Nghiên cứu sản xuất starter của nấm Mucoz và ứng dụng trong sản xuất chao phần 1

-1-
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển cuộc sống con người ngày càng
được nâng cao thì nhu cầu về thực phẩm không dừng lại ở ăn ngon mà còn phải
an toàn và dinh dưỡng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các sản phẩm và
phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm đáp ứng nhu cầu trên là cấp thiết.
Chao là sản phẩm được sử dụng rất phổ biến thì vấn đề chất lượng an toàn
thực phẩm của chao c
ũng được đặt lên hàng đầu.
Ở Việt Nam, nhìn chung việc sản xuất chao vẫn chưa phát triển thành quy
mô công nghiệp. Hầu hết phần nhiều vẫn sản xuất theo lối thủ công với những
thiết bị đơn giản, nơi sản xuất không hợp vệ sinh, sử dụng nguồn nguyên liệu
không rõ nguồn gốc, chế biến đơn sơ, sử dụng mốc chao tự nhiên,….Theo cách
này, chất lượ
ng sản phẩm không thể kiểm soát được và không ổn định, sự xâm
nhập của vi sinh vật sẽ làm hỏng sản phẩm và sinh độc tố, cuối cùng làm thay
đổi giá trị dinh dưỡng và hương vị sản phẩm, không đem lại hiệu quả kinh tế.
Chính vì vậy việc nghiên cứu sản xuất viên mốc chao và ứng dụng vào sản
xuất của chúng tôi với đề tài : “Nghiên cứu starter của nấm mốc Actinomucor
elegans và bướ
c đầu ứng dụng trong sản xuất chao với quy mô công nghiệp”
sẽ đưa nhóm thực phẩm truyền thống này lên một tầm cao mới.






-2-
Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Ở Việt Nam, nhìn chung việc sản xuất chao vẫn chưa phát triển thành
quy mô công nghiệp, hầu hết chao vẫn được sản xuất theo lối thủ công quy mô
nhỏ với những thiết bị đơn giản, lên men tự nhiên… Theo cách này, chất lượng
sản phẩm không ổn định, năng suất không thể kiểm soát được và quan trọng
nhất là không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.
Theo cách sản xuấ
t chao truyền thống với phương pháp lên men tự nhiên
sẽ có nhiều mốc tạp nhiễm, sự xâm nhập của vi sinh vật sẽ làm hỏng sản phẩm
và sinh độc tố, cuối cùng làm thay đổi giá trị dinh dưỡng, hương vị sản phẩm
ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng và không đem lại hiệu quả kinh tế.
Trước đây, cũng có những nghiên cứu nhằm tối ưu hóa quy trình sả
n xuất chao
nhưng chỉ ở dạng mốc bột bào tử, thời gian bảo quản thấp, số lượng bào tử thấp
và còn lẫn nhiều mốc tạp. Chính vì vậy việc nghiên cứu starter của mốc
Actinomucor elegans và bước đầu ứng dụng vào sản xuất chao với quy mô công
nghiệp sẽ đưa nhóm thực phẩm truyền thống lên một tầm cao mới.
Viên mốc chứa số lượng lớn bào t
ử nấm mốc Actinomucor elegans thuần
chủng, thời gian bảo quản dài giúp ta lên men nhanh, nâng cao năng suất nhằm
tiết kiệm thời gian tiền bạc và đặc biệt là sản phẩm chao đạt tiêu chuẩn về vệ
sinh an toàn thực phẩm nhưng vẫn đảm bảo hương vị đặc trưng quen thuộc của
sản phẩm truyền thống. Việc nghiên cứu này sẽ đưa ngành sản xuất chao trên
quy mô công nghiệp và trên h
ết là chúng ta vẫn bảo tồn được nét văn hóa ẩm
thực truyền thống của dân tộc.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC:
1.2.1 Trong nước:
Khoa công nghệ thực phẩm và đồ uống - Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí
Minh – 2002 - Nguyễn Ánh Tuyết đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tối ưu hóa

quá trình sản xuất chao khi dùng chế phẩm nấm mốc Mucor”

-3-

Viện công nghệ sinh học- Cần Thơ – Nguyễn Văn Thành – 2008 - đã
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất giống starter vi sinh vật để cải tiến qui
trình sản xuất chao truyền thống ở ĐBSCL”.
1.2.2 Ngoài nước:
Ph.D.thesis Wageningen University Wageningen – the Netherland, 2003-
Bei - Zhong Han, “Characterization and Product Innovation of Sufu – A
Chinese Fermented Soybean Food”
China Light Industry Press, Beijing - Wang, R-Z & Du, X-X eds - 1998
– “The Production of Sufu in China” .
1.3. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:
- Nghiên cứu quy trình sản xuất giống starter của nấm mốc Actinomucor
elegans:
+ Khảo điều kiện t
ối ưu để nuôi cấy nấm mốc Actinomucor elegans.
+ Khảo sát môi trường tốt nhất để giữ bào tử nấm mốc Actinomucor
elegans.
+ Ứng dụng nghiên cứu quy trình sản xuất viên mốc chao
+ Khảo sát thời gian bảo quản của viên mốc chao.
+ Ứng dụng viên mốc vào quy trình sản xuất chao.

-4-
Chương 2: TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU VÀ
CƠ SỞ LÝ THUYẾT
2.1. GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG NẤM MỐC Mucor:
Năm 1929, Wai đã phân lập được một loại mốc thuộc dòng Mucor, và
ông đặt tên là Mucor sufu (mốc chao). Ông tin rằng mốc này do nguồn gốc rơm
rạ mà ra, vì người ta thường dùng rơm rạ để ủ chao. Giống được sử dụng sản
xuất chao rộng rãi nhất Actinomucor elegans và mucor spp.[11]
Giống Mucor thuộc lớp Zygomycetes (ngành phụ nấ
m tiếp hợp), nang
bào tử kín hình cầu, đường kính khoảng 40µm, là vi sinh vật hiếu khí, sợi nấm
có phân nhánh, có bào tử túi.[5]
Nhìn chung, sợi nấm của giống Mucor dày hơn của giống Rhizopus. Vì
thế, giống Mucor tạo một lớp màng dày và bám chặt vào bề mặt chao. Nhiệt độ
phát triển của Mucor khoảng 25–30°C. [11]
* Điều kiện nuôi cấy Actinomucor elegans: [12]
- Độ ẩm tương đố
i của không khí: 90 - 95%
- Ảnh hưởng của không khí: có O
2

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: 25 - 30
0
C
- Thời gian nuôi nấm mốc: 3 - 4 ngày
2.2 GIỚI THIỆU NGUYÊN LIỆU LÀM VIÊN MỐC:
2.2.1 Bã đậu nành: [2]

Bã đậu nành (có khi gọi là bã đậu) là một phế phẩm của các sản phẩm
làm từ đậu nành như đậu phụ, sữa đậu nành…
Bã đậu nành chứa loại protein chất lượng thấp, bằng khoảng 50% protein
tinh chất; giá trị tự nhiên của nó dưới 50% so với protein thịt gà.

Hình 2.1: Nấm Actinomucor elegans

-5-







2.2.2 Bột mì: [4]
Bột mì là sản phẩm được chế biến từ hạt lúa
mì bằng quá trình nghiền. Trong quá trình này vỏ
cám và phôi được tách ra và phần còn lại của hạt
lúa mì (nội nhũ) được nghiền nhỏ tới độ mịn thích
hợp (ra thành phẩm là bột mì).
+ Độ axit của các axit béo không quá 50mg
KOH cần để trung hòa axit béo tự do trong 100g
bột tính theo chất khô.
+ Protein: hàm lượng protein không thấp hơn 7,0%, tính theo chất khô.
+ Độ ẩ
m: độ ẩm của sản phẩm không vượt quá 15,5%.
+ Cỡ hạt: Bột mì không nhỏ hơn 98% lượng bột lọt qua rây có kích thước
lỗ 212 milimicron (N-70).
+ Kim loại nặng: Trong bột mì không được phép có kim loại nặng với số

lượng gây nguy hiểm cho con người.
+ Dư lượng chất trừ sinh vật hại phải tuân
thủ giới hạn tối đa cho phép theo quy định.
2.2.3 Bột gạo:[4]
Thành phần Tỷ lệ (%)
Chất khô 89
Protein thô 48
Chất xơ thô 0,3
Bảng 2.1: Thành phần chính của bã đậu nành
Hình2.2: Bã đậu nành
Hình 2.3: Bột mì
Hình 2.4: Bột gạo

-6-
Bột gạo ngon phải mịn không lẫn tạp chất, trắng, khó bị chua và thoảng
hương thơm của gạo chất lượng tốt.
Với thành phần chủ yếu là carbohdrat (>80%) nên bột gạo chủ yếu cung
cấp năng lượng cho cơ thể qua lượng carbohydrat với mức năng lượng
175kcal/50g (tinh bột gạo 82%).
2.2.4 Cám gạo:[15]
Trong quy trình xay xát và chế biến gạo, sau
khi thu được sản phẩm chính là gạo thì còn m
ột
sản phẩm phụ có giá trị khá cao đó là cám gạo. Từ
lâu cám gạo được các nhà máy xay xát thu hồi và
bán như là một sản phẩm chính chỉ sau gạo. Cám
được thu hồi dưới hai dạng là cám khô và cám
ướt.
Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn. Cám gạo chiếm khoảng 10 -
12% khối lượng lúa chưa xay xát. Cám là hỗn hợp của lớp vỏ ngoài của hạt gạo

và lớp aloron. Những thành phần được thu hồi khi khi xay xát và chế
biến gạo
và được gọi chung là cám.
Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của cám gạo
Thành phần Khối lượng/100g
Calori (KJ)
Tổng số lipit (g)
Chất béo bảo hòa (g)
Chất xơ tiêu hóa được (g)
Carbohydrat (g)
Đường (g)
Protein (g)
Vitamin E (mg)
Vitamin B6 (mg)
316
21
4
21
28
0,9
13,3
4,9
4,1
Hình 2.5: Cám gạo

-7-
2.3 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHAO:
2.3.1 Đậu nành:[2]
Đậu nành có tên khoa học là Glycine Max Merril. Đậu nành có nhiều màu
sắc khác nhau. Trong đó đậu nành màu vàng là loại tốt nhất được trồng và sử

dụng nhiều.
Hạt đậu nành gồm ba bộ phận:
- Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt.


- Phôi chiếm 2%.
- Tử diệp chiếm 90%.
Bảng 2.3: Thành phần hóa học của hạt đậu nành
Thành phần Tỷ lệ
Protein
(%)
Dầu
(%)
Tro
(%)
Hydratcarbon
(%)
Hạt đậu nành nguyên 100 40,0 21,0 4,9 34,0
Tử diệp 90,3 43,0 23,0 5,0 29,0
Vỏ hạt 8 8,8 1,0 4,3 86,0
Phôi 2,4 41,1 11,0 4,4 43,0
Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một
tỷ lượng rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài
methyonine và tryptophane còn có các acid amin khác với số lượng khá cao
tương đương lượng acid amin có trong thịt.
Hình 2.6: Đậu nành

-8-
Bảng 2.4: Thành phần acid amin trong đậu nành: [6]
Acid amin Hàm lượng (%)

Isoleucine 1,1
Leucine 7,7
Lysine 5,9
Methionine 1,6
Cysteine 1,3
Phenylalanine 5,0
Treonine 4,3
Tryptophan 1,3
Valine 5,4
Histidine 2,6
Trong protein đậu nành, globuline chiếm 85 – 95% ngoài ra còn có một
lượng như albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutenlin.
Đậu nành là loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipid, glucid,
muối khoáng và vitamin. Chính vì thế, đậu nành là một nguồn thực phẩm quan
trọng và được trồng rộng rãi ở Trung Quốc, Mỹ, Brazil. Ở Việt Nam, đậu nành
được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc và Nam.
2.3.2 Đậu phụ: [2]
Đậu phụ là một sản phẩm được sản xuất t
ừ
đậu nành. Đậu phụ không chỉ được sản xuất tại
Việt Nam mà còn được sản xuất nhiều ở Trung
Quốc, Nhật Bản, các nước Đông Nam Á và cả ở
các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, …
Đậu phụ có nhiều dạng khác nhau, chính vì thế mà cũng có tên gọi khác
nhau. Tất cả các dạng và tên gọi khác nhau trên đều chia làm 3 loại: đậu phụ
mềm, đậu phụ cứng và đậu phụ lụa.
Hình 2.7: Đậu phụ

-9-
Trong đó đậu phụ mềm được sản xuất nhiều nhất ở nước ta. Trung Quốc

sản xuất cả 3 loại. Nhật bản sản xuất nhiều loại đậu phụ lụa.
Bảng 2.5: Thành phần dinh dưỡng của 3 loại đậu phụ
Thành phần dinh
dưỡng
Đậu phụ cứng Đậu phụ mềm Đậu phụ lụa
Calories (KJ) 120 86 72
Protein (g) 13 9 9,6
Carbohydrate (g) 3 2 3,2
Chất béo (g) 6 5 2,4
Chất béo no (g) 1 1 -
Cholesterol 0 0 0
Natri (mg) 9 8 30
Chất xơ (g) 1 - -
Canxi (mg) 120 130 40
Sắt (mg) 8 7 1
Tuy nhiên, đậu phụ cũng là sản phẩm trung gian để sản xuất chao. Bánh
đậu phụ dùng để sản xuất chao có một số yêu cầu nghiêm ngặc hơn các loại đậu
phụ dùng để ăn.
Tiêu chuẩn bánh đậu dùng sản xuất chao tốt nhất có thành phần:
- Hàm lượng nước 68 - 72%.
- pH= 6 - 6.5
- Không chứa vi sinh vật tạp và vi sinh vật kỵ khí.
à Quá trình sản xuất đậu phụ: dùng tác động cơ học để phá vỡ cấ
u
trúc tế bào của hạt đậu, giải phóng các thành phần có trong hạt đồng thời dùng
nước làm dung môi hòa tan các chất đó thành dung dịch huyền phù. Sau đó lợi

-10-
dụng tính chất hòa tan khác nhau giữa các chất, dùng phương pháp lọc để tách
lấy 1 dung dịch nhũ tương trong đó chủ yếu là chất đạm tan globulin. Từ dung

dịch này, dựa vào tính chất đông tụ của globulin, thông qua các điều kiện pH,
điện tích, nhiệt độ, … kết tủa chúng lại thành các hoa đậu rồi ép định hình thành
bánh đậu phụ.
2.3.3 Muối: [15]
Có rất nhiều dạng muối ăn: muối thô,
muố
i tinh, muối iốt. Đó là một chất rắn có
dạng tinh thể, có màu từ trắng tới có vết của
màu hồng hay xám rất nhạt, thu được từ nước
biển hay các mỏ muối. Muối thu được từ nước
biển có các tinh thể nhỏ hoặc lớn hơn muối
mỏ.
Muối dùng trong sản xuất tương thường là Natri Clorua, khi pha vào nước
không có vị chát.
2.2.4 Nước: [9]
Nước dùng trong sản xuấ
t tương có độ cứng trung bình 8 – 17 (1 độ cứng
tương đương 10mg CaO/lít hay 7,19mg MgO/lít nước). Các chất khoáng và các
chất hữu cơ khác không được quá 500 – 600mg/l. Lượng vi sinh vật không
được quá 20 – 100/cm
3
nước.
2.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY
NẤM MỐC ACTINOMUCOR ELEGANS:
2.4.1 Oxygen:[2]
Actinomucor elegans là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình
thường khi đầy đủ oxy. Oxygen là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận
chuyển điện tử khi hô hấp hiếu khí và còn dùng oxygen để tổng hợp sterol và
các acid béo không bão hòa.
Để đáp ứng điều kiện nuôi này môi trường nuôi phải xốp, rãi thành lớp

không dày quá 2,5 – 3cm, phòng nuôi ph
ải thoáng. Theo thực nghiệm, để thỏa
Hình 2.8 : Muối

-11-
mãn cho sự hô hấp của Actinomucor elegans trong toàn bộ chu kỳ phát triển cứ
1 kg môi trường cần khoảng 1,7m
3
không khí.
2.4.2 Nhiệt độ:[11]
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme của
Actinomucor elegans là khoảng 25 – 30
o
C. Cần giữ cho nhiệt độ môi trường
không xuống dưới 25
o
C và không cao quá 36
o
C.
Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh
trưởng của nấm mốc, vì phản ứng xúc tác nhờ enzyme cũng giống như các phản
ứng hóa học nói chung, khi nhiệt độ tăng lên 10
0
C tốc độ phản ứng sẽ tăng gấp
đôi. Vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi
chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và nấm mốc sẽ sinh trưởng nhanh hơn.
Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc
độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao nấm mốc s
ẽ chết. Khi
nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển và

các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị tổn thương vì hai lớp lipid sẽ bị hòa tan.
Do đó, mặc dù ở nhiệt độ càng cao các phản ứng xúc tác tiến hành càng nhanh
nhưng do các nguyên nhân nói trên mà tế bào bị tổn thương đến mức khó hồi
phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng.
2.4.3 Độ ẩm của môi trường:[2]

Độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc
là 55 - 58%. Độ ẩm môi trường thích hợp sự hình thành bào tử là khoảng 45%.
Cần giữ cho độ ẩm môi trưởng không bị giảm trong quá trình phát triển.
2.4.4 Độ ẩm tương đối của không khí:[2]
Độ ẩm từ 80% trở lên đến bão hòa đều thích hợp cho nấm mốc. Trong
phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi
khô. Độ ẩ
m thích hợp của nấm mốc Acticnomucor elegans là từ 90 – 95 %.
2.4.5 pH:[11]
Thích hợp cho Actinomucor elegans là môi trường acid yếu 5,5 – 6,5.
Các môi trường tự nhiên như bã đậu nành… thường có sẵn pH ở khoảng này
nên không cần điều chỉnh.

-12-
Khi pH trong tế bào chất có sự biến hóa đột ngột sẽ làm phá vỡ màng
sinh chất hoặc làm ức chế hoạt tính của enzyme hay proteine chuyển màng, do
đó làm tổn thương đến vi sinh vật. Sự biến đổi pH của môi trường sẽ làm thay
đổi trạng thái điện ly của phân tử các chất dinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng sử
dụng chúng của nấm mốc.
2.4.6 Áp suất: [2]
Phần lớn nấm m
ốc có thể sống ở những nơi có áp suất không khí là 1
atm (atmosphere) và không chịu ảnh hưởng rõ rệt gì của áp suất này.
2.4.7 Nồng độ Muối:[11]

Wang (1967) đã nghiên cứu khả năng tiết enzyme protease của hệ nấm
mốc khi nó được phát triển trên môi trường đậu nành. Kết quả chỉ có một phần
nhỏ enzyme này được vi sinh vật tiết ra vào trong dịch lọc môi trường, còn phần
lớn protease đều nằm ở bề
mặt của hệ sợi. pH tối thích cho enzyme protease là
3.0–3.5. Khi hình thành các enzyme cố định trên hệ sợi, nếu thêm NaCl hay các
muối ion hóa vào môi trường nuôi cấy, các muối này sẽ tách một số enzyme ra
khỏi bề mặt hệ nấm. Khi nồng độ NaCl lên đến 0.3M, lượng protease được giải
phóng là cực đại. Các hợp chất không có khả năng ion hóa như urea, glucose,
và sucrose sẽ không thích hợp cho quá trình tách rửa protease. Do đó, có thể kết
luận rằng các enzyme protease đã liên kết với bề m
ặt hệ nấm bằng các liên kết
ion. Trong quá trình giải phóng các enzyme này, sẽ không có sự tham gia của
các phản ứng hóa sinh, bởi vì quá trình tách rửa này diễn ra nhanh chóng ngay
cả ở 0°C.
Vì vậy, nếu vi sinh vật được cấy trên một môi trường không có muối, sẽ
chỉ có một phần nhỏ protease có mặt trong dịch lọc môi trường cấy, còn hầu hết
các enzyme này sẽ nằm dính với hệ sợi. Khi nấm mốc phát triển trong môi
trường có chứa mu
ối, không những có thể phục hồi được một lượng lớn hoạt
tính của enzyme trong dịch lọc mà còn làm tăng cao tổng hoạt tính của protease,
vì quá trình tách liên tục protease khỏi bề mặt hệ nấm sẽ làm cho vi sinh vật có
thể tổng hợp được nhiều enzyme protease hơn.

-13-
Khi nghiên cứu, nấm mốc được phát triển trên môi trường có nồng độ
muối thấp, do đó các protease sẽ bám trên hệ sợi, từ đó ta có thể nghiên cứu vị
trí của các enzyme trước khi được tách ra, và có thể hiểu được quá trình ngâm
muối trong lên men chao.
Giải phóng các protease cố định trên bề mặt hệ nấm. Trong quá trình lên

men chao, nấm mốc được cố định trên bề mặt khối tàu hủ, nhưng hệ nấm không
thể
thâm nhập sâu vào khối này, mặt khác các enzyme của nấm mốc tiết ra
không phải là enzyme ngoại bào, do đó mà chúng chỉ liên kết lỏng lẻo với hệ
nấm bằng các liên kết ion. Vì vậy, các enzyme này dễ dàng bị tách rửa bởi Natri
Clorua hay các dung dịch muối ion khác, từ đó các protease này sẽ thấm vào
đậu hủ đã lên mốc và tiến hành phân giải protein.




-14-
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
STARTER MỐC Actinomucor elegans
3.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
3.1.1 Nguyên liệu :
- Giống Actinomucor elegans được lấy từ Phân viện Công nghiệp Thực
phẩm TP HCM.
- Bột gạo.
- Bột mì.
- Bã đậu nành.
- Cám gạo ,…
3.1.2 Hóa chất sử dụng:
Hóa chất chúng tôi sử dụng là tinh khiết, đảm bảo tính chính xác, sai số
trong giới hạn cho phép:
- Polyphosphate
- Natri clorua (NaCl)
- Cồn 90
0

- Agar
- Natri hydroxit (NaOH)
- Bạc nitrat (AgNO
3
)
- Kali cromat (K
2
Cr
2
O
4
)
- Erther khan
- Acid sunphuric (H
2
SO
4
)
- Acid perchloric (HClO
4
)

- Formol
- Phenolphtalein...

-15-
3.1.3 Thiết bị - dụng cụ thí nghiệm:
Thiết bị tiệt trùng, tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, kính hiển vi, cân phân tích, máy
đo pH, dụng cụ cất đạm, dụng cụ chiết béo, một số dụng cụ thí nghiệm thông
thường khác tại phòng thí nghiệm Vi Sinh và Hóa Lý, thuộc Khoa Công Nghệ

Hoá Học Thực Phẩm – Trường Đại Học Lạc Hồng.
3.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU:












* Thuyết minh sơ đồ:
Mốc giống sau khi nhận về chúng tôi cho cấy chuyền sang ống nghiệm
chứa môi trường Malt đặc, khoảng 3-4 ngày cấy chuyền chúng tôi tiến hành
nhân giống nấm mốc vào các loại môi trường khác nhau, khảo sát loại môi
trường thích hợp để nhân giống nấm mốc.
Sau khi chọn được môi trường thích hợp thì tiến hành khảo sát môi
trường và cách tối ưu giữ bào tử nấm mốc.
Mốc giống Môi trường giữ bào tử mốc
Nhân giống
Trộn đều
Tạo hình
Sấy
Viên mốc

-16-
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy và nhân giống vi sinh vật: [7]
3.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật:
* Chuẩn bị môi trường:
- Malt sau khi xay được trộn với nước (tỷ lệ 1:4), sau đó đem đun cách
thủy 40 - 45
0
C khoảng 30 phút, tiếp theo nâng nhiệt độ lên 70 - 75
0
C và duy trì
khoảng 30 phút, trong quá trình đun cần khuấy đều.
- Lọc dung dịch trên, thu được dung dịch trong, cân 1,5 - 2% agar cho
vào, khuấy đều và đun sôi.
- Sau đó rót nóng vào ống nghiệm (hoặc đĩa Petri) bịt kín ống nghiệm
bằng bông không thấm và đem tiệt trùng ngay ở 121
0
C trong 30 phút.
- Sau khi tiệt trùng, đối với thạch nghiêng cần đặt ống nghiêng khi môi
trường còn nóng và để yên cho tới khi nguội.
- Bảo quản môi trường đã đông đặc trong tủ lạnh ở vị trí lật ngược.
* Gieo cấy và nuôi vi sinh vật:
- Chuẩn bị ống nghiệm chứa mốc giống và ống nghiệm chứa môi
trường mới.
- Cầm que cấy ở tay thuận và tiệt trùng que cấy bằng cách hơ trên
ngọn l
ửa đèn cồn đến khi que nóng đỏ.
- Mở nắp ống nghiệm gốc kẹp nút bông, hơ nút bông và miệng ống
nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn. Luôn giữ miệng ống nghiệm đang mở nằm
nghiêng và gần ngọn lửa đèn cồn.
- Tiếp theo làm tương tự với ống sẽ cấy chuyền.
- Sau đó sử dụng que cấy chạm nhẹ vào lên bề mặt thạch c

ủa ống
nghiệm gốc để lấy vi sinh vật và chuyển sang môi trường mới.
- Rút que cấy ra và hơ trên ngọn lửa đèn cồn để vô khuẩn.

-17-
- Hơ lần lượt miệng ống nghiệm và nút bông qua ngọn lửa đèn cồn sau
đó đậy ống nghiệm lại.
- Sau đó dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy bao gồm:
tên vi sinh vật, ngày gieo cấy, môi trường cấy chuyền.
- Ống môi trường vừa gieo cấy xong được chuyển vào tủ ấm được
nuôi ở điều kiện thích hợp.
3.3.1.2 Phương pháp nhân giống vi sinh vật:
Mục đích: nhằm tạo ra giống trung gian dùng để sản xuất viên mốc.
3.3.1.3 Cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc: [7]
- Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml:
+ Bình 1 chứa 99ml nước cất vô trùng.
+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì.
- Cân 1 g mẫu, nghiền nát mẫu.
- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2.
- Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu.
- Tuỳ theo sự ước đoán số l
ượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng
nhiều hay ít.
- Ghi vào đáy đĩa Petri có môi trường thạch các thông tin:
+ Nồng độ pha loãng.
+ Ngày cấy.
- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa
thạch (tương đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được
dàn đều và không nên vượt quá vài trăm.
- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 30

0
C và ủ trong
48 - 72 giờ.

-18-
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và
tính.
• Cách tính kết quả:
 Trường hợp 1: Chỉ có 1 hộp Petri có số khuẩn lạc từ 25 - 250, tất cả
các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên. Khi đó ta chọn hệ
số pha loãng tương ứng với hộp Petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 -
250 để tính kế
t quả:

Trong đó: + N - Số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu
(CFU/g).
+ C
1
, C
2
– Số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp Petri ở độ pha
loãng đã chọn.
+ d - Hệ số pha loãng mẫu.
 Trường hợp 2: Chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp Petri có số khuẩn
lạc dao động từ 25-250. Tất cả các hộp Petri ở các độ pha loãng khác đều có số
khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên. Khi đó ta chọn độ pha loãng nói trên để tính
kết quả:


Trong đó: + N - Số khuẩn l

ạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu
+ C
1
, C
2
– Số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp Petri ở độ pha
loãng đã chọn.
+ d - Hệ số pha loãng mẫu.
 Trường hợp 3: Ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp Petri có số
khuẩn lạc dao động từ 25 - 250. Khi đó, ta phải tính kết quả cho từng độ pha
loãng.
d
CC
N
2
21
+
=
d
CC
N
2
21
+
=

-19-
• Nếu kết quả thu được ở hai độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau 2
lần hoặc nhỏ hơn, áp dụng công thức dưới đây để tính kết quả cuối cùng:

Trong đó: + N - Số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu.
+ C - Số khuẩn lạc đếm được trên các hộp Petri đã chọn.
+ n
1
, n
2
– Số hộp Petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ
nhất và thứ hai.
+ d - Hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất.
• Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau lớn
hơn 2 lần, sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để tính kết quả.
 Trường hợp 4: Tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ h
ơn
25. Khi đó ta chọn độ pha loãng thấp nhất để tính kết quả.
 Trường hợp 5: Tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn
250. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả.
 Trường hợp 6: Không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp
petri. Khi đó, ta sẽ ghi kết quả có ít hơn (
d
1
1×
) khuẩn lạc, trong đó d là hệ số
pha loãng thấp nhất.
3.3.2 Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm: [3]
Để đánh giá chất lượng sản phẩm thông thường xét về 3 mặt: cảm quan,
vi sinh, hóa lý.
 Chỉ tiêu cảm quan: ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp cho điểm
theo Tiêu chuẩn Việt Nam. Ngoài ra, chúng tôi còn cho thực hiện điều tra thị
hiếu người tiêu dùng đối với sản phẩm chao và tiế

n hành so sánh với sản phẩm
ngoài thị trường theo phép thử 2-3.
()
dnn
C
N
21
1,0+
∑
=

-20-
 Chỉ tiêu vi sinh: Thực hiện kiểm tra một số vi sinh vật cơ bản của
thực phẩm như: tổng số vi khuẩn hiếu khí, Coliform , E.coli…Dựa vào chỉ tiêu
này, người ta có thể dự đoán được thời gian bảo quản sản phẩm.
Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc.
Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọ
c vi sinh vật tùy
môi trường và điều kiện nuôi cấy. Mặc dù vẫn còn một số nhược điểm nhưng
phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế
bào sống. Ngoài ra phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định
lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng rộng
rả
i trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm.
 Chỉ tiêu hóa lý:
• Mục đích kiểm tra hóa lý:
¾ Thực phẩm có đáp ứng các tiêu chuẩn hóa học về phẩm chất và
thành phần dinh dưỡng theo đúng như quy định.
¾ Thực phẩm có đáp ứng các tiêu chuẩn hóa học về vệ sinh, hư hỏng
hoặc bị biến chất.

• Kiểm nghiệm hóa lý thực ph
ẩm chỉ là một khâu trong công tác kiểm
nghiệm thực phẩm nói chung, để xác định chính xác phẩm chất và chất lượng
thực phẩm cần phân tích trạng thái cảm quan và vi sinh vật.
¾ Xác định hàm lượng đạm tổng bằng phương pháp Kjeldahl.
¾ Xác định đạm formol theo phương pháp formol
¾ Xác định đạm amoniac theo phương pháp Kjeldahl nhưng bỏ qua giai
đoạn vô cơ hóa mẫu.
¾ Xác định hàm lượng muối Natri Clorua bằng phương pháp trực tiế
p.
¾ Xác định độ chua theo phương pháp trung hòa với phenolphtalein làm
chỉ thị màu.
¾ Xác định hàm lượng béo theo phương pháp trích ly soxhlet.

-21-
¾ Xác định hàm ẩm theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
¾ Xác định hàm lượng tro theo phương pháp nung thành tro trắng.
3.4. Bố trí thí nghiệm:
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường để nhân giống nấm mốc
Actinomucor elegans.

* Thuyết minh sơ đồ:
Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng có chứa mốc giống như đã trình bày ở
trên.
Chuẩn bị môi trường thí nghiệm trong bình tam giác:
+ Cơ
m, bã đậu nành và cám được làm chín. Để nguội, mỗi loại cho vào
một bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm rồi đậy nút bình bằng bông gòn
không thấm.
+ Tiệt trùng các bình tam giác ở 121
0
C trong vòng 30 phút, sau đó để
nguội đến nhiệt độ 30 ÷ 35
0
C.
* Sơ đồ khảo sát môi trường nhân giống
Cấy chuyền
Ống mốc giống
Môi trường
thạch nghiêng
Nước vô trùng
Nuôi ở 25-30
0
C
Trộn đều bào tử
Môi trường thí nghiệm
trong bình tam giác
Cấy chuyền
Nuôi mốc
Kết quả

T
0
phòng (25÷30
0
C)

-22-
Cấy chuyền từ ống nghiệm ra bình tam giác. Cho 1÷ 2ml nước vô khuẩn
vào ống nghiệm, lắc đều rồi đổ vào môi trường trong bình tam giác. Nuôi ở
nhiệt độ phòng (25 ÷30
0
C) trong 48 ÷ 72 giờ.
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát số lượng bào tử của nấm mốc Actinoucor
elegans trong môi trường nhân giống theo thời gian.










* Thuyết minh quy trình:
Chuẩn bị môi trường trong bình tam giác: Chúng tôi chọn bã đậu nành làm
môi trường nhân giống. Cho môi trường vào bình tam giác rồi đậy bằng bông
không thấm. Sau đó, đem tiệt trùng 121
0
C trong 30 phút, sau đó để nguội, nhân

giống từ ống nghiệm ra bình tam giác.
Sử dụng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc để xác
định số lượng bào tử từ 0 ÷ 10 ngày sau khi cấy. Thời gian nào bào tử không
tăng số lượng thì đó là thời điểm thu bào tử.
3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường để giữ bào tử nấm mốc
Actinomucor elegans trong viên mốc.

Môi trường trong bình
tam giác
Cấy chuyền
Nuôi mốc
Đếm số lượng bào tử
Kết quả
Ống mốc giống
Thời gian:0÷10 ngày
T
0
phòng (25÷30
0
C)

-23-

Chọn 3 loại bột: bột gạo, bột mì, bột nếp. Tiến hành nhào bột với các tỷ
lệ hồ:bột:nước:bào tử mốc khác nhau và tạo hình theo quy trình trên. Quan sát
trạng thái, cấu trúc, màu sắc viên mốc và sự phát triển của nấm mốc.
3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình sấy đến viên mốc.








Sau khi xác định được thời gian thu bào tử
và môi trường thích hợp để
giữ viên mốc chúng tôi tiến hành tạo hình và sấy viên mốc ở 3 nhiệt độ sấy khác
nhau : 50
0
C, 55
0
C, 60
0
C.
3.4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra khả năng sinh trưởng của bào tử trong viên
mốc theo thời gian bảo quản.
Viên mốc
Sấy
Tiến hành quan sát
Kết quả
Định lượng

Bào tử mốc
Bột + hồ
Nước
Nhào trộn
Tạo hình
Viên mốc chưa sấy
polyphosphate

-24-
* Điều kiện bảo quản: Viên mốc sau khi sấy được xếp vào khay và đóng
gói chân không, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát và chúng tôi tiến hành
khảo sát số lượng bào tử và độ ẩm của viên mốc theo thời gian bảo quản.











* Thuyết minh sơ đồ:
Chúng tôi tiến hành lấy 3 viên mốc trước và sau khi sấy nghiền, pha
loãng tiến hành cấy, sử dụng phương pháp đếm khuẩ
n lạc trên môi trường đặc
để xác định số lượng bào tử. Tương tự cứ cách 5, 10, 15, 20, 25, 30… ngày đều
lấy 3 viên mốc nghiền và tiến hành đếm lượng bào tử tương tự.
3.4.6 Thí nghiệm 6: Ứng dụng viên mốc trong sản xuất chao [11]

Viên mốc
Nghiền mịn
Phân lập
Cấy trên đĩa petri
Đếm số khuẩn lạc mọc trên
m
ặt thạch
Kết quả
* Sơ đồ phương pháp cấy gạt trên môi trường đặc

-25-

* Thuyết minh sơ đồ :
Bánh đậu thu được đem cắt khối, kích thước thông thường khối 2cm, có
thể thay đổi tùy thị hiếu người tiêu dùng. Mục đích việc này là tăng diện tích bề
mặt nuôi mốc.
T= 100
0
C
Chao
Nước muối + Rượu
Đậu phụ
Cắt khối
Xử lý nhiệt
Cấy mốc
Nuôi mốc
Cho vào lọ
Lên men
Ủ chín
Nghiền
Viên mốc
T= 25-30
0
C
T= 25-30

0
C