Bước đầu ứng dụng kỹ thuật PCR reverse dot blot nhằm phát hiện đồng thời một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thit heo tươi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT
NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH
ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. CAO BẢO HIỀN
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH
MSSV: 1153010315
Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT
NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH
ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. CAO BẢO HIỀN
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH
GVHD ký xác nhận:

MSSV: 1153010315
Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

LỜI CẢM ƠN
Em xin cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học Mở
TP.HCM trong những năm vừa qua đã tận tình dạy bảo em, truyền đạt những kiến
thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời.
Em kính gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình
cố vấn, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích.
Em chân thành cảm ơn Thầy Lao Đức Thuận đã tạo điều kiện cho em được thực
hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường
Đại Học Mở TP.HCM.
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Trương Kim Phượng, người
đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ em trong suốt
quá trình em học tập và thực hiện khóa luận tại trường.
Em chân thành cảm ơn Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á đã tạo điều kiện cho

em học tập kỹ thuật, hỗ trợ bộ hóa chất thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt chuyên đề
khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cao Bảo Hiền đã tận tình hỗ trợ, chuyển giao
kỹ thuật, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp của
em.
Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc của mình đến ba mẹ, người thân đã ủng
hộ, động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Sinh viên

DƯƠNG NGỌC HUỲNH

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

i


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADH

Arginine dehydrolase

AMC

Acetyl methyl carbinol

AMP

Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat

AP

Alkaline phosphatase

BLAST

Basic local alignment search tool

Bp

base pair

cAMP

Cyclic Andenosine monophosphate

CONS

Coagulase Negative Staphylococcus

CFU

Colony-forming unit

CS

cộng sự

dATP

deoxyadenosine triphosphate

dCTP

deoxycytidine triphosphate

dGTP

deoxyguanosine triphosphate

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxynucleoside triphosphate

dTTP

deoxythymidine triphosphate

dUTP

deoxyuridine triphosphate

IDT

Integrated DNA technologies

gtt

giải trình tự

LDC

Lysine decarboxylase

MR

Methyl Red

NBT/BCIP

Nitrobluetetrazdium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate
NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

pH

Potential Hydrogen

RDB

Reverse Dot Blot

rDNA

ribosomal Deoxyribonucleic Acid

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

ii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
RNA

Ribonucleic acid

rRNA

ribosomal Ribonucleic Acid

S

Semi-conserved

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEs

Staphylococcal enterotoxins

SNP

Single nucleotide polymorphism

SSC

Saline sodium citrate

T3SS

type III secretion systerm

Ta

annealing temperature

TDH

Thermostable direct hemolysin

TE

Tris - EDTA

TLH

Thermolabile hemolysin

TLTK

Tài liệu tham khảo

Tm

melting temperature

TRH

Thermostable – related hemolysin

TSI

Triple Sugar Iron

VP

Voges Proskauer

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

iii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng I.1. Đặc điểm của các vùng siêu biến động V1 – V9 ....................................... 9
Bảng II.1. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R .......................... 27
Bảng II.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R .................. 28
Bảng III.1. Các vùng gen mục tiêu trong các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn gây bệnh
đường ruột ............................................................................................................. 34
Bảng III.2. Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát hiện vi khuẩn gây
bệnh đường ruột .................................................................................................... 35
Bảng III.3. Các trình tự gen được sử dụng trong nghiên cứu .................................. 36
Bảng III.4. Bảng thông tin bộ mồi phổ quát của trình tự gen 16S rRNA và gen 23S
rRNA ..................................................................................................................... 37
Bảng III.5. Bảng thông tin bộ mẫu dò đặc hiệu của một số loài vi khuẩn .............. 37
Bảng III.6. Bảng thông số vật lí của bộ mồi 16S-F, 16S-R và 23S-F, 23S-R .......... 39
Bảng III.7. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng
công cụ BLAST ..................................................................................................... 42
Bảng III.8. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng
công cụ BLAST ..................................................................................................... 45
Bảng III.9. Bảng chỉ số OD của các mẫu DNA vi khuẩn tách chiết từ mẫu thịt heo 58
Bảng III.10. Mức độ nhiễm đồng thời các vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thịt
heo tươi ................................................................................................................. 65
Bảng III.11. Bảng kết quả số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào CFU/ml ............... 67
Bảng III.12. Bảng số liệu về lượng DNA thực tế và mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu
thịt heo .................................................................................................................. 67

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

iv


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình I.1. Nguyên tắc phương pháp PCR ................................................................ 15
Hình I.2. Nguyên tắc phản ứng lai RDB ................................................................ 19
Hình III.1. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-F ..................................................... 41
Hình III.2. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-R ..................................................... 41
Hình III.3. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-F và trình tự 16S
rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 42
Hình III.4. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-R và trình tự 16S
rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 42
Hình III.5. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng phần mềm Annhyb
.............................................................................................................................. 43
.............................................................................................................................. 44
Hình III.6. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-F ..................................................... 44
.............................................................................................................................. 45
Hình III.7. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-R ..................................................... 45
Hình III.8. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-F và trình tự 23S
rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 46
Hình III.9. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-R và trình tự 23S
rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 46
Hình III.10. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng phần mềm Annhyb
.............................................................................................................................. 47
Hình III.11. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAL ................................................ 48
Hình III.12. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ Annhyb
.............................................................................................................................. 49
Hình III.13. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò VPA ............................................... 50
Hình III.14. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VPA bằng công cụ
Annhyb ................................................................................................................. 50
Hình III.15. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAU ................................................ 51

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

v


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Hình III.16. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng công cụ Annhyb
.............................................................................................................................. 52
Hình III.17. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CPE ................................................ 53
Hình III.18. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CPE bằng công cụ Annhyb
.............................................................................................................................. 53
Hình III.19. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CBO ............................................... 54
Hình III.20. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CBO bằng công cụ
Annhyb ................................................................................................................. 55
Hình III.21. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SHI ................................................. 56
Hình III.22. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng công cụ Annhyb
.............................................................................................................................. 57
Hình III.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M1 và M2 với cặp mồi 16S-F, 16SR ........................................................................................................................... 59
Hình III.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M3, M4 và M5 với cặp mồi 16S-F,
16S-R .................................................................................................................... 59
Hình III.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M6 với cặp mồi 16S-F, 16S-R ... 60
Hình III.26 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M1 .................................. 61
Hình III.27. Kết quả BLAST trình tự gtt_M1F ...................................................... 62
Hình III.28 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M2 .................................. 62
Hình III.29 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M3 .................................. 63
Hình III.30 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M4 .................................. 64
Hình III.31 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M5 .................................. 64
Hình III.32 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M6 .................................. 65

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

vi


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... v
MỤC LỤC............................................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
I.

TỔNG QUAN................................................................................................... 3
I.1.

Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đường ruột: .......................................... 4

I.1.1.

Staphylococcus aureus ......................................................................... 4

I.1.2.

Clostridium perfringens ....................................................................... 5

I.1.3.

Clostridium botulinum ......................................................................... 5

I.1.4.

Shigella spp. ........................................................................................ 6

I.1.5.

Vibrio parahaemolyticus ...................................................................... 7

I.1.6.

Salmonella spp..................................................................................... 8

I.2.

Thông tin vùng gen 16S rRNA và 23S rRNA: ........................................... 9

I.2.1.

Vùng gen 16S rRNA ............................................................................. 9

I.2.2.

Vùng gen 23S rRNA ........................................................................... 10

I.3.

Các phương pháp phát hiện tác nhân vi khuẩn: ..................................... 11

I.3.1.

Phương pháp nuôi cấy truyền thống ................................................... 11

I.3.2.

Phương pháp sinh học phân tử hiện đại .............................................. 13

I.4.

Các công trình nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử

để phát hiện nhanh, đồng thời vi khuẩn gây bệnh đường ruột: ..................... 201
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 22
II.1. Vật liệu: ................................................................................................... 23
II.1.1. Các công cụ tin sinh học được sử dụng .............................................. 23
II.1.2. Mẫu thực phẩm trong khảo sát thực nghiệm ....................................... 23
II.2. Phương pháp nghiên cứu: ...................................................................... 23
II.2.1. Khảo sát dữ liệu ................................................................................. 23

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

vii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
II.2.2. Khảo sát in silico ............................................................................... 24
II.2.3. Khảo sát thực nghiệm ........................................................................ 25
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33
III.1. Thu thập dữ liệu: ..................................................................................... 34

III.2. Kết quả khảo sát in silico......................................................................... 36
III.2.1. Thu thập trình tự gen 16S rRNA và 23S rRNA của các loài vi khuẩn .. 36
III.2.2. Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò .......................................... 36
III.2.3. Khảo sát bộ mồi phổ quát .................................................................. 38
III.2.4. Khảo sát bộ mẫu dò ........................................................................... 47
III.3. Kết quả thực nghiệm: .............................................................................. 57
III.3.1. Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn và đo OD....................................... 58
III.3.2. Kết quả điện sản phẩm PCR............................................................... 59
III.3.3. Kết quả lai RDB ................................................................................ 60
III.3.4. Kết quả xác định mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu: ............... 66
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 69
IV.1. Kết luận ................................................................................................... 70
IV.2. Đề nghị .................................................................................................... 70
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 72
VI. PHỤ LỤC..........................................................................................................79

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

viii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh
ngộ độc thực phẩm, tác động lớn đến sức khoẻ cộng đồng và có thể dẫn đến tử vong
[29]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization, WHO),
hàng năm ngộ độc thực phẩm dẫn đến khoảng 16,8 triệu trẻ em tử vong do mắc các
bệnh về tiêu chảy [57]. Theo thống kê của Cục An toàn Thực phẩm (2012), ở Việt
Nam có khoảng 168 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.541 trường hợp, trong đó 4.335

trường hợp nhập viện và 34 trường hợp tử vong [41].
Các tác nhân gây bệnh đường ruột thường lây truyền qua thực phẩm, nước giải
khát. Đây là nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm, bệnh viêm dạ dày cấp
tính và có thể gây ra những biến chứng nghiêm trọng. Cụ thể, Listeria monocytogens
gây sảy thai hoặc viêm màng não ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, Escherichia coli
O157:H7 gây hội chứng tan ure huyết (hemolytic uremic syndrome),...[29].
Phương pháp nuôi cấy truyền thống thường được áp dụng để phát hiện vi sinh
vật gây bệnh có trong thực phẩm, đây là “tiêu chuẩn vàng” trong quy trình chẩn đoán
thường quy ở bệnh viện [5]. Tuy nhiên, phương pháp truyền thống vẫn tồn tại nhiều
hạn chế: tiêu tốn thời gian, khó phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh
đường ruột [11,35].
Nhiều phương pháp phát hiện các tác nhân vi khuẩn dựa trên kỹ thuật sinh học
phân tử như Multiplex PCR, real-time PCR, Microarray,... đã được phát triển và áp
dụng trong thực tế [11,35,40]. Đáng chú ý là phương pháp PCR kết hợp Reverse Dot
Blot cho phép phát hiện nhanh, chính xác nhiều trình tự gen mục tiêu, với bộ mẫu dò
chuyên biệt/đặc hiệu với các dạng đột biến/các tính đa hình hoặc trình tự gen của
nhiều loài vi sinh vật (vi khuẩn) khác nhau [32].
Dựa vào các sơ sở khoa học nêu trên và được sự đồng ý của Công ty cổ phần
Công nghệ Việt Á, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “BƯỚC ĐẦU
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN
ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU
THỊT HEO TƯƠI”.

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Mục tiêu: Tìm hiểu và ứng dụng quy trình PCR kết hợp lai Reverse Dot Blot

nhằm phát hiện nhanh, chính xác và đồng thời một số tác nhân vi khuẩn gây bệnh
đường ruột: Salmonella spp., Clostridium perfringens, Clostridium botulinum,
Vibrio parahaemolitycus, Staphylococcus aureus, Shigella spp.,... trong các mẫu thịt
heo được bày bán trên địa bàn Tỉnh Bình Dương.
Nội dung nghiên cứu:
- Thu thập thông tin về đặc điểm hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường
ruột trên các loại mẫu thực phẩm (thịt heo tươi).
- Thu thập dữ liệu về các công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh
học phân tử PCR, PCR – RDB phát hiện nhanh và đồng thời các chủng vi khuẩn gây
bệnh đường ruột, cụ thể là Salmonella spp., Shigella spp., Clostridium perfringens,
Clostridium botulinum, Vibrio parahaemolitycus, Staphylococcus aureus.
- Khảo sát tính chất vật lý, độ đặc hiệu của bộ mồi phổ quát (universal primers)
và bộ mẫu dò chuyên biệt (kế thừa kết quả nghiên cứu cùng nhóm) với các loài vi
khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella spp., Clostridium perfringens, Clostridium
botulinum, Vibrio parahaemolitycus, Shigella spp., Staphylococcus aureus,…).
- Tìm hiểu quy trình PCR - RDB (bộ Kit RDB – VA.A92 – 0036A) của Công
ty Cổ phần Công nghệ Việt Á.
- Thực hiện quy trình tách chiết DNA vi khuẩn và quy trình PCR – RDB phát
hiện đồng thời một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên một số mẫu thịt heo tươi
được bày bán trên địa bàn Tỉnh Bình Dương.

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

I. TỔNG QUAN

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

I.1.

Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đường ruột:

I.1.1. Staphylococcus aureus
Đặc điểm hình thái:
Staphylococcus aureus (S. aureus) là vi khuẩn Gram dương (+), tế bào hình cầu,
đường kính khoảng 1µm. Các tế bào S. aureus xếp thành chuỗi không đều nhau, đứng
riêng lẻ, từng đôi hay thành chuỗi. Vi khuẩn S. aureus không có lông, không di động
và không sinh bào tử [7].
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi. Vi khuẩn S. aureus phát
triển ở nhiệt độ 15oC – 40oC (nhiệt độ tối ưu là 35oC – 37oC), khoảng pH phát triển
4 – 9,3 (pH thích hợp 7 – 7,5) [4]. Vi khuẩn S. aureus là vi khuẩn sống được trong
điều kiện tương đối khô, nóng, chịu được nồng độ muối cao (NaCl 10% – 15%) [7].
Đặc điểm sinh hóa:
Staphylococcus aureus có các đặc điểm sinh hóa điển hình: lên men các nguồn
carbohydrat khác nhau (lactose, sucrose, galactose, glucose), sinh các loại enzyme
(urease, catalase, coagulase, hyaluronidase, Staphylokinase, proteinase, lipase)
[30,7,34].
Yếu tố độc lực:
Staphylococcus aureus sinh 2 nhóm độc tố:
Nhóm ngoại độc tố với bản chất là protein: độc tố tróc vảy (Exfoliative toxin)
là ngoại độc tố làm bong tróc biểu bì, tạo nốt phỏng ngoài da; độc tố gây sốc (Toxic

shock syndrome toxin) [30,7].
Nhóm nội độc tố: S. aureus sản xuất nội độc tố bền nhiệt (Heat – stabe
enterotoxins, SEs), nội độc tố gây nôn, chia thành các type huyết thanh khác nhau từ
SEA đến SEE, trong đó có SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3. Sau đó, các SE
mới cùng các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU,
không có SEF [25,8].
Thông tin bộ máy di truyền:
Bộ gen của vi khuẩn Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus subsp.
aureus MW2) có kích thước khoảng 2,82 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 32,8%. Gen 16S

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
rRNA có kích thước khoảng 1.556 bp, gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.923 bp
[50].
I.1.2. Clostridium perfringens
Đặc điểm hình thái:
Clostridium perfringens (C. perfringens) là trực khuẩn Gram dương (+), tế bào
hình que, sinh bào tử chịu nhiệt, là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi [31,20].
Clostridium perfringens phát triển ở nhiệt độ thích hợp là 43oC – 45oC, pH thích
hợp khoảng 5 – 9. Vi khuẩn C. perfringens là vi khuẩn ưa mặn, sinh trưởng được
trong môi trường có nồng độ NaCl 4% - 6% [7].
Đặc điểm sinh hóa:
C. perfringens có đặc điểm sinh hóa điển hình: lên men các nguồn carbohydrat
(galactose, sucrose, fructose, maltose), không lên men đường mannitol, không sinh
indol, phản ứng MR âm tính (-), VP âm tính (-), không sinh enzyme catalase [23].
Yếu tố độc lực:

Vi khuẩn C. perfringens sản xuất cả ngoại độc tố và nội độc tố: độc tố ruột
(Clostridium perfringens enterotoxin, CPE) và 4 ngoại độc tố chính: alpha (α), beta
(β và β2), epsilon (ε) và iota (ι), được chia thành 5 type khác nhau C. perfringens (A,
B, C, D và E) [7,25,20].
C. perfrigens type A sinh nội độc tố α là type chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm
và viêm đường ruột ở người - gastroenteritis, C. perfrigens type C gây ngộ độc thực
phẩm dẫn đến hoại tử ruột - enteritis necroticans [25,20]. Các nội độc tố của
Clostridium perfrigens chỉ được hình thành trong quá trình tạo bào tử [25].
Thông tin bộ máy di truyền:
Bộ gen của Clostridium perfringens (Clostridium perfringens ATCC 13124) có
kích thước khoảng 3,26 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 28,4%, vùng gen 16S rRNA có kích
thước khoảng 1.522 bp và gen 23S rRNA khoảng 2.909 bp [55].
I.1.3. Clostridium botulinum
Đặc điểm hình thái:
Clostridium botulinum (C. botulinum) là vi khuẩn Gram dương (+), di động, tế
bào hình que, sinh bào tử, là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc [4,7].
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Vi khuẩn Clostridium botulinum phát triển ở nhiệt độ 35oC - 37oC, tăng trưởng
trong môi trường pH lớn hơn 4 [7].
Đặc điểm sinh hóa:
Đặc điểm sinh hóa điển hình của vi khuẩn Clostridium botulinum: lên men các
nguồn carbohydrat khác nhau (galactose, lactose, maltose, glucose), sinh H2S, NH3,
sinh enzyme lecithinase, lipase, không sinh indol [24].
Yếu tố độc lực:
Vi khuẩn Clostridium botulinum sinh ba loại độc tố: botulinum neurotoxin

(BoNT), C2 toxin và C3. Botulinum neurotoxin (BoNT) tác động đến các tế bào thần
kinh, độc tố C2 và C3 gây tổn thương tế bào, tạo điều kiện cho độc tố BoNT lây lan
vào mô. Các độc tố có bản chất là protein, nhạy với nhiệt, độc tố có thể bị phá hủy ở
nhiệt độ lớn hơn 85oC trong 5 phút [7]. Dựa vào khả năng sinh độc tố, vi khuẩn
Clostridium botulinum được phân loại thành các serotype A, B, C, D, E, F và G [7].
Thông tin bộ máy di truyền:
Bộ gen của Clostridium botulinum (Clostridium botulinum A str. ATCC 3502)
có kích thước khoảng 3,89 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 28,2%, vùng gen 16S rRNA có
kích thước khoảng 1.442 bp và gen 23S rRNA khoảng 2.902 bp [54].
I.1.4. Shigella spp.
Đặc điểm hình thái:
Shigella spp. hay còn gọi là trực khuẩn lỵ, là vi khuẩn Gram âm (-), không sinh
bào tử, không di động, đây là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy nghi [4,7].
Shigella spp. phát triển ở nhiệt độ từ 7oC – 46oC, pH từ 6,5 – 8,8, thích hợp nhất
ở nhiệt độ 37oC và pH 7 – 8 [7].
Đặc điểm sinh hóa:
Shigella spp. có đặc điểm sinh hóa điển hình: lên men glucose nhưng không sinh
hơi, hầu hết các loài không lên men đường lactose, không sinh enzyme khử nitrat,
enzyme urease, enzyme citochrome oxidase, lysine decarboxylase, không sinh H2S,
không có khả năng làm tan gelatin [4,7].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Yếu tố độc lực:
Vi khuẩn Shigella spp. có 2 dạng độc tố: nội độc tố là lipopolysaccharide của
vách tế bào vi khuẩn được phóng thích khi tế bào ly giải, góp phần kích thích thành

ruột. Ngoại độc tố có tên là Shiga toxin, không bền nhiệt, hoạt động như một
enterotoxin, tác động lên thành ruột gây tiêu chảy và tác động lên hệ thần kinh trung
ương ở ruột, chặn các xung thần kinh, gây tê liệt. Ngoài ra, ngoại độc tố này còn hoạt
động như cytotoxin, giết chết các tế bào bằng cách ức chế hấp thụ đường và các
amino acid ở ruột non [7].
Thông tin bộ máy di truyền:
Bộ gen của vi khuẩn Shigella spp. (Shigella dysenteriae Sd197) có kích thước
khoảng 4,37 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 51,2%. Gen 16S rRNA có kích thước khoảng
1.542 bp, gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.902 bp [52].
I.1.5. Vibrio parahaemolyticus
Đặc điểm hình thái:
Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) là vi khuẩn Gram âm (-), tế bào
hình dấu phẩy, có lông ở một đầu, di động [1,7].
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phát
triển ở nhiệt độ trong khoảng 22oC – 42oC [9,4]. Khoảng pH phát triển 5 – 11 (thích
hợp nhất là 7,8 – 8,6) [9]. Vi khuẩn ưa mặn, tăng trưởng tốt trong môi trường có nồng
độ muối cao (NaCl 1% - 7%) nhưng bị ức chế khi nồng độ muối quá cao (NaCl 10%)
[1,4,9].
Đặc điểm sinh hóa:
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có đặc điểm sinh hóa: sinh nhiều loại enzyme
khác nhau (Oxidase, LDC), không sinh ADH, không lên men đường sucrose, sinh
H2S trong môi trường TSI (Triple Sugar Iron) [4,7].
Yếu tố độc lực:
Vibrio parahaemolyticus được phân loại dựa vào kháng nguyên thân (O) và
kháng nguyên nang (K), gồm có O3:K6, O4:K12, O4:K68, O1:K41, O1:K25,
O1:KUT [7].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Vi khuẩn V. parahaemolyticus sinh nội độc tố Hemolysin bền nhiệt
(Thermostable direct hemolysin, TDH và Thermostable – related hemolysin, TRH),
độc tố không bền nhiệt (Thermolabile hemolysin, TLH) [1,7].
Ngoài ra vi khuẩn V. parahaemolyticus còn sản xuất các yếu tố độc lực khác
như type III secretion systerm, T3SS bao gồm 2 dạng độc tố: độc tố tế bào
(cytotoxicity) và độc tố ruột (enterotoxicity) [16].
Thông tin bộ máy di truyền:
Bộ gen của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Vibrio parahaemolyticus
BB22OP) có kích thước khoảng 5,1 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 45,3%, vùng gen 16S
rRNA khoảng 1.475 bp và vùng gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.891 bp [53].
I.1.6. Salmonella spp.
Đặc điểm hình thái:
Salmonella spp. là vi khuẩn Gram âm (-), tế bào hình gậy, quan hệ gần gũi với
họ Enterobacteriaceae, kích thước 0,5 x 3µm, có nhiều lông xung quanh thân, di
động mạnh và không sinh bào tử [25,7].
Salmonella spp. là vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi. Vi khuẩn phát triển ở
nhiệt độ 6oC - 42oC, pH 6 - 9, nhiệt độ tối ưu nhất cho vi khuẩn phát triển là 35oC 37oC và pH thích hợp nhất là 7,2 [7].
Đặc điểm sinh hóa:
Vi khuẩn Salmonella spp. có đặc điểm sinh hóa điển hình: sinh enzyme
Oxidase, tryptophanase, sinh H2S, không sinh enzyme Urease, lên men đường
glucose, không lên men lactose [25].
Yếu tố độc lực:
Dựa trên kháng nguyên thân (O), kháng nguyên lông (H) và kháng nguyên bề
mặt (Vi), Salmonella spp. được chia ra khoảng 2.463 type huyết thanh (serotypes).
Ngoài ra giống Salmonella spp. được chia làm hai loài: S. Bongori và S. enterica.
Trong đó S. bongori gồm tất cả các type huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và
S. enterica được chia làm 6 loài phụ đánh số: I (enterica), II (salamae), IIIa

(arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae), VI (indica) [7].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Salmonella sp. sinh hai loại độc tố: độc tố ruột (enterotoxicity) và độc tố tế bào
(cytotoxicity) [7].
Thông tin bộ máy di truyền:
Bộ gen của Salmonella spp. (Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typehimurium str. LT2) có kích thước khoảng 4,59 Mb, trong đó tỉ lệ %GC khoảng
52,22%. Vùng gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1.366 bp và vùng gen 23S rRNA
có kích thước khoảng 2.904 bp [51].

Thông tin vùng gen 16S rRNA và 23S rRNA:

I.2.

I.2.1. Vùng gen 16S rRNA
Vùng gen 16S ribosomal RNA (rRNA) có chiều dài khoảng 1.500 bp và có tính
chất bảo tồn cao, hiện diện ở tất cả các loài vi khuẩn [13]. Trình tự vùng gen 16S
rRNA được xem là một công cụ quan trọng cho việc phát hiện mối quan hệ phát sinh
loài giữa các vi khuẩn, được xem là phân tử mục tiêu cho việc phát hiện và định danh
vi khuẩn trong các thí nghiệm lâm sàng [26,30].
Trên vùng trình tự gen 16S rRNA có các vùng bất biến U (Universal) là các
vùng có sự biến đổi rất ít giữa các loài (bảo tồn ở cấp độ loài) và các vùng siêu biến
động V (Hypervariable regions) là những vùng có sự khác nhau giữa các loài, các
chủng thuộc loài hoặc nhóm loài. Vùng siêu biến động gồm 9 vùng khác nhau (V1 V9), chứa các trình tự đặc hiệu cho loài, được sử dụng làm trình tự mục tiêu khuếch

đại và thiết kế mẫu dò để phát hiện các loài vi khuẩn khác nhau [13]. Giữa hai vùng
trên (vùng bảo tồn và vùng siêu biến động) là những vùng có biến đổi ít được gọi là
vùng bán bảo tồn S (semiconserved).
Bảng I.1. Đặc điểm của các vùng siêu biến động V1 – V9 [13]
Vùng siêu biến
động

Đặc điểm

(Hypervariable
regions, V)
Vùng V1

Sử dụng để phân biệt các tác nhân gây bệnh thuộc chi
Streptococcus spp. và sự khác nhau giữa Staphylococcus aureus

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
với các loài Staphylococcus không sinh enzyme coagulase
(Coagulase Negative Staphylococcus, CONS). Có ít nhất 4 biến
thể đơn đa hình độc nhất (unique single nucleotide
polymorphisms, SNPs), vùng V1 có ý nghĩa trong thiết kế mẫu
dò cho S. aureus.
Kích thước trung bình 100 bp, dùng để phân biệt các loài vi
khuẩn đến mức chi, phân biệt tác nhân gây bệnh thuộc
Staphylococcal và Streptococcal, Clostridium, Haemophilus và

Vùng V2

Neisseria, các loài thuộc Mycobacterial. Không phân biệt được
Escherichia sp. và Shigella sp., K. pneumoniae và E. aerogenes.
Vùng V2 có chứa nhiều biến thể đơn đa hình (single nucleotide
polymorphisms, SNPs).
Vùng V3 tương tự vùng V2 có thể phân biệt vi khuẩn ở mức chi,
vùng trình tự ngắn trong V3 gồm số lượng lớn các SNPs. Được

Vùng V3

sử dụng để xác định các loài

Mycobacterium fortuitum,

Nocardia spp., Propionibacterium acnes và Rhodococcus equi.
Vùng V3 cũng giúp phân biệt vi khuẩn họ Enterobacteriacea:
Enterobacter aerogene và Klebsiella pneumoniae.
Là vùng siêu biến động ngắn nhất, dài khoảng 58 bp, có sự biến

Vùng V6

động

lớn

và

giúp

phân

biệt

vi

khuẩn

thuộc

họ

Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Shigella spp. và
Salmonella spp.

Vùng V4, V5,
V7 và V8

Các vùng có mức độ bảo tồn cao hơn mức độ biến động, do đó
không thích hợp là trình tự mục tiêu hỗ trợ cho việc định danh ở
mức loài.

I.2.2. Vùng gen 23S rRNA
Vùng gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.900 bp với mức độ biến động ở
mức độ loài cao hơn so với vùng gen 16S rRNA. Các nhà nghiên cứu dựa trên vùng
bảo tồn và vùng biến động của trình tự gen 23S rRNA để thiết kế hệ mồi phổ quát

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

10

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
(universal primers), mồi/mẫu dò chuyên biệt (specific primers/probe) sử dụng cho
phản ứng multiplex PCR, real – time PCR, phản ứng lai phân tử, microarray để phát
hiện các loài vi khuẩn gây bệnh đường ruột thường gặp [6,38].
I.3.

Các phương pháp phát hiện tác nhân vi khuẩn:

I.3.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống
Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chuẩn vàng” cho việc
phân lập và định danh các tác nhân vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm [5]. Phương
pháp định danh truyền thống dựa vào kiểu hình, đặc trưng về hình thái, sự biến đổi
các giai đoạn tăng trưởng, khả năng sử dụng nguồn cơ chất hữu cơ trong môi trường
nuôi cấy [37]. Phương pháp bao gồm một chuỗi các bước: nuôi cấy tăng sinh không
chọn lọc, tăng sinh chọn lọc, nuôi cấy trên đĩa thạch chọn lọc/phân lập, quan sát hình
thái, thử nghiệm sinh hóa, sự xác nhận huyết thanh học.
− Tăng sinh: làm giàu mật độ vi sinh hiện diện trong mẫu. Quá trình tăng sinh
gồm 2 giai đoạn: tăng sinh và tăng sinh chọn lọc. Trong quy trình kiểm nghiệm vi
sinh vật trong nước, thực phẩm, bước tăng sinh để phục hồi sức sống của vi sinh vật
bị tổn thương và tăng sinh chọn lọc làm tăng mật độ tương đối các vi sinh vật cần
phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác.
Các bước này nhằm đạt được mức giới hạn cho phép sự hiện diện của vi sinh vật gây
bệnh trong mẫu thực phẩm, làm tăng độ nhạy của phương pháp [4].
− Nuôi cấy phân lập: dùng môi trường chọn lọc rắn để phân lập chọn lọc các
khuẩn lạc đơn của vi sinh vật mục tiêu, tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban
đầu và đưa về dạng thuần trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng cho từng loài vi
khuẩn [4].
− Quan sát hình thái: bằng phương pháp nhuộm Gram, soi tươi, giúp quan sát

được hình thái tế bào, khả năng di động hay không di động, là Gram âm hay Gram
dương, có bào tử hay không bào tử, hình dạng bào tử [4].
− Thử nghiệm sinh hóa: là quá trình định danh các chủng vi sinh vật thông qua
các phản ứng sinh hóa của chủng vi sinh vật [4].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
Một số thử nghiệm sinh hóa thường được sử dụng:
− Thử nghiệm catalase: xác định các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi có
khả năng chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện
tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2; enzyme catalase của vi khuẩn thủy
phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2. Phản ứng dương tính có bọt khí
xuất hiện, phản ứng âm tính không có bọt khí [4,39].
− Thử nghiệm phân giải Ure: phát hiện vi sinh vật tổng hợp enzyme urease phân
giải urea thành NH3 và CO2, trong đó NH3 làm tăng pH của môi trường và theo dõi
sự đổi màu chất chỉ thị pH (thang đổi màu pH 6,8 – 8,4). Phản ứng dương tính môi
trường có màu tím đỏ, phản ứng âm tính môi trường không đổi màu [4,39].
− Thử nghiệm Coagulase: phát hiện sự có mặt của enzyme Coagulase bằng phản
ứng đông huyết tương. Phản ứng dương tính xuất hiện khối đông huyết tương, phản
ứng âm tính không xuất hiện khối đông huyết tương [4,39].
− Xác định khả năng di động: dùng để phát hiện các vi khuẩn có khả năng di
động trên môi trường bán lỏng và làm đục môi trường. Phản ứng dương tính vi khuẩn
mọc lan ra trên đường cấy, phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy [4].
− Thử nghiệm sinh Indol: phát hiện các vi sinh vật có enzyme tryptophanase
chuyển hóa trypton tạo thành indol. Phản ứng dương tính tạo màu hồng cánh sen,
phản ứng âm tính có màu vàng [4,39].

− Thử nghiệm MR (Methyl Red): phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo
thành acid pyruvic. Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol, acid acetic,
acid lactic, acid succinic. Các acid làm môi trường giảm mạnh, pH ≈ 4 – 4,5, ở pH
này Methyl red màu đỏ, ngược lại pH cao hơn thì Methyl red chuyển sang màu vàng.
Đọc kết quả, phản ứng dương tính có màu đỏ, phản ứng âm tính có màu vàng [4,39].
− Thử nghiệm VP (Voges – Proskeur): nhằm phát hiện các vi sinh vật chuyển
hóa glucose thành acid pyruvic. Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành acetyl
methyl carbinol (AMC). AMC tác dụng với 𝛼- naphtol trong môi trường kiềm tạo
thành diacetyl. Diacetyl phản ứng với nhân guanidine (arginine) có trong peptone
cho hợp chất màu hồng. Phản ứng dương tính có màu đỏ trên bề mặt môi trường,
phản ứng âm tính có màu nâu đất [4,39].
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
− Thử nghiệm chuyển hóa citrate: xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng
citrate làm nguồn hydrocarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi
trường và thay đổi chỉ thị màu. Phản ứng dương tính màu xanh nước biển, phản ứng
âm tính: không đổi màu [4,39].
Ưu nhược điểm:
Ưu điểm: Phương pháp nuôi cấy truyền thống là phương pháp tiêu chuẩn vàng
có độ tin cậy cao, dễ thực hiện, chi phí thấp và có thể phát hiện chính xác tác nhân
vi khuẩn gây bệnh ở người, gây ngộ độc thực phẩm, gây bệnh đường ruột....[5].
Nhược điểm: Thực hiện phương pháp nuôi cấy truyền thống cần nhiều công sức
và thời gian (3 ngày – 10 ngày), rất khó phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn
[35,11]. Do yếu tố môi trường dẫn đến sự thay đổi trong biểu hiện gen của vi sinh
vật, gây ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm sinh hóa và đặc tính phát triển của vi sinh
vật trên môi trường nuôi cấy [5].

I.3.2. Phương pháp sinh học phân tử hiện đại
Polymerase Chain Reaction (PCR):
I.3.2.1.1

Định nghĩa:

Polymerase Chain Reaction (PCR) là quá trình khuếch đại đoạn trình tự DNA
mục tiêu trong điều kiện in vitro theo chu kỳ nhiệt, với sự tham gia của cặp mồi và
sự xúc tác của enzyme DNA polymerase [1,3].
I.3.2.1.2

Nguyên tắc:

Phản ứng PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (khoảng 30 – 40 chu
kỳ), mỗi chu kì gồm 3 bước cơ bản:
(1) DNA khuôn mẫu bị biến tính thành mạch đơn ở nhiệt độ cao.
(2) Mồi xuôi và mồi ngược với bản chất là oligonucleotide mạch đơn sẽ bắt cặp
bổ sung với trình tự mục tiêu ở nhiệt độ lai thích hợp. Mồi được bắt cặp với mạch
khuôn đã biến tính để tạo một vị trí khởi đầu cho quá trình tổng hợp một phân tử
DNA mới, mồi có thể đặc hiệu với một trình tự nucleotide riêng biệt hoặc chúng có
thể là mồi phổ quát (universal), cặp mồi phổ quát bắt cặp bổ sung với trình tự
nucleotide chung trong một tập hợp nhiều phân tử DNA đặc biệt [36].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015
(3) Kéo dài mạch DNA, sự khuếch đại trình tự mục tiêu được thực hiện có sự

tham gia của enzyme polymerase, các đoạn mồi và mạch khuôn DNA. Một chu kì
được lặp lại nhiều lần với các DNA mới được tổng hợp được xem là mạch khuôn,
cộng thêm vào lượng DNA mục tiêu ban đầu, sự khuếch đại theo lũy thừa của các
trình tự DNA với 2 mồi oligonucletide làm cho số lượng bản sao tăng lên hàng triệu
lần [25,42].
Giai đoạn (1) là giai đoạn biến tính (denaturation): tách phân tử DNA mạch kép
thành mạch đơn ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường
94oC – 95oC trong vòng 30 giây – 1 phút, các enzyme lúc này chưa hoạt động [36]
Giai đoạn (2) là giai đoạn bắt cặp của mồi lên mạch khuôn (annealing): Nhiệt
độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp bổ sung với
mạch khuôn DNA thường là 50oC – 65oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo
dài từ 30 giây – 1 phút. Liên kết được hình thành giữa mồi và gen mục tiêu là liên
kết hydrogen, trong giai đoạn này polymerase có thể đính kèm và chuẩn bị sao chép
các mẫu.
Giai đoạn (3) là giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC
là nhiệt độ lý tưởng cho enzyme DNA polymerase (là enzyme chịu nhiệt) hoạt động
tổng hợp, kéo dài mạch tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần
khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Các thành phần cần thiết trong phản ứng PCR [2,3]:
− DNA mạch khuôn (đoạn DNA cần khuếch đại).
− Cặp mồi đặc hiệu, bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn, có bản chất là đoạn
oligonucleotide khoảng 15 – 30 nucleotide, gồm mồi xuôi và mồi ngược.
− Dung dịch đệm (buffer) thích hợp cho phản ứng PCR gồm các thành phần
KCl, Tris - HCl pH 8,3.
− Cofactor Mg2+ dưới dạng MgCl2.
− Hỗn hợp các cơ chất ở dạng dNTP (deoxynucleoside triphosphate) gồm 4 loại:
dGTP, dATP, dTTP, dCTP.
− Enzyme Taq DNA Polymerase (enzyme chịu nhiệt).

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

Hình I.1. Nguyên tắc phương pháp PCR
Ưu điểm của phương pháp PCR là thời gian thực hiện nhanh, đơn giản và ít tốn
kém, độ tinh sạch của mẫu DNA không cần cao, cho phép thực hiện với nguồn mẫu
ở dạng bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc
gây ngộ độc [2,4].
Multiplex PCR:
I.3.2.2.1

Định nghĩa:

Multiplex PCR (phản ứng PCR đa cặp mồi) là phương pháp PCR cải tiến, có
hai hoặc nhiều trình tự DNA mục tiêu được khuếch đại đồng thời trong cùng một
phản ứng PCR với sự tham gia của nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau [28,42].
I.3.2.2.2

Nguyên tắc:

Đối với phản ứng multiplex PCR, mỗi cặp mồi được thiết kế để khuếch đại một
trình tự gen mục tiêu với kích thước sản phẩm khác nhau, các cặp mồi trong phản
ứng multiplex PCR cần có nhiệt độ bắt cặp tối ưu và xấp xỉ nhau, không có sự bắt
cặp giữa các mồi, nồng độ mồi, Mg2+, các dNTPs tự do và enzyme polymerase được
điều chỉnh phù hợp cho việc tổng hợp các gen được quan tâm [14,42].
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

15