(± 0.025 ppm) phân tán ở nữa phải –
dưới của Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) gây ra sự phân tán
của các mẫu bệnh (dấu màu đỏ) trên Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A)


Nhận xét Biểu đồ tải trọng một chiều (hình 3.8-C):

Có mối tương quan giữa Biểu đồ tải trọng hai chiều Biểu đồ tải trọng một
chiều và Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2 ở hình 3.8-A, 3.8-B, 3.8-C :



Các tín hiệu cộng hưởng tại 4.08 ppm 3.28 ppm 3.18 ppm 3.08 ppm
2.58 ppm, 1.23 ppm 1.18 ppm…phân bố ở phần tọa độ âm (-) của trục
PC1 trên Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) sẽ tương ứng với các
tín hiệu âm (-) trên Biểu đồ tải trọng một chiều (hình 3.8-C). Tọa độ
PC1 âm (-) của các điểm này trên hình 3.8-B tương ứng với mức cường
độ các tín hiệu âm (-) trên hình 3.8-C. Vậy xu hướng giảm hàm lượng
của các chất chuyển hóa tương ứng là nguyên nhân gây ra sự khác biệt
giữa nhóm mẫu bệnh và nhóm mẫu lành, khiến các mẫu phân bố tách
nhóm trên Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2 (hình 3.8-A).



Tương tự, tất cả tín hiệu cộng hưởng phân bố ở phần tọa độ dương (+)
của trục PC1 trên Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) sẽ tương ứng
với các tín hiệu dương (+) trên Biểu đồ tải trọng một chiều (hình 3.8C). Tọa độ PC1 dương (+) của các điểm này trên hình 3.8-B tương ứng
với cường độ các tín hiệu dương (+) trên hình 3.8-C. Vậy xu hướng
18


tăng hàm lượng của các chất chuyển hóa tương ứng là nguyên nhân gây
ra sự khác biệt giữa nhóm mẫu bệnh và nhóm mẫu lành, khiến các mẫu
phân bố tách nhóm trên Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2 (Hình 3.8-A).
Biểu đồ tải trọng một chiều (C) có hình dạng tương tự phổ 1HNMR nên việc nhận danh các tín hiệu trên Biểu đồ tải trọng một chiều (C)
cũng được thực hiện tương tự nhận danh phổ 1H-NMR bằng cách xếp
chồng 2 phổ.
Từ đó xác định được những chất chuyển hóa có ý nghĩa quan
trọng với hàm lượng tăng mạnh hoặc giảm mạnh là creatinine/creatine

(giảm)

hippurate (tăng)

phenylacetate (tăng)

phenylacetylglutamine

(tăng) p-cresol (tăng) tyrosine (tăng) có vai trò như những chất đánh dấu
sinh học ung thư đại-trực tràng (ký hiệu chữ màu đỏ trong bảng 3.5).
Bảng 3.5: Xu hướng biến đổi chất chuyển hóa trong ung thư đại-trực tràng
stt

Chất chuyển hóa

Xu hướng biến đổi:
(+) Tăng / (-) Giảm

1.

Creatinine / Creatine

-/+

2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.

Hippurate
Glycine
Citrate
Trimethylamine N-Oxide
Lactate
Alanine
Dimethylamine
Taurine
Methyl Succinate
Leucine / Isoleucine
Valine
Phenylacetate
Acetic Acid
Phenylacetylglutamine

+
+
+
+

19

stt

Chất chuyển hóa

Xu hướng biến đổi:

16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.

Threonine
P.Cresol
Acetoacetate
Succinate
Pyruvate
Isocitrate

Aspartate
Trimethylamine
Tyrosine
Histidine
Glutamate
Betaine
Serine
Guanidoacetate
Methionine

(+) Tăng / (-) Giảm
+
+
+
+
+
+
+
+

3.6
Xác nhận giá trị phƣơng pháp NMR trong chẩn đoán ung thƣ
đại-trực tràng
Tính toán các chỉ số đặc trưng của phương pháp : Độ nhạy =
89.6% ; Độ đặc hiệu = 90.3% ; Giá trị dự đoán dương tính = 84.1% ; Giá
trị dự đoán âm tính = 94.6%.
Đánh giá sự phù hợp của phương pháp : chỉ số Kappa = 0.80 . Kết
luận : Phương pháp NMR cho kết quả chẩn đoán sàng lọc phù hợp khá tốt
với kết quả phương pháp nội soi sinh thiết giải phẫu bệnh.
3.7

Kiểm chứng lâm sàng mô hình chẩn đoán NMR
Chọn một số trường hợp bệnh án có vấn đề trong công tác chẩn

đoán bệnh. Đó là các trường hợp bác sĩ phải chẩn đoán lại nhiều lần và một
số trường hợp có kết quả chẩn đoán sơ bộ bằng nội soi khác biệt so với kết
quả giải phẫu bệnh.
20


Trường hợp 1 : Mẫu nước tiểu mã số 339
 Kết quả nội soi: Ung thư đại tràng Sigma. Bệnh nhân được sinh thiết mô
khối u để tiếp tục làm giải phẫu bệnh
 Kết quả giải phẫu bệnh lần 1: Viêm ruột mạn tính không đặc hiệu. Kết
quả này khác biệt so với kết quả chẩn đoán sơ bộ. Bệnh nhân được làm lại
nội soi sinh thiết giải phẫu bệnh
 Kết quả giải phẫu bệnh lần 2: Carcinom tuyến, biệt hóa vừa ở đại tràng.
Đây là kết luận sau cùng.
Mẫu được dùng kiểm chứng như sau: Mẫu được giả định là “mẫu
mù” được đưa vào mô hình PLS mà không kèm theo bất kỳ thông tin nào
từ bệnh án. Kế quả : mẫu được phần mềm AMIX phân bố vào vùng mẫu
bệnh. Vậy kết quả chẩn đoán bằng phương pháp NMR là bệnh nhân bị ung
thư đại-trực tràng phù hợp kết luận sau cùng của giải phẫu bệnh.
Trường hợp 2 : Các mẫu nước tiểu mã số 101 175 184 296 có kết quả
chẩn đoán sơ bộ bằng phương pháp nội soi không chính xác so với kết quả
giải phẫu bệnh cụ thể như sau:
STT

Mã số

Kết quả nội soi

1

101

Ung thư đại tràng lên

2

175

3

184

4

296

Ung thư ống hậu
môn-trực tràng
Theo dõi ung thư trực
tràng
Ung thư trực tràng

Kết quả giải phẫu bệnh
Viêm ruột mạn tính
không đặc hiệu
Viêm ruột mạn tính

không đặc hiệu
Viêm ruột mạn tính
không đặc hiệu
Viêm ruột mạn tính
không đặc hiệu

Mô hình PLS cho thấy các mẫu 101 175 184 296 được phần mềm
AMIX phân bố trong vùng mẫu lành của mô hình. Vậy kết quả chẩn đoán
sàng lọc bằng phương pháp NMR phù hợp kết quả giải phẫu bệnh.

21


Chƣơng 4
a.

BÀN LUẬN

Kiểm soát quá trình

Kiểm soát quá trình thu thập và bảo quản mẫu
 Phải ghi nhận đầy đủ các thông tin về mẫu để có thể giảm thiểu hoặc loại
trừ sự khác biệt giữa các mẫu.
 Mẫu nước tiểu phải được thu thập đúng theo Phương pháp lấy mẫu nước
tiểu sạch giữa dòng để tránh nhiễm khuẩn và tế bào.
 Nước tiểu được thu thập vào 1 thời điểm cố định trong ngày tốt nhất vào
buổi sáng sớm bụng đói.
 Lưu mẫu ở -80oC nhưng không quá 1 tháng để ổn định chất chuyển hóa.

 Độ dịch chuyển hóa học trên phổ NMR rất nhạy với pH. Phải sử dụng

dung dịch đệm.
Kiểm soát quá trình xử lý mẫu:
 Chuẩn xác khi rút thể tích dung dịch chuyển vào ống NMR vì sai khác
thể tích mẫu chứa trong các ống NMR dẫn đến sự sai khác cường độ phổ
thâu nhận được.
 Chất bảo quản NaN3 nhất thiết phải bổ sung, ngăn vi khuẩn tăng trưởng.
 Ly tâm lọc nước tiểu cũng nhằm ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn
gây sai lệch phổ NMR.
Kiểm soát kỹ thuật ghi phổ NMR
 Một lượng chất nội chuẩn 3- (trimetylsilyl) propionic axit-2,2,3,3-d4
(TMSP-d4) thường được thêm vào mẫu nước tiểu để lấy làm tọa độ tham
chiếu là 0.00 ppm
 Nhiệt độ tối ưu là 300oK (27oC) ±0.01oK.
 Thiết bị ổn định nhiệt BCU là rất cần thiết đối với các hệ NMR sử dụng
cho mục đích nghiên cứu hóa sinh.
Kiểm soát quá trình phân tích dữ liệu đa biến
 Kết quả phân tích đa biến trên phổ đồ phụ thuộc rất nhiều vào việc
chuyển phổ đồ thành bảng số dữ liệu ban đầu.
22


 Tiến hành lập bảng số dữ liệu bằng kỹ thuật phù hợp như: chọn kích
thước khoảng chia chọn vùng phổ loại trừ… Xử lý kết hợp số liệu thống kê
và kiến thức phổ là cần thiết để kết quả thí nghiệm có ý nghĩa đúng đắn.
Kiểm soát an toàn phòng thí nghiệm:
 Cần lưu trữ mẫu nước tiểu đúng quy định và tuyệt đối tuân thủ nguyên
tắc an toàn phòng thí nghiệm sinh học
4.2

Mô hình chẩn đoán sàng lọc PLS

 Các điểm phổ mẫu lành phân bố tập trung hơn. Nguyên nhân là do số
mẫu lành thu thập được nhiều hơn.
 Đa số trường hợp dương tính giả (69%) là các bệnh nhân có bệnh lý khác
về tiêu hóa. Đây có thể là nguyên nhân gây hiện tượng dương tính giả.
 Các trường hợp âm tính giả đa số không có tiền sử bệnh hoặc chỉ bị các
bệnh thông thường. Các ung thư khác chưa được phát hiện có thể là nguyên
nhân gây hiện tượng âm tính giả.
 Có thể tổng hợp kết quả các nghiên cứu phân tích tổng thể chất chuyển
hóa trên thế giới để xây dựng thành thư viện dữ liệu về sự biến đổi chất
chuyển hóa ở nhiều loại bệnh.
 Biểu đồ điểm số PCA theo PC1 và PC2 (hình 3.6) chia làm 2 vùng rõ rệt
phù hợp bản chất tự nhiên của tập hợp mẫu: vùng mẫu bệnh và vùng mẫu
lành chứng tỏ quy luật biến đổi chất chuyển hóa xác định được rất đặc
trưng cho tình trạng bệnh hay khỏe mạnh.
 Mô hình chẩn đoán đã được kiểm chứng trên 5 trường hợp lâm sàng, tất
cả đều phù hợp với kết quả giải phẫu bệnh.
4.3

So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của phƣơng pháp NMR với các

nghiên cứu trên thế giới
Độ nhạy độ đặc hiệu của kỹ thuật NMR trong nghiên cứu này lần
lượt là 89.6% và 90.3%. Các nghiên cứu khác cũng công bố độ nhạy độ
đặc hiệu cao tương đương.
23


4.4

So sánh kết quả xác định chất đánh dấu sinh học với các nghiên

cứu trên thế giới
 Có 80% chất chuyển hóa biến đổi trùng với kết quả nghiên cứu của
Yunping Qiu và cộng sự (2010). Trong đó 5 chất đánh dấu sinh học ung
thư đại-trực tràng là hippurate, phenylacetate, phenylacetylglutamine, pcresol, succinate, tyrosine là các chất chuyển hóa có mạch vòng.
 Có 67% chất chuyển hóa biến đổi trùng với kết quả nghiên cứu của
Young Kee Chae và cộng sự (2010). Creatinine là chất chuyển hóa có hàm
lượng giảm mạnh và rõ rệt nhất.
 Có 10% chất chuyển hóa là pyruvate guanidoacetate dimethylamine chưa từng được ghi nhận trong các nghiên cứu khác. Và 23% chất chuyển
hóa là serine, betaine, lactate, threonine, leucine/isoleucine, trimethylamine,
glutamate - có xu hướng biến đổi khác biệt với các nghiên cứu trên thế giới.
4.5 Sự biến đổi chất chuyển hóa và cơ chế sinh ung thƣ
Sự tăng nồng độ các chất đánh dấu sinh học ung thư ở người bệnh
làm tăng số nhóm cho proton (-OH, -NH) và nhóm nhận proton (>C=O,
>N- ) làm tăng khả năng tồn tại mối liên kết tạo thành giữa các chất
chuyển hóa với các nucleotide trong phân tử ADN thông qua các nhóm cho
nhận proton, gây ra sự biến loạn mã di truyền trên ADN.
4.6

Giới hạn của nghiên cứu

 Nhiều biến thực (khoảng 3000 tín hiệu) được phân bố vào một vùng phổ
H-NMR chỉ rộng khoảng 10 ppm. Khi chia khoảng phổ để phân tích dữ

1

liệu đa biến lại không thể chia quá nhỏ để tăng độ chính xác vì bị giới hạn
bởi độ phân giải và sự ổn định tín hiệu Sử dụng kỹ thuật tách mẫu như LCMS để giảm bớt tín hiệu.
 Cần tăng số lượng mẫu nghiên cứu. Tính toán cỡ mẫu theo công thức

tương quan độ nhạy độ đặc hiệu của phương pháp NMR và tỷ lệ lưu hành
(prevalence) ung thư đại-trực tràng có thể lên đến hàng ngàn mẫu.
24


 Đối tượng tham gia nghiên cứu là những người tìm đến khám tại bệnh
viện nên kết quả chưa thật sự đại diện cho một quần thể lớn hơn.
 Kết quả nghiên cứu này chỉ dừng ở dạng Nghiên cứu cắt ngang (crosssectional) chưa ứng dụng được vào thực tế lâm sàng.
 Kết quả dương tính cần được xác nhận bằng một phương pháp khác như
xét nghiệm nội soi siêu âm sinh thiết.
KẾT LUẬN
 Luận án nghiên cứu “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ
trợ chẩn đoán ung thư đại-trực tràng” đã đem lại những đóng góp mới cho
lĩnh vực khoa học chuyên ngành - Y học. Luận án là công trình nghiên cứu
tiên phong giới thiệu xây dựng thử nghiệm một phương pháp hỗ trợ chẩn
đoán ung thư còn rất mới trên thế giới chưa có ở Việt nam dựa trên sự kết
hợp công cụ phân tích hiện đại - Cộng hưởng từ hạt nhân - và phương pháp
thống kê đa biến.
 Khác với những nghiên cứu tương tự trên thế giới luận án “ Sử dụng kỹ
thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại-trực tràng”
đã nghiên cứu trên mẫu nước tiểu của các bệnh nhân ngay tại Việt Nam.
Ngoài những đặc trưng riêng của mỗi cá thể ảnh hưởng lên thành phần chất
chuyển hóa như tình trạng bệnh lý tình trạng sử dụng thuốc… thành phần
chất chuyển hóa trong những mẫu nước tiểu được nghiên cứu mang tính
chất đặc trưng chung của người Việt Nam về chủng tộc địa lý ẩm thực…
Đây là nguồn cơ sở dữ liệu phù hợp chuẩn xác tối ưu cho mô hình chẩn
đoán phát hiện sớm ung thư đại-trực tràng áp dụng cho người Việt Nam.
 Luận án nghiên cứu “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ
trợ chẩn đoán ung thư đại-trực tràng” đã khảo sát và chuẩn hóa quy trình
điều kiện thông số cho một nghiên cứu thuôc loại phân tích chất chuyển

hóa đối với các loại mẫu sinh học tiêu biểu là mẫu nước tiểu. Đây là nền
25