Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn HBsAg sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virus B (HBV), một căn bệnh diễn biến thầm lặng với các
triệu chứng mơ hồ nhưng để lại các biến chứng nặng nề như xơ gan, ung thư
gan. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 2 tỷ người đã bị lây nhiễm
HBV và khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV mãn tính. Ước tính mỗi năm
sẽ có thêm từ 10-30 triệu ca nhiễm mới HBV và có khoảng 1 triệu người chết
mỗi năm do bệnh viêm gan B và các biến chứng của nó. Việt Nam nằm trong
vùng lưu hành cao, tỷ lệ viêm gan B trong quần thể từ 10-15% đặc biệt có
những vùng lên đến 20% [1, 2].
Được phát hiện bởi Blumberg vào năm 1965, kháng nguyên bề mặt của
virus viêm gan B đã được sử dụng như một dấu ấn của sự nhiễm virus viêm
gan B [3]. Kháng nguyên này được phát hiện bằng các phương pháp định
tính, định lượng. Xét nghiệm định tính và định lượng HBV được thực hiện
rộng rãi tại các phòng xét nghiệm từ công lập đến tư nhân, với các trang thiết
bị máy móc và hóa chất được cung cấp đa dạng. Tuy nhiên độ chính xác và độ
tin cậy của kết quả xét nghiệm nói chung và xét nghiệm HBV nói riêng là vấn
đề cần được quan tâm. Để đảm bảo vấn đề chất lượng xét nghiệm nói chung
và xét nghiệm HBV nói riêng, các phòng xét nghiệm bắt buộc phải xây dựng
cho mình một quy trình kiểm soát chất lượng bao gồm cả nội kiểm tra chất
lượng và ngoại kiểm tra chất lượng [4].
Nội kiểm tra chất lượng là các quy trình được cán bộ phòng xét nghiệm
thực hiện để giám sát liên tục và nhanh chóng quy trình xét nghiệm. Việc này
được tiến hành thường quy hàng ngày, việc giám sát thường được sử dụng là
dùng biểu đồ Levey-Jennings. Thực hiện tốt nội kiểm tra đánh giá chất lượng
giúp phòng xét nghiệm có một kết quả xét nghiệm chính xác hơn.


2

Chương trình đánh giá chất lượng phòng thí nghiệm từ bên ngoài giúp
cho các phòng thí nghiệm theo dõi chất lượng một cách có hệ thống ở mức độ
Quốc gia. Giúp cho nhà quản lý biết thực trạng của hệ thống và có các biện
pháp hỗ trợ kịp thời. Ngoài ra tham gia chương trình giúp cho các phòng thí
nghiệm phát hiện các lỗi thông thường, hạn chế sai sót trong các khâu của quá
trình xét nghiệm, nâng cao chất lượng xét nghiệm. Thông qua chương trình,
các phòng thí nghiệm tham gia tạo thành mạng lưới để trao đổi thông tin và
cập nhật các thông tin mới nhất về các vấn đề liên quan đến công tác xét
nghiệm (cập nhật các sinh phẩm, các hướng dẫn, quy định mới....). Bên cạnh
đó thông qua các báo cáo tổng kết cho từng vòng của chương trình cũng giúp
Bộ y tế xác định được mức độ tin cậy trong công tác xét nghiệm của các
phòng thí nghiệm từ đó có các chính sách phát triển phù hợp [5].
Các chương trình nội kiểm và ngoại kiểm đã được triển khai tại nhiều
quốc gia trên thế giới với các đơn vị cung cấp có uy tín cao như RCPA (Úc),
CLIA (Mỹ), BLQS (Thái Lan)… với đầy đủ các chương trình ngoại kiểm tra
chất lượng, đáp ứng đầy đủ nhu cầu của phòng xét nghiệm.
Trong điều kiện hiện nay của Việt Nam, các chương trình ngoại kiểm
đã từng bước được triển khai song còn bị hạn chế do nhiều yếu tố. Một trong
những yếu tố đó là các bộ mẫu chuẩn, chúng ta phải mua hoàn toàn của nước
ngoài nên giá thành còn cao. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài “Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn HBsAg sử dụng
trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm” với mục tiêu:
1.
2.

Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn xét nghiệm HBsAg.
Đánh giá chất lượng của mẫu huyết thanh chuẩn được sản xuất nhằm
ứng dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm.

3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Virus viêm gan B
1.1.1. Một số đặc điểm sinh học của HBV
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, một họ gây viêm gan cho nhiều loài
động vật. HBV là một virus DNA nhỏ với các đặc điểm về siêu cấu trúc, phân
tử, kháng nguyên và sinh học độc đáo, khác biệt với các họ virus đã được biết.
Các đặc điểm sinh học đáng chú ý là tính hướng cơ quan (tropism) nổi bật đối
với tế bào gan và có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (tình trạng người
mang mạn tính) [6]. HBV là một virus bền vững, nó có thể sống và gây nhiễm
trùng trong vòng 6 tháng ở điều kiện nhiệt độ phòng [7].
1.1.2. Hình thái học và cấu trúc của HBV


Hình thái học hạt virus hoàn chỉnh
HBV có 3 kiểu hạt trong máu của người nhiễm virus. Virus hoàn chỉnh

(virion, hạt Dane) có hình cầu, đường kính 42-45nm; các hạt cầu và các dạng
sợi nhỏ hơn có đường kính khoảng 22nm chứa các protein và lipit vỏ ngoài
HBsAg [6].

.
Hình 1.1: Các dạng HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử


4

Nguồn: />

Cấu trúc của HBV virion [6]
Dùng phương pháp nhuộm âm bản, virion hấp phụ vào các rây của kính

hiển vi điện tử và một cấu trúc hai vỏ của virion hiện rõ.

Hình 1.2: Cấu trúc của HBV virion
Nguồn: www.yanengbio.com/en/Product_view.asp?cp_id=72
- Vỏ protein bên ngoài hoặc màng bao kích thước 7nm, được tạo thành
bởi các kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein, lipid. Các chi tiết cấu trúc
bề mặt như núm hoặc gai như ở nhiều virus có màng bao khác không thấy có
trên HBV.
- Bên trong là hạt lõi hay còn gọi là capsit có đường kính 28-34nm. Vỏ
trong bao gói HBV DNA, có thành phần kháng nguyên HBcAg và một số
enzyme quan trọng như polymerase, protein kinase…
1.1.3. Thành phần cấu trúc kháng nguyên


5



Hạt Dane: Huyết thanh của người bị nhiễm trùng cũng chứa một số lượng ít
hơn những hạt kích thước khoảng 42nm. Đó là những virus còn nguyên vẹn



và có khả năng gây nhiễm [7].
HBsAg: Sự hiện hữu của HBsAg là bằng chứng đầu tiên của nhiễm HBV, nó

xuất hiện trước các bằng chứng về sinh hóa của bệnh gan [8]. Huyết thanh của
người mang virus nồng độ cao chứa một lượng khá lớn các hạt không gây
nhiễm là các protein HBs dư thừa (HBsAg). Đó là các hạt hình cầu hoặc hình
sợi. Các hạt hình cầu có đường kính 17-25nm, chiếm đa số; chúng có dạng
như là các túi nhỏ với thành dày độ 4nm và đường kính bên trong từ 1015nm. Các hạt hình sợi (hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20nm có chiều
dài thay đổi. Huyết thanh của người mang HBV với nồng độ virus huyết thấp
thường là các hạt cầu HBs và các sợi HBs rất ít hoặc không có. Hai cấu trúc



virus phụ này không chứa HBV DNA và vì thế không gây nhiễm [6].
HBcAg (các hạt lõi trong gan): Các hạt lõi HBV trống không có vỏ ngoài
thường được thấy trong nhân tế bào gan là nơi chúng được tổng hợp và dự trữ
(một số hạt lõi có thể được tổng hợp trong bào tương). Có hai loại hạt lõi: hạt



lõi trống không chứa DNA và hạt lõi đầy có chứa DNA[6].
HBeAg: Kháng nguyên này đại diện cho dạng tiết ra của HBcAg xuất hiện
trong quá trình ủ bệnh, giai đoạn tiền triệu và nhiễm trùng cấp. Xuất hiện sau
HBsAg 2-4 tuần, sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự
lây nhiễm. Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn
đến tăng khả năng viêm gan B mạn tính[6, 8].
1.1.4. Dịch tễ học HBV
Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế
giới, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung
thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan. Người ta ước tính trên thế
giới có hơn 50 triệu người nhiễm HBV mới xảy ra hàng năm [9].

6

Trên bản đồ dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dân số Việt
Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào
hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới, tỷ lệ có HBsAg
trong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên,
Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996) cho thấy nước ta là nước có
dịch HBV địa phương cao [1, 2].
Căn cứ vào tần suất nhiễm HBV, tỷ lệ nhiễm virus toàn bộ, độ tuổi
nhiễm virus và cách truyền bệnh chủ yếu, người ta chia thành 3 khu vực với 3
mức độ lưu hành rõ rệt: vùng nội dịch lưu hành cao, vùng nội dịch lưu hành
trung bình và vùng nội dịch lưu hành thấp [9].
- Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area)
Trong vùng dịch lưu hành cao có ≥ 8% người nhiễm HBV mạn và trong
huyết thanh của đa số người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm virus trước
đó. Những vùng này gồm đa số các nước châu Á, trong đó có Việt Nam (trừ
Nhật và Ấn Độ), châu Phi, Trung Đông, vùng châu thổ Amazon Nam Mỹ…
phơi nhiễm HBV trong các vùng dịch lưu hành cao có thể đạt đến 100% [9].
- Vùng nội dịch lưu hành trung bình (intermediate endemic area)
Trong vùng dịch lưu hành trung bình, tần suất của người nhiễm HBV
mạn từ 2-7% và 20-50% người lớn đã từng nhiễm HBV. Những vùng này
gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, miền Tây Á, Nhật, Đông Nam châu Âu
và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ. Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sống
trung bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20-60% [9].
-

Vùng nội dịch lưu hành thấp (low endemic area)
Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từng
nhiễm virus dưới 20%. Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc,
New Zealand. Tần suất của HBsAg từ dưới 0,1% ở Bắc Âu và 1% đến 5% ở

7

Nam châu Âu. Ở Mỹ, có từ 1 đến 1,25 triệu người mang HBV mạn tính, nhiều
người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [6].

Hình 1.3: Sự phân bố HBV trên thế giới
Nguồn: />1.1.5. Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị HBV
1.1.5.1. Con đường lây nhiễm


Lây truyền qua đường ngoài tiêu hoá do tiếp xúc với máu, các vật phẩm
của máu (dịch nhiễm virus)
Đây là con đường lây nhiễm thường gặp nhất, cả ở vùng dịch lưu hành
cao và thấp. Việc sàng lọc máu hoặc các chế phẩm máu để loại HBsAg và
không dùng dung môi là huyết thanh cho vacxin hầu như đã loại bỏ nguyên
nhân này ở các nước phát triển. Tuy nhiên, các bệnh nhân nhận các yếu tố
đông máu đậm đặc vẫn còn nguy cơ nhiễm virus do HBsAg ở mức độ thấp,
không phát hiện được[6].


Lây truyền qua đường sinh dục


8

Đây là con đường truyền nhiễm HBV đã được chứng minh và thường gặp
ở các nước phát triển nhất là trong nhóm đồng tính luyến ái. Ở đường lây nhiễm
này thì nguy cơ nhiễm HBV thường tỷ lệ thuận với số lượng bạn tình và với tình

trạng nhiễm giang mai trước đó. Sự kết hợp chặt chẽ với giang mai có thể do
tính chất gây loét của giang mai, giúp nhiễm HBV hiệu quả hơn [6].


Lây truyền từ mẹ sang con (truyền nhiễm chu sinh)
HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sinh hơn là lúc lây qua nhau

thai. Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tuỳ thuộc vào
hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở
mẹ [6].


Các đường lây truyền khác
Ngoài các đường lây nhiễm trên, HBV còn có thể lây nhiễm qua

nước bọt, tinh dịch hay lây nhiễm qua da nếu có tổn thương niêm mạc tại
vùng tiếp xúc với HBV[6].
1.1.5.2. Chẩn đoán viêm gan B


Chẩn đoán viêm virus B cấp
Các triệu chứng lâm sàng của viêm gan B thường mơ hồ, không đặc
hiệu như mệt mỏi, chán ăn, đau cơ…. dễ nhầm với các bệnh lý khác. Tuy
nhiên có một số điểm cần được chú ý khi chẩn đoán:
- Có tiền sử truyền máu hay các chế phẩm của máu, tiêm chích, quan hệ
tình dục không an toàn trong khoảng từ 4 tuần đến 6 tháng [6].
- Lâm sàng: có thể có các triệu chứng chán ăn, mệt mỏi, vàng da, tiểu ít
sẫm màu, đau tức vùng gan, nôn, buồn nôn, phân bạc màu... [6, 8].

9

- Thể vàng da kéo dài: Có các triệu chứng lâm sàng giống như thể điển
hình, kèm theo có ngứa. Tình trạng vàng da thường kéo dài trên 6 tuần, có khi
3-4 tháng [6, 8].
- Thể viêm gan tối cấp: Người bệnh có biểu hiện suy gan cấp kèm theo
các biểu hiện của bệnh lý não gan.
- Cận lâm sàng:
+ AST, ALT tăng cao (thường tăng trên 5 lần so với bình thường).
+ Bilirubin tăng cao, chủ yếu là Bilirubin trực tiếp.
+ HBsAg (+) hoặc (-) và anti-HBc IgM (+).


Chẩn đoán viêm virus B mạn
- HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+).
- AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng.
- Có bằng chứng tổn thương mô bệnh học tiến triển, xơ gan (được xác
định bằng sinh thiết gan hoặc đo độ đàn hồi gan, chỉ số APRI) mà không do
căn nguyên khác.
1.1.5.3. Chỉ định điều trị
Chỉ định điều trị bằng thuốc kháng virus khi:
- ALT tăng trên 2 lần giá trị bình thường hoặc có bằng chứng xác nhận
có xơ hóa gan tiến triển/xơ gan bất kể ALT ở mức nào.
- HBV-DNA ≥ 105 copies/ml (20.000 IU/ml) nếu HBeAg (+) hoặc
HBVDNA ≥ 104 copies/ml (2.000 IU/ml) nếu HBeAg (-).
1.1.5.4. Theo dõi điều trị
Cần tư vấn cho bệnh nhân những nguy hiểm của HBV cũng như các giai
đoạn của điều trị nhằm đạt kết quả điều trị tốt nhất. Một số điểm cần lưu ý:
- Tuân thủ điều trị: cần tư vấn cho bệnh nhân về lợi ích của việc tuân
thủ điều trị và các biện pháp hỗ trợ tuân thủ điều trị.

- Tháng đầu tiên sau khi bắt đầu điều trị: theo dõi AST, ALT, creatinine máu.


10

- Sau mỗi 3-6 tháng trong quá trình điều trị: theo dõi AST, ALT,
creatinine máu, HBeAg, Anti-HBe, HBV-DNA, có thể định lượng HBsAg.
- Nếu điều trị IFN hoặc Peg IFN: theo dõi công thức máu, glucose máu,
ure máu, creatinin máu, chức năng tuyến giáp để phát hiện tác dụng không
mong muốn của thuốc.
- Sau khi ngưng điều trị: Xét nghiệm sau mỗi 3 - 6 tháng: AST, ALT,
HBsAg, HBeAg, anti-HBe, HBV DNA để đánh giá tái phát [6, 8].
1.1.5.5. Biện pháp phòng ngừa


Miễn dịch thụ động
Globulin miễn dịch (Ig – Immunoglobulin) có kháng thể kháng HBs

với hiệu giá cao (Hepatitis B immune globuline, HBIG) có khả năng gây miễn
dịch thụ động giúp ngăn chặn viêm nhiễm cấp tính và mạn tính nếu chúng ta
sử dụng HBIG ngay trong vòng 7 ngày sau phơi nhiễm. HBIG cũng có khả
năng bảo vệ bệnh nhân khỏi tình trạng tái nhiễm HBV sau quá trình cấy ghép
gan. HBIG cũng được chỉ định cho những trẻ sơ sinh của những bà mẹ mang
HBsAg dương tính [8].


Miễn dịch chủ động:
Miễn dịch chủ động có khả năng tạo miễn dịch cao. Vaccine VGB có

thể được sản xuất từ huyết tương của người mang HBsAg dương tính hoặc

bằng phương pháp tái tổ hợp sử dụng động vật có vú hoặc nấm men mang
plasmid có chứa HBs hoặc chứa gen preS1 và preS2. Gần đây, các nghiên cứu
dùng kết hợp tiêm chủng chủ động và thụ động cho thấy hiệu quả lên tới 90%.
HBIG cùng với vacxin được khuyến cáo dùng trong tất cả các trường hợp như
thế nhất là đứa trẻ của bà mẹ mang HBsAg (+) [6].
1.1.5.6. Các xét nghiệm chẩn đoán HBV


11

Để chẩn đoán viêm gan B cấp và mạn tính, người ta đã áp dụng các thử
nghiệm phát hiện HBsAg và các kỹ thuật miễn dịch học để phát hiện kháng
nguyên và kháng thể của virus. Bên cạnh đó kỹ thuật kính hiển vi điện tử có
thể được sử dụng để xác định HBV trong máu hoặc trong sinh thiết các tổ
chức gan.


Phương pháp trực tiếp
Là phương pháp phát hiện hạt virus (hạt Dane) hoặc các thành phần cấu

trúc của virus. Cụ thể là phát hiện: hạt virus, DNA của virus, kháng nguyên
HBsAg, kháng nguyên HBeAg, kháng nguyên HbcAg trong tế bào gan (kết
hợp với làm sinh thiết gan).
Phương pháp gián tiếp (phương pháp huyết thanh học)
Ngưng kết hồng cầu thụ động: kháng nguyên hòa tan được hấp phụ lên bề mặt


-

những nền mượn như hạt bentonit, hạt latex nhưng thông dụng nhất là hồng

cầu cừu. Những hạt này ngưng kết với kháng thể nhờ sự hiện diện của kháng
nguyên dính vào bề mặt chúng. Những hạt này khá lớn nên phản ứng dương
tính có thể khám phá bằng mắt thường. Nếu dùng hồng cầu làm giá mang kháng
nguyên thì phản ứng được gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động. Để phát
hiện kháng nguyên, người ta gắn kháng thể lên nền mượn. Khi kháng thể gặp
kháng nguyên đặc hiệu, hiện tượng ngưng kết sẽ xuất hiện. Loại này được gọi
là phản ứng ngưng kết thụ động ngược, phản ứng ngưng kết thụ động nhạy
hơn phản ứng ngưng kết trực tiếp nhờ hình thể tương đối lớn của những hạt
mang kháng nguyên và độ đặc hiệu cao hơn vì có thể tinh chế được các kháng
-

nguyên hoặc kháng thể trước khi gắn lên nền mượn [10, 11].
Miễn dịch gắn enzym (ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay): Kỹ
thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấm
polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đối
ứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn với
kháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu. Cơ chất của


12

enzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc
-

kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm [12, 13].
Miễn dịch huỳnh quang: những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein,
Rhodamin có thể kết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu
của kháng thể. Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên
và phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh
quang. Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác

dụng với kháng nguyên (phương pháp trực tiếp) hoặc kháng thể được cho tác
dụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người
liên hợp với Fluorescein. Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồi
cho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó
nhỏ một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh
quang (phương pháp gián tiếp) [14].
- Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang: Kỹ thuật này được thực
hiện trên máy tự động hoàn toàn, nguyên lý như sau:
+ Dùng kháng thể đã biết để phát hiện kháng nguyên chưa biết và ngược lại.
+ Dùng hệ thống phát hiện là điện hóa phát quang để nhận biết sự hiện
diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
Kỹ thuật bao gồm các phản ứng:
+ Phản ứng miễn dịch: kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể được
đánh dấu bằng ruthenium. Sử dụng sự tương tác của biotin và streptavidin cùng
với các vi hạt có từ tính để gắn phức hợp kháng nguyên-kháng thể (đánh dấu
bằng ruthenium) vào pha rắn.


13

+ Phản ứng điện hoá phát quang: để phát hiện sự hiện diện của phức
hợp kháng nguyên- kháng thể đánh dấu bằng ruthenium. Dưới tác dụng của
điện, phức hợp ruthenium phản ứng với tripropylamine (TPA) và phát quang.
Kết quả phản ứng điện hóa phát quang là tín hiệu ánh sáng được máy
ghi nhận và suy ra nồng độ ban đầu của kháng nguyên hoặc kháng thể có
trong mẫu thử. Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng chất đánh
dấu là ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì
vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh,
trong khoảng 18 phút. Các kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn biotin và
chất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủ streptavidin được ủ trong hỗn hợp

phản ứng. Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium
tác dụng với prophylamine, chuyển sang trạng thái kích thích, và tín hiệu
phát quang được hình thành. Tín hiệu ánh sáng được đo và kết quả xét
nghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập. Một
đường cong quy chiếu được ghi nhớ trong một thanh đã mã hóa các thuốc
thử và được xác định một lần nữa bởi máy phân tích tự động bởi một
đường chuẩn ở hai điểm [10, 11, 15].
-

Kỹ thuật sắc kí miễn dịch: Phức hợp kháng kháng thể gắn chất màu được
phân bố đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên đặc thù của vi sinh vật được
gắn cố định tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể
lên bản sắc ký, kháng thể đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với
kháng kháng thể gắn màu, phức hợp miễn dịch kháng thể - kháng kháng thể
gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do
kháng thể kết hợp với kháng nguyên vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng”
hiện màu. Nếu trong huyết thanh không có kháng thể đặc hiệu, ở “vạch phản


14

ứng” kháng nguyên không thể giữ được kháng kháng thể gắn màu, vì vậy

-

không hiện màu [16, 17].
Nhận định kết quả:
Kết quả định tính: Kết quả định tính cho biết trong mẫu xét nghiệm có hay
không có kháng thể hoặc kháng nguyên. Thông thường kết quả các phản ứng
được ký hiệu bằng các mức độ dương tính (+, + +, + + +) , không rõ dương

tính hay âm tính (+/-), âm tính (-). Các ký hiệu này tuy có tiêu chuẩn quy định
nhưng phụ thuộc vào chủ quan của người đọc kết quả [18].

-

Kết quả định lượng: Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm trùng qua việc xác
định kháng thể trong huyết thanh được gọi là chẩn đoán huyết thanh học. Kết
quả định lượng trong chẩn đoán huyết thanh cho biết hiệu giá kháng thể.
Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao hay thấp được đánh giá qua hiệu giá
kháng thể.

-

Ranh giới hiệu giá: Là ranh giới giữa hiệu giá kháng thể bình thường và hiệu
giá bệnh lý. Liên cầu thường cư trú ở hầu hết mọi người nên trong huyết
thanh của hầu hết mọi người đều có kháng thể kháng streptolysin O (ASO).
Vì thế người ta xem 1/200 (200 đơn vị /ml), là hiệu giá ranh giới. Chỉ khi nào
trong huyết thanh có 400 đơn vị/ml trở lên mới là bệnh lý.

-

Kết quả dương tính giả: Hay gặp lúc làm phản ứng huyết thanh học vì kỹ
thuật và trong một vài trạng thái sinh lý bệnh lý của người bệnh.

-

Kết quả âm tính giả: Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng âm tính giả
như: các thành phần tham gia phản ứng không được chuẩn độ, lượng kháng
thể quá nhiều so với kháng nguyên…Để khắc phục hiện tượng dương tính giả,
âm tính giả phải chuẩn độ các thành phần tham gia phản ứng, đảm bảo đúng

các điều kiện của phản ứng (dung dịch đệm, nhiệt độ, thời gian ủ...) và phải
luôn luôn có chứng dương, chứng âm [16].
1.1.5.7. Ý nghĩa xét nghiệm HBsAg định lượng


15

Xét nghiệm định lượng HBsAg là một dấu ấn sinh học quan trọng để
theo dõi diễn biến tự nhiên và dự đoán hiệu quả điều trị viêm gan B mạn.
Mức độ HBsAg huyết thanh ở bệnh nhân có HBeAg dương tính có khuynh
hướng cao hơn ở bệnh nhân có HBeAg âm tính. Các bệnh nhân viêm gan B
mạn với genotype D ở trạng thái HBeAg âm tính có số lượng HBV DNA thấp
(<2000 IU/mL), HBsAg < 1000 IU/mL và ỏ bệnh nhân nhiêm HBV genotype
B hoặc C có HBsAg < 100 IU/mL được xác định là những người mang virus
không hoạt động (inactive carriers) [19]. Trong quá trình điều trị, qHBsAg
được sử dụng một cách hiệu quả để đánh giá đáp ứng điều trị HBV của các
thuốc tiêm như Inteferon (IFN), peginteferon (PEG-IFN) hoặc của các thuốc
uống tương tự nucleos(t)ide (NA). qHBsAg cũng có thể được áp dụng để phát
hiện các bệnh nhân cần tiếp tục điều trị, các bệnh nhân có triển vọng thải sạch
HBsAg và các bệnh nhân ít có khả năng tái phát để dừng hoặc thay thế phác
đồ điều trị. Việc định lượng HBsAg giúp các nhà lâm sàng có được các quyết
định điều trị đúng cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả điều trị cũng như tránh
được các diễn biến xấu của nhiễm HBV [20].
1.2. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm
1.2.1. Một số khái niệm về chất lượng
• Chất lượng (Quality): Là mức độ của tập hợp các đặc tính vốn có

đáp ứng các yêu cầu.
• Quản lý chất lượng (Quality Management-QM): Là một loạt các

hoạt động có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về
chất lượng. Việc định hướng và kiểm soát về chất lượng một tổ chức
nói chung bao gồm: chính sách chất lượng; mục tiêu chất lượng; hoạch
định chất lượng; kiểm soát chất lượng; đảm bảo chất lượng và cải tiến
chất lượng.


16

• Kiểm soát chất lượng (Quality Control-QC): Các hoạt động và kỹ

thuật được sử dụng nhằm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chất lượng.
• Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): Tất cả các hoạt

động hệ thống được lập kế hoạch thiết yếu nhằm cung cấp độ tin cậy chắc
chắn rằng sản phẩm hoặc dịch vụ thỏa mãn các yêu cầu chất lượng.
• Đánh giá chất lượng bên ngoài (External Quality Assessment-

EQA): còn được gọi ngoại kiểm hay thử nghiệm thành thạo phòng thí
nghiệm. Việc xác định hoạt động thử nghiệm của phòng thí nghiệm
bằng so sánh liên phòng.
• So sánh liên phòng: Việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử

nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự
được thực hiện bởi hai hay nhiều phòng thí nghiệm theo các điều kiện
xác định trước [21, 22].
1.2.2. Giới thiệu về hệ thống đảm bảo chất lượng
Hệ thống quản lý chất lượng (HTQLCL) do Viện tiêu chuẩn phòng thí
nghiệm và lâm sàng CLSI Hoa Kỳ đề xuất, hệ thống này bao gồm 12 thành
tố cơ bản bao trùm tất cả các hoạt động của phòng thí nghiệm [ 23 , 24 ] .

Mô hình của HTQLCL hoàn toàn phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế
(International Organization for Standardization -ISO) ISO 90001/ISO 15189/ISO
17025. Chính vì vậy, Tổ chức Y tế thế giới đã phối hợp với CLSI và CDC
Hoa Kỳ ban hành cuốn cẩm nang Quản lý hệ thống phòng thí nghiệm để các
phòng thí nghiệm của các nước trên thế giới có thể và áp dụng nhằm nâng cao
chất lượng [25].


17

Hình 1.4: Mô hình quản lý chất lượng [25]
Tổ chức: Để có hệ thống quản lý chất lượng có chức năng tốt,
phòng thí nghiệm phải có cơ cấu tổ chức, quản lý nhằm thực hiện được các
chính sách về chất lượng.
Nhân sự: Nguồn lực của phòng thí nghiệm là vấn đề quan trọng
nhất, đó là những nhân viên đủ năng lực, năng động, có tầm nhìn và điều
quan trọng phải có sự khích lệ thúc đẩy các cán bộ tận tâm với công việc và
tuân thủ các quy định.
Thiết bị: Thiết bị phải phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm, các thiết bị
đảm bảo hoạt động tốt và có bảo dưỡng định kỳ.
Mua sắm và kiểm kê: Quản lý về cung ứng sinh phẩm và vật tư
phòng thí nghiệm nhằm đảm bảo các sinh phẩm và vật tư có chất lượng tốt,
sử dụng đúng mục đích.
Kiểm soát quá trình: Bao gồm nhiều yếu tố để đảm bảo chất lượng của
phòng thí nghiệm trong quá trình thực hiện xét nghiệm. Những yếu tố này
bao gồm kiểm soát chất lượng, thẩm định và công nhận.


18

Quản lý thông tin: Các thông tin phòng thí nghiệm cần được quản lý
cẩn thận đảm bảo sự chính xác và bí mật.
Tài liệu và hồ sơ: Tài liệu và hồ sơ luôn được lưu giữ cẩn thận để
đảm bảo sự chính xác và có thể đánh giá được.
Quản lý sự cố: Phòng thí nghiệm luôn cần một hệ thống để phát hiện
những vấn đề và sự cố, hành động khắc phục, tìm hiểu nguyên nhân và đưa ra
những hành động để không tái diễn các sự cố.
Đánh giá: Quá trình đánh giá chính là công cụ để kiểm soát việc
thực hiện của phòng thí nghiệm và so sánh với các chuẩn mực để đánh giá.

Cải tiến quá trình: Mục đích đầu tiên của HTQLCL là sự cải tiến liên
tục các quá trình trong phòng thí nghiệm và sự cải tiến được thực hiện một
cách hệ thống.
Dịch vụ khách hàng: Đảm bảo khách hàng nhận được các dịch vụ
cần thiết cho họ.
Cơ sở vật chất và an toàn: Cơ sở vật chất và an toàn bao gồm nhiều vấn
đề như: An ninh, An toàn, sức khỏe, môi trường làm việc [4, 5, 26, 27].
1.2.3. Sơ đồ hoạt động của phòng xét nghiệm


19

Hình 1.5: Sơ đồ hoạt động của phòng thí nghiệm [25]
Hoạt động của một phòng thí nghiệm được chia thành 3 giai đoạn:
Giai đoạn trước xét nghiệm, giai đoạn trong xét nghiệm và giai đoạn sau
xét nghiệm.
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm
 Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho việc làm xét nghiệm, chuẩn bị bệnh nhân,

lấy mẫu bệnh phẩm, chuẩn bị thuốc thử... Trong giai đoạn này các cán bộ cần
đảm bảo lấy và bảo quản bệnh phẩm đúng quy cách (dụng cụ khô, sạch,
dùng chất chống đông thích hợp, ghi đúng tên bệnh nhân trên ống máu, gửi
kịp thời đến phòng xét nghiệm …). Những sai sót trong quá trình lấy và
bảo quản bệnh phẩm sẽ dẫn đến sai sót trong kết quả xét nghiệm như lấy
máu vỡ hồng cầu, đưa m ẫ u máu đến phòng thí nghiệm c h ậ m sẽ làm
nồng độ glucose trong máu giảm (mỗi giờ bị giảm 17% do hồng cầu tiêu
thụ glucose). Ngoài ra đối với một số xét nghiệm việc biến động sinh lý,
biến động giữa các cá thể như di truyền, tuổi tác, giới tính... hay biến động
trong bản thân cá thể như chế độ ăn uống, vận động, nhịp độ sinh học...,


20

biến động do tình trạng bệnh, biến động do lấy mẫu như vị trí lấy mẫu, thời
gian lấy mẫu, điều kiện bảo quản, vận chuyển.... cũng đều ảnh hưởng đến kết
quả xét nghiệm [4, 21, 22].
 Giai đoạn xét nghiệm
Trong giai đoạn này việc biến động đối với kỹ thuật phân tích ảnh
hưởng nhiều đến kết quả xét nghiệm. Đó là việc biến động tại các cơ sở xét
nghiệm do sai sót của các thiết bị và kỹ thuật, sai số trong phòng thí nghiệm
hoặc trình độ tay nghề của cán bộ. Những sai sót trong giai đoạn xét nghiệm
thường xảy ra khi các đơn vị không có quy trình chuẩn hoặc có nhưng
không tuân thủ cũng như các trang thiết bị không được hiệu chỉnh định
kỳ. Vì vậy, giai đoạn này phòng thí nghiệm cần đảm bảo thực hiện xét
nghiệm theo quy trình chuẩn thức phù hợp, nhằm đạt được kết quả với độ
chính xác cao, đáp ứng yêu cầu xét nghiệm. Quy trình thực hiện xét nghiệm
phải có tính chuẩn thức, được công nhận và được cập nhật. Các quy trình
phải được viết bằng ngôn ngữ dễ hiểu đối với nhân viên, theo mẫu quy
định và luôn được để sẵn trên bàn làm việc để tiện tham khảo. Bên cạnh

đó việc đảm bảo chất lượng xét nghiệm cần được thực hiện thông qua việc sử
dụng các mẫu nội kiểm tra và tham gia các chương trình ngoại kiểm tra và
định kỳ hiệu chỉnh các trang thiết bị [4, 21, 22].
 Giai đoạn sau xét nghiệm
Sau khi đã hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá và ghi nhận kết quả,
gửi trả kết quả đến nơi yêu cầu xét nghiệm là rất quan trọng. Việc vào hồ sơ
xét nghiệm và trả kết quả cần tránh sai sót và chậm trễ, gây tổn hại đến
uy tín của phòng thí nghiệm. Trả lời kết quả xét nghiệm cần đảm bảo đủ
thông tin và được lưu trữ ở phòng thí nghiệm để tiện tham khảo hoặc tra
cứu khi cần thiết [4, 21, 22].
1.2.5. Các sai số trong phòng xét nghiệm


21

Trong quá trình tiến hành xét nghiệm không tránh khỏi những sai số
ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. có thể chia thành các loại sau:
• Sai số thô bạo: thường do lỗi của nhân viên làm xét nghiệm trong

quá trình xử lý mẫu, sử dụng pipet, pha hoá chất thuốc thử, không
tuân thủ đúng qui trình thao tác, nhầm lẫn dung dịch thuốc thử, tính
toán sai…
• Sai số ngẫu nhiên: khi ta tiến hành làm một xét nghiệm trong điều

kiện như nhau và lặp lại nhiều lần thì kết quả xét nghiệm không thể
cho giá trị như nhau mà có sự phân tán nhiều hoặc ít. Sai số này
thường do yếu tố con người, máy móc thiếu bảo dưỡng và nhiễm
bẩn. Muốn hạn chế sai số này cần trang bị máy có độ chính xác
cao và hoá chất có chất lượng tốt, chú ý bảo dưỡng kiểm tra máy
móc, thuốc thử.

• Sai số hệ thống: là các sai số lặp đi lặp lại trong cách lần thực

hiện. Nguyên nhân gây ra sai số hệ thống có thể do máy móc,
dụng cụ, hóa chất… dẫn đến kết quả có xu hướng luôn thấp hơn
hoặc luôn cao hơn so với trị số mong muốn.
Các sai số trên đặc biệt là sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống liên
quan chặt chẽ đến độ chính xác và độ xác thực [4].
1.2.6. Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm
1.2.6.1. Khái niệm nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm
Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm (IQC – Internal Quality Control),
gọi tắt là nội kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hằng ngày trong nội bộ
một phòng xét nghiệm, được thực hiện bởi nhân viên của phòng xét nghiệm
nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm, từ
đó đi đến quyết định liệu kết quả xét nghiệm có đủ tin cậy trước khi trả cho
bác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân. Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm là một
phần của kiểm tra chất lượng (QC – Quality Control) nhằm góp phần vào
công tác bảo đảm chất lượng xét nghiệm [4].


22

1.2.6.2. Các thông số thống kê dùng trong nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm
Phòng xét nghiệm cần tự thiết lập các chỉ số thống kê: trung bình, SD,
CV… và giới hạn kiểm soát để đánh giá chất lượng tương ứng với từng
phương pháp, thiết bị xét nghiệm. Đó là vì khoảng giới hạn kiểm soát được
các nhà sản xuất đưa ra thường khá rộng và không phù hợp với thực tế của
phòng xét nghiệm, bên cạnh đó còn có sự khác nhau về phương pháp thiết bị
của phòng xét nghiệm và nhà sản xuất. Do đó, để đảm bảo chính xác nội kiểm
tra chất lượng xét nghiệm, mỗi một phòng xét nghiệm cần tự xây dựng cho
mình một hệ thống chỉ số riêng. Những thông số được sử dụng để đánh giá độ

chính xác: Giá trị trung bình (), độ lệch chuẩn (SD), hệ số phân tán (CV%),
công thức tính như sau [28]:
Giá trị trung bình: tính theo công thức

=
Trong đó:

- : trị số trung bình
- xi : trị số thu được của một lần thực nghiệm
- n: tổng số lần thực nghiệm

Trị số trung bình là chỉ số thống kê mô tả xu hướng trung tâm của sự
phân bố của một dãy số liệu, biểu thị trị số tiêu biểu cho dãy số liệu. Bất kỳ sự
thay đổi trong tính chính xác chẳng hạn như sự thay đổi có hệ thống hoặc độ
lệch có thể được phản ánh trong sự thay đổi của giá trị trung bình, điều đó sẽ
được thể hiện bởi sự thay đổi của sự phân bố các kết quả kiểm tra [29].
Độ lệch chuẩn SD:
n

SD =

∑ (x
i =1

i

− X) 2

n −1

với n < 30.


23

n

SD =

∑ ( x − X)
i =1

2

i

n

với n > 30.
Trong đó:

- x1, x2,..,xn là giá trị thực nghiệm
- là giá trị trung bình
- n: số lượng các giá trị thực nghiệm.

Độ lệch chuẩn là chỉ số thống kê mô tả sự phân tán của một dẫy số liệu,
phản ánh trung bình khoảng cách của số liệu so với trị số trung bình. Trong
khi giá trị trung bình là chỉ số mô tả xu hướng trung tâm, do đó liên quan đến
độ chính xác hoặc sai số hệ thống thì độ lệch chuẩn lại là giá trị đo lường
chiều rộng của sự phân bố và liên quan đến độ phân tán hoặc sai số ngẫu

nhiên. Độ lệch chuẩn càng lớn thì dải phân bố càng rộng, sai số ngẫu nhiên
càng lớn và phương pháp càng thiếu chính xác. Độ lệch chuẩn càng nhỏ, dải
phân bố hẹp, sai số ngẫu nhiên nhỏ hơn và độ chính xác cao hơn [29].
Hệ số biến thiên (CV – Coeficient of variation)

CV(%) =
Trong đó:

- CV là hệ số biến thiên (%)
- SD là độ lệch chuẩn
- là giá trị trung bình

Độ lệch chuẩn thường thay đổi theo nồng tức là nồng độ càng lớn thì độ
lệch chuẩn càng lớn. Khi đó cần dùng hệ số biến thiên để đánh giá độ lệch
chuẩn ở mỗi mức nồng độ quan tâm. Hệ số biến thiên phản ánh tỉ số giữa độ
lệch chuẩn và giá trị trung bình, nó cung cấp cách đánh giá hiệu năng phương
pháp tốt hơn ở các khoảng nồng độ khác nhau [29].
1.2.6.3. Một số quy tắc và biểu đồ dùng trong nội kiểm
Biểu đồ Levey - Jennings:


24

Biểu đồ Levey - Jennings là biểu đồ kiểm soát chất lượng quan trọng
nhất được sử dụng trong phòng xét nghiệm. Nó có thể dùng để nội kiểm tra
hoặc ngoại kiểm tra chất lượng đều tốt. Biểu đồ Levey - Jennings giúp phát
hiện các loại sai số (sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống). Biểu đồ Levey Jennings được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1952 bởi S.Levey và E.
Jennings [23]. Biểu đồ Levey - Jennings gồm có:
- Một đường ở giữa biểu đồ tương ứng với giá trị trung bình của các kết
quả xét nghiệm.

- Hai đường ngang ở trên và dưới của đường trung bình tương ứng với
đường giới hạn tin cậy trên ( + 2SD) và đường giới hạn tin cậy dưới ( − 2SD).
- Hai đường ngang trên và dưới của giới hạn tin cậy là đường giới hạn
báo động trên ( + 3SD) và đường giới hạn báo động dưới ( − 3SD) [29].
Quy tắc Westgard và QC đa quy tắc
Quy tắc Westgard được Jame Westgard đề nghị sử dụng. Năm 1981,
ông đã công bố trên tạp chí Hóa sinh lâm sàng một đề tài về kiểm tra chất
lượng phòng xét nghiệm, ông đưa ra quy tắc để đánh giá kết quả nội kiểm dựa
trên biểu đồ kiểm soát chất lượng Levey Jennings [28].
QC đa quy tắc (Multirule QC) sử dụng kết hợp các tiêu chí quyết định
hoặc các quy tắc kiểm soát để quyết định xem lần chạy phân tích là trong giới
hạn hay ngoài giới hạn kiểm soát. Chương trình QC đa quy tắc sử dụng phối
hợp các quy tắc kiểm soát khác nhau để xét tính chấp nhận được hay không
của lần chạy phân tích [29].
Một số quy tắc Westgard để kiểm định thông dụng nội kiểm tra chất
lượng xét nghiệm được thể hiện ở hình dưới đây


25

Hình 1.6: Các quy luật Westgard thông dụng
( />Trong đó
Luật
12s
13s

22s

R4s

41s
10x

Giải thích

Lỗi

Giá trị của một mẫu chứng nằm trên hoặc dưới
RE/SE
2SD.
Giá trị của một mẫu chứng nằm trên hoặc dưới
RE
3SD.
Giá trị của hai mẫu chứng nằm trên hoặc dưới 2SD
(các giá trị liên tục của cùng một mẫu chứng (qua
SE
các lần chạy), trong cùng một lần chạy (qua các
mẫu chứng khác nhau).
Một giá trị của mẫu chứng 1 nằm trên 2SD và một
giá trị mẫu chứng 2 nằm dưới 2SD trong cùng một RE
lần chạy.
4 giá trị liên tục của mẫu chứng nằm trên hoặc
dưới 1SD (trong cùng một chất chứng hoặc các
SE
mẫu chứng khác nhau).
10 giá trị liên tục của mẫu chứng nằm về một phía
SE
của giá trị trung bình.

Chú thích: Lỗi hệ thống (SE: Systematic Error)

Hành
động
Cảnh
báo
Loại bỏ

Loại bỏ

Loại bỏ

Loại bỏ
Loại bỏ