So sánh trình tự gen tổng hợp isoflavone phân lập từ đậu xanh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐỖ THỊ CẨM VÂN

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN TỔNG HỢP
ISOFLAVONE PHÂN LẬP TỪ ĐẬU XANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐỖ THỊ CẨM VÂN

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN TỔNG HỢP
ISOFLAVONE PHÂN LẬP TỪ ĐẬU XANH
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi. Các số
liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được
ghi rõ nguồn gốc.
Tôi xin cam đoan và hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong
luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 10 năm 2016
Tác giả luận văn

Đỗ Thị Cẩm Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã luôn quan tâm, hướng dẫn và chỉ bảo
tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Thị Thu Yến và các thầy cô giáo
Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như thực
hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, KS. Hồ Mạnh Tường
và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công
nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,
đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn cùng tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 10 năm 2016
Tác giả luận văn

Đỗ Thị Cẩm Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Cây đậu xanh .............................................................................................. 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh .................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây đậu xanh ..................................................... 4
1.1.3. Giá trị của cây đậu xanh .......................................................................... 8
1.2. Thành phần và hoạt tính của Isoflavone .................................................. 10
1.2.1. Thành phần của Isoflavone ................................................................... 10
1.2.2. Hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của Isoflavone .............................. 13
1.3. Gen và con đường sinh tổng hợp Isoflavone ........................................... 15
1.3.1. Con đường sinh tổng hợp Isoflavone .................................................... 15
1.3.2. Gen tổng hợp Isoflavone ....................................................................... 16
1.3.3. Gen tổng hợp Isoflavone CHI ở cây xanh ............................................ 18
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19
2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu ................................. 19
2.1.1. Vật liệu .................................................................................................. 19
2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iv

2.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 21
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22

2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và mRNA tổng số ..................... 22
2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA ............................................................... 23
2.2.3. PCR khuếch đại gen CHI ...................................................................... 24
2.2.4. Tách dòng gen CHI ............................................................................... 27
2.2.5. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ............................................ 29
2.2.6. Phương pháp phân tích trình tự gen ...................................................... 29
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 30
3.1. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ DNA genome ........................ 30
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 30
3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CHI từ cây đậu xanh ...................................... 31
3.1.3. Kết quả tách dòng gen CHI từ DNA genome ....................................... 32
3.2. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ cDNA .................................... 34
3.3. Phân tích trình tự gen CHI từ các mẫu nghiên cứu ................................. 37
3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen CHI từ DNA genome và từ cDNA.......... 37
3.3.2. Kết quả so sánh trình tự gen CHI phân lập từ mẫu đậu xanh nghiên
cứu với trình tự gen CHI đã được công bố trên Ngân hàng gen. .................... 41
3.3.3. Phân tích trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI của mẫu đậu
xanh nghiên cứu .............................................................................................. 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 48
1. Kết luận ....................................................................................................... 48
2. Đề nghị ........................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Amino acid trong bột đậu xanh và tiêu chuẩn của FAO/WHO ....... 9
Bảng 2.1. Cặp mồi nhân gen CHI ................................................................... 20
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng................................................... 21
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA .................................... 24
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen CHI .............................................. 25
Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen CHI .............................. 25
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen CHI vào vector pBT ...................... 27
Bảng 3.1. Tỷ số A260/A280 và hàm lượng DNA tổng số của hai giống đậu
xanh nghiên cứu .............................................................................. 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây đậu xanh................................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Genistein và Daidzein ................................ 11
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ............................................ 16
Hình 2.1. Hình ảnh hạt của mẫu giống đậu xanh nghiên cứu....................... 19
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose ........................... 30
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại DNA của gen
CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10 ........................... 32
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR plasmid ....................... 34
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của gen
CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10 ........................... 35
Hình 3.5. Kết quả kiể m tra sản phẩ m cắt vector pBT-CHI bằng că ̣p enzyme

NcoI và NotI ................................................................................. 36
Hình 3.6: Đặc điểm cấu trúc gen CHI từ các mẫu đậu xanh nghiên cứu ..... 40
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide gen CHI của đậu xanh Việt Nam với
trình tự đã công bố ........................................................................ 42
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid từ gen CHI của đậu xanh Việt Nam
với trình tự đã công bố .................................................................. 43
Hình 3.9. So sánh (alignment) trình tự amino acid của CHI giữa các loài
thực vật khác nhau. ....................................................................... 45
Hình 3.10. Cây phân loại của CHI ở một số thực vật ..................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vii

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

bp

Base pair (cặp bazơ)

cDNA

Complementary DNA

CHI

Chalcone isomerase

cs

cộng sự

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribose nucleic acid

dNTP

Deoxy nucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

E.coli

Escherichia coli

kb

Kilo base

mRNA

Messenger ribonucleic acid

PCR

Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA

Ribonucleic acid

TAE

Tris-acetate-Ethylene diamine tetraacetic acid

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galacto-pyranoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu xanh là cây đậu đỗ ngắn ngày, khả năng sinh trưởng mạnh, dễ
thích ứng với nhiều mô hình trồng trọt. Đặc biệt trong những nghiên cứu gần

đây cho thấy đậu xanh có thể trồng được nhiều vụ trong năm. Đậu xanh có thể
trồng xen, trồng gối, trồng thuần trên nhiều loại đất canh tác khác nhau. Cây
Đậu xanh ngoài giá trị kinh tế nó còn có giá trị vô cùng quan trọng khác về
mặt sinh học, đó là khả năng cố định nitơ khí quyển thành đạm cung cấp cho
cây nhờ vi khuẩn Rhirobium virgana cộng sinh ở bộ rễ.
Hạt đậu xanh là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, hạt đậu xanh
giàu hydratcacbon, protein và các loại vitamin khác. Protein đậu xanh chứa
đầy đủ các amino acid không thay thế. Với hàm lượng dinh dưỡng cao của
hạt đậu xanh nên sản phẩm chế biến từ hạt đậu xanh rất phong phú như: Bột
đậu xanh, bánh đậu xanh, đồ xôi, nấu chè làm miến, làm giá đỗ.... Ngoài việc
cung cấp dinh dưỡng, hạt đậu xanh còn được dùng trong đông y như một bài
thuốc nam: Vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, tính hàn có tác dụng giải nhiệt giải
độc. Dùng nấu ăn để tiêu phù thũng, hạ bí, giải nhiệt độc, giải các chất độc
của thuốc và kim loại, hạt đậu xanh còn dùng chữa bệnh đái tháo đường...
Trong đậu xanh còn có chứa thành phần isoflavone là dược chất có nguồn gốc
thảo mộc, có thể làm giảm sự xuất hiện của một số loại ung thư, giảm các
triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, béo phì, loãng
xương, ngăn chặn sự gia tăng choleterol trong máu. Bên cạnh đó, hoạt chất
Isoflavone giúp phụ nữ tăng cường chất lượng của da, giảm được các nếp
nhăn, giảm độ sâu của nếp nhăn mắt, làm cho da săn chắc hơn nhờ tăng
cường kết nối collagen, đồng thời cải thiện màu sắc và giữ ẩm cho da.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2

Các công trình nghiên cứu về cây đậu xanh hiện nay chủ yếu trên

phương diện hình thái, năng suất, đánh giá sự đa dạng về kiểu gen, kiểu hình
và đa hình protein …. Một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng
kháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus, kháng mọt,… trên một số giống
đậu xanh. Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt tính, tác dụng của Isoflavone
đậu xanh và về gen isoflavone ở đậu xanh vẫn còn rất hạn chế.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế khách quan đó, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: "So sánh trình tự gen tổng hợp Isoflavone phân lập từ đậu xanh".
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm trình tự gen CHI phân lập từ hai mẫu
giống đậu xanh.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách DNA tổng số, tách mRNA tổng số, nhân gen, tách dòng gen và
xác định trình tự gen của 2 mẫu giống đậu xanh nghiên cứu.
- So sánh trình tự gen CHI và trình tự amino acid suy diễn của protein
CHI từ 2 mẫu đậu xanh nghiên cứu với mẫu trên ngân hàng gen.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây đậu xanh
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh
Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck] hay còn gọi là đậu nhỏ,
đậu chè, có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo.

Cây đậu xanh đươ ̣c xế p trong hê ̣ thố ng phân loại khoa học như sau:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Phân họ: Faboideae
Chi: Vinga.
Loài: V.radiata.
Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loài thuộc hai chi phụ
là Vigna và Ceratotropic. Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu
châu Á, bao gồm 16 loài trong đó có 5 loài trồng trọt là: Đậu xanh (Vigna
radiata (L).Wiliczek), đậu gạo (Vigna umbellata (thumb)), đậu ván (Vigna
aconiti folia (Jacq)), đậu Adzukia (Vigna angularis (Wild), và Vigna
trilobata (L).Wildzek [3], [5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




4

Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi
ở các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương [5].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây đậu xanh
Đậu xanh là cây hàng năm, thuộc loại thân thảo, thân yếu có lớp lông
mịn màu nâu sáng. Thân cây gồm 7-8 đốt, phân cành muộn, chiều cao cây
trung bình 40-70 cm, đường kính trung bình 8-12 mm. Một cây đậu xanh
hoàn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt (Hình 1.1).

a

b

c

d

e

f
Nguồn [43], [44].

Hình 1.1. Cây đậu xanh
(a):thân, lá, hoa cây đậu xanh; (b):cây đậu xanh giai đoạn bắt đầu ra quả
non;(c):cây đậu xanh giai đoạn quả chắc; (d):cây đậu xanh vào thời kỳ
chín;(e):quả đậu xanh lúc chín; (f):hạt đậu xanh
Rễ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




5

Bộ rễ đậu xanh bao gồm rễ chính và rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu
vào đất khoảng 20-30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70-100
cm. Rễ phụ thường có 30-40 cái, dài khoảng 20-25 cm, phân bổ chủ yếu ở
tầng mặt, không sâu quá 25 cm [2]. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu

bì rễ biến đổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh
dưỡng cho cây. Ở các điểm tiếp giáp rễ chính và rễ phụ cũng như trên
chiều dài của rễ phụ thường hình thành nhiều nốt sần. Nốt sần là nơi tụ tập
vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. So với một số loại đậu đỗ khác thì số
lượng nốt sần của cây đậu xanh ít hơn, nốt sần nhỏ hơn. Thường trung bình
trên mỗi cây có khoảng 20-30 nốt sần, tập trung chủ yếu ở cổ rễ. Kích
thước của các nốt sần không giống nhau, đường kính dao động từ 4-5 mm.
Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2-3 lá thật và đạt tối đa
khi cây ra hoa rộ. Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn
các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn. Người ta nhận thấy rằng
những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động
mạnh hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng. Trung bình
mỗi vụ, một ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85-107 kg nitơ
làm cho đất tơi xốp hơn [7], [9]. Nếu bộ rễ phát triển tốt thì bộ lá xanh lâu,
cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy. Ngược lại, bộ rễ phát triển kém thì cây sẽ
chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ bị lép [3], [8].
Thân, cành
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng
40-70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có
màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




6

sáng bao bọc. Thân có 3 dạng: đứng thẳng, đứng nghiêng, bò lan trên mặt đất.
Dạng bò lan thường chỉ gặp ở các vùng đồi núi của Ấn Độ và Mianma.

Trên thân chia 7-8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng. Độ dài của các lóng
thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác. Các lóng dài khoảng 8-10
cm, các lóng ngắn chỉ 3-4 cm. Từ các đốt mọc ra các cành, trung bình có 1-5
cành. Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh gọi là cành cấp
I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2-3 mắt, từ các mắt này mọc ra các
chùm hoa. Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùm hoa. Thời kỳ trước
khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm, sau đó mới tăng
nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc đã có quả chắc.
Đường kính trung bình của thân chỉ từ 8-12 mm và tăng trưởng tỷ lệ thuận với
tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [3].
Lá
Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi
thân chính có 7-8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn.
Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên và
dưới của lá đều có lông bao phủ. Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên, các
lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn. Chỉ số diện tích lá (m2
lá/m2 đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch.
Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc
vào giống, đất trồng và thời vụ [2], [3].
Hoa
Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,
xếp xen kẽ nhau ở trên cuống. Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ
ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




7

đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây mọc 18-20 ngày thì mầm hoa
hình thành, sau 35-40 ngày thì nở hoa. Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu
tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10-15 ngày. Mỗi chùm hoa dài từ 2-10 cm
và có từ 10-125 hoa. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu xanh
tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt [3]. Hoa đậu xanh thường nở rải rác,
các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn chậm
hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây. Trên cùng một cành, các chùm hoa
cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10-15 ngày. Trong một chùm hoa cũng
vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh 10-15 ngày. Hoa
nở được 24 giờ là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quả chín.
Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây. Công thức
hoa là: K5C5A10G1[3].
Thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm:
- Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài trong 16 ngày.
- Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp trong 30 ngày.
- Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày.
Quả và hạt
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng
dẹt với đường kính 4-6 mm, dài 8-14 cm, dài khoảng 8-10 cm, có 2 gân nổi rõ
dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màu
xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen... gặp nắng rễ bị tách
vỏ. Một cây trung bình có khoảng 20-30 quả, mỗi quả có từ 5-10 hạt. Trên vỏ
quả được bao phủ một lớp lông mịn. Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của
giống và khả năng chống chịu của cây. Những giống đậu xanh chống chịu bệnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




8

khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông dày, vào thời kì chín hoàn toàn
lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [1], [2]. Các quả của những lứa
hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra lứa sau đó, nhưng quả to và hạt
mẩy hơn. Các quả của những đợt hoa ra sau thường ngắn, ít hạt, hạt không mẩy,
màu hạt cũng nhạt và bé hơn. Các quả sinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều
quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ở cành. Quả đậu xanh chín rải rác,
có khi kéo dài đến 20 ngày [9].
Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất
dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là
nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên. Hạt có hình
tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và có nhiều màu sắc khác nhau như:
màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn cách
nhau bằng những vách xốp của quả. Ruột hạt màu vàng, xanh, xanh nhạt.
Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu quan trọng để
đánh giá chất lượng của hạt. Mỗi quả có từ 8-15 hạt. Hạt của những quả trên
thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành. Hạt của các quả lứa đầu
cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau. Số lượng hạt trung bình trong một quả là
một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh. Trọng
lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20-90 gam tùy giống, thời vụ và chế
độ canh tác. Trọng lượng 1000 hạt từ 50-70 gam[9].
1.1.3. Giá trị của cây đậu xanh
Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, đứng hàng thứ ba
sau đậu tương và lạc. Về dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm
giàu đạm (khoảng 24-28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng 1,3%, glucid
60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P… cùng nhiều loại vitamin
hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C… Protein hạt đậu xanh chứa đầy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9

đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine,
methyonine, valine…[3], [8].
Protein đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế và tương
đối phù hợp với tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em được tổ chức Nông
lương và y tế thế giới đưa ra theo bảng 1.1.
Hàm lượng dinh dưỡng trong 100g bột đậu xanh không tách vỏ có
24,0g Protein; 1,3g dầu; 59,7g hydratcacbon; 3,5g khoáng; 124mg Ca; 326mg
P; 7,3mg Fe; 94,0mg Caroten; 0,47mg B1; 0,39mg B2 và 334kcalo.
Bảng 1.1. Amino acid trong bột đậu xanh và tiêu chuẩn của FAO/WHO

Amino acid

Bột Đậu Xanh
(% protein)

Thực phẩm tiêu chuẩn
FAO/WHO -2007
(% protein)

Isoleicine

3,5

3,6

Leucine

5,9

7,3

Lycine

6,1

6,4

Methionin + Cystine

2,0

3,5

Phenyalanin + Tyrosine

6,7

7,3

Threonine

2,1

4,2

Tryptophan

1,8

1,0

Valin

4,1

5,0

(Nguồn: FAO năm 2007)
Hạt đậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà
còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị và làm nguyên liệu cho công nghiệp chế
biến và tinh rút protein. Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại
thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè,
xôi đỗ và một số đồ uống...[8]. Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




10

dùng để làm rau, muối dưa. Thân lá xanh của cây đậu xanh dùng làm thức ăn
cho chăn nuôi, còn thân lá già đem phơi khô, nghiền nhỏ làm bột dự trữ cho
gia súc...[3], [8]. Ngoài ra, đậu xanh còn có giá trị trong y học. Hạt đậu xanh
có vị ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [4].
Cây đậu xanh ngoài giá trị kinh tế nó còn có giá trị vô cùng quan trọng
khác về mặt sinh học, đó là khả năng cố định nitơ khí quyển thành đạm cung

cấp cho cây nhờ vi khuẩn Rhirobium virgana cộng sinh ở bộ rễ. Lượng đạm
cố định được phụ thuộc vào môi trường đất tương đương từ 30 - 60kg N/ha.
1.2. Thành phần và hoạt tính của Isoflavone
1.2.1. Thành phần của Isoflavone
Isoflavone có nguồn gốc phytoestrogen thực vật thuộc nhóm các hợp
chất flavonoid. Các hợp chất này được tìm thấy đầu tiên trong phân lớp đậu
thuộc họ đậu. Chúng là các hợp chất phenolic với cấu trúc tương tự cấu trúc
của estrogen ở người. Isoflavone có trong nhiều loại đậu khác nhau, trong đó
có cả ở đậu xanh.
Isoflavone tồn tại ở dạng tự do aglucon và dạng liên kết glucosid.
Isoflavone dạng tự do gồm có 3 loại genistein, daidzein và glycitein; có hoạt
tính sinh học cao hơn rất nhiều so với các Isoflavon còn lại. Genistein và
daidzein (hình 1.2) là hai hợp chất isoflavone tự nhiên đang được nghiên cứu
vì lợi ích sức khỏe đáng kể mà nó đem lại, hai hợp chất này chiếm phần lớn
trong tổng số các Isoflavone. Theo Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa
Kỳ (FDA) thì tổng hàm lượng daizdein và genistein chiếm khoảng từ 93%
đến 98% Isoflavone tổng số.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




11

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Genistein và Daidzein [45].

Genistein:
Genistein thuộc nhóm các isoflavones. Genistein có tên đầy đủ 7Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-one hay 4',5,7-Trihydroxyisoflavone.
Genistein đã được xác định có mặt trong nhiều loại đậu, rau quả và ngũ cốc

khác với hàm lượng khác nhau. Genistein cũng đã được chứng minh là
một phytoestrogen và có khả năng phát huy nhiều tác dụng cũng như ảnh
hưởng khác nhau khi có mặt trong cơ thể. Các tác động của hợp chất này
có thể thông quan thụ quan của hormon sinh dục nữ estrogen hoặc không
quan thụ quan này [24].
Genistein có tác động tương tự estrogen (estrogen angonist): Kích thích
sự phát triển và duy trì các đặc tính sinh dục cái (bao gồm cả các đặc điểm sinh
dục sơ cấp và thứ cấp). Genistein có khả năng hạn chế loãng xương ở phụ nữ
mãn kinh, ảnh hưởng tốt đến tim mạch và nồng độ cholesterol trong máu. Hạn
chế đáp ứng của tế bào với estrogen nhờ khả năng "khóa" các thụ quan của
hormon này.
Một số Isoflavone (bao gồm genistein) có khả năng hạn chế quá trình
hình thành mạch máu mới (antiangiogenic), ức chế các tế bào phát triển vô giới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




12

hạn có liên quan đến ung thư và có khả năng ức chế hoạt tính của một số thành
phần tham gia điều khiển quá trình phân chia và sống sót của tế bào.
Các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm cho thấy genistein và một số
isoflavone có khả năng hạn chế sự phát triển của các loại ung thư nói trên khi
cơ thể được tiếp xúc sớm với những chất này nhưng có khả năng làm tăng nguy
cơ bị bệnh khi phải thu nhận chúng trong giai đoạn bào thai (qua hệ tuần hoàn
của mẹ) hoặc ở nhưng cá thể trưởng thành nhưng có nồng độ estrogen trong
máu thấp.
Một số nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa Isoflavone với các
bệnh ung thư vú, sai lệch sự phát triển của dương vật, thiếu máu (do genistein

có khả năng ức chế enzyme topoisomerase đẫn đến phá hủy mạch kép của
DNA và gây đột biến). Trong khi đó, các nhà khoa học tại Viện nghiên cứu ung
thư Hoa Kỳ đã thử nghiệm trên động vật nhưng không tìm thấy ảnh hưởng có
hại của genistein. Nghiên cứu lâm sàng trên người đang được tiến hành [26].
Cơ chế tác động: Genistein là chất ức chế tyrosine kinase (các enzym có
khả năng xúc tác cho quá trình chuyển nhóm phốt phát từ ATP đến tyrosin).
Tyrosine kinase có liên quan đến hầu hết các tín hiệu của quá trình phát triển và
phân chia tế bào [42].
Daidzein:
Daidzein là chất rắn hầu như không tan trong nước. Daidzein có hoạt
tính estrogen và hoạt tính chống oxy hóa. Nó cũng có hoạt tính kháng nghiện
rượu, kháng các nhân tố gây ung thư, kháng xơ vữa động mạch, kháng hội
chứng loãng xương.
Daidzein được hấp thụ ở ruột sau đó được vận chuyển vào chu trình của
cơ thể bởi hệ bạch huyết, có rất ít daidzein đến được các mô. Sau đó chúng
được phân phối tới gan dưới dạng liên kết với gluconat và sulphat nhờ Enzyme
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




13

UDP-glucurostyltransferaza. Dạng liên kết của daidzein với gluconat và
sulphat được bài tiết vào trong nước tiểu và vào trong ống dẫn mật. Dạng liên
kết này lại bị cắt để tạo thành daidzein được hấp thụ và chuyển hóa ở ruột già
thành dihydrodaidzein và sau đó được chuyển thành Equol và Odesmethylangolensin.
1.2.2. Hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của Isoflavone
Isoflavone giúp cho sự cải thiện toàn bộ về chất lượng sống của phụ nữ
mãn kinh. Ăn các thực phẩm giàu isoflavone đã cải thiện rõ rệt những triệu

chứng của tuổi mãn kinh so với ở nhóm phụ nữ dùng chế độ dinh dưỡng
thông thường [27].
Hiệu quả của Isoflavone trên da của phụ nữ sau mãn kinh cũng đã được
nghiên cứu. Tiến hành nghiên cứu với những phụ nữ sau mãn kinh (n=30),
trước và sau khi điều trị với 100mg/ngày bằng chiết xuất đậu tương đậm đặc
giàu isoflavone trong thời gian 6 tháng. Trước và sau liệu trình điều trị, một
mẩu da ở vùng mông được lấy mẫu. Đánh giá hình thái học xác định độ dầy
của biểu mô, nếp nhăn (chỉ số nhú), sợi đàn hồi và sợi collagen của da. Số
lượng mạch máu ở các mẫu này cũng được phân tích. Tăng 9.46% độ dầy
biểu mô được quan sát thấy ở 23 bệnh nhân sau điều trị Isoflavone. Chỉ số
nhú tỉ lệ nghịch tương ứng với nếp nhăn da. Ở 25 phụ nữ (86.2%) có tăng số
lượng collagen trong da. Ở 22 phụ nữ (75.8%) có tăng sợi đàn hồi của da. Ở
21 phụ nữ có sự tăng đáng kể các mạch máu trong da. Kết quả của nghiên cứu
này chứng minh rằng bổ sung chiết xuất đậu tương đậm đặc giàu isoflavone
trong 6 tháng làm tăng đáng kể độ dầy lớp biểu mô, mạch máu, sợi đàn hồi và
sợi collagen của da [10].
Vai trò của các isoflavone trong việc ngăn chặn bệnh ung thư, đặc
biệt là các bệnh ung thư phụ thuộc vào hormone như màng trong tử cung, ở
vú, buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt thay đã được nghiên cứu rộng rãi.
Kết quả cho thấy các bệnh này rất ít phổ biến ở các nước phương Đông, nơi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




14

có chế độ ăn giàu đậu tương. Sự bài tiết nước tiểu cao của equol và
enterolactone (các sản phẩm chuyển hoá của Isoflavone ở động vật có vú)
đã được tìm thấy có liên quan đến việc giảm đáng kể nguy cơ ung thư vú.

Kết quả từ 26 nghiên cứu trên động vật thực nghiệm về ung thư đã chỉ ra
tác dụng bảo vệ trong 17 nghiên cứu (chiếm 65%), gồm có giảm nguy cơ
ung thư, số khối u và không có nghiên cứu nào cho thấy đậu tương làm
tăng khối u [27].
Nhiều cơ chế chống ung thư của các Isoflavone và genistein đã được đề
xuất. Genistein ức chế hoạt động của enzyme tyrosine kinase trong sự tự
phosphoryl hoá của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF), ức chế tăng sinh tế bào,
trong khi equol có liên quan đến biểu hiện của gene estrogen. Các tác dụng
khác được đề xuất như ức chế enzyme topoisomerase DNA, ức chế chu kỳ
phát triển tế bào, ức chế sự hình thành mạch, ức chế enzyme tham gia vào các
quá trình tổng hợp estrogen [28].
Hiệu quả bảo vệ của Isoflavone chống lại ung thư tuyến tiền liệt đã
được xem xét, đặc biệt là tác dụng của equol, một sản phẩm có thể được xem
là một antiandrogen mới. Tỷ lệ tử vong do mắc ung thư tuyến tiền liệt ở Mỹ
cao hơn nhiều so với tại các nước châu Á như Nhật Bản và Trung Quốc, nơi
có chế độ ăn uống giàu đậu tương [31].
Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi James W. Anderson, với 730
tình nguyện viên để xem ảnh hưởng của việc ăn protein đậu nành với hệ
thống mạch máu qua việc đo lường chất cholesterol. Sau khi thử nghiệm và
phân tích các dữ kiện thâu thập, kết quả cho thấy là lượng cholesterol trong
máu giảm theo tỷ lệ lượng tiêu thụ protein đậu nành: nhóm ăn 25 grams một
ngày giảm 8.9 mg/dl, nhóm ăn 50 grams giảm 17.4 mg/dl, và nhóm ăn 75
grams protein đậu nành giảm 26.3 mg/dl lượng cholesterol trong máu. Tính
chung thì lượng cholesterol giảm 9.3%, lượng LDL cholesterol giảm 12.9%,
lượng triglycerides VLDL giảm 10.5%, và lượng HDL cholesterol tăng 2.4%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15

Bởi vì mỗi 1% lượng cholesterol giảm sẽ làm giảm mức độ nguy hiểm của
bệnh động tim và tai biến mạch máu não từ 2% đến 3%, cho nên với lượng
trung bình cholesterol giảm 9.3% độ nguy hiểm về bệnh tim mạch có thể xảy
ra sẽ giảm được 18% đến 28% [11].
Hoạt tính chống oxy hoá là một trong những cơ chế có thể góp phần
vào tác dụng bảo vệ tim mạch của đậu tương và các isoflavone có trong đậu
tương. Các Isoflavone có cấu trúc hoá học giống với estrogen, có tác dụng
chống oxy hoá yếu vì có nhóm -OH ở vòng "A", tương tự vị trí trong cấu trúc
của vitamin E, dẫn đến làm bền vững màng tế bào, bảo vệ tế bào với quá tŕnh
peroxide lipid. Ngoài ra, các isoflavone còn có nhiều nhóm -OH, giúp tăng
cường hiệu quả chống oxy hoá của chúng bằng cách cho các gốc peroxyd
nguyên tử hydro của nhóm -OH phenol. Sự khác nhau về hiệu lực giữa
genistein và daidzein là do sự có mặt của nhóm 5-hydroxyl, làm cho genistein
có tác dụng tốt hơn daidzein. Tác dụng chống oxy hoá của các isoflavone có
thể làm giảm các tác hại của gốc tự do gây ra với DNA [36], [38].
Nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng của isoflavones đậu tương đối
với điều trị suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ đã được tiến hành. Một nghiên
cứu quan sát nhằm kiểm tra mối quan hệ giữa lượng đậu nành và chức năng
nhận thức thấy rằng những người đàn ông Hawaii đã tiêu thụ đậu phụ ít nhất
hai lần một tuần trong độ tuổi trung niên có nhiều khả năng duy trì trí nhớ sau
20-25 năm sau đó hơn so với những người báo cáo tiêu thụ đậu phụ ít hơn hai
lần một tuần [37].
1.3. Gen và con đường sinh tổng hợp Isoflavone
1.3.1. Con đường sinh tổng hợp Isoflavone
Isoflavone được tổng hợp từ một nhánh của con đường trao đổi chất
phenylpropanoid (Hình 1.3).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

16

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone [32]
Phản ứng đầu tiên là một aminno acid L-phenylalanine loại bỏ đi nhóm
amin để tạo ra axit cinnamic qua các enzyme lyase phenylalaninen ammonia
(PAL). Đầu tiên, phenylalanine phản ứng với malonyl CoA để tạo thành 4
hydroxycinnamoyl CoA. Dưới sự kiểm soát xúc tác của chalcone synthase, 4CoA hydroxycinnamoyl ngưng tụ với ba phân tử malonyl CoA để tạo thành một
chalcone. Isomerase chalcone xúc tác đóng vòng của vòng dị vòng. Isoflavone
synthase gắn một nhóm 2-hydroxyl, sau đó được gỡ bỏ bởi một dehydratase
isoflavone để tạo thành daidzein (7,4'-dihydroxyisoflavone) và genistein (5,7,4'trihydroxyisoflavone) [32].
1.3.2. Gen tổng hợp Isoflavone
Hai enzyme chìa khóa quan trọng trong con đường sinh tổng hợp
Isoflavone là chalcone isomerase (CHI) và isoflavone synthase (IFS) [19].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN