Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong aspergillus niges D15LCC1 và khảo sát khả năng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

--------

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE
TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER
D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ PHƢƠNG MAI

NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE
TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER
D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm
Mã số: 62 54 02 05
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. TÔ KIM ANH

2. TS. LÊ QUANG HÒA

Hà Nội - 2012


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu và kết quả
nghiên cứu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố.

Hà Nội, ngày…….tháng………năm 2012

Nguyễn Thị Phương Mai

i


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh –
Viện trƣởng – Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách
Khoa Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt và cấp kinh phí cho tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu. Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Quang
Hòa và GS.TS Đặng Thị Thu – Phòng Hóa Sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử - Viện
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận
tình hƣớng dẫn, dìu dắt cho tôi thực hiện nghiên cứu này.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trƣởng bộ
môn Hóa sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử cùng các thầy, cô giáo vá các cán bộ phòng
Hóa sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong
quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Tuấn Anh – giảng viên bộ môn Hóa sinh-Vi sinh

và Sinh học phân tử, Th.s Lê Tuân - cán bộ nghiên cứu bộ môn Hóa sinh-Vi sinh và Sinh
học phân tử cùng các học viên đã hƣớng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu tại bộ môn.
Tôi xin đƣợc cảm ơn TS. Trƣơng Quốc Phong – Trƣởng phòng thí nghiệm Proteomic,
cùng các cán bộ và các học viên tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học
Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội
đã động viên, hƣớng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
thực hiện nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà Tây cùng
gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày……..tháng…….năm 2012
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Phƣơng Mai

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ ii
MỤC LỤC ............................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ..................................................... viii
BẢNG VIẾT TẮT CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ............................................................ ix
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................... x
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I............................................................................................................................ 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................................... 3
1.1. LACCASE ...................................................................................................................... 3
1.1.1. NGUỒN THU LACCASE ...................................................................................... 3
1.1.1.1. Laccase trong tự nhiên ...................................................................................... 3
1.1.1.2. Laccase tái tổ hợp ............................................................................................. 4
1.1.2. CẤU TRÖC CỦA LACCASE ................................................................................ 6
1.1.3. CƠ CHẾ XÖC TÁC CỦA LACCASE ................................................................... 9
1.1.3.1. Xúc tác chuyển hóa các hợp chất phenol.......................................................... 9
1.1.3.2. Xúc tác chuyển hóa các hợp chất khác ........................................................... 10
1.1.4. ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE ............................................................................... 11
1.1.4.1 Khối lƣợng phân tử .......................................................................................... 11
1.1.4.2. Tính đặc hiệu cơ chất ...................................................................................... 12
1.1.4.3. Các hằng số động học của phản ứng của laccase .......................................... 12
1.1.4.4. pH tối ƣu và độ bền pH .................................................................................. 14
1.1.4.5. Nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt ...................................................................... 15
1.1.4.6. Các chất kìm hãm ........................................................................................... 15
iii


1.2. ỨNG DỤNG CỦA LACCASE.....................................................................................16
1.2.1. Laccase trong phân hủy các hợp chất mạch vòng ................................................. 16
1.2.2 Ứng dụng trong công nghiệp giấy .......................................................................... 17
1.2.3. Ứng dụng laccase công nghiệp dệt nhuộm ............................................................ 17
1.2.4. Laccase trong công nghiệp thực phẩm .................................................................. 18
1.2.5. Laccase trong sản xuất bioethanol ......................................................................... 19
1.2.6. Các ứng dụng khác của laccase ............................................................................. 19
1.3. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ NẤM MỐC........................................20
1.3.1. Ảnh hƣởng của trạng thái nấm mốc ...................................................................... 20
1.3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng .................................................................. 20
1.3.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon ......................................... 20

1.3.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ............................................................................. 21
1.3.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn khoáng ........................................................................ 22
1.3.2.4. Ảnh hƣởng của chất cảm ứng ......................................................................... 23
1.3.2.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH ....................................................................... 24
1.3.2.6. Ảnh hƣởng của sự thông khí .......................................................................... 25
1.4. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE.............................................25
1.4.1 Lên men gián đoạn ................................................................................................ 26
1.4.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed-batch) ....................................... 27
1.4.3 Lên men liên tục ..................................................................................................... 28
1.4.4. Động học của quá trình sinh tổng hợp laccase ...................................................... 29
1.4.4.1. Động học phát triển của nấm mốc .................................................................. 29
1.4.4.2. Động học quá trình tạo sản phẩm trong các hệ thống lên men ....................... 30
1.4.5. Sinh tổng hợp laccase nhờ hệ thống biểu hiện A. niger D15#26- pAN52-4 ......... 32
1.5. TINH CHẾ LACCASE.................................................................................................34
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................36
iv


2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU............................................36
2.1.1. Các mẫu vật nghiên cứu ........................................................................................ 36
2.1.2. Vi sinh vật.............................................................................................................. 36
2.1.3. Các loại thiết bị ...................................................................................................... 37
2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy .............................................................................................. 38
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................................38
2.2.1. Xác định sinh khối nấm mốc ................................................................................. 38
2.2.2. Xác định hoạt độ laccase ...................................................................................... 38
2.2.3. Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến ............................... 39
2.2.4. Xác định đƣờng khử theo phƣơng pháp DNS ...................................................... 40
2.2.5. Xác định protein bằng phƣơng pháp Lowry ......................................................... 40
2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE) ...................... 41

2.2.7. Điện di không biến tính phát hiện laccase ............................................................ 41
2.2.8. Xác định hàm lƣợng ethanol.................................................................................. 41
2.2.9. Xác định hàm lƣợng phenol tổng số bằng phƣơng pháp Folin Ciocalteau .......... 42
2.2.10. Thu bào tử nấm mốc trên đĩa thạch ..................................................................... 42
2.2.11. Phân lập và sàng lọc các chủng sinh laccase ....................................................... 43
2.2.12. Phƣơng pháp sàng lọc dòng biểu hiện laccase .................................................... 43
2.2.13. Phƣơng pháp nuôi cấy và tối ƣu hóa điều kiện nuôi A. niger D15#26lcc1 1.8B.............. 43
2.2.14. Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase từ A. niger D15#26lcc1 1.8B .............. 44
2.2.15. Tinh chế laccase tái tổ hợp .................................................................................. 45
2.2.16. Khảo sát đặc tính cơ bản của enzyme .................................................................. 45
2.2.17. Thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật .................................................................. 46
2.2.18. Nghiên cứu sử dụng laccase trong chuyển hóa lignocellulose ............................ 47
2.2.18.1. Xác định hàm lƣợng lignin theo phƣơng pháp biến tính của Komarov ....... 47
2.2.18.2. Khảo sát vai trò khử độc dịch thủy phân bã mía của laccase ....................... 48
v


CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................50
3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN SINH TỔNG HỢP LACCASE........................................50
3.2. SÀNG LỌC CÁC DÕNG A. NIGER D15#26 lcc1 SINH TỔNG HỢP LACCASE...53
3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN TĂNG TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG
HỢP LACCASE TRONG A. niger D15#26lcc1 1.8B.........................................................57
3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ glucose ........................................................................... 57
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ CuSO4 ............................................................................ 60
3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống cấp .............................................................................. 61
3.3.4. Ảnh hƣởng của pH................................................................................................. 62
3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ .................................................................................... 64
3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ A. niger D15#26lcc1
1.8B TRONG LÊN MEN GIÁN ĐOẠN.............................................................................66
3.4.1. Chọn miền khảo sát ............................................................................................... 66

3.4.2. Thiết lập mô hình ................................................................................................ 67
3.4.3. Tối ƣu hóa quá trình tổng hợp laccase................................................................... 71
3.5. KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI TỔNG HỢP LACCASE...................................................72
3.5.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí đến sinh tổng hợp laccase .................................... 72
3.5.2. Động thái của quá trình sinh tổng hợp laccase từ A. niger D15#26lcc1 1.8B trong
hệ thống lên men gián đoạn ............................................................................................. 74
3.6. THỬ NGHIỆM SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG LÊN MEN HAI GIAI
ĐOẠN..................................................................................................................................75
3.7. THỬ NGHIỆM LÊN MEN FED-BATCH.................................................................78
3.8. TINH CHẾ LACCASE.................................................................................................81
3.9. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP..........................................83
3.9.1. Ảnh hƣởng của pH tới laccase ............................................................................... 83
3.9.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới enzyme ...................................................................... 84
3.9.3. Các hằng số động học của phản ứng enzyme............................................................. 85
vi


3.10. KHẢO SÁT ỨNG DỤNG LACCASE TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ
LIGNOCELLULOSE.............................................................................................................87
3.10.1. Tiền xử lí hóa nhiệt kết hợp với laccase..................................................................... 87
3. 10.2. Vai trò laccase trong khử độc dịch thủy phân cho mục tiêu lên men ethanol .... 88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................................92
KẾT LUẬN..........................................................................................................................92
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................................93
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................94
PHỤ LỤC...........................................................................................................................104

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

TT

Các từ hoặc

Giải thích các từ hoặc thuật ngữ viết tắt

thuật ngữ viết tắt
1

ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

2

BSA

Bovine serum albumin

3

DMP

2,6-dimethoxyphenol

4

DNS

2,3 – dinitro salycilic

5

EPR

Cộng hƣởng thuận từ

6

E0

Thế oxi hóa khử

7

FC

Folin Ciocalteau

8

FPLC

Fast protein liquid chromatography

9

HBT

1-hydroxybenzotriazole

10

kb

11

kDa

Kilo dalton

12

mV

Milivol

13

PAH

Polycyclic aromatic hydrocarbon– Hydrocacbon mạch vòng

14

RBBR

15

SDS – PAGE

16

TCA

Kilo base

Remazol Brilliant Blue R
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Trichloroacetic acid

viii


BẢNG VIẾT TẮT CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC

STT

Các thông số

Giải thích các thông số động học

1

µ

2

µmax

3

S

Nồng độ cơ chất, kg cơ chất m-3

4

KS

Hằng số bán bão hòa cơ chất hay hằng số Monod, kg cơ chất.m-3

5

YP/S

Hiệu suất tạo sản phẩm, g sản phẩm/g cơ chất

6

YX/S

Hiệu suất tạo sinh khối, g sinh khối/g cơ chất

7

ΔP

Sự thay đổi của sản phẩm, g sản phẩm

8

ΔS

Sự thay đổi của cơ chất, g cơ chất

9

rp

Tốc độ tạo sản phẩm, g/m3h

10

qp

Tốc độ sản phẩm tạo thành dựa trên sinh khối tƣơi, g sản phẩm/g

Tốc độ tăng trƣởng riêng phần, h-1
Tốc độ tăng trƣởng tối đa, h-1

sinh khối/giờ
Mật độ sinh khối, g/m3

11

X

12

Fvào

Tốc độ dòng vào

13

Fra

Tốc độ dòng ra

14

D

Tỷ lệ pha loãng

15

P0

Nồng độ sản phẩm ban đầu, g sản phẩm/m3

16

Pi

Nồng độ sản phẩm đầu ra, g sản phẩm/m3

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Khối lƣợng phân tử và số lƣợng izozyme laccase trong tự nhiên ........................ 11
Bảng 2.1. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố.................................................. 44
Bảng 3.1. Số lƣợng các mẫu và chủng nấm thu đƣợc từ quá trình phân lập ....................... 50
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính laccase trên môi trƣờng chứa các chất chỉ thị .......... 51
Bảng 3.3. Hoạt độ laccase sau 9 ngày nuôi cấy trên MT2 .................................................. 52
Bảng 3.4. Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm ............................... 66
Bảng 3.5. Kết quả thực nghiệm .......................................................................................... 67
Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy – hàm mục tiêu hoạt độ laccase (U/L) ...................... 68
Bảng 3.7. So sánh hiệu suất sinh trƣởng và tổng hợp laccase của A.niger D15#26lcc1 1.8B
(thực hiện trong bình tam giác 250 ml) ............................................................................... 77
Bảng 3.8. So sánh hằng số động học của quá trình sinh tổng hợp laccase từ A. niger
D15#26lcc1 1.8B trong hệ thống lên men .......................................................................... 80
Bảng 3.9. Các bƣớc tinh sạch laccase từ A. niger D15#26lcc1 1.8B .................................. 82
Bảng 3. 10. So sánh hằng số động học của laccase tái tổ hợp, cơ chất ABTS .................... 85
Bảng 3.11. Hiệu quả thu hồi laccase nhờ kỹ thuật lọc dòng ngang ..................................... 86
Bảng 3.12. Hiệu suất thu hồi laccase nhờ kết tủa với (NH4)2SO4 bão hòa.......................... 87

x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sự phân bố các ion Cu2+ trong laccase từ B. subtilis ........................................... 7
Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của laccase ................................................................................... 8
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase ................ 9
Hình 1.4. Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần không có bản chất phenol bởi laccase . 11
Hình 1.5. Mô hình động học sinh trưởng nấm mốc theo Monod......................................... 29

Hình 1.6. Mô hình động học sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm trong lên men gián đoạn 30
Hình 1.7.Các chế độ bổ sung dinh dưỡng trong lên men fed-batch .................................... 31
Hình 2.1. Cấu tạo vectơ biểu hiện pAN52 - 4...................................................................... 37
Hình 3.1. Vòng oxy hóa cơ chất chỉ thị tanic (a), RBBR (b) và phản ứng định tính của
laccase với syringaldazine (c: A-dương tính, B- âm tính)................................................... 51
Hình 3.2. Vòng oxy hóa cơ chất ABTS (a) và syringaldazine (b) của các chủng N7.2,
R5.3 và T. versicolor 06 trên môi trường MT1................................................................. 52
Hình 3.3. Kết quả sàng lọc chủng laccase tái tổ hợp trên môi trường tối thiểu được bổ sung
thêm ABTS ............................................................................................................................ 54
Hình 3.4. Kết quả chọn dòng A. niger D15#26lcc1 sinh tổng hợp laccase ........................ 55
Hình 3.5. Điện di đồ phổ protein của A. niger D15#26lcc1 1.8B, A. niger D15#26 và T.
versicolor 06 ......................................................................................................................... 56
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sinh trưởng (A) và sinh tổng hợp laccase
(B) ........................................................................................................................................ 58
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến sinh tổng hợp laccase trong A. niger
D15#26lcc1 1.8B trên môi trường MT5. ............................................................................. 60
Hình 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến tổng hợp laccase ................................................ 61
Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp laccase trên môi trường MT5 trong A.
niger D15#26lcc1 1.8B ........................................................................................................ 62
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH đến tổng hợp hợp protease và sinh trưởng của A. niger
D15#26lcc1 1.8B ................................................................................................................. 63
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 đến tổng hợp laccase từ A. niger D15#26lcc1
1.8B ...................................................................................................................................... 64
xi


Hình 3. 12. Ảnh hưởng của nồng độ pepton đến sinh trưởng và tổng hợp laccase từ A.
niger D15#26lcc1 1.8B ........................................................................................................ 65
Hình 3. 13. Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ laccase tái tổ hợp và dự đoán
kết quả tối ưu ....................................................................................................................... 69

Hình 3.14. Bề mặt đáp ứng của hoạt độ laccase tích lũy vào điều kiện môi trường ........... 70
Hình 3.15. Kiểm tra thực nghiệm các điều kiện tối ưu tổng hợp laccase từ chủng A.niger
D15#26lcc1 1.8B ................................................................................................................. 71
Hình 3.16. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy và tốc độ cấp khí đến tổng hợp laccase ............. 73
Hình 3.17. Động thái quá trình sinh tổng hợp laccase từ A. nigerD15#26lcc1 1.8B ........ 75
Hình 3.18. Thử nghiệm lên men hai pha tổng hợp laccase từ A. niger D15#26lcc1 1.8B
trong bình tam giác 250ml .................................................................................................. 76
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ glucose trong lên men bán liên tục (fed-batch) (A) glucose 0,125g/l.h; (B) - glucose 0,25g/l.h.......................................................................... 79
Hình 3.20. Sắc ký đồ tinh sạch laccase từ A.niger D15#26lcc1 1.8B trên cột Hitrap Q fast
flow, rửa cột với đệm axetat natri 25mM, pH 5, gradient NaCl 0 – 1M ............................. 81
Hình 3.21. Điện di đồ (A) SDS-PAGE và (B) PAGE.......................................................... 82
Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ (A) và độ bền pH (B) của laccase từ A. niger
D15#26lcc1 1.8B ................................................................................................................. 83
Hình 3. 23. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ (A) và độ bền (B) laccase từ A. niger D15#26
lcc1 1.8B............................................................................................................................... 84
Hình 3.24. Vai trò của laccase trong xử lý bã mía .............................................................. 88
Hình 3.25. Khả năng loại phenol trong dịch tiền xử lý của laccase. .................................. 90
Hình 3.26. So sánh khả năng loại bỏ phenol của enzyme tái tổ hợp (NC) và enzyme thương mại
(TM) ..................................................................................................................................... 90
Hình 3.27. Khả năng lên men dịch thủy phân 1% cellulose bã mía sau xử lý với laccase . 91

xii


MỞ ĐẦU
Laccase (EC 1.10.3.2) là một polyphenol oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng trong
trung tâm xúc tác và thƣờng đƣợc gọi là polyphenol oxidase đa đồng. Laccase có khả năng
xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa
chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nƣớc.
Laccase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp bao gồm tẩy trắng giấy, tẩy

màu của thuốc nhuộm vải, loại bỏ hợp chất phenol dƣ trong rƣợu, khử độc môi trƣờng,
trong sản xuất nhiên liệu sinh học…
Laccase có thể thu nhận từ vi khuẩn, thực vật và côn trùng nhƣng với hoạt tính hạn
chế. Các laccase trong nấm đƣợc quan tâm nhiều hơn do khả năng xúc tác của chúng. Các
chủng tổng hợp laccase trong tự nhiên thƣờng có hoạt tính thấp và đòi hỏi các chất cảm
ứng tạo enzyme với giá thành cao. Trong thời gian gần đây việc sản xuất laccase tái tổ hợp
đã góp phần giảm đi tính phức tạp của quá trình lên men tổng hợp enzyme.
Các hệ thống đã đƣợc sử dụng để biểu hiện laccase thành công cho đến nay bao gồm vi
khuẩn, nấm men và nấm sợi. Laccase biểu hiện trong vi khuẩn và nấm men thƣờng không
cho phép thu nhận đƣợc enzyme hoạt tính cao do yêu cầu glycosyl hóa cao của các nguồn
gen nấm mốc. Hệ thống biểu hiện laccase trong nấm sợi có ƣu điểm là thực hiện quá trình
glycosyl hóa tƣơng tự nhƣ nấm mốc ở trạng thái tự nhiên, có khả năng tiết ra một lƣợng
lớn protein tái tổ hợp có hoạt tính. Hệ thống biểu hiện laccase ở nấm sợi thành công chủ
yếu trong các vật chủ nhƣ: Aspergillus oryzae, A. niger, A. sojae, Trichoderma reseei…
Tuy nhiên, cho tới nay, hoạt độ đạt đƣợc của các chủng tái tổ hợp vẫn còn ở mức hạn chế,
có rất ít các nghiên cứu về các kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ nấm sợi
đƣợc công bố. Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài “Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ A. niger
D15#26lcc1 và khảo sát khả năng ứng dụng”
* Mục tiêu nghiên cứu:
- Nghiên cứu kỹ thuật lên men laccase của Trametes versicolor 06 biểu hiện trong A.
niger D15#26lcc1, nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
- Xác định đặc tính laccase của T. versicolor 06 biểu hiện trong A. niger D15#26lcc1

1


* Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase
- Sàng lọc các dòng A. niger D15#26lcc1 tái tổ hợp sinh tổng hợp laccase

- Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase trong A. niger D15#26lcc1 1.8B
- Tinh chế và xác định đặc tính laccase tái tổ hợp
- Khảo sát khả năng ứng dụng của laccase tái tổ hợp.
* Những đóng góp mới của luận án:
- Là công trình đầu tiên nghiên cứu kỹ thuật lên men thu nhận laccase tái tổ hợp của T.
versicolor 06 biểu hiện trong A. niger D15#26lcc11.8B bao gồm lên men gián đoạn, lên
men hai pha và lên men bán liên tục, hoạt độ laccase tích lũy đạt 8856 U/L trong lên men
bán liên tục (fed-batch), tăng 1,5 lần so với lên men gián đoạn thông thƣờng và tăng 6,05
lần so với chủng gốc T. versicolor 06.
- Laccase tái tổ hợp đƣợc khảo sát đặc tính, thử nghiệm sử dụng hỗ trợ quá trình tiền
xử lý lignocellulose và khử độc dịch thủy phân cho lên men ethanol, tăng khả năng loại bỏ
phenol 57,17%, đạt hiệu suất lên men 72,76%. Đóng góp này của luận án mở ra khả năng
sử dụng enzyme trong cocktail enzyme trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose.

2


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Laccase (benzenediol : oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) thuộc nhóm các oxidase
có chứa nhiều ion đồng trong phân tử. Các enzyme này có khả năng xúc tác sự oxy hóa của
nhiều loại cơ chất khác nhau với chất nhận điện tử cuối cùng là oxy. Laccase có khả năng
xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa
chúng thành quinon. Phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nƣớc
[117]. Bên cạnh đó laccase có khả năng xúc tác chuyển hóa các hợp chất không có bản
chất phenol với sự tham gia của các chất chuyển điện tử trung gian.
1.1. LACCASE
1.1.1. NGUỒN THU LACCASE
1.1.1.1. Laccase trong tự nhiên
Laccase đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên trong các loại thực vật, nấm và vi khuẩn.
Laccase từ thực vật đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Rhus vernicifera (ở cây sơn mài Nhật

Bản) vào năm 1883 [128]. Sau đó, laccase đƣợc nghiên cứu ở rất nhiều các loại thực vật
khác nhƣ ở Ficus racemosa L (cây sung), Weeping willow (cây thùy dƣơng), Nicotiana
tabacum (cây thuốc lá) và Prunus persica (cây đào). Laccase thực vật đóng vai trò trong sự
hình thành thân gỗ, có vai trò polyme hóa các monolignol hình thành các dimer và trimer
trong quá trình lignin hóa. Laccase từ cây R. vernicifera là một laccase thực vật đầu tiên
đƣợc nghiên cứu về đặc tính lý hoá và đặc tính quang phổ, đồng thời đƣợc sử dụng rộng rãi
trong nghiên cứu cơ chế phản ứng chung của laccase [61]. Mặc dù laccase đƣợc phát hiện
đầu tiên ở thực vật, nhƣng nhìn chung laccase có nguồn gốc thực vật ít đƣợc nghiên cứu vì phần
lớn chúng là các enzyme có thế oxy hóa khử thấp. Việc tách chiết và tinh chế laccase từ thực
vật thƣờng rất khó vì dịch chiết từ thực vật chứa một số lƣợng lớn enzyme oxy hóa khử với
phổ cơ chất rộng. Đây là lý do chính khiến cho các nghiên cứu về laccase từ thực vật bị
hạn chế.
Ngoài các nguồn laccase từ thực vật, sinh tổng hợp laccase trong vi khuẩn cũng đƣợc
khảo sát trong các nghiên cứu gần đây. Vi khuẩn đầu tiên đƣợc phát hiện có khả năng tổng
hợp laccase là Azospirillum lipoferum [49]. Laccase từ vi khuẩn này có khả năng tham gia
vào việc hình thành hợp chất melanin. Các loài vi khuẩn Bacillus subtilis gần đây cũng
đƣợc phát hiện là nguồn sinh tổng hợp laccase. Tuy nhiên, laccase trong vi khuẩn thƣờng
thu đƣợc hoạt tính rất thấp và khó có khả năng ứng dụng trong thực tiễn sản xuất.
3


Laccase từ nấm đã đƣợc hai nhà khoa học là Bertrand và Laborde nghiên cứu từ năm
1896 [117]. Laccase trong nấm là các enzyme ngoại bào có chứa nhiều nguyên tử đồng xúc
tác các phản ứng oxy hoá, tham gia chủ yếu vào quá trình phân giải lignin. Đây là đặc điểm
nổi bật của laccase trong nấm đảm thuộc họ Basidiomycetes. Một số loại nấm đảm đã đƣợc
nghiên cứu kỹ về đặc tính cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp laccase trong tự nhiên nhƣ
Pleurotus ostreatus, Phlebia radiate, Coriolus (Trametes, Polyporus) versicolor. Bên cạnh
đó, laccase cũng đƣợc thu nhận từ các nấm thuộc họ Ascomycetes, Deuteromycetes cũng
nhƣ trong nấm men [65].
Ngoài thực vật, nấm và vi khuẩn, hoạt tính của laccase cũng đƣợc tìm thấy trong lớp

biểu bì của một số loại côn trùng nhƣ Anopheles gambiae, Aedes aegypti, Tribolium
castanem, Manduca sexta, Nephotettix cincticeps [50]. Tuy vậy, nguồn enzyme này không
đƣợc khai thác nhiều do đặc tính không nổi trội của chúng.
Hiện nay trong các nguồn laccase trong tự nhiên thì laccase trong nấm đƣợc nghiên
cứu kỹ về đặc tính xúc tác, cơ chất đặc hiệu, khả năng xúc tác cũng nhƣ sự đa dạng trong
nguồn gen. Laccase từ T. versicolor đƣợc biết đến với thế oxi hóa khử cao nhất (780 –
800mV), các gen mã hóa laccase từ T. versicolor cũng đã đƣợc tách chiết và biểu hiện
trong nhiều hệ biểu hiện laccase tái tổ hợp, có thể ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp.
1.1.1.2. Laccase tái tổ hợp
Do khả năng xúc tác oxy hóa đƣợc nhiều loại cơ chất mà điển hình là các hợp chất có
chứa vòng phenol nên các laccase có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học. Tuy
nhiên, nhƣ đã nói, laccase đƣợc tổng hợp từ các chủng tự nhiên thƣờng với lƣợng rất ít và
yêu cầu các chất cảm ứng với giá thành cao [71]. Do vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên
thế giới đã nghiên cứu, phát triển và sử dụng các hệ thống khác nhau biểu hiện gen mã hóa
laccase nhằm tạo ra một lƣợng enzyme đủ lớn với giá thành thấp đáp ứng nhu cầu ứng
dụng của laccase trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau.
Tùy vào hệ thống biểu hiện sử dụng, hoạt tính và các đặc tính của laccase tái tổ hợp
không hoàn toàn giống với chủng gốc và không giống nhau ngay cả khi cùng nguồn gen.
Laccase có nguồn gốc từ nấm mốc và nấm, thƣờng có tỉ lệ glycosyl hoá cao, thành phần
carbohydrate của laccases có thể chiếm 10 đến 45% trọng lƣợng phân tử enzyme. Do mức
độ glycosyl hóa trong các vật chủ không hoàn toàn giống nhau nên khả năng biểu hiện
laccase đạt hiệu quả khác nhau, thông thƣờng các nghiên cứu cho thấy việc biểu hiện đạt
4


hiệu quả thấp trong các thể chủ vi khuẩn hoặc nấm men do không có khả năng hoặc khả
năng glycosyl hóa không phù hợp của chúng [16].
Để sản xuất các protein tái tổ hợp nói chung, các hệ thống biểu hiện dựa trên vật chủ
E. coli đƣợc sử dụng phổ biến nhất do các ƣu điểm có nhiều vector biểu hiện, dễ kiểm soát

sự biểu hiện gen, dễ nuôi cấy, và hiệu suất tổng hợp protein mục tiêu cao. Tuy nhiên, đối
với trƣờng hợp các laccase từ nấm, đến nay việc biểu hiện các enzyme này trong tế bào
chủ E. coli là không hiệu quả [71]. Nguyên nhân chính có thể là do các hệ thống biểu hiện
ở E. coli không cho phép thực hiện biến đổi hậu dịch mã glycosyl hóa, vốn cần thiết cho
hoạt động và độ bền của các laccase.
Các hệ thống vật chủ đã đƣợc sử dụng để biểu hiện thành công laccase từ nấm cho đến
thời điểm này chủ yếu là nấm men: S. cerevisiae, P. pastoris, P. methalonica, Yarrowia.
lipolytica, K. lactis và nấm mốc, điển hình nhƣ: A. oryzae, A. niger, A. sojae, T. reseei,
Pycnoporus cinabarinus…[71].
Các hệ thống biểu hiện trong nấm men có ƣu điểm là dễ thực hiện, với nhiều loại
vector đã đƣợc thƣơng mại hóa. Ngoài các ƣu điểm khác nhƣ khả năng thực hiện các biến
đổi hậu dịch mã, khả năng nuôi cấy với mật độ cao, nấm men còn có ƣu điểm là không có
nhiều protein ngoại bào giúp cho việc tinh sạch các protein tái tổ hợp khi đƣợc tiết ra bên
ngoài tế bào dễ dàng hơn. Hai loài nấm men thƣờng đƣợc lựa chọn để biểu hiện laccase tái
tổ hợp là S. cerevisiae và P. pastoris [46; 119]. P. pastoris đã đƣợc chứng minh là hệ thống
biểu hiện laccase tái tổ hợp tốt hơn so với S. cerevisiae với hiệu suất đạt từ 8 đến17 mg/l
[21]. Hiệu suất sản sinh laccase thay đổi đáng kể phụ thuộc vào gen mã hóa laccase và vật
chủ đƣợc sử dụng để biểu hiện. Các nghiên cứu cho thấy, lcc1 từ T. versicolor đƣợc biểu
hiện thành công trong P. pastori đạt hiệu suất sinh tổng hợp laccase 2,8 U/L nhƣng lại
không biểu hiện đƣợc trong S. cerevisiae [16; 24]. Việc biểu hiện laccase trong nấm men
cho phép giải quyết các mục tiêu cụ thể. Ví dụ, cồn nhiên liệu đã đƣợc sản xuất từ các
nguồn vật liệu thô bằng việc sử dụng S. cerevisiae biểu hiện laccase có tính chống chịu các
chất độc đƣợc sinh ra trong tiền xử lý lignocellulose bằng kiềm [76]. Tuy nhiên, một trong
những vấn đề gặp phải khi sử dụng các vật chủ nấm men để sản xuất laccase tái tổ hợp là
hiện tƣợng glycosyl quá mức (hyperglycosylation). Điều này làm giảm hoạt tính của chế
phẩm laccase thu nhận đƣợc trong canh trƣờng [101].
Để giải quyết những nhƣợc điểm khi biểu hiện laccase từ nấm trong thể chủ nấm men,
các hệ thống biểu hiện laccase dựa trên thể chủ nấm mốc có ƣu điểm nổi bật do khả năng
5

thực hiện quá trình glycosyl hóa tƣơng tự nhƣ trong nấm mốc ở trạng thái tự nhiên và có
thể tiết ra một lƣợng lớn protein tái tổ hợp bên ngoài tế bào. Hiệu suất sinh tổng hợp
laccase thu nhận từ nấm sợi có thể cao hơn nhiều so với trong nấm men, có thể tới vài trăm
mg/l [16; 101]. Theo Bohlin và cs, laccase tái tổ hợp từ T. versicolor biểu hiện trong A.
niger đạt hiệu suất sinh tổng hợp laccase 2700 U/L. Trong các hệ thống nấm mốc, A. niger
là vật chủ đƣợc sử dụng hiệu quả để biểu hiện các protein tái tổ hợp [43]. Nghiên cứu của
Eric Record và cs [101] biểu hiện laccase lac1 từ P. cinnabarinus trong A. niger D15#26,
sử dụng plasmid pAN52-4 mã hóa enzyme glyceraldehytde-3-phosphate dehydrogenase,
đoạn khởi động cho phép biểu hiện mạnh các protein tái tổ hợp đặc biệt trong môi trƣờng
có glucose. Hoạt tính laccase tăng 80 lần và đạt tối đa 7000 U/L. Saloheimo và cs [105]
tổng hợp laccase tái tổ hợp từ Phlebia radiata biểu hiện trong T. reesei chỉ thu đƣợc
20mgl-1. Lên men tổng hợp laccase tái tổ hợp từ Mt. thermophil biểu hiện trong A. oryzae
đạt 19 mgl-1 [12], laccase từ P. cinnabarinus biểu hiện trong A. niger D15#26 đạt 70 mgl-1
[101]. Theo nghiên cứu của Kiiskinen và cs, laccase từ M. albomyce biểu hiện vào nấm sợi
T. reesei cho hiệu suất lên men cao nhất cho đến nay, đạt 230mgl-1 trong bình tam giác, đạt
290mgl-1 trong hệ thống lên men gián đoạn và đạt 920 mgl-1 trong lên men bán liên tục [67].
1.1.2. CẤU TRÚC CỦA LACCASE
Laccase đƣợc cấu tạo từ các glycoprotein, với phần cacbohydrat góp phần tạo nên mức
độ ổn định cao của enzyme [97]. Trong nấm thƣờng xảy ra quá trình glycosyl hóa với mức
độ dao động khác nhau, laccase từ Coriolopsis fulvocinnerea có mức độ glycosyl hóa lên
đến 32% [110] và laccase từ Pleurotus pulmonarius có mức độ glycosyl hóa tới 45% [33].
Cấu trúc của laccase đƣợc đặc trƣng bởi sự tham gia của ít nhất một ion Cu 2+ dạng T1,
một ion Cu2+ dạng T2 và hai ion Cu2+ dạng T3. Ba dạng này có thể đƣợc phân biệt nhờ sử
dụng cộng hƣởng thuận từ (EPR – electroparamagnenic resonance spectroscopy) [29].
Dạng đồng T1, nguyên nhân tạo nên màu xanh da trời của protein, hấp phụ mạnh ánh sáng
có bƣớc sóng 610 nm và là dạng đƣợc phát hiện bằng cộng hƣởng từ. Dạng đồng T2 không
tạo màu trong phổ ánh sáng nhìn thấy nhƣng thể hiện từ tính trong cộng hƣởng từ. Dạng
đồng T3 gồm có một cặp ion Cu2+ có cấu trúc hai nhân và có khả năng hấp phụ yếu ở bƣớc
sóng 330 nm gần vùng tia tử ngoại nhƣng không tạo nên tín hiệu khi phân tích bằng cộng

hƣởng từ [117]. Ion đồng T1 thƣờng đƣợc liên kết với hai gốc histidine và một gốc
cysteine. Ngoài ra, các ion này còn có khả năng liên kết với methionine ở vi khuẩn, leucine
hoặc phenylalanine ở nấm sợi (Hình 1.1). Trên thực tế, mặc dù có sự tƣơng đồng lớn về
các thông số cộng hƣởng từ nhƣng thế oxi hoá khử của trung tâm Cu2+ T1 có những thay
6


đổi lớn giữa các cơ chất và enzyme có nguồn gốc khác nhau, quy định khả năng xúc tác
phản ứng của chúng.

Hình 1.1. Sự phân bố các ion Cu2+ trong laccase từ B. subtilis [36]

Các ion Cu2+ ở vị trí T2/T3 có thể kết hợp với 8 gốc histidines tạo nên một cấu trúc ổn
định trong 4 khung His-X-His. Hai nguyên tử T3 đƣợc liên kết với 6 gốc histidine trong
khi đó nguyên tử T2 đƣợc liên kết với 2 gốc histidine còn lại. Một phối tử hydroxyl nối cặp
ion Cu2+ T3 với nhau. Chính sự bắt cặp của 2 ion T3 này dẫn đến sự khử từ tính nên không
tạo tín hiệu cộng hƣởng từ.
Tất cả các ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase. T1 có
vai trò là nơi nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử này đƣợc vận chuyển qua bộ ba
axit amin (His-Cys-His) đến vị trí T2/T3. Tại T2/T3, oxy nhận điện tử và bị khử thành H2O.
Thế oxi hóa khử của trung tâm T1 trong laccase từ các loại nấm là khác nhau. Laccase
của Myceliophthora thermophila có thế oxi hóa khử khoảng 0,465 V. Thế oxi hóa khử của
laccase từ T. versicolor cao nhất, đạt 0,780 V, làm cho chúng có khả năng phản ứng lớn
nhất trong các loại laccase. Thế oxi hóa khử của trung tâm T1 của T. versicolor cũng đƣợc
Xu và cs [124] chứng minh là cao nhất đạt 0,5 – 0,8 V, do đó chúng có khả năng xúc tác
7


oxi hóa cơ chất và chuyển điện tử mạnh mẽ, có khả năng xúc tác phân hủy các hợp chất
không có bản chất phenol.

Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của laccase [96]

Laccase từ nấm thƣờng có nhiều isozym, số lƣợng các isozym khác nhau giữa các loài.
Các isozym laccase có thể khác nhau rõ rệt về pH tối ƣu, nhiệt độ tối ƣu, độ bền pH, độ
bền nhiệt, và ái lực với cơ chất [7; 54]. Ngoài ra, các isozym có thể khác nhau về tính chất
vật lý.
Các isozym khác nhau ở trình tự amino acid và hoạt tính với các cơ chất chuẩn của
laccase. Palmieri và cs [96] cho thấy trong nấm P. ostreatus có hai isozym (POXA1 và
POXA2) có trọng lƣợng phân tử là 61 và 67 kDa, pI tƣơng ứng là 6,7 và 4. Trong T.
versicolor có hai isozym (laccase 1 và laccase 2) có trọng lƣợng phân tử 64 và 67kDa, pI
tƣơng ứng 3,1 và 3,3 [24]. Laccase từ P. ostreatus V-184 có bốn isozym khác nhau (LCC1,
LCC2, LCC3 và LCC4), tất cả các isozym này đều đã đƣợc tinh chế và xác định đặc tính
với cơ chất ABTS và guaicol, trong đó LCC1 và LCC2 có khối lƣợng phân tử 60 và 65
kDa, đều có giá trị pI tƣơng ứng là 3, LCC3 và LCC4 khối lƣợng phân tử ƣớc tính khoảng
80 và 82 kDa với giá trị pI tƣơng ứng là 4,7 và 4,5 [84]. Laccase của R. solani và Fusarium
proliferatum có bốn isozym với các điểm đẳng điện khác nhau [73], T. villosa có năm loại
isozym, các isozym này chỉ khác nhau về thành phần carbohydrate [125].
8


1.1.3. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA LACCASE
1.1.3.1. Xúc tác chuyển hóa các hợp chất phenol
Laccase xúc tác oxy hóa cơ chất điển hình là p-dihydroxy phenol hoặc là hợp chất
phenol khác đồng thời khử oxy thành nƣớc. Laccase xúc tác phổ cơ chất rất rộng bao gồm
các diphenol, các polyphenol hoặc các hợp chất có bản chất tƣơng tự phenol nhƣ các
diamine, amin thơm, hợp chất mạch vòng thơm dễ oxi hóa khác và các benzenethiol [123].
Một số loại cơ chất phenol thông dụng cho laccase bao gồm 3,5-dimethoxy-4hydroxybenzaldehyde azine (syringaldazine, SYR), 1-naphtol, p-cresol (1-hydroxy-4methylbenzene), 2,6-dimethoxyphenol (DMP) và 2-methoxyphenol (guaiacol, GUA) hoặc
hợp chất đƣợc sản sinh khi tham gia phân huỷ hợp chất lignin. Thurston [117] đã chứng
minh rằng hydroquinone và catechol là những cơ chất chính của laccase, guaicol và DMP

thƣờng phản ứng tốt hơn, P-phenylene diamine là cơ chất đƣợc sử dụng rộng rãi còn
syringaldazine là cơ chất đặc hiệu của laccase. Vì vậy, laccase có khả năng xúc tác oxi hóa
các monophenol, các diamine và một loạt các hợp chất mạch vòng phenol.

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase [6]

Khi bị oxy hoá bởi laccase, cơ chất bị mất một điện tử và hình thành một gốc tự do.
Sau đó gốc không bền này có thể tiếp tục bị oxi hóa bởi laccase (biến đổi phenol thành
quinine) hoặc tiếp tục tham gia phản ứng không đƣợc xúc tác bởi enzyme nhƣ hydrat hóa,
phản ứng oxi hóa khử hoặc phản ứng trùng hợp [117]. Quá trình oxy hóa lignin bởi laccase
đƣợc mô tả nhƣ trong Hình 1.3, theo đó, các tiểu phần phenol trong cấu trúc phân tử lignin
9


bị oxy hóa bởi laccase và tạo ra các gốc tự do phenoxy. Các gốc oxy hóa này có thể tiếp
tục bị cắt khỏi mạch, đƣợc cacbonyl hóa hoặc polyme hóa [117].
Laccase từ Cerrena unicolor và T. versicolor oxy hoá các hợp chất meta-phenol ở mức
độ khác nhau. Trong khi laccase từ C. unicolor oxi hoá mạnh các hợp chất para-phenol
[42] thì laccase từ T. versicolor có khả năng oxi hoá các hợp chất ortho-phenol [62]. Các
nghiên cứu so sánh về tính chất laccase của nấm cho thấy tất cả các laccase đều có khả
năng oxy hoá axit methoxyphenolic nhƣng ở các mức độ khác nhau. Hai hợp chất có
nguồn gốc từ các hydroquinone là 2-methoxy-1,4-benzohydroquinone và 2,6-dimethoxy1,4-benzohydroquinone cũng đã đƣợc chứng minh là bị oxy hoá bởi laccase từ nấm
Pleurotus eryngii [51].
1.1.3.2. Xúc tác chuyển hóa các hợp chất khác
Laccase cũng có thể oxy hóa các hợp chất không có bản chất phenol (non-phenolic)
khi có mặt chất chuyển điện tử trung gian (mediator) thích hợp (Hình 1.4A). Cơ chế xúc
tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc laccase oxy hóa chất trung gian
chuyển chất trung gian về dạng oxy hóa; sau đó các hợp chất trung gian đã đƣợc oxy hóa
tiếp tục thực hiện phản ứng oxy hóa khử với cơ chất tạo sản phẩm (Hình 1.4B). Hiện nay,
có hơn 200 chất chuyển điện tử trung gian đã đƣợc tìm thấy trong đó ABTS, HBT (1hydroxybenzotriazole), guaiacol, syringaldazine là các chất chuyển điện tử trung gian đƣợc

sử dụng rộng rãi nhất. Các chất chuyển điện tử trung gian lý tƣởng phải là một cơ chất tốt
của laccase, cấu trúc dạng oxi hóa và dạng khử của chúng phải ổn định nhƣng không ức
chế hoạt tính enzyme. Các chất chuyển điện tử trung gian phải có thế oxi hóa khử cao và
có thể thực hiện các phản ứng xúc tác phức tạp mà không bị giảm hoạt tính hóa học. Theo
nghiên cứu của Sa´nchez và cs cho thấy syringaldazine và ABTS có thế oxi hóa khử cao
nhất tƣơng ứng khoảng từ 800 – 873mV [104]. Laccase thƣờng hoạt động phối hợp với các
enzyme khác, làm tăng hiệu quả của quá trình phân giải. Các nghiên cứu vẫn đang đƣợc
tiếp tục tiến hành để làm sáng tỏ vai trò của laccase trong quá trình phân giải này, đặc biệt
là trong quá trình phân giải lignin. Bên cạnh đó, vai trò khử độc của dịch thủy phân cho
mục tiêu lên men ethanol của laccase cũng đƣợc khẳng định. Laccase có khả năng loại bỏ
các hợp chất phenol trong dịch thủy phân cao nhất trong số các enzyme thử nghiệm, chỉ
sau nhựa trao đổi ion [25].
10


Hình 1.4. Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần không có bản chất phenol bởi laccase [5; 10]
A. Cơ chế xúc tác oxi hóa của laccase với chất chuyển điện tử trung gian (mediator), B. Oxy hóa
tiểu đơn vị không có bản chất phenol của lignin với sự tham gia của chất chuyển điện tử trung gian

1.1.4. ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE
1.1.4.1 Khối lƣợng phân tử
Laccase có khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 60 – 80 kDa, tuy vậy nhiều
laccase có khối lƣợng phân tử lớn nhƣ laccase từ các loại nấm Ascomycetes nhƣ M.
indicum và Podospora anserina có khối lƣợng phân tử 100 kDa, laccase từ A. nidulans có
khối lƣợng phân tử 110 kDa (Bảng 1.1)
Bảng 1.1 Khối lượng phân tử và số lượng izozyme laccase trong tự nhiên

Số lƣợng isozym

Khối lƣợng

phân tử (kDa)

Tài liệu
tham khảo

Agaricus bisporus

2

65/100

[97]

A. nidulans

2

110

[72]

Botrytis cinerea

2

72

[117]

Coriolus hirsutus

1

80

[109]

M. indicum

3

24/56/72

[115]

Neurospora crassa

1

65

[47]

P. anserina

1

90

[17]

P. ostreatus

4

80-82

[85]

T. villosa

1

63

[127]

T. versicolor

2

64/67

[20]

Trichoderma sp.

1

71

[7]

Nấm mốc

11