Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (reverse hybridization

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý
đào tạo sau Đại học, các Thầy giáo, Cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội đã
giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, các bạn đồng nghiệp Trung tâm
Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện phụ sản Trung ương đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và quá trình thu thập số liệu.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Hoàng Thị Ngọc
Lan và TS. Lương Thị Lan Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành
luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ủng hộ,
giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015
Tác giả luận văn
Lê Phương Thảo


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng
kỹ thuật lai phân tử (Reverse hybridization)” là đề tài do tôi thực hiện, tất cả
các số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công
bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu sai, tôi xin hoàn toàn
chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015
Tác giả luận văn
Lê Phương Thảo

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................1
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................2
MỤC LỤC........................................................................................................3
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ............................................................6
DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ....................................................................8
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN............................................................................4
1.1. Bệnh Thalassemia.......................................................................................
1.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia.....................21
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........36
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................36
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................37
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................37
2.4. Cách thức tiến hành nghiên cứu...............................................................39
2.5. Hạn chế sai số trong nghiên cứu..............................................................47
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu........................................................................47
2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu...................................................48
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.....................................................49
3.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu.............................................49
3.2. Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng phương pháp
Reverse hybridization..............................................................................50
3.3. Đánh giá giá trị của phương pháp............................................................57
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN..............................................................................66
4.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh
Thalassemia.............................................................................................66
4.2. Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse
hybridization và tỷ lệ các loại đột biến...................................................71
4.3. Đánh giá giá trị kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước
sinh bệnh Thalassemia............................................................................77

KẾT LUẬN....................................................................................................83
1. Các đột biến gen được phát hiện bằng kỹ thuật Reverse hybridization......83
2. Giá trị của kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh
bệnh Thalassemia....................................................................................83
KIẾN NGHỊ...................................................................................................84
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................85
PHỤ LỤC.........................................................................................................1


DANH MỤC VIẾT TẮT
NST

Nhiễm sắc thể

DNA

Deoxyribo Nucleotid Acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

SEA

(Phản ứng khuếch đại chuỗi)
South East Asia

THAI

FIL
MED
Hb

Thailand
Filipino
Mediterranean
Hemoglobin

Α

(Huyết sắc tố)
alpha

Β

beta

HBA

Hemoglobin alpha

HBB

Hemoglobin beta

ARMS-PCR
MLPA

Amplification Refractory Mutation

System Polymera Chain Reaction
Multiplex Ligation-dependent Probe

NOR

Amplification
Normal (Bình thường)

HET

Heterozygous (Dị hợp tử)

HOM
ĐCTN

Homozygous (Đồng hợp tử)
Đình chỉ thai nghén

MCV

Thể tích trung bình hồng cầu

MCH

Lượng hemoglobin trung bình hồng cầu


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ
Bảng 1.1. Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường....
Bảng 1.2. Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường [16], [20]

.................................................................................................................
Bảng 1.3. Kiểu gen và các thể bệnh α-thalassemia.........................................13
Bảng 1.4. Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt
Nam [11]..................................................................................................18
Bảng 1.5. Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gapPCR.........................................................................................................23
Bảng 1.6. Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu.....................................26
Bảng 1.7. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin
StripAssaySEA........................................................................................30
Bảng 1.8. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay......31
Bảng 2.1. Các chỉ số nghiên cứu.....................................................................38
Bảng 2.2. Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến trên Teststrip.................................44
Bảng 2.3. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen α globin........................46
Bảng 2.4. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen β globin........................46
Bảng 3.1. Đặc điểm về dân tộc của thai phụ...................................................49
Bảng 3.2. Tuổi thai ở thời điểm chọc hút dịch ối của đối tượng nghiên cứu
.................................................................................................................49
Bảng 3.3. Tiền sử đẻ con Thalassemia............................................................49
Bảng 3.4. Tiền sử phù thai...............................................................................50
Bảng 3.5. Tỷ lệ phát hiện đột biến..................................................................50
Bảng 3.6. Phân bố loại đột biến......................................................................50
Bảng 3.7. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh α -thalassemia.........................52
Bảng 3.8. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia..........................53
Bảng 3.9. Kiểu gen các thai được chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia
.................................................................................................................54
Bảng 3.10. Kiểu gen các trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh βthalassemia..............................................................................................54


Bảng 3.11. Kết quả chẩn đoán trước sinh cho 11 gia đình có con đầu mắc
HbH hoặc β-thalassemia thể nặng...........................................................55
Bảng 3.12. Đối chiếu kết quả về phân bố kiểu gen của thai từ 2 phương

pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization...........................57
Bảng 3.13. Đối chiếu về kết quả xác định các dạng đột biến cụ thể...............57
Bảng 3.14. So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc αthalassemia).............................................................................................59
Bảng 3.15. So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc βthalassemia).............................................................................................60
Bảng 4.1. So sánh đặc diểm của 2 phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR và
Reverse hybridization trong chẩn đoán Thalassemia..............................80


DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
Hình 1.1. Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb.........
Hình 1.2. Vị trí gen α globin trên NST 16.........................................................
Hình 1.3. Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α.................................
Hình 1.4. Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α....................
Hình 1.5. Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin....................................10
Hình 1.6. Vị trí gen β globin trên NST 11.......................................................14
Hình 1.7. Năm đột biến xẩy ra (đóng khung) ở vị trí đầu của intron thứ nhất
của gen  globin....................................................................................17
Hình 1.8. Chẩn đoán đột biến mất đoạn α+-thalassemia bằng multiplex
gap-PCR..................................................................................................24
Hình 1.9. Chẩn đoán đột biến mất đoạn α0-thalassemia bằng multiplex gapPCR.........................................................................................................24
Hình 1.10. Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR................................25
Hình 1.11. Các vị trí đột biến trên Teststrip của β-Globin StripAssay SEA
.................................................................................................................32
Hình 1.12. Các vị trí đột biến trên Teststrip của α-Globin StripAssay............33
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu.......................................................................39
Biểu đồ 3.1. Các loại đột biến gây bệnh α-thalassemia...................................51
Biểu đồ 3.2. Các loại đột biến gây bệnh β-thalassemia..................................52
Hình 3.1. Đồng hợp tử đột biến --SEA...........................................................61
Hình 3.2. Dị hợp tử đột biến --SEA................................................................62
Hình 3.3. Không phát hiện đột biến gen.........................................................63

Hình 3.4. Đồng hợp tử đột biến CD17............................................................64
Hình 3.5. Dị hợp tử đột biến kép CD41/42 / CD26........................................65
Hình 4.1. Sơ đồ sàng lọc trước sinh bệnh Thalassemia..................................69


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thalassemia là một dạng bệnh của huyết sắc tố - hemoglobin (HST Hb) phổ biến trên thế giới. Bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường,
nguyên nhân là do đột biến gen gây giảm hoặc không tổng hợp protein globin
tham gia cấu tạo Hb, dẫn đến thiếu hụt Hb trong hồng cầu. Trên thế giới, ước
tính 7% dân số mang gen bệnh và mỗi năm có khoảng 300.000 ÷ 500.000 trẻ
được sinh ra với thể đồng hợp tử nặng của bệnh này . Tại Việt Nam, có
khoảng hơn 5 triệu người mang gen và bị bệnh Thalassemia, hàng năm có
thêm 100.000 trẻ mang gen bệnh và 1.700 trẻ mắc bệnh nặng do đột biến cả 2
gen được sinh ra .
Bệnh được chia làm 2 loại chính là alpha thalassemia (α-thalassemia)
và beta thalassemia (β-thalassemia) tùy thuộc vào loại đột biến xảy ra ở gen α
(quy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 16) hay gen
β (quy định tổng hợp chuỗi beta globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 11). Theo
thống kê, có trên 300 đột biến gen α và trên 200 đột biến gen β có liên quan
đến bệnh Thalasemia , . Cá thể đồng hợp tử mang 2 alen đột biến αthalassemia loại --SEA/--SEA gây bệnh Hb Bart’s, đây là thể nặng nhất của bệnh
α-thalassemia. Thai nhi mắc Hb Bart’s thường bị phù rau thai, thai chết lưu
trong tử cung hoặc chết sớm sau sinh. Thể này đặc biệt phổ biến ở các nước
Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines . Bệnh nhân β-thalassemia
thể nặng hay còn gọi là thể Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 2 đột biến
khác nhau, thường có biểu hiện thiếu máu nặng dần sau 3 ÷ 6 tháng tuổi, phụ
thuộc vào truyền máu và thải sắt suốt đời . Người bệnh Thalassemia thể ẩn là
người có kiểu gen dị hợp tử mang 1 alen đột biến, có thiếu máu nhược sắc
trên huyết đồ nhưng lại không có biểu hiện trên lâm sàng. Phương pháp điều
trị chủ yếu hiện nay đối với bệnh Thalassemia vẫn là truyền máu, thải sắt, cắt

lách và điều trị các biến chứng khi cần , , . Quá trình này rất tốn kém mà hiệu
quả không cao. Vì thế, bệnh trở thành gánh nặng không chỉ cho bệnh nhân và
gia đình mà cho toàn xã hội [9]. Đối với các trường hợp gia đình có bố mẹ là
người mang gen bệnh hoặc tiền sử sinh con Thalassemia thì biện pháp sàng
lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia có ý nghĩa quan trọng và là
phương pháp phòng ngừa hiệu quả nhất .
Ở Việt Nam, để chẩn đoán bệnh Thalassemia chúng ta đang sử dụng
phương pháp multiplex PCR (PCR đa mồi) để sàng lọc các đột biến: 5 đột
biến mất đoạn lớn của gen α globin như: -- SEA (South East Asia), --THAI
(Thailand), --FIL (Philippin), -α4.2, -α3.7 và các đột biến điểm HbQs, HbCs và 8
đột biến phổ biến của gen β globin gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia
bao gồm: CD17 (AAG>TAG), CD41/42 (-TCTT), -28 (A>G), CD71/72 (+A),
IVS 1.1 (G>T), IVS 1.5 (G>C), IVS 2.654 (C>T) và CD26 (GAG>AAG) ,
xác định kiểu gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory
Mutation System Polymerase Chain Reaction) và giải trình tự vùng gen
globin. Các phương pháp này dễ dàng áp dụng cho việc phát hiện các đột biến
đơn lẻ đã biết, nhưng lại không có khả năng xác định cùng lúc nhiều đột biến.
Hiện nay, kỹ thuật lai phân tử là một trong những kỹ thuật được dùng để chẩn
đoán thay thế các phương pháp trên. Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân
tử ngược) được cải tiến trên cơ sở của kỹ thuật lai phân tử có thể phát hiện
cùng lúc được nhiều đột biến khác nhau trên cùng một gen. Kỹ thuật Reverse
hybridization đã được ứng dụng hiệu quả trong xác định đồng nhiễm
genotype virus sinh u nhú ở người (HPV). Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật
này chưa được áp dụng trong chẩn đoán bệnh Thalassemia. Đây là một quy
trình mới, có nhiều ưu điểm so với các phương pháp hiện đang được áp dụng,
vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Chẩn đoán trước sinh bệnh


Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization)”, với

mục tiêu:
1. Phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse
hybridization trong chẩn đoán trước sinh.
2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán
trước sinh bệnh Thalassemia.


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. Bệnh Thalassemia
1.1.1. Cấu tạo của Hemoglobin (Hb) và các gen tổng hợp chuỗi globin
Phân tử Hb cấu tạo bởi 4 chuỗi globin và 4 phân tử Hem, mỗi chuỗi
globin gắn với một phân tử Hem. Tùy theo các giai đoạn phát triển cá thể mà
globin gồm các chuỗi polypeptid khác nhau. Các chuỗi polypeptid đều có cấu
trúc từ các acid amin và được sắp xếp theo một thứ tự chặt chẽ. Ngoài ra cấu
trúc không gian của các chuỗi polypeptid này cũng rất quan trọng trong vai
trò đảm bảo chức năng vận chuyển khí của phân tử Hb [12].
Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả
Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptid ra
các loại: Zeta (ζ), epsilon (ε), gamma (γ ), alpha (α), beta (β), delta (δ) [13].
Các gen chi phối sự hình thành chuỗi ε, γ , δ, β nằm trên nhiễm sắc thể (NST)
số 11; các gen chi phối sự hình thành chuỗi ζ, α nằm trên NST số 16. Trong
giai đoạn phôi, Hb chủ yếu là Hb Gower I (ζ 2ε2), Hb Gower II (α2ε2) và Hb
Portland (ζ2γ 2). Trong giai đoạn thai, loại Hb chủ yếu là HbF (α2γ 2). Trong
giai đoạn trưởng thành, loại Hb chủ yếu là HbA 1 (α2β2) và một ít HbA2 (α2δ2).
Người trưởng thành có 97,5% HbA1, khoảng 2% HbA2 và khoảng 0,5% HbF.

Bảng 1.1. Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường

Loại Hb
Hb A1
Hb A2
Hb F
Hb Gower 1
Hb Gower 2
Hb Portland

Thành phần
globin
α2 β2
α 2 δ2
α 2 γ2
ζ2 ε 2
α2 ε2
ζ2 γ 2

Thời kỳ xuất hiện
Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường
Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường
Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi
Phôi thai 2 ÷ 3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai
Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1
Phôi thai 2 ÷ 3 tuần đầu

Số lượng acid amin trong chuỗi polypeptid đặc trưng cho từng loại
chuỗi, ví dụ: chuỗi α có 141 acid amin, chuỗi β gồm 146 acid amin. Trình tự
các acid amin trong chuỗi rất nghiêm ngặt, sự thay thế của acid amin này

bằng acid amin khác trong nhiều trường hợp thể hiện thành những bệnh của
Hb .

Hình 1.1. Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb

Ở người bình thường, số lượng chuỗi α globin và chuỗi β globin được
sản xuất cân bằng để tham gia cấu tạo phức hợp α2β2, tế bào máu của người
bình thường có thể tích tế bào khoảng 100 µm3.


Thalassemia là một dạng bệnh của Hb, trong đó chuỗi α globin giảm
hoặc không được tạo thành gọi là bệnh α-thalassemia, chuỗi β globin giảm
hoặc không được tạo thành gọi là bệnh β-thalassemia .
1.1.2. Bệnh α-thalassemia
α-thalassemia là bệnh di truyền alen lặn NST thường do đột biến gen α
globin nằm trên nhánh ngắn NST số 16 (16p13.3), gây giảm hoặc không tổng
hợp chuỗi α globin.

Hình 1.2. Vị trí gen α globin trên NST 16

(Nguồn: [15] )
Cụm gen α globin ở người dài khoảng 70kb, chứa 2 gen α globin: α1
(chiều dài 840bp, chứa 3 exon và 2 intron), và α2 (chiều dài 830bp, chứa 3
exon và 2 intron). Ngoài ra nó còn chứa một gen ζ2 phôi thai; 3 gen giả gồm
pseudo zeta1 (ψζ1), pseudo α1 (ψα1), pseudo α2 (ψα2) và một gen theta1 (θ).
Gen ζ2 hoạt động tổng hợp chuỗi ζ trong suốt giai đoạn phôi thai, gen α1 và
α2 chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi α globin, các gen còn lại không có chức
năng. Các gen chức năng sắp xếp theo trật tự 5’- ζ2 - α2 - α1 - 3’, được bao
quanh bởi các gen có biểu hiện mạnh như MPG, NPRL3 và Luc7L, được điều

tiết chủ yếu bởi vùng không mã hóa có tính bảo thủ cao (multispecies
conserved sequences, MSCR2) hay còn gọi là vùng HS-40 [16].

Hình 1.3. Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α

(Nguồn: Douglas R. Higg, 2013 [16] )
Gen α1 và α2 đều mã hóa các chuỗi α globin gồm 141 acid amin nhưng
do trình tự khởi động (promoter) của 2 gen khác nhau nên khả năng biểu hiện
của gen α2 mạnh hơn gen α1 từ 2 đến 3 lần. Vì vậy các đột biến xảy ra ở gen α2
thường có hậu quả nặng nề hơn những đột biến ở gen α1 [16], [17].
α-thalassemia là một trong những bệnh Hb phổ biến nhất, phân bố khắp
thế giới . Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu, chiếm tới 60 ÷ 90%
các nguyên nhân gây phù thai ở các nước Đông Nam Á . Trong đó, tỷ lệ
người mang gen đột biến mất đoạn dạng SEA ở Đông Nam Á là cao nhất, ở
Bắc Thái Lan là 14%, Nam Trung Quốc là 5,0 ÷ 8,8%, Hồng Kông là 4,5%,
Trung tâm Thái Lan là 3,7%, Bắc Đài Loan là 3,5% .


1.1.2.1. Cơ chế sinh bệnh
Bệnh α-thalassemia là bệnh Hb do thiếu hụt hoặc thiếu hoàn toàn chuỗi
α trong phân tử Hb . Đột biến gây bệnh α-thalassemia chủ yếu là các đột biến
mất đoạn, đột biến không mất đoạn ít gặp hơn. Cơ chế sinh bệnh cũng khác
nhau với từng loại đột biến.
Đến nay, hơn 300 loại đột biến trên vùng gen α globin đã được phát
hiện, bao gồm các đột biến mất đoạn lớn - mất đoạn cả 2 gen (mất 1 phần
hoặc toàn bộ cả 2 gen α), đột biến mất đoạn nhỏ - mất đoạn 1 gen (mất 1 phần
hoặc toàn bộ gen α1 hoặc gen α2) và đột biến điểm [4].
- Đột biến mất đoạn gen α-thalassemia: là nguyên nhân chủ yếu gây αthalassemia (~ 90%), bao gồm mất đoạn từ 1 đến 2 gen α globin.
+ Đột biến dẫn đến α+-thalassemia

Là đột biến mất đoạn ở 1 gen α gây giảm tổng hợp chuỗi α globin. Phổ
biến là các mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trong gen α. Cơ chế tạo ra
các mất đoạn này là do sự tái tổ hợp giữa các vùng tương đồng trên gen α.
Các gen mã hóa chuỗi α nằm trong 2 vùng tương đồng cao, các vùng đó được
chia thành các vùng: X, Y và Z, tách biệt nhau bởi các đoạn chèn nhỏ. Trong
quá trình phân bào của dòng tế bào mầm, sự trao đổi chéo không cân bằng sẽ
làm cho 1 NST bị mất 1 gen α và 1 NST có 3 gen α. Trao đổi chéo xảy ra ở
vùng Z, tạo ra 1 NST mất 1 đoạn gen dài 3.7kb và 1 NST có 3 gen α
(αααanti3.7). Tương tự, nếu trao đổi chéo xảy ra ở vùng X sẽ tạo nên 1 NST
mất 1 đoạn gen dài 4.2kb và 1 NST có 3 gen α (ααα anti4.2). Tần suất xuất
hiện NST có 1 gen α và 3 gen α trong tinh trùng là từ 1 ÷ 5 x 10 -5. Các mất
đoạn và lặp đoạn cũng có thể xảy ra trong các tế bào sinh dưỡng bởi các cơ
chế liên quan [16].


Hình 1.4. Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α

(Nguồn: Douglas R. Higgs, 2013 [16])
Bên cạnh các mất đoạn 1 gen phổ biến là 3.7kb (-α 3.7) và 4.2kb (-α4.2)
thì các mất đoạn toàn bộ 1 gen α (α1 hoặc α2) cũng đã được quan sát. Các mất
đoạn này được hình thành do sự tái tổ hợp giữa các vùng không tương đồng
trong cụm gen α. Mặc dù bị mất hẳn 1 gen α nhưng ảnh hưởng của loại đột
biến này đến hoạt động biểu hiện của gen α còn lại cũng tương tự như -α 3.7 và
-α4.2, điều này đã được khẳng định trong một số nghiên cứu theo dõi các đặc
điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các cá thể mất 1 phần gen α và các cá thể
mất toàn bộ 1 gen α [20].
+ Đột biến mất đoạn dẫn đến α0-thalassemia
Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại mất đoạn 2 gen bao gồm mất
1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn 2 gen α làm vắng mặt hoàn toàn
quá trình tổng hợp gen α. Cơ chế hình thành các mất đoạn này được cho là do

các tổ hợp sai lệch, các chuyển đoạn tương hỗ và quá trình cắt ngắn NST số
16. Phổ biến là các đột biến vùng Địa Trung Hải (Mediterranean, -- MED), đột


biến vùng Đông Nam Á (Southeast Asia, --SEA), đột biến người Philippin (-FIL

). Các đột biến mất đoạn khác như: -α5.2, -(α)20.5, mất đoạn 100 ÷ 200 kb lấy

đi toàn bộ cụm gen α globin cùng các gen khác (gen quy định 1 enzym sửa
chữa DNA và ức chế sự phân tách GDP từ Rho - Rho GDP, gen mã hóa
protein disulfide isomerase - PDI-R, và vùng điều hòa gen - promotor), mất
gen α1, gen θ, vùng trình tự xuôi chiều tính từ tâm động từ cụm gen α, mất
vùng điều tiết gen MCS-R nhưng còn lại 2 gen α, dù hiếm gặp hơn nhưng đều
dẫn đến α0-thalassemia. Đồng hợp tử các nhiễm sắc thể có đột biến α 0thalassemia sẽ gây hội chứng phù thai do Hb Bart’s. Dị hợp tử đột biến α 0thalassemia và α+-thalassemia sẽ gây bệnh HbH [16], [17].

Hình 1.5. Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin

(Nguồn: David H. K. Chui, 1998 )
- Đột biến không mất đoạn trong α-thalassemia
Bao gồm chủ yếu là các đột biến điểm trong vùng HS-40 và trong gen
α1 hoặc gen α2. Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liên
quan đến biểu hiện của gen α, ký hiệu α NDα hoặc ααND (ND: nondeletion, αND:
đột biến điểm trên gen α).


Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến T thành C ở bộ ba kết
thúc dịch mã. Đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (~ 4%). Đột
biến làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành codon CAA mã hóa cho
acid amin Glutamine vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã
kết thúc tiếp theo trong khung dọc mới dừng lại, kết quả là 1 chuỗi α globin bị

kéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử protein 141 acid amin ban đầu,
tạo nên Hb Constant Spring (HbCs). Đột biến này phá vỡ các vùng không
mã hóa làm phân tử ARN thông tin tạo thành không ổn định nên mức độ
biểu hiện yếu, chỉ khoảng 3% so với chuỗi α2 bình thường, vì vậy trong
một số trường hợp không thể phát hiện được bằng điện di phân tích các
thành phần Hb [16], [20].
Ngoài ra còn có các mất đoạn trong khung dọc (in-frame deletions), đột
biến dịch khung dọc (frame-shift mutations), đột biến vô nghĩa (nonsenses
mutations) dẫn tới sản xuất ra các protein bất thường (như mô tả ở bảng 1.2)
Bảng 1.2. Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường [16], [20]

Vị trí đột biến
T > G (codon 32)
T > C (codon 125)
G > A (codon 32)
G > C (codon 59)

Biến đổi protein
Methionin > Arginin
Leucin > Prolin
Methionin > Isoleucin
Glycin > Arginin

Huyết sắc tố
Hb Rotterdam
Hb Quong Sze
Hb Amsterdam
Hb Aadana

1.1.2.2. Quy luật di truyền và cơ chế di truyền

Quy luật di truyền: theo quy luật alen lặn trên NST thường.
Cơ chế di truyền: bệnh có thể do gen bệnh truyền từ bố, mẹ cho con
hoặc do đột biến mới phát sinh qua quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ đi vào
thế hệ con, sự biểu hiện bệnh ở thế hệ con còn tuỳ thuộc vào kiểu gen.
Tùy mức độ đột biến của gen mà có các thể bệnh khác nhau.


1.1.2.3. Phân loại các thể bệnh theo kiểu gen
Như đã biết có hai gen chi phối tổng hợp α globin. Như vậy cặp NST
số 16 có 4 alen chi phối tổng hợp α globin.
- Trong 4 alen có 1 alen không hoạt động, kiểu gen của người thuộc thể
bệnh này là: αα/α- (HBA1HBA2/HBA-) hoặc α-/αα (HBA-/HBA1HBA2),
người mang kiểu gen này thường không biểu hiện triệu chứng (silent carrier).
Thể bệnh này còn gọi là α-thalassemia 2.
- Trong 4 alen có 2 alen không hoạt động, loại này còn gọi là αthalassemia thể nhẹ hoặc α-thalassemia 1. Người bệnh α-thalassemia thể nhẹ
trong máu hồng cầu thể tích giảm, nhưng không có biểu hiện triệu chứng lâm
sàng. Người thuộc thể bệnh này có 2 kiểu gen là:
+ αα/-- (HBA1HBA2/--): cả hai gen α globin trên cùng một NST bị đột
biến, hai gen trên NST kia vẫn bình thường. Loại này chủ yếu gặp ở Đông
Nam Á.
+ α-/α- (HBA-/HBA-): trong hai NST, mỗi NST có một alen bị đột
biến, alen kia hoạt động bình thường. Thể bệnh này thường gặp ở những
người da đen, cá thể mang kiểu gen này do nhận được hai NST mang kiểu gen
α- từ hai người bệnh α-thalassemia 2.
- Người bệnh mang kiểu gen α-/-- (HBA-/--): có 3 trong 4 alen α
globin trên hai NST không hoạt động, chỉ có 1 alen α globin hoạt động.
Người bệnh mang kiểu gen này thường là con của cặp bố mẹ, mà một trong
hai bố mẹ mang thể bệnh α-thalassemia 2, còn người kia mang thể bệnh αthalassemia 1. Người bệnh này có mức độ thiếu máu vừa phải hoặc nặng,

trong máu có HbH (β4), hồng cầu thể tích trung bình thấp khoảng 50µm3
(bình thường là 100µm3), thể hiện bệnh ngay lúc mới sinh.
- Người bệnh không có gen α nào hoạt động, kiểu gen là (--/--), đây là
thể bệnh nặng nhất, kiểu gen này là hậu quả giao phối của hai cá thể αthalassemia 1 có kiểu gen là αα/-- (HBA1HBA2/--) hoặc cá thể có kiểu gen
α-/-- (HBA-/--) với cá thể có kiểu gen αα/-- (HBA1HBA2/--). α-thalassemia
thuộc thể bệnh này trong máu xuất hiện Hb Bart’s (γ 4). Hb Bart’s không có
khả năng vận chuyển oxy gây phù bào thai dẫn đến thai chết ngay trong giai
đoạn bào thai hoặc khi mới sinh.
Bảng 1.3. Kiểu gen và các thể bệnh α-thalassemia

Kiểu hình

Kiểu gen
HBA1HBA2/
HBA1HBA2
HBA-/
HBA1HBA2

Bình thường
Người mang gen α-thalassemia:
không có triệu chứng
α-thalassemia thể nhẹ: có triệu
chứng thiếu máu nhẹ
Bệnh HbH (β4): thiếu máu tan máu
hồng cầu nhỏ, lách to
Hb Bart’s (γ 4): phù thai, thường
chết trước sinh

hoặc

--/
HBA1HBA2
hoặc
-HBA/-HBA
--/-HBA
--/--

1.1.2.4. Phòng bệnh
Tư vấn di truyền trước hôn nhân để phát hiện người dị hợp tử cho lời
khuyên di truyền để hạn chế sinh ra những thể đồng hợp tử nặng. Chẩn đoán
trước sinh cũng là biện pháp quan trọng để hạn chế sinh con bị bệnh.


1.1.3. Bệnh β-thalassemia
Bệnh β-thalassemia là bệnh do đột biến gen HBB (Hemoglobin beta gen β globin) nằm trên nhánh ngắn NST số 11 (11p15.5). Gen HBB dài
1600bp, gồm 3 exon và 2 intron. β-thalassemia là một trong những bệnh
huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới . Ở Việt Nam, khi nghiên
cứu nguyên nhân thiếu máu ở trẻ em Việt Nam, Nguyễn Công Khanh và cộng
sự đã cho thấy bệnh β-thalassemia chiếm 49% các trường hợp thiếu máu tan
máu nặng và đứng hàng đầu trong các nguyên nhân gây thiếu máu do tan máu
ở trẻ em [23]. Bệnh β-thalassemia phổ biến ở các dân tộc ít người khu vực
miền núi và trung du phía bắc. Tỷ lệ người mang gen phân bố trong cả nước
và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ mang
gen bệnh rất cao ở các dân tộc ít người như: Mường (25%), Thái (16,6%),
Nùng, Sán dìu (14,3%), Pako (8,33%) , [25].

Hình 1.6. Vị trí gen β globin trên NST 11

(nguồn: [27])
Trẻ mắc β-thalassemia thể nặng gây hậu quả nghiêm trọng đến sự phát

triển cá thể và ảnh hưởng đến tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng [26].
Đặc biệt việc điều trị rất khó khăn và tốn kém, ít hiệu quả, thường tử vong
sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Vì vậy, việc phòng bệnh được đặt
ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh di truyền này. Tập


quán kết hôn cùng huyết thống là nguyên nhân chính lan truyền nguồn gen
bệnh và làm tăng tỷ lệ mắc bệnh gây ảnh hưởng đến nòi giống tộc người. Nên
việc phát hiện sớm người mang gen bệnh để tư vấn di truyền trước hôn nhân
là giải pháp quan trọng nhất trong việc phòng bệnh, từ đó làm giảm tỷ lệ mắc
bệnh β-thalassemia ở trẻ em.
1.1.3.1. Cơ chế sinh bệnh
Bệnh β-thalassemia gây nên do đột biến gen làm giảm hoặc mất chức
năng của gen β globin dẫn đến giảm hoặc không tổng hợp được chuỗi β
globin.
Trong bệnh β-thalassemia, chuỗi β globin bị thiếu hụt, chuỗi α globin
được sản xuất quá mức và hình thành dạng phức hợp Hb đồng nhất chỉ có một
loại chuỗi α (α4), những Hb này ở dạng không hoà tan và tủa trong những tế
bào máu dẫn tới tế bào hồng cầu bị phá huỷ ở tuỷ xương và ở lách. Cũng như
bệnh α-thalassemia, những tế bào hồng cầu trong bệnh β-thalassemia bị giảm
kích thước (50 ÷ 80 µm3) và số lượng.
Đột biến gen dẫn đến không tổng hợp, hoặc giảm tổng hợp chuỗi β
globin, thay vào đó là sự tăng tổng hợp các chuỗi γ và các chuỗi α để tạo
thành HbF (α2γ 2), loại bệnh này còn tăng cường tổng hợp các chuỗi δ để tạo
thành HbA2 (α2δ2),, vì vậy người bệnh có HbF và HbA 2 nhiều hơn người bình
thường.
Locus gen β globin nằm trên NST số 11, nếu cả hai gen β globin đều bị
đột biến mất chức năng hoàn toàn, không sản xuất được β globin, khi đó gọi
là β0-thalassemia. Nếu một hoặc hai gen β globin bị đột biến nhưng vẫn sản
xuất một số lượng nhỏ β globin, khi đó gọi là β+-thalassemia.

1.1.3.2. Quy luật di truyền
Bệnh di truyền theo quy luật alen lặn trên NST thường.
1.1.3.3. Một số dạng đột biến trên gen β globin
Hiện nay đã phát hiện trên 200 loại đột biến trên gen β globin , xếp
vào 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin làm mất chức
năng của gen β gây β0-thalassemia, và nhóm làm giảm số lượng chuỗi β
globin gây β+-thalassemia. Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bố
với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc.
Sau đây là cơ chế một số dạng đột biến thường gặp:
- Đột biến điểm tại vùng promoter: do thay thế nucleotid tại vị trí hộp TATA
hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi β globin chỉ còn 10% so với bình
thường.
- Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucleotid
trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA, UAG
hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạo
sản phẩm β globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào. Dạng đồng
hợp tử những đột biến này gọi là β0-thalassemia.
- Đột biến tại những dấu hiệu nối (splicing signals): quá trình cắt những
intron và nối các exon của gen β globin đòi hỏi các vị trí cho nối GT tại đầu 5’
của intron và vị trí nhận nối AG tại đầu 3’ của intron bình thường là đòi hỏi
cần thiết cho việc nối exon bình thường. Những đột biến ở vị trí cho nối GT
hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối exon, do đó không tạo
mARN β globin thuần thục và hậu quả không tạo ra sản phẩm β globin gọi là
β0-thalassemia.


Hình 1.7. Năm đột biến xẩy ra (đóng khung)
ở vị trí đầu của intron thứ nhất của gen β globin

(Nguồn: Trịnh văn Bảo, 2011 [14] )
Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối RNA
(Ribonucleic Acid) chính xác nhưng còn tổng hợp được β globin gọi là β+thalassemia.
-

Đột biến ở trong các exon: luôn tạo ra các bản sao mRNA (Messenger

Ribonucleic Acid) được lắp ghép không chính xác và dẫn tới β+-thalassemia.
- Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã
là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chất
tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein. Các đột biến điểm xẩy
ra tại vị trí AATAAA sẽ gây giảm tổng hợp β globin gây β+-thalassemia.
- Những đột biến khung xẩy ra ở các exon: do thêm vào hoặc mất đi một
hoặc vài nucleotid, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc mã di
truyền làm thay đổi sản phẩm β globin, ví dụ: thêm AG vào trước mã 145 của