“NGHIÊN cứu điều CHẾ, PHÂN bố SINH học và KHẢ NĂNG gắn với tế bào UNG THƢ của PHỨC hợp MIỄN DỊCH PHÓNG xạ 131I–RITUXIMAB

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
______________________

NGUYỄN THỊ THU

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC VÀ
KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƢ CỦA PHỨC
HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131I–RITUXIMAB”

Chuyên ngành: Mô - phôi và tế bào học
Mã số:

62420117

(DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2016
1


Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu hạt nhân, Đà
Lạt,

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Mai Trọng Khoa
2. PGS.TS. Võ Thị Thương Lan

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . …

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia
chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
...................................................
Vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm 20 ...

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
2


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu điều chế dược
chất phóng xạ gắn kháng thể đơn dòng dùng trong điều trị miễn
dịch phóng xạ đang được sự quan tâm lớn của y học. Nhiều
nghiên cứu mới vẫn đang còn trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng. Việc chữa trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin đang
áp dụng hiện nay là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Tuy nhiên tỷ lệ
chết vẫn còn cao. Việc tìm ra phương thức điều trị hiệu quả vẫn
đang là thách thức đối với các nhà khoa học.
Cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào hiệu quả hơn

để điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin, dược chất
phóng xạ đang được sử dụng lâm sàng đã được sử dụng là
Bexxar và Zevalin, tuy nhiên, kháng thể sử dụng vẫn là kháng
thể mang bản chất chuột. Để khắc phục nhược điểm trên, kháng
thể đơn dòng thế hệ mới có bản chất humanized là rituximab ra
đời, rituximab được chọn để đánh dấu với đồng vị phóng xạ 131I
tạo thành thuốc phóng xạ
phức hợp miễn dịch

131

131

I-rituximab. Với nhiều ưu điểm là

I-rituximab gắn đặc hiệu lên kháng

nguyên CD20 biểu hiện mật độ cao trên tế bào lympho B ung
thư, diệt tế bào ung thư bằng cơ chế tác động kép, đó là cơ chế
bức xạ ion hóa và cơ chế sinh học, tạo hiệu quả tiêu diệt tế bào
ung thư cao.
Để điều chế phức miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab có thể
ứng dụng lâm sàng, nâng cao hiệu quả điều trị bệnh u lympho
ác tính không Hodgkin, đề tài “Nghiên cứu điều chế, phân bố
sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn
dịch phóng xạ 131I-rituximab” được thực hiện trong luận án này.

1

Mục tiêu của luận án: Bao gồm hai phần, thứ nhất là
nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế phức miễn dịch phóng
xạ

I-rituximab và các kiểm tra chất lượng. Thứ hai là nghiên

131

cứu đánh giá tiền lâm sàng của 131I-rituximab bao gồm đánh giá
tính đặc hiệu của kháng thể sau khi đánh dấu với đồng vị phóng
xạ, đánh giá phân bố, đào thải và đánh giá tính an toàn trên
động vật thí nghiệm.
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của luận án: Bao gồm
nghiên cứu đánh dấu kháng thể đơn dòng rituximab với đồng vị
phóng xạ

I để tạo thành dược chất phóng xạ và nghiên cứu

131

hoạt tính miễn dịch, tính an toàn của

131

I-rituximab cũng như

phân bố thuốc trên chuột, thỏ thí nghiệm và nghiên cứu thăm dò
liều thám thính trên người bệnh.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
 Về ý nghĩa khoa học: Tạo ra sản phẩm thuốc phóng xạ nhắm

đích dùng trong điều trị ung thư lymphòao B không Hodgkin
bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, có tác động kép trong quá
trình điều trị, vừa tiêu diệt ung thư bằng cơ chế sinh học vừa
tiêu diệt ung thư bằng bức xạ ion hóa.
 Ý nghĩa thực tiễn:
- Có khả năng cạnh tranh với thuốc phóng xạ nhập ngoại.
- Khi kết hợp với đồng vị phóng xạ, dược chất phóng xạ có
tác động kép trong quá trình điều trị, vừa tiêu diệt ung thư bằng
cơ chế sinh học vừa tiêu diệt ung thư bằng bức xạ ion hóa.
- Góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu điều chế trong
nước. Ứng dụng điều trị miễn dịch phóng xạ tại các bệnh viện
trong nước.

2


- Mở ra hướng chẩn đoán và điều trị mới, có ý nghĩa thiết
thực cho bệnh nhân, nâng cao sức khỏe cho cộng đồng, giảm
chi phí nếu như đi nước ngoài điều trị, tiết kiệm cho xã hội.
Những điểm mới của luận án: Luận án đã nghiên cứu
điều chế và kiểm tra chất lượng dược chất phóng xạ

131

I-

rituximab dùng trong điều trị u lympho ác tính không Hodgkin.
Các điểm mới trong luận án là:
- Điều chế được sản phẩm 131I-rituximab để điều trị ung thư
bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ.

- Kết hợp được phân tử kháng thể rituximab với đồng vị
phóng xạ bằng kỹ thuật đánh dấu phóng xạ dùng chất oxy hóa,
chất khử với hàm lượng tối thiểu và kỹ thuật đánh dấu phóng xạ
trong luận án đảm bảo được hoạt tính của kháng thể.
- Kỹ thuật gắn phức hợp

131

I-rituximab lên cột sắc ký ái lực

và kỹ thuật gắn với tế bào lấy từ bệnh nhân ung thư ác tính
khôg Hodgkin.
Cấu trúc của luận án: Gồm 5 phần
Mở đầu: Gồm 2 trang
Tổng quan: Gồm 15 trang. Giới thiệu về kháng thể đơn dòng và
phương pháp điều trị miễn dịch phóng xạ, giới thiệu về đồng vị
phóng xạ dùng trong chẩn đoán và điều trị hiện nay.
Phương pháp nghiên cứu: Gồm 19 trang. Trình bày các phương
pháp nghiên cứu đã được sử dụng trong luận án.
Kết quả và bàn luận: Gồm 54 trang. Trình bày các kết quả
nghiên cứu và đánh giá, bàn luận.
Kết luận và kiến nghị: Gồm 2 trang. Trình bày tóm tắt kết quả
nghiên cứu theo mục tiêu đề ra và hướng tiếp theo.

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Ứng dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị miễn dịch
phóng xạ

Từ khi được sản xuất, kháng thể đơn dòng đã có nhiều ứng
dụng trong các lĩnh vực như y học, chăn nuôi, công nghiệp. Đặc
biệt là trong chẩn đoán và điều trị bệnh, kháng thể đơn dòng khi
gắn với chất phóng xạ hoặc hoá chất, có thể phát hiện sớm bệnh
ung thư, phát hiện sự lan truyền ung thư, ngăn chặn và loại trừ
sự phát triển của ung thư, điều trị các ung thư ác tính. Điều trị
bằng kháng thể đơn dòng là phương pháp điều trị hiệu quả đối
với tế bào ung thư nhưng mức độc thấp nhất đối với tế bào bình
thường. Sau khi tiêm, kháng thể đi khắp nơi trong cơ thể và gắn
vào các kháng nguyên đặc hiệu trên tế bào ung thư. Dựa vào
đặc điểm đó kháng thể đơn dòng được gắn với đồng vị phóng
xạ để phát huy hiệu quả điều trị.
Rituximab được cho phép sử dụng trên người vào năm
1997, được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền, dung hợp vùng
biến đổi chuỗi nặng và nhẹ của chuột với vùng hằng định
IgG1/κ của người (Hình 1.1). Kháng thể tạo thành có khả năng
tiêu diệt các tế bào B in vitro và làm giảm lượng tế bào B trong
máu ngoại vi in vivo. Sự giảm tế bào B trong tủy xương, lách và
các hạch lympho trong đã được nghiên cứu kỹ sau nhiều năm
điều trị trên lâm sàng.

4


Hình 1.1: Cấu trúc của kháng thể rituximab
Việc sử dụng rituximab được phê chuẩn phần lớn dựa trên
các thử nghiệm đối với u lympho tế bào B không Hodgkin tái
phát nhẹ. Tỷ lệ đáp ứng trong nhóm khó chữa này là khoảng
50% khi chỉ sử dụng rituximab.
1.2. Phƣơng pháp đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ

I: Từ khi kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng phát triển,

131

người ta đã đánh dấu với các đồng vị phóng xạ như
111

In,

123

I,

131

I, 67Ga,

Tc, 90Y … Việc chọn đồng vị phóng xạ dựa trên

99m

những đặc điểm là thời gian bán rã phải từ 6 giờ đến 7 ngày là
thích hợp, năng lượng gamma từ 70 - 300 keV, độ giàu gamma
đơn năng trên mỗi phân rã phải cao, không có những bức xạ
đặc biệt khác, đồng vị con phải ổn định và sản phẩm ở dạng
không có chất mang. Phức của nhân phóng xạ và protein phải
ổn định hóa học invivo. Việc chọn nhân phóng xạ thích hợp cho
quá trình đánh dấu ngoài tính chất riêng của từng nhân phóng
xạ thích hợp cho chụp hình hay điều trị còn phụ thuộc vào tính
chất dược động học của phân tử kháng thể.

Đồng vị phóng xạ 131I được dùng trong chẩn đoán vì nó có
nhiều thuận lợi là giá thành thấp, dễ sản xuất, nhưng còn nhiều
5


nhược điểm là còn tồn tại những iod tự do, liều bức xạ cao cho
bệnh nhân, thời gian bán rã dài. Năng lượng phát tia gamma
cho chụp hình của 131I là 364 keV, các mức năng lượng cực đại
của

131

I là Emax: 0,25, 0,33, 0,47, 0,61, 0,81 MeV, Eav 192 keV.

Kháng thể gắn

131

I có thể dùng cho chẩn đoán và điều trị. Có

hai cách để gắn phóng xạ vào

131

I, đó là phương pháp thay thế

trực tiếp iot phóng xạ vào trong vị trí ortho đã hoạt hoá trên
vòng thơm, hầu hết là tyrosine, cách khác là cộng hợp phân tử
hữu cơ đã iod hoá với nhóm chức năng trên dây chuyền phản
ứng của phân tử kháng thể.

Phương pháp thay thế trực tiếp là dùng chất oxy hoá nhẹ
để bảo toàn hoạt tính miễn dịch của kháng thể, các chất oxy hóa
thường dùng là chloramin T, tetrachlorodiphenylglycouril
(iodogen) và hydrogenperoxidase (lactoperoxidase). Các vấn đề
chủ yếu liên quan đến kỹ thuật này là sự không gắn được của
tyrosine dư thừa có thể làm duỗi phân tử protein. Phân tử duỗi
ra này sẽ làm thay đổi cấu trúc toàn vẹn của protein trong môi
trường phản ứng. Ngoài ra, sự xạ phân có thể sẽ xảy ra, làm giải
phóng iod tự do và có thể sẽ tích lũy trong tuyến giáp hoặc
trong dạ dày. Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà
nghiên cứu vẫn tiến hành nghiên cứu đánh dấu kháng thể với
131

I cho mục đích điều trị bệnh ngày càng nhiều.
Việc điều trị u lympho ào B không Hodgkin bằng kháng

thể đơn dòng được mở đầu bởi Gerald DeNardo, Sally
DeNardo, David trường đại học California năm 2006. Bên cạnh
đó, kháng thể đơn dòng gắn phóng xạ

131

I-rituximab đã được

thực hiện lâm sàng bởi các tác giả Sang Mao Lim và cộng sự từ
năm 2007 đến nay, hiệu quả điều trị cho thấy khả năng thành
6


công là đáng kể. Các tác giả Leahy MF, Turner JH (2011) cũng

đã có nhiều thành công sau hơn 10 năm điều trị lâm sàng dùng
131

I-rituximab.

2. PHƢƠNG PHÁP GHIÊN CỨU
Các nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Viện
Nghiên cứu hạt nhân, Bệnh viện Bạch Mai và Học viện Quân y.
Các phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị, nguyên vật liệu
đã sử dụng được trình bày như sau:
2.1. Phƣơng pháp gắn kháng thể đơn dòng rituximab với
đồng vị phóng xạ
vị phóng xạ

131

131

I: Dùng phương pháp oxy hóa khử, đồng

I bị oxi hóa tạo thành iodine-131[131I+] và gắn

vào phân tử tyrosine tại vị trí ortho trên vòng phenol với hiệu
suất gắn cao. Kháng thể đơn dòng rituximab được khảo sát
đánh dấu với đồng vị phóng xạ

131

I. Các khảo sát hàm lượng

chloramin T, khảo sát pH, khảo sát hàm lượng kháng thể, thời
gian phản ứng. Kết quả được tính toán bằng phần mềm trên
máy quét phóng xạ Bioscan hoặc Cyclone. Hiệu suất đánh dấu
của kháng thể được tính toán bằng cách chia hoạt độ phóng xạ
tại vị trí đỉnh 131I- rituximab cho hoạt độ tổng cộng.
2.2. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel dùng sephadex G25: Để tách
phân đoạn kháng thề đánh dấu với đồng vị phóng xạ ra khỏi
hỗn hợp phản ứng, cột sephadex PD10 pharmacia, GE
Healthcare được sử dụng. Phức hợp 131I-rituximab được tách ra
khỏi

131

I tự do và các thành phần khác. Dung môi rửa giải là

nước muối sinh lý 0,9% hoặc đệm PBS. Vận tốc rửa giải là
30cm3/giờ. Hoạt độ phóng xạ của phức hợp và hiệu suất đánh
dấu được xác định.
2.3. Phƣơng pháp xác định độ tinh khiết hóa phóng xạ:
Dùng phương pháp điện di và các phương pháp sắc ký lớp
7


mỏng TLC, TCC, sử dụng các bản mỏng thích hợp như TLC
aluminum sheet silica gel 60 F254. TecControl Biodex 150771.
Độ tinh khiết hóa phóng xạ và hiệu suất đánh dấu được tính
toán bằng cách scan băng sắc ký trên thiết bị quét phóng xạ
Bioscan hoặc máy phóng xạ tự chụp Cyclone, tính toán bằng
phần mềm OptiQuan 5.0, phần mềm Biochrom. Thử theo Tiêu
chuẩn cơ sở DPPX-13:2010 ISO 17025.

2.4. Phƣơng pháp xác định độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ:
Bằng các phương pháp đo phổ gamma trên hệ phổ kế gamma,
thử theo Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS-DPPX-14:2010 ISO 17025).
Chấm 2 l dung dịch mẫu lên tâm giấy lọc hình tròn có đường
kính là 1,5 cm. Đo tốc độ đếm trên phổ kế gamma ORTEC®
DSPEC jrTM (USA). Nhận diện các hạt nhân phóng xạ phát tia
gamma qua các đỉnh năng lượng ghi được trên phổ kế gamma.
Tính diện tích các đỉnh gamma trên chương trình
GammaVision 32 và phần trăm hoạt độ phóng xạ 131I tại đỉnh
364 keV so với tổng hoạt độ. Hoạt độ phóng xạ của 131I lớn hơn
99,90 %.
2.5. Các phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng sinh học: Sản
phẩm được kiểm tra độ vô khuẩn, chí nhiệt tố, kiểm tra phân bố
sinh học trên động vật. Thử nội độc tố vi khuẩn được thực hiện
trên máy Endosafe PTS100. Thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX15:2010 ISO 17025. Thử vô khuẩn bằng phương pháp cấy
thuốc vào các môi trường thioglicolat ủ ở nhiệt độ 30 - 350C,
môi trường soya - bean casein ủ ở nhiệt độ 20 -250C, quan sát
14 ngày liên tục, thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX-13:2010 ISO
17025. Kiểm tra tính ổn định bằng cách bảo quản ở điều kiện
40C và -200C. Sau các khoảng thời gian lấy sản phẩm phân tích
độ tinh khiết hoá phóng xạ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
TLC. Để làm ổn định sản phẩm trong huyết thanh người, pha
8


loãng dung dịch 131I- rituximab đến nồng độ 100 MBq/ml, thêm
vào đó huyết thanh và ủ 370C tại các khoảng thời gian. Sản
phẩm phân tích bằng phương pháp TLC hoặc điện di, đo đếm
hoạt độ phóng xạ, tính toán phần trăm tỉ lệ giữa các phần trên
hoạt độ tổng. Phân bố sinh học trên chuột được thực hiện bằng

cách tiêm thuốc vào tĩnh mạch đuôi chuột, chia chuột thành
nhóm, 5 chuột, giết và mỗ theo các khoảng thời gian lấy các cơ
quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ, xương, phổi, tim, máu,
ruột, dạ dày, bọng đái, đuôi, cân và đo đếm phóng xạ, tính phân
bố theo liều tiêm trên gam (ID%/g).
2.6. Các nghiên cứu in vitro và in vivo
- Nuôi cấy và tăng sinh tế bào ung thư Raij: Môi trường
nuôi cấy và bảo quản tế bào là RPMI có bổ sung thêm 10%
FBS và 1% Penicillin/Streptomycin. Tế bào sau khi gieo được
nuôi trong tủ nuôi cấy tế bào, duy trì nhiệt độ ở 370C và nồng
độ CO2 là 5%. Kiểm tra tế bào và thay môi trường 2-3 lần/
tuần. Sau 1-2 tuần nuôi cấy, tế bào phát triển, khi đạt mật độ
cấy chuyền sang các chai nuôi mới. Sau thời gian nuôi cấy 8 10 ngày, thu hoạch tế bào và thêm đệm PBS để có nồng độ tế
bào là 107 tế bào/ml.
- Kiểm tra tính an toàn và đào thải trên động vật: Tiêm vào
tĩnh mạch tai thỏ dung dịch

131

I – rituximab với các liều từ 500

Ci đến 5000 Ci, thỏ được chia thành 6 nhóm, mỗi nhóm 5
con. Tiêm tiền liều bằng rituximab, mỗi con 100 mcg theo
đường tĩnh mạch tai. Nhóm đối chứng tiêm nước muối sinh lý
0,9%. Thỏ được gây mê bằng Thiopental và chụp hình phân bố
thuốc trên máy máy xạ hình SPECT với tốc độ 10 cm/ phút, độ
phân giải 256 x 1024 pixel tại các thời điểm sau tiêm theo các

9

khoảng thời gian. Xác định đào thải thuốc theo các thông số
đếm trên máy SPECT.
- Phương pháp gắn

131

I-rituximab với kháng nguyên CD20:

Kháng nguyên CD20 được cố định lên cột sắc ký ái lực dựa
trên ái lực của niken nitroacetic acid agarose với đuôi histag
trên phân tử kháng nguyên CD20. Sau khi gắn kháng nguyên
CD20 lên cột niken NTA agarose. Phức kháng thể

131

I-

rituximab được ủ trong đệm tris-HCl. Sau khi ủ, lấy hạt ra, rửa
với Tris-HCl nhiều lần, lần sau cùng thay bằng đệm phosphate
PBS, sau đó tách phần gắn không đặc hiệu và phần tự do, đo
hoạt độ phóng xạ và tính phần trăm hoạt tính gắn.
- Phương pháp gắn 131I-rituximab với tế bào bạch cầu bệnh
nhân NHL: Thực nghiệm gắn

131

I-rituximab với tế bào được

tiến hành theo phương pháp Lindmo. Tách tế bào lympho với

số lượng đủ tế bào để làm ống đôi. Cho

131

I-rituximab ủ với tế

bào bạch cầu lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán là u lympho ác
tính không Hodgkin, có dấu ấn CD20 (+). Phản ứng gắn với tế
bào được thực hiện trong các ống thủy tinh trong đệm PBS 0,15
mM, pH 7 và so sánh với các ống gắn không đặc hiệu Non
Specific Binding (NSB) và các ống tổng.
- Gắn 131I-rituximab với tế bào Raji và nguyên bào sợi: Cho
phức hợp 131I-rituximab gắn với một lượng tế bào ung thư Raji.
Các ống gắn không đặc hiệu Non Specific Binding (NSB) và
ống gắn nguyên bào sợi được thực hiện đồng thời. Sau khi ủ, đo
hoạt độ phóng xạ của các ống ằng cách dùng hệ lọc milipore 96
lỗ, rửa 3 lần, thu màng lọc chứa tế bào, đo hoạt độ phóng xạ
trên máy đo gamma cùng với ống tổng. Tính đặc hiệu của
kháng thể được xác định dựa trên hằng số Bmax và Kd bằng
10


phương pháp phân tích Schatchard dùng phần mềm Graphpad
Prism 7,01.
* Các trang thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng
- Máy phóng xạ tự chụp Cyclone Plus Phosphor Scanner,
B431200, PerkinElmer, Mỹ
- Máy đo hoạt độ phóng xạ Capintec, miền đo từ 0,0018000mCi, Mỹ.
- Hệ phổ kế gamma đa kênh, độ phân giải tại đỉnh năng lượng
1332keV của Co-60 là 1,9keV của hãng Ortec, Mỹ.

- Máy SPECT hãng SIEMENT
- Máy sắc ký lỏng cao áp FPLC 6850A, Perkin Elmer, cột
Agilentb Zorbax GF-250
- Máy đo nhanh nội độc tố vi khuẩn Endosafe - PTSTM
Portable Test System 100, Mỹ.
- Phòng sạch vô trùng, class <10.000
- Tủ hút vô trùng, Class 100, Mỹ.
* Nguyên liệu, hoá chất chủ yếu: Đồng vị phóng xạ 131I dạng
Na131I sản xuất tại Viện Nghiên cứu hạt nhân, nồng độ phóng
xạ 100-200 mCi/ml. Rituximab, chai 500 mg/50ml, hãng
ROCHE. Kháng nguyên CD20 mua từ hãng fitzgerald, Mỹ. Cột
gel Sephadex G25 mua từ hãng Amersham Bioscences. NiNTA Agarose R901-15, hãng invitrogen, Mỹ. Các hoá chất
chloramin T, natri metabisulphite, mua từ hãng Sigma Aldrich.
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả đánh dấu kháng thể rituximab với đồng vị
phóng xạ 131I
- Kết quả khảo sát đánh dấu phóng xạ: Hàm lượng ChT tham
gia trong phản ứng đánh dấu trong khoảng 20 - 200 g để oxy
hóa từ 5 - 50 mCi

131

I (Hình 4.1A). Hàm lượng kháng thể là

khoảng 100 g để có thể gắn với mức tối thiểu hoạt độ phóng
11


xạ là 5 mCi (Hình 4.1B). Phản ứng đánh dấu đạt hiệu suất cao
nhất ở pH 7 - 8 (Hình 4.1C), tại pH này có thể làm cho kháng

thể ổn định trong quá trình bảo quản và điều trị trên con người.
Thời gian phản ứng đánh dấu là khoảng từ 1 đến 5 phút (Hình
4.1B), thời gian này đủ nhanh để có thể các phân tử tiếp xúc
nhau, phản ứng nhanh và người thực hiện có thể kết thúc phản
ứng. Kết quả cho phản ứng đánh dấu đạt hiệu suất cao 96% và
phương pháp đánh dấu ổn định (Hình 3.1D).

Hình 3.1: Khảo sát các điều kiện điều chế 131I-rituximab
- Quy trình đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ: Để điều
chế

I-rituximab có hoạt độ riêng 6,6 Ci/g, kháng thể được

131

đánh dấu với

131

I trong đệm phosphat 0,5 M, pH 7,5. Cho vào

chai phản ứng theo thứ tự 100 l đệm phosphat, 300 l
rituximab (10 mg/ml), 100 l dung dịch phóng xạ Na131I có
hoạt độ 740 MBq, thêm 50 l ChT (2 mg/ml). Lắc trộn nhẹ cho
12


phản ứng xảy ra trong 3-5 phút. Sau đó, cho 100 l SMB (4
mg/ml) vào, trộn nhẹ 30 giây. Hỗn hợp phản ứng được nạp cột
sephadex PD10 và tách, thu phân đoạn sản phẩm, đo hoạt độ

phóng xạ và bảo quản thuốc ở điều kiện lạnh.
Trong miền pH tối ưu là 7,5 - 8,5, sự oxy hoá của
thành I dễ dàng, phản ứng gắn
+

131

I tạo

131

I vào phân tử kháng thể hiệu

quả hơn. Khi pH lớn hơn 8,5 hiệu suất đánh dấu giảm, có lẽ do
phản ứng không thuận nghịch tạo thành IO3- :
I2 + OH-

IO3- + I + H2O

Trong miền pH nhỏ hơn 6,5 hiệu suất phản ứng ít hiệu quả
hơn do sự phân ly của HOCl trong môi trường axit.
Tóm lại quy trình đánh dấu phóng xạ cho thấy chất phóng
xạ

131

I gắn dễ dàng vào phân tử kháng thể bằng phương pháp

chloramin T. Hiệu suất đánh dấu cao, đạt khoảng 96%.
- Quy trình tách

131

I-rituximab: Hỗn hợp phản ứng có chứa

phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab được tinh sạch qua
cột sắc ký lọc gel sephadex G25 PD10, (Hình 3.2).

Hình 3.2: Khảo sát các điều kiện điều chế 131I-rituximab
Các thành phần 131I-rituximab, 131I tự do và các chất oxy
hóa, chất khử còn thừa được tách ra khỏi nhau bằng phương
pháp sắc ký lọc gel. Đệm tách là nước muối sinh lý 0.9% và
13


Hoạt độ phóng xạ
(mCi)

dùng đệm PBS 0,2M, pH 7,2. Cân bằng cột tách trong vài giờ,
hút dung dịch đã đánh dấu nạp vào cột gel, chờ cho dung dịch
thấm đều vào gel, rửa giải bằng dung dịch NaCl 0,9% hoặc đệm
phosphat 0,02 M. Vận tốc xối 30 cm3/giờ. Đồ thị tách phân
đoạn sản phẩm (Hình 3.3):
16
14
12
10
8
6
4

2
0

Phosphat 0,2M, pH
7,2

131I

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Phân đoạn 131I - rituximab (ml)

Hình 3.3: Đồ thị tách 131I-rituximab qua cột
Hiệu suất đánh dấu của 131I-rituximab đạt từ 94-97%. Chọn
phân đoạn có hoạt độ phóng xạ chứa phức hợp

131

I-rituximab,

thu sản phẩm, lọc qua phil lọc vô trùng 0,20m và bảo quản ở
nhiệt độ 2-40C.
Độ tinh khiết hóa phóng xạ: 131I-rituximab có độ tinh khiết hóa
phóng xạ đạt hơn 98%, TLC, 10 x 100, Bioscan. (Hình 3.4):

Hình 3.4: Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab
14


Phức

I-rituximab nằm tại vị trí gốc, độ tinh khiết hóa

131

phóng xạ là 99,4%,

131

I di chuyển về vị trí ngọn là 0,6%. Độ

tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab được phân tích trên

hệ FPLC dùng detector UV và detector đo phóng xạ, thời gian
lưu của các phân tử kết tụ của kháng thể là 12,5 phút, phân tử
rituximab và

131

I-rituximab là 14,0 phút và

Phân tử kháng thể đánh dấu phóng xạ

131

I là 22,2 phút.

131

I-rituximab và

rituximab có thời gian lưu giống nhau, (Hình 3.5):

Hình 3.5: Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, FPLC
- Độ tinh khiết hạt nhân của
gamma

131

131

I-rituximab: Kết quả đo phổ

I-rituximab được tóm tắt trong Hình 3.6 sau:

800000
I-131
IND

364 keV

700000

Counts

600000
500000

400000
300000
200000
284 keV

637 keV

100000

723 keV
0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Channel

Hình 3.6: Phổ gamma của 131I-rituximab
15

1000


Độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ của

131

I-rituximab luôn

lớn hơn 99,9%, hiện diện ở đỉnh photon có năng lượng là 364
KeV. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng của 131I-rituximab, Bảng 3.1:
Bảng 3.1: Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng của 131I-rituximab
Sản phẩm, chỉ
tiêu
Dung dịch 131Irituximab/nước
muối sinh lý
Hoạt độ riêng
pH
Hiệu suất đánh
dấu
Độ tinh khiết
hóa phóng xạ
Độ tinh khiết hạt
nhân phóng xạ

Ổn định trong
huyết thanh
Bảo quản -200C
và 40C

Chất lƣợng

Phƣơng pháp

5 mCi/10ml
Dung dịch trong
suốt, không màu
6,6 Ci/g và
2,0 Ci/g

Chloramin T

Hoạt
độ
phóng
xạ/hàm lượng KT
Theo DĐVN IV, Phụ
lục 6.2
Sắc ký lọc gel, TLC,
TCC, điện di
TCCS-DPPX 132010
TCCS-DPPX 142010

6-7
> 95,0%

> 98,0%
> 99,9%
> 95,0%

Sắc ký lớp mỏng

> 95,0%

Sắc ký điện di

Độ vô khuẩn

Đạt

Nội độc tố vi
khuẩn

< 3 EU/ml

TCCS-DPPX 162010
TCCS-DPPX 152010, pha loãng mẫu
1:40 lần

Kết quả nghiên cứu tính ổn định của sản phẩm của
rituximab trong huyết thanh ờ nhiệt độ 37 C, (Hình 3.7):
0

16

131

I-


Độ tinh khiết hóa phóng xạ
(%)

120
100
80
60
40
20
0

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Thời gian (ngày)

Hình 3.7: Đồ thị ổn định của 131I-rituximab trong huyết thanh
- Kết quả gắn tế bào với phức hợp 131I-rituximab:
Tế bào Raiji và nguyên bào sợi được dùng trong thực
nghiệm gắn với phức hợp 131I-rituximab (Hình 3.8).

Tế bào Raji khi thu hoạch

Tế bào nguyên bào sợi

Hình 3.8: Hình chụp tế bào ung thư Raji và nguyên bào sợi
Kết quả gắn bão hòa của

131

I-rituximab với tế bào ung thư

Raji và kết quả tính hằng số Kd và Bmax được trình bày trong
Hình 3.9:
17


I - r it u x im a b b o u n d ( a m o l/ c e ll)
131

1 .5

R a ji c e lls
F ib r o b la s t c e lls
1 .0

N o n s p e c ific b in d in g

0 .5

0 .0
0

25

50
131

75

100

125

I - r it u x im a b ( n M )

Hình 3.9: Đồ thị gắn 131I-rituximab với tế bào ung thư Raji
Trục hoành là nồng độ tăng dần của

131

I-rituximab, phần

gắn đặc hiệu amol/cell được vẽ trên trục tung là số vị trí gắn
của kháng thể trên mỗi tế bào. Kết quả được phân tích bởi
phương pháp làm khớp với hàm phi tuyến (nonlinear
regression) dùng phần mềm Graphpad Prism 7.
Phần gắn không đặc hiệu NSB được tính bởi sự cạnh tranh
với 500 g kháng thể rituximab không phóng xạ. Đồ thị đạt đến
giá trị cực đại cho thấy bão hòa. Giá trị Kd là 6,2 nmol/L, Bmax
là 1,24 amol/tế bào và từ đó số vị trí gắn của kháng thể trên tế
bào là 7 x 105. Phần gắn không đặc hiệu ít hơn 3%, phần gắn
với nguyên bào sợi nhỏ hơn 15%. Các tế bào nguyên bào sợi là
tế bào không mang dấu ấn CD20, do vậy khả năng gắn với tế
bào lành của phức hợp là ít xảy ra, tỉ lệ này một phần nói lên có
phản ứng chéo không đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên
khác trên bề mặt tế bào tuy không đáng kể. Các kết quả cho
thấy ái lực của kháng thể sau khi đánh dấu phóng xạ đảm bảo

18


hoạt tính miễn dịch và số vị trí gắn trên mỗi tế bào đạt 10 5 phù
hợp khi so sánh với trong các nghiên cứu đã công bố.
Kết quả gắn của 131I-rituximab với tế bào bạch cầu tách từ
máu ngoại vi bệnh nhân là 22,5 ± 9,52. Vì là bệnh lý ung thư
của tế bào lympho trong cơ thể, chủ yếu bệnh biểu hiện tại
hạch, cơ quan bạch huyết. Tế bào ung thư có thể lưu thông theo
đường bạch huyết đi vào máu ngoại vi và lưu thông trong tuần

hoàn. Tế bào lympho mang dấu ấn CD20 ở máu ngoại vi có thể
là tế bào lympho bình thường hoặc là tế bào của NHL và chúng
đều có thể gắn với kháng thể 131I-rituximab.
Kết quả kiểm tra hoạt tính miễn dịch của phức hợp

131

I-

rituximab với kháng nguyên CD20: Đồ thị biểu diễn kết quả
gắn của

I-rituximab với kháng nguyên CD20 lên cột niken

131

Phức 131I-rituximab gắn
CD20 (%)

agarose như trong hình 3.10:
100
99
98
97
96
95
94
93
92
91

90
10

20

30

50

100 1000 5000 10000

Hàm lượng kháng nguyên CD20 (ng)

Hình 3.10: Hoạt tính gắn 131I-rituximab với CD20
Phản ứng gắn phức hợp

131

I-rituximab lên kháng nguyên

CD20 cho kết quả hoạt tính gắn đạt hơn 97% trong miền từ
50ng đến 10g. Số liệu cho thấy kháng thể đơn dòng rituximab
khi đánh dấu với đồng vị phóng xạ
19

131

I không bị mất hoạt tính.

Biểu đồ còn cho thấy khả năng gắn cực đại của kháng thể gắn
phóng xạ với kháng nguyên CD20 đạt đến 98%. Số liệu cho
thấy hoạt tinh miễn dịch của phức hợp đảm bảo cho sử dụng
trong điều trị.
- Kết quả kiểm tra phân bố và đào thải trên động vật:
Kết quả phân bố sinh học trên chuột:

131

I-rituximab phân

bố trong máu ngay sau khi tiêm, khoảng 10-30% liều tiêm/gam
có trong máu sau khi tiêm từ 1 ngày đến 3 ngày, phức hợp tập
trung trong thận ít hơn 10%, ít tập trung trong gan, tuyến giáp,
sai số phân bố trong gan cao. Thuốc đào thải ra khỏi máu sau
khoảng một tuần và bài tiết qua thận nhanh.
Phân bố sinh học trên thỏ: Hình SPECT cho thấy tập trung
nhiều ở khu vực lồng ngực, gan, thận và hàm mặt Hình 3.11.

Hình 3.11: Phân bố 131I-rituximab trên thỏ thí nghiệm, SPECT
20


Kết quả chụp hình phân bố

131

I-rituximab bệnh nhân có

chẩn đoán CD20 dương tính, dạng NHL, đã điều trị hoá chất

nhiều chu kỳ và tái phát, phân bố thuốc được chụp trên máy
SPECT. Vì đặc điểm của bệnh NHL là các mô bạch huyết có
mặt ở các nơi trong cơ thể, NHL có thể xảy ra ở một node
lympho đơn, một nhóm node, hoặc một cơ quan, do đó kiểu
ung thư này có thể trải dài trên hầu hết các phần của cơ thể như
gan, tủy xương, lách.
Kết quả theo dõi đào thải thuốc trên thỏ như sau: Liều 500
và 5000 Ci Đồ thị thấy rằng trong ngày đầu tiên khoảng 3040% liều tiêm tập trung trong máu. Trong 3 ngày tiếp theo
thuốc đào thải dần, không quá nhanh hoặc quá chậm. Sau
khoảng 120 giờ, thuốc được đào thải hoàn toàn ra khỏi động vật

131

I-ritu x im a b ra d io a c tiv ity (x 1 0 0 0 C P M )

thí nghiệm, (Hình 3.12).

8000
131

I-ritu x im a b (5 0 0  C i)

131

I-ritu x im a b (1 0 0 0  C i)

131

I-ritu x im a b (1 5 0 0  C i)

4000

131

I-ritu x im a b (2 0 0 0  C i)

3000

131

I-ritu x im a b (5 0 0 0  C i)

7000
6000
5000

2000
1000
0
0

25

50

75

100

125

150

175

200

T im e (h o u r)

Hình 3.12: Đồ thị đào thải 131I-rituximab theo liều tiêm
- Kết quả kiểm tra tính an toàn trên động vật: Kết quả đo
các chỉ số an toàn của thỏ sau khi tiêm

131

I-rituximab trong

bảng 4.3 sau: Kết quả cho thấy, số lượng hồng cầu ổn định
trong khoảng 5 T/L. Nồng độ huyết sắc tố ở thỏ dao động
21


quanh mức 11 g/dl ở tất cả các nhóm. Số lượng bạch cầu trong
máu ngoại vi tại thời điểm trước khi nghiên cứu đã có sự khác
biệt giữa các nhóm. Nồng độ men gan SGOT trong máu ngoại
vi thỏ ổn định trong quá trình thực nghiệm.
Bảng 3.3: Chỉ số huyết học và sinh hóa của các nhóm thỏ tại
các thời điểm nghiên cứu (   SE)

Tóm lại: Tiêm phức hợp miễn dịch phóng xạ vào thỏ với liều từ

thấp đến cao không ảnh hưởng đến sức khỏe thỏ. Kết quả phân
tích cho thấy tính an toàn của thuốc trên động vật thực nghiệm.
Hình ảnh mô bệnh học mô gan và mô thận đều cho hình
ảnh cấu trúc bình thường, (Hình 3.13). Hình ảnh mô gan (hình
A) trên tiêu bản nhuộm H.E. cho thấy các bè gan sắp xếp thành
dải, cấu trúc rõ, các tế bào gan và tế bào nội mô lót lòng các
xoang tĩnh mạch có cấu trúc bình thường; cấu trúc khoảng cửa
bình thường.
22


A

B

Hình 3.13 Hình ảnh mô học tổ chức gan (A) và thận (B)
sau đợt thử nghiệm tiêm 131I-rituximab liều 5mCi/thỏ.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận: Luận án đã thực hiện các nội dung chính đáp ứng
mục tiêu đề ra:
 Xây dựng quy trình điều chế phức miễn dịch phóng xạ

131

I-

rituximab và kiểm tra chất lượng.
- Xây dựng quy trình điều chế

131

I-rituximab:

131

I-rituximab

được điều chế với các hoạt độ riêng là 6,6 Ci/g và 2 Ci/g,
hiệu suất đánh dấu đạt 94 - 97 %.
- Kiểm tra chất lượng:

131

I-rituximab đạt các tiêu chuẩn về

thuốc phóng xạ, độ tinh khiết hóa phóng xạ đạt hơn 98% và độ
tinh khiết hạt hạt nhân phóng xạ hơn 99,9%, đạt các chỉ tiêu về
độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn và ổn định.
 Nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng của

131

I-rituximab bao

gồm đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể sau khi đánh dấu với
đồng vị phóng xạ, đánh giá phân bố, đào thải và đánh giá tính
an toàn trên động vật thí nghiệm.
- Tính đặc hiệu của 131I-rituximab: Gắn với tế bào ung thư Raji
đạt hơn 50% tại nồng độ 5 x 106 tế bào, Kd là 6,2 nmol/L, Bmax
là 1,24 amol/tế bào, phần gắn không đặc hiệu của 131I-rituximab

23