Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây dược liệu tự nhiên ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2






TRẦN VĂN THỌ



NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG
SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG
XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRONG MỘT SỐ CÂY
DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM






LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC






HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2





TRẦN VĂN THỌ



NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG
SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG
XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRONG MỘT SỐ CÂY
DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM


Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60.42.01.20



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC



Người hướng dẫn khoa học: TS. DƯƠNG MINH LAM

HÀ NỘI - 2014



i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi tới TS. Dương Minh Lam lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm
ơn chân thành, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn các Thầy/Cô giáo Phòng Sau Đại học, các
Thầy/Cô Khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt quá trình thực hiện luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô giáo trong tổ Bộ môn phòng
CNSH – Vi sinh, Khoa Sinh học trường ĐHSP Hà Nội đã giúp tôi rất nhiều
trong việc thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị làm việc tại phòng thí nghiệm
Hiển vi điện tử, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW – Bộ Y tế đã giúp đỡ tôi thực hiện
những thao tác lấy mẫu và chụp ảnh hiển vi quang học và điện tử quét.
Đồng thời tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia
đình, đồng nghiệp và các bạn của tôi đã có những khích lệ tinh thần và những
quan tâm sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2014
Tác giả luận văn


Trần Văn Thọ

ii

LỜI CAM ĐOAN

Xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân.
Các số liệu có nguồn gốc, tuân thủ đúng nguyên tắc, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố.

Tác giả luận văn


Trần Văn Thọ



iii

MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn i
Mục lục iii
Danh mục các từ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 4
1.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới 4
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn 4

1.2. Đa dạng và vai trò của xạ khuẩn nội cộng sinh 8
1.3. Xạ khuẩn sinh kháng sinh 15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh 15
1.3.2. Định nghĩa và phân loại chất kháng sinh 18
1.3.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh 22
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Vật liệu 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 26
2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định 27
2.1.3. Hóa chất 27
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị 27
2.2. Các loại môi trường sử dụng 28
2.2.1 Môi trường phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh 28
2.2.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn 28



iv

2.2.3. Môi trường nghiên cứu hình thái xạ khuẩn 29
2.2.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 30
2.3. Các phương pháp nghiên cứu 31
2.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập dòng xạ khuẩn
nội công sinh trong cây dược liệu 31
2.3.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 33
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 36
2.4. Phương pháp sử lý số liệu 36
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37
3.1. Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây dược liệu tự
nhiên ở Việt Nam 37

3.2. Nhóm màu và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn
phân lập được 38
3.3. Đặc tính sinh học xạ khuẩn nội cộng sinh và phân loại xạ khuẩn 44
3.3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Streptomyces 44
3.3.2. Đặc điểm hình thái của chủng Actinopolyspora 46
3.3.3. Đặc điểm hình thái của chủng Saccharopolyspora 47
3.4. Đặc điểm nuôi cấy 49
3.4.1. Màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất và sắc tố tan 49
3.4.2. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon 52
3.4.3. Sự hình thành sắc tố melanin 56
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC





v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CNSH: Công nghệ sinh học
ĐHSP: Đại học Sư phạm
HSCC: Hệ sợi cơ chất
HSKS: Hệ sợi khí sinh
VSVKĐ: Vi sinh vật kiểm định

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Một số loài xạ khuẩn nội cộng sinh mới được phát hiện 13
Bảng 2.2. Một số chất kháng sinh từ xạ khuẩn và hoạt tính của chúng 16
Bảng 2.3. Phân loại chất kháng sinh 19
Bảng 2.4. Một số chất kháng sinh mới công bố từ xạ khuẩn nội cộng sinh 23
Bảng 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh ở một số loài dược liệu 37
Bảng 3.2. Các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu và hoạt tính kháng
sinh của chúng 39
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xa khuẩn nội cộng sinh 41
Bảng 3.4. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn ức chế VSVKĐ 42
Bảng 3.5. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn được tuyển chọn 43
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của các chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh 55





vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh Streptomyces sp. EN27 trong hạt lúa mì 9
Hình 1.2. Kháng sinh được phát hiện qua các năm 15
Hình 3.1. Hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn được tuyển chọn 43
Hình 3.2. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces 45

Hình 3.3. Hệ sợi mang bào tử và bào tử của chủng S1A6 46
Hình 3.4. Hệ sợi mang bào tử và bào tử của chủng SC1A4 46
Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Actinopolyspora 47
Hình 3.6. Hệ sợi mang bào tử và bào tử của chủng Sacchararopolyspora 48
Hình 3.7. Màu sắc HSKS chủng S1A4 trên các môi trường nghiên cứu 50
Hình 3.8. Màu sắc của HSCC chủng S1A4 trên các môi trường nghiên cứu 50
Hình 3.9. Màu sắc của HSKS chủng SC 1A4 trên các môi trường nghiên cứu 51
Hình 3.10. Màu sắc của HSKS chủng SC 1A4 trên các môi trường nghiên cứu….54





1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là một quốc gia nằm trên bán đảo Đông Dương, khu vực
Đông Nam Á, kéo dài từ vĩ độ 23
0
23
’
Bắc đến 8
0
27
’
Bắc, với 3260km bờ biển,
3/4 diện tích lãnh thổ là đồi núi thấp. Nhiệt độ trung bình tại Việt Nam dao
động từ 21

0
C đến 27
0
C và tăng dần từ Bắc vào Nam. Lượng mưa trung bình
hàng năm 1500 – 2000 mm, độ ẩm không khí trên dưới 80%, lượng bức xạ
mặt trời rất lớn với số giờ nắng từ 1400 – 3000 giờ/năm [72]. Chính những
yếu tố vô cùng thuận lợi này đã giúp Việt Nam được đánh giá là một trong
những trung tâm giàu về đa dạng sinh học nhất thế giới [12]. Hiện nay, ở Việt
Nam đã có 300 loài thú, 830 loài chim, 260 loài bò sát, 158 loài lưỡng cư,
khoảng 5.300 loài côn trùng 547 loài cá nước ngọt, 2.038 loài cá biển được
thống kê. Với thực vật có 481 loài Rêu (Bryophyta), 691 loài Dương xỉ
(Polypodiophyta), 69 loài Hạt trần (Gymnospermae), với 10.386 loài thực vật
có mạch, đặc biệt có 3.830 loài thực vật có giá trị về mặt y học (cây thuốc) đã
được định danh [14].
Xạ khuẩn là đối tượng nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên
thế giới về đa dạng và các hoạt chất của chúng, đặc biệt là các chất kháng
sinh. Cho đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu
về xạ khuẩn phân lập ở đất canh tác, đất rừng, đất mặn…[1]. Một vài
nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh (xạ khuẩn trong cơ thể thực vật) trong
cây rừng ngập mặn đã được nghiên cứu [9], [13], tuy nhiên, chưa có công
trình nào nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên đối tượng cây dược liệu
tự nhiên.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy mức độ đa dạng cao của xạ
khuẩn nội cộng sinh trong các cây thuốc và có những tác động tích cực tới



2

thực vật chủ như kích thích sự sinh trưởng và bảo vệ cơ thể thực vật khỏi sự

xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh, đóng vai trò như là một tác nhân kiểm
soát sinh học, nhiều hoạt chất mới có có khả năng ứng dụng [24].
Với 3.830 loài cây thuốc trong tổng số 10.386 loài thực vật bậc cao có
mạch đã biết, chiếm khoảng một phần ba tổng số loài thực vật có mạch, Việt
Nam được đánh giá là quốc gia có độ đa dạng cây thuốc cao ở trong khu vực
Đông Nam Á [12]. Tuy nhiên, nghiên cứu xạ khuẩn trên cây thuốc ở Việt
Nam hiện chưa có, nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng
và khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh
trong một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam” dưới sự hướng dẫn của
TS. Dương Minh Lam bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh
học, Đại học Sư Phạm Hà Nội.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá được mức độ đa dạng và khả năng sinh chất kháng sinh của các
chủng xạ khuẩn nội cộng sinh một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm đánh giá sự đa dạng sinh học và sàng lọc các
chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có hoạt tính quí từ một số cây dược liệu tự
nhiên ở Việt Nam. Cụ thể:
- Phân lập xạ khuẩn nội công sinh từ các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả
của một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và định loại các chủng xạ khuẩn nội
cộng sinh.
- Đánh giá mức độ đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh.
- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có hoạt tính kháng sinh.
4. Những đóng góp mới của đề tài



3

- Lần đầu tiên nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên các loài cây
nghiên cứu.
- Xác định được độ đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây
dược liệu tự nhiên ở Việt Nam.
- Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh.



4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Xạ khuẩn (Actinobacteria) là một ngành vi khuẩn Gram dương, bao
gồm một lớp duy nhất là Actinobacteria trong đó có 5 bộ lớn là:
Actinomycetales, Bifidobacteriales, Coriobacteriales, Sphaerobacterales và
Rubrobacterales [11], [74]. Thành phần và số lượng của xạ khuẩn phân bố
không đều trong các bộ trên. Actinomycetales là bộ chiếm hơn 90% về số
lượng loài, với 40 họ, có nhiều họ xạ khuẩn với nhiều chi và loài sinh kháng
sinh quí được ứng dụng nhiều trong y học.
Những nghiên cứu đa dạng và phân loại học góp phần làm tăng nhanh
số lượng các loài xạ khuẩn được ghi nhận trên thế giới. Năm 2009, Xiao –
Yang Zhi đã bổ sung thêm những thông tin trong hệ thống phân loại xạ khuẩn
bằng việc sử dụng phương pháp phân tích 16S rDNA và bổ sung thêm 2 họ
trong bộ Actinomycetales là Kineosporiineae và Actinopolysporineae [69].
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn
1.1.2.1. Sơ lược về lịch sử phân loại xạ khuẩn
Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt
các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Ông

coi đặc điểm sinh lý là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại. Nhiều loài mới
đã được công bố từ năm 1914-1943 trên thế giới [63]
Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra hệ thống phân loại, xạ
khuẩn được xếp thành nhóm có 3 họ,10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài
thuộc chi Streptomyces. Đến năm 1949, số lượng xạ khuẩn đã được mô tả là 6
họ bao gồm 26 chi [63].
Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới, hệ
thống này dựa vào màu sắc hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất, hình dạng bào tử
và cuống sinh bào tử. Hệ thống này được sửa đổi nhiều và tái bản năm 1983.



5

Những năm gần đây, các hệ thống phân loại này càng ngày càng nhiều,
để thống nhất trong cách mô tả, chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (The
International Streptomyces Project) đã nêu lên các phương pháp và môi
trường mô tả [53]. Môi trường nuôi cấy và đặc điểm cuống sinh bào tử, chuỗi
bào tử, và bề mặt bào tử là những tiêu chí chính trong hệ thống phân loại.
Streptomyces là chi được đề cập nhiều nhất trong hệ thống phân loại này.
1.1.2.2. Một số phương pháp cơ bản trong phân loại xạ khuẩn
Ngày nay, nhờ sự phát triển cao của sinh học phân tử, hóa sinh học,
sinh lý học…những kiến thức về phân loại học xạ khuẩn đã có nhiều thay đổi
cơ bản. Do số lượng các loài xạ khuẩn mới được mô tả ngày càng nhiều, để
việc phân loại nhanh và chính xác về di truyền phân tử, người ta đã sử dụng
phương pháp phân loại số (Numerical taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát
sinh (Phylogeny taxonomy). Song người ta vẫn dựa chủ yếu vào các đặc điểm
hình thái, nuôi cấy, các đặc điểm sinh lý - sinh hóa, miễn dịch học và sinh học
phân tử [43], [66], [68], [70].
1.1.2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy, xạ khuẩn được chia
thành 4 nhóm chính [53]:
- Nhóm 1: Xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt. Đặc trưng của nhóm này là
sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành HSKS và HSCC. Đại diện các chi:
Streptomyces, Streptoverticillium, Actinopolyspora…
- Nhóm 2: Xạ khuẩn có bào tử nang. Đặc trưng của nhóm này là hệ sợi
phân chia theo hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự như nang
bào tử. Đại diện các chi: Actinoplanes, Spirillospora, Streptosporangium…
- Nhóm 3: Xạ khuẩn dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt hệ
sợi. Đại diện chi: Nocardia, Sacchorothix…
- Nhóm 4: Xạ khuẩn có dạng tương tự Corynebacter và dạng cầu, tế
bào có hình chữ V, T và thường không có hệ sợi.



6

Trong những năm gần đây, dựa vào nghiên cứu xạ khuẩn trên các môi
trường khác nhau, ISP đã chia hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu:
- Kiểu S – type “Spira” chuỗi bào tử xoắn.
- Kiểu R – type “Rectus” chuỗi bào tử thẳng.
- Kiểu F – type “Flexuous” chuỗi bào tử dạng cong queo.
- Kiểu RA – type “Retinaculum - Apertum” chuỗi bào tử dạng móc câu
hay xoắn không hoàn toàn.
- Kiểu MV – type “Monoverticillus” chuỗi bào tử một tầng chồi.
- Kiểu MV-S – type “Monoverticillus – Spira” chuỗi bào tử một tầng
chồi xoắn.
- Kiểu BIV – type “Biverticillus” chuỗi bào tử hai tầng chồi
- Kiểu BIV – S – type “Biverticillus – Spira” chuỗi bào tử hai tầng chồi
Hầu hết các chi xạ khuẩn được mô tả hiện nay được phân chia tùy

theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Tuy nhiên,
việc coi các đặc điểm hình thái, nuôi cấy là dữ liệu cơ bản dùng để phân
loại xạ khuẩn không thành công, vì chính cùng một loài có thể biểu hiện
khác nhau về hình thái trên các môi trường khác nhau hay những loài khác
nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Do vậy ngày nay trong phân loại
xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh
lý, sinh hóa, sinh học phân tử.
1.1.2.2.2. Đặc điểm hóa phân loại
Những năm gần đây, các phương pháp phân loại Prokaryota dựa vào
thành phần hóa học của tế bào được sử dụng rộng rãi. Nó đã trở thành một
phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng
thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
- Thành tế bào



7

- Axit techoic
- Axit béo
- Menaquinon
- Type photpholit
- Trong các đặc điểm trên thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất trong phân loại xạ khuẩn. Theo hướng phân loại này, người ta chia thành
tế bào xạ khuẩn thành 4 type:
- Type I: Thành tế bào có L – ADP và glixin
- Type II: Thành tế bào có mADP và glixin
- Type III: Thành tế bào có mADP
- Type IV: Thành tế bào có mADP, đường arabinose, galactose.

1.1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
Khi phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý – sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác
nhau nhờ hệ thống enzim. Các chỉ tiêu khác cũng được xác định như mối
quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi
trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển, tính chất đối
kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh
và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
1.1.2.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các
vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái,
sinh lý – sinh hóa.
Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath và Jaccard đề nghị
hệ số giống nhau S (Similarity) theo công thức sau:



8

%
100
Nsx
S
Ns Nd



Ns: Tổng số các đặc điểm giống nhau mà hai chủng so sánh
Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau

Kết quả của sự so sánh này được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy
thuộc vào mức độ giống nhau mà các vi sinh vật được xếp vào các nhóm.
1.1.2.2.5. Nghiên cứu về chủng loại phát sinh
Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm mục đích xây dựng một cây
phát sinh chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN,
protein mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của 16S rADN đã
cho phép sắp xếp lại vi sinh vật theo chủng loại phát sinh, gần với tự nhiên
hơn. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày nay người ta vẫn dùng 3
phương pháp chính: lai ADN, lai ARN, và phân tích 16S rADN. Mức độ
giống nhau giữa 2 cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ thân thuộc giữa chúng.
1.2. Đa dạng và vai trò của xạ khuẩn nội cộng sinh
Hầu hết các xạ khuẩn được phân lập chủ yếu ở đất, vùng rễ, thảm mục.
Tuy nhiên, sự liên kết của chúng với thực vật chưa được nghiên cứu một cách
đầy đủ.
Smith (1957) là người đầu tiên đã phân lập thành công chủng Micromonospora
sp. từ lát cắt mô của cây cà chua khỏe mạnh. Chủng xạ khuẩn này có khả năng
kháng Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Smith đã lặp lại các thí nghiệm
của mình và đã xác định được vị trí cư trú của chủng xạ khuẩn này trong cây
cà chua. Sinh vật nội cộng sinh cư trú bên cạnh các mô thực vật và thường
được nuôi dưỡng và bảo vệ từ cây chủ. Ngược lại, các sinh vật nội cộng sinh
tạo điều kiện thuận lợi cho cây chủ sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, bảo
vệ cây chủ [30].
Xạ khuẩn nội cộng sinh là những xạ khuẩn sống trong mô của thực vật



9

khỏe mạnh và không gây ra những nguy hại nào cho cây chủ[52]. Cho đến
nay, một số lượng lớn xạ khuẩn nội cộng sinh đã được phát hiện từ cây trồng

nông nghiệp như: lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua, cây chuối, ngô và
cây chanh [17],[18], [23], [27], [28], [55], [60], [61], cây gỗ [58],[64], [66],
[67], [69]], dương xỉ và rêu [38], cây thuốc [33]. Streptomyces và
Microbispora là hai chi được tìm thấy nhiều nhất ở trong mô của thực vật
[44], [56]. Micromonospora, Nocardioides, Nacardia và Streptosporangium
là những chi cũng được tìm thấy.

Hình 1. 1. Hình ảnh Streptomyces sp. EN27 trong hạt lúa mì [28]
Những thông tin về đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh không chỉ có ý
nghĩa quan trọng trong việc sàng lọc những chủng tốt mà còn giúp cho chúng
ta hiểu về vai trò sinh thái học của chúng.
Tan (2006) [57] phân lập được 619 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ
cây cà chua và tất cả chúng đều thuộc chi Streptomyces. Inderiati và Muliani
(2008) [30] cho rằng đa số xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây thuốc lá đã
được phân loại thuộc chi Streptomyces. Lee (2008) [41] đã phân lập được 81
chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc vào tám chi từ rễ của cây bắp cải Trung



10

Quốc. Microbispora là chi được phân lập phổ biến nhất, sau đó Streptomyces
và Micromonospora. Streptomyces chiếm khoảng 50% của 55 chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh phân lập được từ cây đinh hương Ấn Độ [62]. Kajur và
Khan (2011) [39] phân lập được 50 chủng xạ khuẩn từ lá của Mentha arvensis
thu được 60% số lượng chủng thuộc thuộc chi Streptomyces, 25% số lượng
chủng thuộc Micromonospora, 7.5% số lượng chủng thuộc Actinopolyspora
và 7.5% số lượng chủng thuộc Saccharopolyspora. 40 chủng xạ khuẩn nội
cộng sinh phân lập từ rễ, thân và lá của ba loài cây thuốc Ấn Độ hầu hết đều
thuộc chi Streptomyces [33]. Điều thú vị là chi Streptomyces là chi thường

xuyên phân lập được ở các quốc gia từ các nguồn cây chủ khác nhau, chủ yếu
là các loài S. aureus, S. galilaeus, S. caviscabies, S. setonii, S. cyaneus S.
thermocarboxydus [26], [27], [57], [60], [62]. Các tác giả này cho rằng những
loài này có khả năng thích nghi cao hơn đối với thực vật so với các loài khác.
Chi Microbispora chủ yếu là nội cộng sinh. Microbispora được phân lập
thường xuyên từ lá hơn ở trong đất (Kizuka 1998) [43]. Araujo (2000) [18]
phân lập được 53 chủng xạ khuẩn từ cây ngô, trong đó 33 chủng thuộc chi
Microbispora, 6 chủng thuộc chi Streptomyces. Thongchai Taechonisan (2003)
[58] phân lập được 330 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ 36 loài thực vật, trong đó
277 chủng thuộc chi Streptomyces, 14 chủng thuộc Microbispora, 8 chủng thuộc
chi Nocaridia và 4 chủng thuộc chi Micromonospora. Lee (2008) [41] thu
được 67% số lượng chủng thuộc chi Microbispora, 12% số lượng chủng
thuộc chi Streptomyces và Micromonospora chiếm 11% từ cây bắp cải Trung
Quốc. Những kết quả này một lần nữa khẳng định sự phân bố rộng rãi của 2
chi Streptomyces và Microbispora trong cơ thể thực vật.
Rễ, thân, lá, quả là những bộ phận chứa đựng đa dạng xạ khuẩn nội
cộng sinh. Đa số xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập ở rễ nhiều hơn ở các
phần khác của cơ thể [62], [71]. Số lượng xạ khuẩn nội cộng sinh ở rễ nhiều



11

gấp đôi so với ở thân cây Azadirachta indica ở phía bắc Ấn Độ [62].
Teachowisa (2003) [58] phân lập được 330 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ
36 loài thực vật ở Thái Lan: 212 (64%) chủng có nguồn gốc từ rễ, 97 (29%)
chủng có nguồn gốc từ lá và 21 (6%) chủng có nguồn gốc từ thân. Kezhao
(2012) [40] phân lập được 560 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ 26 loài cây
thuốc ở cao nguyên Panxi Trung Quốc; 58,2% chủng xạ khuẩn có nguồn gốc
từ rễ, 27.8% chủng có nguồn gốc từ thân và 14% chủng xạ khuẩn có nguồn

gốc từ lá. Gangwar (2012) [32], cũng thu được 60% số lượng chủng xạ khuẩn
có nguồn gốc từ rễ khi phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh từ cây lúa mì. Năm
2014, Gangwar [33] phân lập được 40 chủng xạ khuẩn nội cộng từ rễ, thân và
lá của 3 cây thuốc ở Ấn Độ, trong đó 70% số lượng chủng có nguồn gốc từ rễ,
17.5% chủng có nguồn gốc từ thân và 12.5% chủng có nguồn gốc từ lá.
El – Tarabily (2009) [30] đã ước lượng được xạ khuẩn nội cộng sinh
trong rễ cây dưa chuột và đậu lupin khoảng 10
5
cfu/g rễ tươi. Ở rễ, xạ khuẩn
nội cộng sinh đa dạng hơn ở các phần khác. Tian (2007) [60] khi phân tích 16S
rADN của 45 và 33 chủng xạ khuẩn phân lập được từ thân và rễ, đã thấy rằng
những chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ rễ thuộc vào 9 chi xạ khuẩn, trong khi
đó xạ khuẩn có nguồn gốc thân chỉ thuộc vào 4 chi của xạ khuẩn. Kết quả này
đã chứng tỏ sự đa dạng của xạ khuẩn ở trong rễ cao hơn ở thân. Sự đa dạng xạ
khuẩn trong đất là một trong những nguyên nhân giải thích sự đa dạng của xạ
khuẩn nội cộng sinh ở trong rễ. Xạ khuẩn trong môi trường đất có thể dễ dàng
di chuyển vào trong rễ [30]. Rễ vừa có vai trò hút nước, chất dinh dưỡng, đồng
thời là nguồn cơ chất lý tưởng cho xạ khuẩn nội cộng sinh.
Strobel và Daisy (2003) cho rằng sự đa dạng của xạ khuẩn nội cộng
sinh có thể tìm thấy trong vùng nhiệt đới và vùng ôn đới [54]. Janso và Carter
(2010) [38] đã phân lập được 123 xạ khuẩn nội cộng sinh từ cây trong vùng
nhiệt đới ở các vị trí khác nhau thuộc Papu New Guinea và đảo Mborokua,



12

đảo Solomon. Khi phân tích 16S – rADN 123 chủng xạ khuẩn thuộc 17 chi đã
được miêu tả, trong đó có một vài chi hiếm như Sphaerisporangium và
Planotetraspora, là những chi mà trước đó chưa có tác giả nào công bố. Rừng

mưa nhiệt đới là nơi chứa đựng sự đa dạng sinh học lớn trên trái đất, trong đó
có xạ khuẩn nội cộng sinh có nguồn gốc từ các cây thuốc. Trong nghiên cứu
Qin và cộng sự, 2174 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đã được phân lập từ các
nguồn cây thuốc khác nhau ở rừng mưa nhiệt đới Xishuangbanna của Trung
Quốc. Bằng việc sử dụng phương pháp xử lý bề mặt và chọn lọc môi trường
nuôi cấy, Qin đã phát hiện ra xạ khuẩn thuộc vào 10 bộ khác nhau, 32 chi,
trong đó có ít nhất 19 đơn vị phân loại mới. Chỉ từ một nguồn cây chủ
Maytenus austroyunnanensis; 1 chi mới và 7 loài mới đã được phát hiện [47].
Zhu (2009) [70] đã phân lập được nhiều hơn 160 chủng xạ khuẩn nội cộng
sinh từ các mô của thực vật mọc hoang dại, cây trồng, cây nhiệt đới Trewia
nudiflora. Ông đã thấy sự hiện diện của xạ khuẩn nội cộng sinh ở các mô và
cung cấp thêm những thông tin về đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn
phân lập được. Có thể thấy rằng sự đa dạng và giàu có của xạ khuẩn nội cộng
sinh ở rừng mưa nhiệt đới cao hơn so với các vùng khác. Rừng mưa nhiệt đới
là tiềm năng hứa hẹn của loài mới và nguồn kháng sinh mới. Sự đa dạng này
được thể hiện giữa các vùng khác nhau và giữa các loài thực vật khác nhau.
Ngày nay, xạ khuẩn nội cộng sinh vẫn đang được các nhà khoa học tập
trung nghiên cứu. Rất nhiều loài mới và tiềm năng ứng dụng của chúng đang
dần dần được khám phá Glycomyces endophyticcus sp. nov [46].
Pseudonocardia endophytica sp. nov., Streptomyces mayteni sp. nov [36],
Promicromonospora xylanilytica sp. nov[50] . Nocardioides panzhihuaensis
sp. nov. [49], Streptomyces sp. Y3111[42].




13

Bảng 2.1. Một số loài xạ khuẩn nội cộng sinh mới được phát hiện [48]
GenBank

Tên của xạ khuẩn nội
cộng sinh
Cây chủ
Hệ số giống nhau
S%(Similarity)
AJ784008 Micromonospora
coriariae
Coriaria myrtifolia M. endolithica
(98.94%)
AJ783996 Micromonospora lupini Lupinus angustifolius M. microbrigensis
(98.5%)
AJ783993 Micromonospora
saelieesensis
Lupinus angustifolius M.
purpureochromogenes
(98.7%)
AM944497 Micromonospora pisi Pisum sativum M. pattaloongensis
(98.7%)
DQ343154 Pseudonocardia oroxyli Oroxylum indicum P. halophobica
(97.8%)
EU921261 Pseudonocardia acaciae
Acacia auriculiformis
A. Cunn. Ex Benth.
P. spinosispora
(96.2%)
DQ887489 Pseudonocardia
endophytica
Lobelia clavata P. kongjuensis (98.5%)

GQ906587 Pseudonocardia tropica Maytenus

austroyunnanensis
P. alni (99.5%)
FJ805427 Psedonocardia
adelaidensis
Eucalyptus microcarpa

P. zijingensis (98.7%)
FJ805426 Psedonocardia eucalypti Eucalyptus microcarpa

P. spinosispora
()96.3%
GU227146 Psedonocardia artemisiae Artemisia annua L. P. saturnea (96.6%)
HM153789 Psedonocardia
sichuanensis
Jatropha curcas L. P. zijingensis (98.6%)
EU375845 Dietzia schimae Schima sp. D. maris (99.8%)
EU375846 Dietzia cercidiphylli Cercidiphyllum
japonicum
D. natronolimnaea
(99.5%)
EU200681 Glycomyces endophyticus Carex baccans Nees G. algeriensis (99%)
DQ460469 Glycomyces sambucus Sambucus adnata Wall G. lechevalierae
(97.2%)
EU200682 Glycomyces scopariae Scoparia dulcis G. algeriensis (97.4%)

EU814511 Glycomyces mayteni Maytenus
autroyunnanensis
G. algeriensis (97.1%)

14

DQ460470 Streptomyces alni Alnus nepalensis
D.
Don
S. hebeiensis (97.6%)
EU200685 Streptomyces artemisiae Artemisia annua L. S. armeniacus (99.9%)

EU925562 Streptomyces sedi Sedum sp. S. specialis (97.5%)
EU200683 Streptomyces mayteni Maytenus
autroyunnanensis
S. phaeopurpureus
(99.5%)
GU367158 Nonomuraea endophytica Artemisia annua L. N. candida (98.8%)
FJ157184 Nonomuraea
antimicrobica
Maytenus
austroyunnanensis
N. candida (98.2%)
EU814512 Saccharopolyspora
endophytica
Maytenus
austroyunnanensis
S. flava (97.7%)
EU005371 Saccharopolyspora
gloriosae
Gloriosa superba L. S. gregorii (991%)
FJ214364 Saccharopolyspora

tripterygii
Tripterygium
hypoglaucum
S. flava (97.6%)
EU429322 Actinoallomurus acaciae Acacia auric
uliformis
A. Cunn. Ex Benth
A. caesius (99.3%)
EU420071 Actinoallomurus aryzae Oryza sativa
L. cv.
KDML 105
A. iriomotensis
(99.2%)
EU005372 Micrococcus endophyticus

Aquilaria sinensis M. luteus (99.06%)
FJ214355 Micrococcus ynnanensis Polyspora axillaris M. luteus (99.7%)
FJ805428 Nocardia callitridis Callitris preissiii N. nova (97.4%)
HM153801 Nocardia endophytica Jatropha curcas L. N. nova (97.5%)
EF466117 Nocardioides caricicola
Carex scabriflolia
Steud
N. pyridinolyticus
(97.0%)
FJ57185 Actimadura flavalba Maytenus
autroyunnanensis
A. atramentaria
(97.4%)
EU420070 Actinophytocola aryzae Oryza sativa
L. cv.

RD6
Kibdelosporangium
aridum (95.5%)
FJ214343 Plantactinospora mayteni Maytenus
austroyunnanensis
M. endolithica (98.1%)

AB490769 Phytohabitans suffuscus Orchid M. pattaloongensis
(97.7%)
FJ157186 Jiangella alba Maytenus
autroyunnanensis
J. alkaliphila (98.8%)
EU560726 Jishengella endophytica Acanthus illicifolius M. olivasterospora



15

(98.7%)
FJ214356 Herbidospora osyris Osyric wightiana
Wall.
ex Wight
H. cretacea (99.9%)
FJ214362 Kineosporia mesophila Tripterygium wilfordii K. mikuniensis
(98.2%)
DQ473536 Leifsonia ginsengi Ginseng L. poae (97.6%)
EU325542 Rhodococcus cercidiphylli

Cercidiphyllum
japonicum

R. fascians (99.6%)

1.3. Xạ khuẩn sinh kháng sinh
1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh
Sự phát hiện ra penicillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ
nguyên chất kháng sinh ra đời [29].
Sau penicillin, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tập trung nghiên
cứu về chất kháng sinh từ vi sinh vật. Năm 1939 Dubo đã phát hiện ra
gramixydin và tiroxidin. Năm 1944, Waksman phát hiện ra streptomycin.
Năm 1947, Erhlick đã phát hiện ra chloramphenicol. Năm 1948, Duggar phát
hiện ra clotetraxyclin. Năm 1952, Gure phát hiện ra erytromyin… và nhiều
chất kháng sinh mới vẫn đang được tìm kiếm và phát hiện [29].


Hình 1.2. Kháng sinh được phát hiện qua các năm [29]



16

Năm 2001, Patallo và cộng sự đã chiết xuất elloramycin từ S. olivaceus
Tu 2353 có hoạt tính kháng mạnh vi khuẩn Gram dương và chống ung thư.
Tuy nhiên, hầu hết các kháng sinh có độc cao nên chỉ một số loại kháng sinh
được ứng dụng như ellipticin, carboplatine, oxaliplatine, knedaplatine…[29].
Năm 2002, một số lượng lớn chất kháng sinh và các hoạt chất sinh học đã
được phát hiện từ các nhóm sinh vật khác nhau, được thể hiện trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Một số chất kháng sinh từ xạ khuẩn và hoạt tính của chúng [29]

Hợp chất tự
nhiên

Nguồn gốc Ứng dụng
Quốc gia
phát hiện
Cơ quan
phát hiện
Actinomycin S. antibioticus Kháng ung thư Mỹ Nghiên cứu
Adriamycin S. peucetius Kháng ung thư Ý Thương mại
Amphotericin S. nataensis Kháng nấm Mỹ Nghiên cứ
/
Thương mại
Avermectin S. avermitilis Kháng kí sinh trùng

Nhật/Mỹ Nghiên cứ
/
Thương mại
Bacitracin Bacillus species Kháng khuẩn Mỹ Nghiên cứu
Bialaphos S. hygroscopicus Kháng ung thư Nhật Thương mại
Bleomycin S. verticillus Kháng ung thư Nhật Nghiên cứu
Candicidin S. griseus Kháng nấm Mỹ Nghiên cứu
Chloramphenicol

S. venezuelae Kháng khuẩn Mỹ Nghiên cứ
/
Thương mại
Chlortetracycline

S. aureofaciens Kháng khuẩn Mỹ Thương mại
Epothilone Sorangium
cellulosum
Kháng ung thư Đức Nghiên cứu

Erythromycin
Saccharopolyspora
erythraea
Kháng khuẩn Mỹ Thương mại
Fosfomycin S. wedmorensis Kháng khuẩn
Tây Ban
Nha
Thương mại
Gentamicin Micromonospora
species
Kháng khuẩn Mỹ Thương mại