Khảo sát tỷ lệ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong sản phẩm kem có chứa sữa tại trung tâm quatest3 theo tiêu chuẩn 462007qđ BYT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

" KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH
TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ CHỨA SỮA TẠI TRUNG TÂM
QUATEST3 THEO TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT "

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD:ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT
SVTH: LÂM VĂN THẮNG
MSSV: 1153010771
Khóa: 2011-2015
Bình Dƣơng, ngày 26 tháng 05 năm 2015


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm bộ môn
Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Thầy Nguyễn Văn Minh đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều cũng như
cho em những lời khuyên quý giá để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em
xin gửi đến thầy lời cảm ơn chân thành nhất.
Em cũng xin cảm ơn chị Trần Thị Ánh Nguyệt đã tạo điều kiện để em tiếp xúc

với môi trường làm việc thực tế, giúp em có cái nhìn toàn diện hơn về ngành Công
nghệ sinh học nói chung và ngành Kiểm nghiệm vi sinh vật nói riêng, qua đó thấy
được những phẩm chất có có của một Kiểm nghiệm viên là trung thực cẩn thận, và
đặc biệt là không ngừng học hỏi. Em cám ơn chị rất nhiều ạ.
Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Ái Lâm, cô Phương Dung, chị Thu Hồng, anh
Thanh, chị Diệu Thu, chị Phương, chị Phượng cùng với các anh chị và các bạn đang
làm việc tại phòng Thử nghiệm vi sinh-GMO, Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo
lƣờng chất lƣợng 3 (QUATEST3) đã nhiệt tình hướng dẫn và dành cho em những
tình cảm quý giá trong suốt quá trình em thực tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Con xin gửi lời tri ân đến Cha, Mẹ và các anh chị, người thân trong gia đình đã
luôn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp DH11SHO3 đã cùng tôi chia sẽ biết bao
buồn vui cũng như đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt những năm tháng dưới
mái trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người
Sinh viên LÂM VĂN THẮNG

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. I

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang I


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC ....................................................................................................................... I
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................IV
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... V

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ................................................................................................VI
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... VII
DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................................ VIII
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 4
1.1. Tồng quan về QUATEST 3 ................................................................................... 4
1.1.1. Những nét chung ............................................................................................. 4
1.1.2. Nhiệm vụ ........................................................................................................ 4
1.1.3. Phòng thử nghiệm vi sinh – GMO .................................................................. 5
1.2. Tổng quan về kem ................................................................................................. 6
1.2.1. Nguồn gốc: ...................................................................................................... 6
1.2.2. Thành phần của kem ....................................................................................... 7
1.2.3. Các vi sinh vật trong kem ............................................................................... 7
1.3. Đại cương về các vi sinh vật gây bệnh thường hiện diện trong kem .................... 7
1.3.1. Đại cương về Coliforms .................................................................................. 7
1.3.2. Đại cương về Escherichia coli........................................................................ 8
1.3.3. Đại cương về Staphylococus aureus ............................................................. 11
1.3.4. Đại cương về Listeria monocytogenes ......................................................... 14
1.3.5. Đại cương về Salmonella .............................................................................. 17
1.3.6. Giới thiệu về phương pháp PCR ................................................................... 22
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 31
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 31
2.2. Thiết bị - Hóa chất: .............................................................................................. 31
2.3. Phương pháp kiểm nghiệm: ................................................................................. 32
2.3.1. Quy trình chung ............................................................................................ 32
2.3.2. Mô tả mẫu: .................................................................................................... 32
2.3.3. Đồng nhất mẫu:............................................................................................. 32

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang II


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

2.3.4. Phân tích mẫu: .............................................................................................. 32
2.3.5. Lưu trữ, bảo quản mẫu:................................................................................. 33
2.4. Phương pháp phân tích vi sinh vật ...................................................................... 33
2.4.1. Định lượng Coliforms trong thực phẩm bằng phương pháp đếm đĩa theo
ISO 4832:2006 ........................................................................................................ 33
2.4.2. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN theo FDA 2013 (Chap 4G) ..... 34
2.4.3. Định lượng Staphylococus aureus bằng phương pháp MPN theo AOAC
2013 (987.09 ) ......................................................................................................... 37
2.4.4. Định danh Listeria monocytogenes: TCVN 7700-1:2007, ISO 11290 – 1
: 1996 / Amd.1 : 2004. ............................................................................................ 38
2.4.5. Định tính Salmonella: TCVN 4829:2005 Sửa đổi lần 1 : 2008 (ISO 6579 :
2002/Amd.1 : 2007) ................................................................................................ 42
2.4.6. Tiến hành định tính Salmonella.spp, Listeria monocytogenes bằng
phương pháp PCR song song với phương pháp truyền thống ................................ 48
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 54
3.1. Kết quả mô tả mẫu:.............................................................................................. 54
3.2. Kết quả đánh giá vi sinh vật trong mẫu ............................................................... 57
3.2.1. Quy định về chỉ tiêu kiểm nghiệm ................................................................ 57
3.2.2. Kết quả đánh giá vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp truyền thống .... 58
3.2.3. Kết quả định tính Salmonella spp. và Listeria mocytegense trong mẫu
bằng phương pháp PCR .......................................................................................... 69
3.2.4. Kết quả và nhận xét chung............................................................................ 71
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 74
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 74
4.2. Đề nghị ................................................................................................................ 74

Tài liệu tham khảo : ..................................................................................................... 75
PHẦN PHỤ LỤC ..............................................................................................................i

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang III


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
APHA

American Public Health Association

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

BYT

Bộ Y tế

BS

British Standards

Đ

Đạt

GMO

Genetically Modified Organism

GMP

Good Manufacturing Pratice

IEC

International Engineering Consortium

ISO

International Organization for Standardization

KĐ

Không đạt

KPH

Không phát hiện

QUATEST 3

Trung tâm kỹ thuật đo luờng chất luợng 3

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

HACCP

Hazard Analysis and Critical Control Points

USFDA

United States Food and Drug Administration

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang IV


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu kem chứa sữa. ........ 33
Bảng 2.2 Bảng tóm tắt các phản ứng của Listeria spp. ................................................. 42
Bảng 2.3 Các phản ứng sinh hóa của các chủng Salmonella ........................................ 47
Bảng 2.4 Các phản ứng kháng huyết thanh thử khẳng định .......................................... 48
Bảng 2.5 Điều kiện để nuôi cấy các vi sinh vật ............................................................. 48
Bảng 2.6 Mồi đặc trưng cho từng loại vi sinh vật ......................................................... 49
Bảng 2.7 Nồng độ các thành phần phản ứng PCR phát hiện các vi sinh vật:
Salmonella spp và Listeria monocygenes ...................................................................... 50
Bảng 2.8 Chương trình nhiệt trên máy PCR .................................................................. 51
Bảng 3.1 Kết quả đánh giá mô tả mẫu ........................................................................... 54
Bảng 3.2 Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm không được phép ................................ 57

vượt quá giới hạn được quy định tại bảng dưới đây: ..................................................... 57
Bảng 3.3 Kết quả định lượng Coliforms trong các mẫu ................................................ 58
Bảng 3.4 Kết quả định tính và định lượng E.coli trong các mẫu .................................. 60
Bảng 3.5 Kết quả định lượng Staphylococus aureus trong các mẫu ............................ 62
Bảng 3.6 Kết quả định tính Listeria monocytogenes trong các mẫu ............................. 64
Bảng 3.7 Kết quả định tính Salmonella trong các mẫu ................................................. 66
Bảng 3.8 Kết quả điện di các mẫu Salmonella spp. và Listeria monocytogenes phân
lập từ các mẫu kem trên thạch agarose .......................................................................... 69

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang V


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biều đồ 3.1: Kết quả thu được sau khi đánh giá thử nghiệm các chỉ tiêu trong các
mẫu kem có chứa sữa ..................................................................................................... 72

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang VI


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Kem giải khát bổ dưỡng (Internet). ................................................................. 7

Hình 1.2: E. coli dưới kính hiển vi điện tử ( Internet ) .................................................... 8
Hình 1.3: Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử (Internet) ......................... 11
Hình 1.4: Listeria monocytogenes dưới kính hiển vi (Internet) .................................... 14
Hình 1.5. Vi khuẩn Salmonella (Internet). .................................................................... 18
Hình 1.6 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella ................................................ 21
Hình 1.7 Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt................ 24
Hình 1.8: Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động của máy luân nhiệt với buồng
ủ nhiệt Peltier ................................................................................................................. 27
Hình 1.9: Hình vẽ minh họa cơ chế hoạt động chống ngoại nhiễm của UNG ............. 28
Hình 2.1: Quy trình chung trong kiểm nghiệm mẫu ..................................................... 32
Hình 2.2 Cấy & đọc kết quả phản ứng CAMP ............................................................. 41
Hình 3.1 Kết quả điện di đoạn gen đặc trưng của Salmonella trên gel agarose 2% ..... 71

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang VII


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH ...............................................................................................i
Hình 1 Khuần lạc Coliforms trên môi trường VRBA. ......................................................i
Hình 2 Phản ứng IMViC .................................................................................................i
Hình 3 Môi trường RVS trước và sau khi cấy dịch khuẩn .............................................ii
Hình 4 Môi trường XLD trước và sau khi cấy ................................................................ii
Hình 5 Phản ứng sinh hóa trên môi trường TSI agar .................................................... iii
Hình 6 Phản ứng urease: âm tính (trái), dương tính (phải) ........................................... iii
Hình 7 Môi trường LDC trước(A) và sau khi cấy vi khuẩn (B:dương tính, C âm
tính) ................................................................................................................................ iii

Hình 8: Phản ứng phát hiện β-galactosidase(A: âm tính; B dương tính). .......................iv
Hình 9 Phản ứng indol (A:âm tính, B: dương tính) ......................................................iv
Hình 10 Phản ứng VP (A:âm tính, B: dương tính) .......................................................iv
Hình 11 E.coli trên môi trường EMB .............................................................................. v
Hình 12 L. monocytogenes trên môi trường ALOA ........................................................ v
Hình 13 Phản ứng coagulase ............................................................................................ v
Hình 14 Khuẩn lạc S. aureus trên môi trường BP ........................................................... v
PHỤ LỤC 2 : CÁC HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG ĐƢỢC SỬ DỤNG ..............vi
1.

Violet red bile lactose agar (VRBL) ........................................................................vi

2.

Brilliant green bile broth (BGB) ..............................................................................vi

3.

Butterfield's buffer phosphate diluents ....................................................................vi

4.

Phẩm nhuộm Gram .................................................................................................vii

5.

Lauryl tryptose broth ( LST )..................................................................................vii

6.

EC broth ................................................................................................................ viii

7.

Tryptone ................................................................................................................ viii

8.

Butterfield's phosphate buffered ........................................................................... viii

9.

L - EMB agar ...........................................................................................................ix

10.

MRVP broth .........................................................................................................ix

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang VIII


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

11.

Brain heart infusion broth (BHI broth) ................................................................ix

12.

Baird - Parker agar ................................................................................................ x

13.

Huyết thanh thỏ/ Rabbit plasma ...........................................................................xi

14.

Trypticase soy broth với 10

15.

Nước muối sinh lý/ Physiological salt solution 0.85 % .......................................xi

16.

Half Fraser broth .................................................................................................xii

17.

Fraser broth (ISO 11290-1:1996) ...................................................................... xiii

18.

Oxford ............................................................................................................... xiii

19.

Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) ............................... xiii

20.

Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (ISO 11290-1:1996) ...................... xv

21.

Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB) (ISO 11290-1:1996) ....................xvi

22.

Molity agar (ISO 11290-1:1996) .......................................................................xvi

23.

Blood agar. .........................................................................................................xvi

24.

10.H2O2 3 % ..................................................................................................... xvii

25.

Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth). ................................ xvii

26.

Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth) .............. xviii

27.

Modified semi-solid Rappaport-Vasiliadis medium (MSRV) ...........................xix

28.

Xylose - Lysine desoxycholate agar (XLD) ....................................................... xx

29.

Hektoen enteric agar (HE) .................................................................................. xx

30.

Bismuth sulfite agar (BS) (Wilson và Blair) ......................................................xxi

31.

Triple sugar iron agar (TSI) ...............................................................................xxi

32.

Tryptone ........................................................................................................... xxii

33.

MR - VP medium ............................................................................................. xxii

34.

Christensen’s urea agar. ................................................................................... xxii

35.

Nutrient agar ................................................................................................... xxiii

36.

L-Lysine decarboxylation medium. ................................................................ xxiii

37.

Semi - solid nutrient agar. ................................................................................xxiv

38.

Nước muối sinh lý ............................................................................................xxiv

39.

ONPG solution .................................................................................................xxiv

40.

Reagents ...........................................................................................................xxiv

SVTH Lâm Văn Thắng

, NaCl và 1

sodium pyruvate ...........................xi

Trang IX


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

41.

Kháng huyết thanh: O, H, Vi ............................................................................ xxv

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang X


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường
xuyên, trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có
thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguồn
gốc từ vi sinh vật do sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của
các độc tố được tiết ra bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm (Trần
Linh Thước, 2002).
Trong tháng 8/2014, cả nước xảy ra 11 vụ ngộ độc thực phẩm làm 307 người
mắc, 216 người đi viện và 01 trường hợp tử vong. Về căn nguyên: 03/11 vụ do vi
sinh vật, 03/11 vụ do độc tố tự nhiên, 01/11 vụ do hóa chất và còn 04/11 vụ chưa
xác định được nguyên nhân gây ngộ độc. Tích lũy từ đầu năm đến thời điểm báo
cáo, toàn quốc đã xảy ra 87 vụ ngộ độc thực phẩm với 2937 người mắc, 2295 người
đi viện và 19 trường hợp tử vong (www.moh.gov.vn/news/ ).

Ở Canada hàng năm có khoảng trên 2 triệu người bị ngộ độc do thức ăn, nếu
tính trung bình theo dân số thì cứ 11 người có 1 người mắc bệnh. Ở Mỹ có khoảng
13 triệu người ngộ độc thức ăn trong năm và cứ 18 người có 1 người mắc bệnh do
thực phẩm, trong đó 85

số ca ngộ độc thức ăn là do nguyên nhân vi sinh (Nguyễn

Phùng Tiến và cs., 2003).
Ngày nay các sản phẩm thực phẩm và nước giải khát tương đối đa dạng, trong
đó Kem hay cà rem (từ tiếng Pháp: crème) là món ăn ngọt dạng đông lạnh rất được
người dân ưa chuộng trong những ngày nắng nóng. Kem được làm từ sản phẩm sữa
như kem béo, trứng gà thêm vào gia vị và đường. Tuy mới xuất hiện ở Việt
Nam trong đầu thế kỷ 20 nhưng hiện nay kem đã có vị trí rất quan trọng trong ẩm
thực của người Việt (vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
Khi nhu cầu ẩm thực kem càng tăng nhanh đặt ra vấn đề an toàn vệ sinh của
các sản phẩm kem. Ở Việt Nam, tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trong cả nước
nói chung và các khu vực đô thị nói riêng trong thời gian qua đang tạo nhiều lo lắng
cho người dân. Để khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong kem hiện nay tôi đã

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 1


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

tìm hiểu theo. TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT 14 Quy định giới hạn tối đa ô
nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm.
Xuất phát từ những lí do trên, tôi đã thực hiện đề tài: " KHẢO SÁT TỈ LỆ
NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ

CHỨA SỮA THEO TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT ".

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 2


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

TỔNG QUAN

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 3


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tồng quan về QUATEST 3
1.1.1. Những nét chung
QUATEST 3 là tổ chức khoa học công nghệ thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng – Bộ Khoa học và Công nghệ, được thành lập từ tháng 5 năm
1975 trên cơ sở Viện Định chuẩn Quốc gia trước đây.
QUATEST 3 có đội ngũ chuyên viên, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu
và có nhiều kinh nghiệm, hệ thống phòng thí nghiệm với trang thiết bị hiện đại theo
chuẩn mực quốc tế. QUATEST 3 áp dụng hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu
chuẩn ISO 9001 cho hoạt động điều hành, hoạt động tư vấn đào tạo và Trang thiết
bị thí nghiệm; lĩnh vực thí nghiệm được công nhận phù hợp với tiêu chuẩn
ISO/IEC 17025, lĩnh vực giám định hàng hóa được công nhận phù hợp với

ISO/IEC 17020, lĩnh vực chứng nhận sản phẩm được công nhận phù hợp với
ISO/IEC Guide 65 và lĩnh vực cung cấp .dịch vụ thử nghiệm thành thạo theo
ISO/IEC 17043.
Qua hơn 35 năm hoạt động, QUATEST 3 đã được biết đến như một đơn vị
hàng đầu tại Việt Nam trong lĩnh vực cung cấp dịch vụ kỹ thuật về tiêu thuẩn, đo
lường, chất lượng và đánh giá sự phù hợp (www.quatest3.com.vn/thu-nghiem).
1.1.2. Nhiệm vụ
QUATEST 3 cung cấp các dịch vụ kỹ thuật về tiêu chuẩn, đo lường, chất
lượng và đánh giá sự phù hợp phục vụ quản lý nhà nước và yêu cầu của các tổ
chức, doanh nghiệp. Các nhiệm vụ chính bao gồm:
–

Kiểm tra, giám định và thẩm định kỹ thuật về chất lượng, vệ sinh, an toàn của
sản phẩm, hàng hóa, vật liệu, cấu kiện công trình.

–

Thử nghiệm vật liệu, sản phẩm, hàng hóa

–

Kiểm định, hiệu chuẩn và đánh giá phương tiện đo.

–

Chứng nhận sự phù hợp của sản phẩm với tiêu chuẩn và qui chuẩn kỹ thuật;
chứng nhận Rau, quả và chè an toàn phù hợp với VietGAP.

–

Kiểm định và đánh giá an toàn công nghiệp.

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 4


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

–

Khảo sát, quan trắc, phân tích, đánh giá thực trạng và tác động môi trường.

–

Khảo sát, đánh giá các điều kiện kỹ thuật, thực trạng công nghệ, chuyển giao
công nghệ.

–

Đào tạo và tư vấn năng suất chất lượng, ứng dụng kỹ thuật mã số - mã vạch.

–

Đào tạo nghiệp vụ, chuyên môn và kỹ thuật về tiêu chuẩn đo lường chất
lượng.

–

Nghiên cứu, chế tạo và cung cấp các chuẩn đo lường, mẫu chuẩn và các

phương tiện đo. Trang bị và cung cấp dịch vụ bảo trì, bảo dưỡng và sửa chữa
các phương tiện đo lường, thử nghiệm, thiết bị kỹ thuật.

–
–

Tiếp nhận đăng ký và tư vân ưng dụng mã số, mã vạch.
Cung cấp thông tin, tiêu chuẩn và các tài liệu liên quan đến tiêu chuẩn, đo
lường, chất lượng (www.quatest3.com.vn/thu-nghiem).

1.1.3. Phòng thử nghiệm vi sinh – GMO
Phòng thử nghiệm Vi sinh-GMO thuộc QUATEST 3 là phòng thí nghiệm
chuẩn khu vực ASEAN về lĩnh vực vi sinh, được công nhận ISO/IEC 17025 về xây
dựng và quản lý phòng thí nghiệm.
Với nỗ lực nâng cao năng lực kỹ thuật của các phòng thử nghiệm để được thừa
nhận quốc tế và khu vực, Phòng Thử nghiệm Vi sinh - GMO của QUATEST
3 được các nước ASEAN chọn là phòng thử nghiệm đối chứng (ASEAN Reference
Laboratory – ARL) theo chương trình EC – ASEAN.
 Năng lực kỹ thuật chính
Phân tích vi sinh trong thực phẩm, nông sản, mỹ phẩm, nước, thức ăn chăn
nuôi, đồ uống, phân vi sinh, chế phẩm sinh học và các sản phẩm tiêu dùng khác.
Phân tích định tính và định lượng sinh vật biến đổi gen (GMO) có trong các
loại sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật, các loại hạt giống, các loại thức ăn dành
cho gia súc(www.quatest3.com.vn/thu-nghiem)....
 Phƣơng pháp thử nghiệm
TCVN, APHA, US FDA, BS, ISO, GS, AOAC,…
 Thiết bị chính

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 5


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Các thiết bị vi sinh như tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ ấm, kính hiển vi, tủ đông
sâu… Các thiết bị để thử nghiệm thực phẩm biến đổi gen như PCR Real Time, máy
ly tâm lạnh, máy điện di ngang, thiết bị nhân gen, tủ lắc ổn nhiệt
(www.quatest3.com./ thu-nghiem).

1.2. Tổng quan về kem
Kem hay cà rem (từ tiếng Pháp: crème) là món ăn ngọt dạng đông lạnh làm
từ sản phẩm sữa như kem béo, trứng gà thêm vào gia vị và đường. Hỗn hợp này
được khuấy đều khiến nước đá không kết tinh được. Kết quả là kem ở dạng mịn
(vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
1.2.1. Nguồn gốc:
Kem có xuất xứ từ thời La Mã cổ đại, tiền thân của kem là món tuyết ngọt
được vị Hoàng đế Nero sai người lên tận đỉnh núi Apennine để lấy "tuyết tươi" về
ướp nó nhiều lần với mật ong và hoa quả (vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
Vào thời Đường, món Tuyết ngọt được người Trung Quốc tạo ra hình hài
mới. Đó là hỗn hợp của sữa trâu, bò, dê đã được lên men, trộn với bột mỳ, sau đó
được ướp long não cho có hương vị và làm lạnh bằng băng với muối. Món quý này,
cũng như tuyết ngọt của Nero, chỉ được dùng trong những buổi tiệc lớn của triều
đình (vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
Về sau, năm 1925, trong Cuốn sách "Description of the World" (Diện mạo thế
giới) của Marco Polo đã làm cả châu Âu kinh ngạc. Trong số vô vàn những điều lạ
lẫm, Marco Polo nói đến có một thứ được gọi là "sữa được làm khô trong một thứ
bột nhão". Theo người Ý, đặc sản này của Trung Hoa sẽ mãi chỉ là sữa và bột nhão
nếu không có Marco Polo. Chính nhờ ông mà nó mới trở thành kem ở châu Âu
(vi.wikipedia.org/wiki/Kem).

Đối với Việt Nam món kem chỉ mới xuất hiện ở đầu thế kỷ 20, do người Pháp
mang công thức và cách chế biến sang phục vụ quân đội xâm lược và từ đó trở nên
rộng

rãi

với

người Việt

Nam nhất

là

ở miền

nam

Việt

Nam

(vi.wikipedia.org/wiki/Kem).

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 6


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.1. Kem giải khát bổ dƣỡng (Internet).
1.2.2. Thành phần của kem
Kem gồm có thành phần chính là sữa, đường, các chất phụ gia, các loại hương
bổ sung như vani, socola, dâu....
Ngoài ra trên thị trường ngày nay có xuất hiện các loại bột làm kem thuận tiện
trong qua trình chế biến. Bột kem cũng được làm từ sữa, đường và các phụ gia
nhưng đã được sấy khô thành dạng bột và có thể bảo quản lâu dài. Ngoài ra bột kem
có bổ sung hương liệu phù hợp với khẩu vị của từng người (vi.wikipedia.org/wiki
/Kem).
1.2.3. Các vi sinh vật trong kem
Các vi sinh vật thường nhiễm trong các sản phẩm kem là Enterobacteriace,
Coliforms, E.coli, S. aureus, Salmonella, Listeria ....
Trong phạm vi bài báo cáo này em chỉ khảo sát mức độ nhiễm các vi sinh vật
gây bệnh trong các sản phẩm kem có chứa sữa theo Tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT.

1.3. Đại cƣơng về các vi sinh vật gây bệnh thƣờng hiện diện trong kem
1.3.1. Đại cương về Coliforms
Coliforms và Fecal coliforms (coliforms phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để
chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật máu nóng
(Trần Linh Thước, 2002).
1.3.1.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy
SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 7


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Nhóm Coliforms gồm những vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi, Gram (-)
không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường
nuôi cấy lỏng (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.1.2 Đặc điểm sinh hóa
Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm:
Indol (I), Methyl Red (MR), Voges – Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường gọi tắt
là IMViC (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.1.3 Khả năng gây bệnh
Khi Coliforms phân hiện diện số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng
nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện
trong phân. Trong các thành viên của nhóm coliform phân thỉ E.coli là loài được
quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.2. Đại cương về Escherichia coli
1.3.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.2 E. coli dƣới kính hiển vi điện tử ( Internet )
E.coli thuộc giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae, loài E.coli, là trực
khuẩn Gram (–) có kích thước dài hay ngắn tùy theo môi trường nuôi cấy. Kích
thước trung bình từ 0,5- 3 µm, hai đầu tròn, không bào tử, tạo giáp mô mỏng, di
động nhờ có lông tơ quanh tế bào, trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực (Trần
Linh Thước, 2002).
1.3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 8


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

E.coli phát triển trên môi trường dinh dưỡng bình thường, nhiệt độ từ (1846)0C hay thấp hơn. Trên môi trường thạch để tủ ấm 370C tạo khuẩn lạc thấp, lồi,
mềm, không màu, đường kính 1-3 mm. Trên môi trường thạch EMB khuẩn lạc có
màu tím ánh kim (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.2.3 Đặc điểm sinh hóa
E.coli lên men được nhiều loại đường như glucose, lactose, manitol, xylose,
glycerol, rhamose, sorbitol, arabinose....không lên men đường dextrin và inositol.
Phản ứng đặc trưng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác là IMViC
( Indol:+, Methyl Red +, Voges- Proskauer: -, Citrate -) (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.2.4 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
E.coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H, được chia thành
nhiều tuyp huyết thanh khác nhau. Kháng nguyên O (somatic antigen) là kháng
nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau
(Bộ Y tế, 2009).
Những chủng E.coli liên qua đến tiêu chảy thuộc các nhóm sau:
– EPEC (enteropathogenic E.coli): một số tuýt oihuyết thanh gây tiêu chảy ở trẻ
duới 2 tuổi, cơ chế gây bệnh chưa rõ. Các tuýt thường gặp là O26, O44, 086,
O111, O112, O14, O119, O124, O125, O126, O127, O128, O142 (Bộ Y tế,
2009).
– ETEC (enterotoxignic E.coli) : thường gặp ở các trẻ ở các nước đang phát triển,
chúng cũng gây bệnh cho người lớn, đặc biệt lả du khách nên được gọi là
traveler’s diarrhea. ETEC gây bệnh bằng cách tiết 2 loại độc tố ruột: LT( heat
labile) và ST (heat stable):
+ Độc tố LT: không bền với nhiệt, có cấu trúc chức năng miễn dịch giống độc
tố vi khuẩn tả. LT gây hoạt hóa adenylcyclase trong tế bào biểu mô ruột, làm
tăng lượng AMP vòng. Do kích thích bài tiết ion Cl- và bicarbonate, đồng
thời thời ức chế tái hấp thu Na+, hậu quả cuối cùng gây tiêu chảy mất nước
(Bộ Y tế, 2009).

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 9


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

+ Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động của ST là hoạt hóa guanylcyclase
làm tăng GMP vòng , dẫn đến kích thích bài tiết nước và muối gây tiêu chảy
(Bộ Y tế, 2009).
+ Những dòng ETEC tiết ra 1 hay 2 loại độc tố ruột tùy plasmid của chúng.
Tiêu chảy trầm trọng và kéo dài ở bệnh nhân nhiễm vi khuẩn tiết cả hai loại
độc tố này. Thường gặp nhất là các tuýt O6 H16, O8 H9, O15 H11,O78 H12.
– EIEC (enteroinvasive E.coli): triệu chứng bệnh giống hội chứng lỵ do shigella.
Vi khuẩn xâm lấn niêm mạc ruột, , gây tiêu chảy phân có đàm máu. Chúng có
thể lên men lactose hay không, lysine decarboxylase thường âm tính và có thể
không di động. Thường gặp ở các tuýt O28AC, O112AC, 0124, O140, O147 và
O152 (Bộ Y tế, 2009).
– VTEC( verocytotoxin-producing E.coli): gây tiêu chảy có thể biến chứng đe
dọa mạng sống là viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tan máu- ure huyết
HUS. HUS biểu hiện bộ ba triệu chứng suy thận cấp giảm tiểu cầu và thiều
máu tán huyết do tổn thương mao mạch. Bao gổm nhiều tuýt huyết thanh khác
nhau như O26, O111, O113, O124, O145, O157,.. độc tố tiết ra có tác dụng gây
độc tế bào vero, gọi lả VT, tương tự độc tố shiga, có 2 loại VT:
+ VT1 có cấu trúc tương tự độc tố shiga nhưng có trọng lượng phân tử thấp
hơn. Trong thực nghiệm VT1 gây độc tế bào, liệt và chết chuột, đồng thời có
tính chất độc tố ruột vì thử nghiệm thắt đoạn ruột thỏ dương tính.VT1 gây
chết chuột kém hơn độc tố shiga nhưng tác dụng độc tố ruột lớn hơn gấp năm
lần (Bộ Y tế, 2009).
+ VT2 cấu trúc hơi khác VT1, tác dụng trên tế bào vero kém hơn 1000 lần
nhưng liều gây chết 50

thỏ lại cao hơn 100 lần. Trên thỏ VT2 gây manh

tràng xuất huyết còn VT1 gây tiêu chảy không có máu (Bộ Y tế, 2009).
1.3.2.5 Sức đề kháng của Escherichia coli
E.coli bị diệt ở 600C từ 15-30 phút, nhiệt độ lạnh chịu được 2 giờ. Trong điều
kiện tự nhiên, E.coli sống được một vài tuần đến một vài tháng (Nguyễn Ngọc
Tuân, 2002).

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 10


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Formol, acid femic, HgCl2 diệt vi khuẩn trong 5 phút. Hấp autoclave 1210C
trong 15 phút diệt được E.coli (Nguyễn Phùng Tiến và cs.,2003).
1.3.2.6 Triệu chứng ngộ độc
Thời gian ủ bệnh từ 2-20 giờ, người trúng độc đau bụng dữ dội, ít nôn mữa, đi
phân lỏng khoảng 1-15 lần trong ngày. Thân nhiệt bình thường hay tăng nhẹ, trường
hợp nặng có thể sốt cao, mệt mỏi tay chân co quắp, đổ mồ hôi, thời gian khỏi bệnh
tương đối dài (Nguyễn Phùng Tiến và cs.,2003).
1.3.3. Đại cương về Staphylococus aureus
1.3.3.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.3: Staphylococcus aureus dƣới kính hiển vi điện tử (Internet)
S.aureus thuộc giống Staphylococus, bộ Bacillales, họ Staphylococcaea là vi
khuẩn hình cầu, tụ lại từng chùm, Gram (+), kích thước 0,8- 1µm, không di động
không sinh bào tử, không tạo capsule. Trên môi trường canh có thể hình thành
chuỗi ngắn, khi canh trường già hơn có thể bắt màu gram âm (Trần Linh Thước,

2002).
1.3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy
Staphylococus aureus mọc dễ trên nhiều loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn ở
điều kiện hiếu khí và kị khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, nhưng ở nhiệt
độ phòng (20-25)0C là thích hợp nhất để vi khuẩn tiết sắc tố (Bộ Y tế, 2009).
Trên môi trường thạch dinh dưỡng: S.aureus tạo khuẩn lạc tròn ướt, lồi, màu
vàng. Trên môi trường Baird Parker (BP): tạo khuẩn lạc màu đen, quanh khóm có
vòng sáng. Trên môi trường thạch máu: gây dung huyết, khuẩn lạc tròn nhẵn, đường
SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 11


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

kính 1-3mm, hình thành sắc tố trắng đen hơi vàng. Trên môi trường geratin gây tan
chảy (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.3.3 Đặc điểm sinh hóa
S.aureus lên men đường manitol, glucose, lactose, không lên men glycerin,
cho phản ứng indol âm tính, Metyl Red dương tính, Voges- Proskauer dương tính,
chuyển Nitrate thành Nitrite, không sinh H2S, catalase dương tính, coagulase dương
(Nguyễn Tiến Dũng, 2004).
1.3.3.4 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
 Cấu trúc kháng nguyên
Tế bào S.aureus là hỗn hợp của hơn 30 loại kháng nguyên. S.aureus có kháng
nguyên O gồm chủ yếu 2 loại peptidoglycan và protein A:
+ Peptidoglycan: bản chất là một polysaccharide của thành tế bào, có tác dụng
giữ cho thành tế bào được chắc, đồng thời kích thích bạch cầu đơn nhân sản
xuất interleukin-1 lôi kéo bạch cầu trung tính, có hoạt tính như nội độc tố và
hoạt hóa bổ thể (Bộ Y tế, 2009).

+ Protein A: cũng là thành phần của thành tế bào có tác dụng tham gia trong
phản ứng kết hợp bổ thể (Bộ Y tế, 2009).
Teichoid acid : bản chất là những glycerol hay rabitol photphate, liên kết với
peptidoglycan và nó cũng có tính kháng nguyên. Kháng thể chóng lại teichoid acid
đã dược tìm thấy ở bệnh nhân viêm nội tâm mạc do S.aureus (Bộ Y tế, 2009).
Nang : chỉ có ở một số dòng S.aureus có tác dụng ngăn cản sự thực bào của
bạch cầu trung tính (Bộ Y tế, 2009).
 Độc tố và enzyme
Độc tố ruột: khoảng 50

S.aureus tiết ra độc tố ruột. Chúng được kí hiệu từ

A-E. Đây là những protein được cấu tạo từ những polypeptid đơn giản. Có 5 nhóm
huyết thanh học được đặt tên là SEA (Staphylococus Enterotoxin A), SEB, SEC,
SED và SEE. Nhóm thứ 6 SEF không được xem là độc tố ruột và đặt lại là độc tố
gây hội chứng shock toxin-1. Những độc tố này có sức đề kháng cao với nhiệt độ.

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 12


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Độc tố ruột được tiết ra khi chúng mọc trên thức ăn nhiều đường và protein (Bộ Y
tế, 2009).
Độc tố gây dung huyết tế bào α, β, γ, δ : tất cả đều có kiểu kháng nguyên riêng
biệt. Những tế bào hồng cầu của nhiều loài khác nhau sẽ có tính mẫn cảm khác
nhau đối với các độc tính nảy. Độc tố α và β gây dung huyết mạnh, trong đó độc tố
α có ái lực mạnh với hồng cầu thỏ, độc tố này gây co thắt cơ trơn, hoại tử da và gây

chết. Độc tố β phần lớn ái lực với tế bào hồng cầu cừu. Độc tố bị ức γ chế bởi
cholesterol, độc tố δ bị ức chế bởi những phospholipids (Bộ Y tế, 2009).
Độc tố gây ra hội chứng shock: do những dòng vi khuẩn gây ra hội chứng
shock độc tính cho người (Bộ Y tế, 2009).
Độc tố gây tróc vảy:làm bong biểu bì, tạo nốt phỏng ngoài da. Ngoại độc tố:
gồm 1 số độc tố gây chết súc vật thí nghiệm, gây hoại tử da và chứa những
hemolysin tan được (Bộ Y tế, 2009).
 Các enzyme
+ Coagulase: làm đông huyết tương, biến đổi prothrombin thành thrombin,
fibrinogen thành fibrin. Lipase gây rối loạn sự bảo vệ các acid béo trên da.
Hyaluronidase: là một enzyme được biết đến như là một yếu tố dẫn truyền,
nó làm phân hóa acid hyaluronic, tạo điều kiện cho vi khuẩn lan tràn trong
mô tế bào (Bộ Y tế, 2009).
+ Leukocidin: phá hủy bạch cầu hạt và marcophage, nó được tạo thành bởi hai
protein tương hỗ và rất nhạy cảm với nhiệt độ. Staphylokinase làm tan fibrin
do biến đổi plasminogen thành plasmin bởi enzyme fibrinolytic (Bộ Y tế,
2009).
+ Catalase biến hidrogen peroxid thành oxygen và nước. Protease phá hủy
protein (Bộ Y tế, 2009, Trần Linh Thước, 2002).
1.3.3.5 Triệu chứng ngộ độc
Triệu chứng ngộ độc xuất hiện nhanh 1-6 giờ và kéo dài từ 2-12 giờ. Triệu
chứng ban đẩu là bủn rủn tay chân, đau bụng quặn, chảy nước dãi, buồn nôn, ói

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 13


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

mửa có máu. Đau đầu co cơ, toát mồ hôi. Triệu chứng cấp tính qua nhanh sau 1-2
ngày (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
1.3.4. Đại cương về Listeria monocytogenes

Hình 1.4: Listeria monocytogenes dƣới kính hiển vi (Internet)
1.3.4.1 Đặc điểm hình thái
L. monocytogenes thuộc Bộ: Bacillales, Họ Listeriaceae, Giống: Listeri, là
trực khuẩn Gram (+), hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phát triển ở nhiệt độ từ 1 –
450C, không tạo bào tử nhưng có chuyển động điển hình khi được cấy ở nhiệt độ 20
- 250C và có thể phát triển trong tế bào (Trần Linh Thước, 2002).
Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 12µm. Phản ứng catalase dương tính. Sau khi nhuộm Gram ta thấy những tế bào hình
que riêng lẻ hoặc những tế bào nối với nhau thành một chuỗi tế bào. Vi khuẩn này
có thể tồn tại ở pH rộng từ 4,3 - 9,6 (J. M Farber và cs., 1991).
1.3.4.2 Đặc điểm nuôi cấy
Listeria monocytogenes có khả năng phát triển tốt trên môi trường giàu dinh
dưỡng. Trên môi trường Oxford agar cho khuần lạc màu nâu đen hay màu xanh đen,
đường kính 2-3 mm, có vòng phân giải màu đen, khuẩn lạc lõm xuống sau 48h nuôi
cấy, đây là điểm đặc trưng của của giống Listeria. Trên môi trường ALOA khuẩn

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 14