Nghiên cứu và phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não nhật bản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRẦN QUANG HUY

NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH
ĐIỆN HÓA ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

Hà Nội – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRẦN QUANG HUY

NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH
ĐIỆN HÓA ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
Chuyên ngành: Công nghệ vật liệu điện tử
Mã số: 62.52.92.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. MAI ANH TUẤN
2. PGS.TS PHAN THỊ NGÀ

Hà Nội - 2012

ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đề tài: “Nghiên cứu và phát triển bộ cảm biến miễn
dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não Nhật Bản” do chính tôi đề xuất và
thực hiện dưới sự giúp đỡ của các thầy hướng dẫn. Tên đề tài và nội dung nghiên
cứu khơng trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác ở Việt Nam cũng
như trên thế giới. Các kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực, chưa từng được
công bố hay sử dụng để bảo vệ cho bất kỳ luận án nào khác. Tất cả các cơng trình
đã cơng bố chung với thầy hướng dẫn khoa học và đồng nghiệp đều được sự đồng ý
của các tác giả trước khi đưa vào luận án. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với
nội dung luận án này.
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2012
Tác giả luận án

Trần Quang Huy


iii

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Mai Anh Tuấn và
PGS.TS. Phan Thị Ngà - những người thầy đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng và
giúp đỡ về mặt khoa học để tơi có thể hồn thành đề tài luận án tiến sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám đốc, toàn thể cán bộ Viện đào tạo quốc
tế về khoa học vật liệu (ITIMS); Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách
khoa Hà Nội đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, hỗ trợ về chun mơn cũng như
thủ tục hành chính trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám đốc; Ban chủ nhiệm khoa Virus;

Phịng thí nghiệm Siêu cấu trúc và Cơng nghệ nano y sinh; Phịng thí nghiệm virus
Arbo và các đồng nghiệp thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều
kiện để hỗ trợ tôi trong thời gian đi học và đóng góp những ý kiến q báu về mặt
chun mơn trong q trình thực hiện đề tài luận án.
Xin cảm ơn tới tất cả các thành viên nhóm cảm biến sinh học thuộc Viện ITIMS
đã nhiệt tình giúp đỡ để tơi hồn thành tốt luận án này.
Xin được coi thành quả của luận án như một món quà tinh thần để dành tặng
cho bố mẹ tôi – bậc sinh thành, những người cả cuộc đời chỉ quẩn quanh bên đồng
ruộng của vùng quê nghèo khó. Bố mẹ luôn là điểm tựa và sẵn sàng hy sinh tất cả
để thổi bùng lên ngọn lửa hy vọng trong bước đường sự nghiệp của chúng con.
Thành quả này sẽ khơng trọn vẹn nếu khơng có được sự hỗ trợ về vật chất cũng
như tinh thần của người vợ thân yêu, con gái Thùy Trang và các em của tôi- những
người đã luôn đồng hành để động viên, chia sẻ những ngọt bùi và khó khăn của
cuộc sống trong suốt thời gian vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy – cô giáo cũ, những người
thân và bạn bè đã động viên về tinh thần, giúp đỡ về vật chất cũng như chuyên môn
trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Luận án được sự hỗ trợ kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ quốc
gia (NAFOSTED), đề tài mã số: 106.16.181.09
Xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận án
Trần Quang Huy


iv

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU
Chương 1. LÝ THUYẾT VỀ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH
1.1. Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến miễn dịch
1.2. Cảm biến miễn dịch phát hiện virus gây bệnh
1.2.1 Khái niệm về virus gây bệnh
1.2.2 Bệnh truyền nhiễm do virus
1.2.3 Bệnh do virus viêm não Nhật Bản
1.2.4 Triển vọng của cảm biến miễn dịch trong phát hiện virus gây bệnh
1.3. Phân loại cảm biến miễn dịch
1.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa
1.3.1.1 Cảm biến miễn dịch đo điện thế
1.3.1.2 Cảm biến miễn dịch đo dòng
1.3.1.3 Cảm biến miễn dịch đo tổng trở
1.3.1.4 Cảm biến miễn dịch đo độ dẫn
1.3.2 Cảm biến miễn dịch quang
1.3.3 Cảm biến miễn dịch áp điện
1.3.4 Cảm biến miễn dịch nhiệt
1.4. Chuyển điện tử trong cảm biến miễn dịch
1.5. Động học tương tác kháng nguyên – kháng thể
1.6. Các phương pháp cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch
1.6.1 Kỹ thuật miễn dịch
1.6.2 Các phương pháp cố định kháng thể
1.6.2.1 Hấp phụ vật lý
1.6.2.2 Liên kết cộng hóa trị
1.6.2.3 Ái lực sinh học
1.7. Cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở vi điện cực
1.8. Cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng hạt nano vàng và protein A
1.9. Kết luận

Trang
vii
ix
x
1
5
6
8
8
9
11
12
14
16
17
18
19
20
20
21
21
21
24
29
29
32
33
34
37
40

41
44


v

Chương 2. CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN CHO
CẢM BIẾN MIỄN DỊCH
2.1. Đặt vấn đề
2.2. Vật liệu và phương pháp
2.2.1 Vật liệu, hóa chất
2.2.2 Chế tạo vi điện cực
2.2.3 Phương pháp thực nghiệm
2.2.3.1 Làm sạch bề mặt điện cực
2.2.3.2 Cố định kháng thể từ huyết thanh lên điện cực
2.2.3.3 Khảo sát đặc trưng bề mặt điện cực
2.3. Kết quả và thảo luận
2.3.1 Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét
2.3.2 Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi lực nguyên tử
2.3.3 Phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier
2.3.4 Hiển vi huỳnh quang bề mặt điện cực
2.4. Kết luận

45
46
47
47
47
49
49

49
51
53
53
57
60
52
72

Chương 3. PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA SỬ DỤNG
KHÁNG THỂ TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN ĐỂ PHÁT HIỆN
VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
3.1. Đặt vấn đề
3.2. Vật liệu và phương pháp
3.2.1 Vật liệu, hóa chất
3.2.2 Đảm bảo an tồn sinh học
3.2.3 Cố định kháng thể
3.2.4 Đóng gói và bảo quản cảm biến miễn dịch
3.2.5 Kiểm tra kháng nguyên virus trong mẫu phân tích
3.2.6 Đo đặc trưng nhạy của cảm biến miễn dịch điện hóa
3.2.6.1 Phát hiện gián tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự thay đổi độ dẫn
3.2.6.2 Phát hiện trực tiếp kháng nguyên dựa trên sự thay đổi tổng trở
không faraday

73

3.3. Kết quả và thảo luận
3.3.1 Kiểm tra sự có mặt kháng nguyên virus trong mẫu phân tích
3.3.2 Phát hiện gián tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự thay đổi độ dẫn
3.3.3 Phát hiện trực tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự thay đổi tổng trở

không faraday

82
82
82
94

3.4. Kết luận

109

74
75
75
76
76
77
77
78
79
80


vi

Chương 4. TĂNG CƯỜNG TÍN HIỆU CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA SỬ
DỤNG HẠT NANO VÀNG GẮN PROTEIN A
4.1. Đặt vấn đề
4.2. Vật liệu và phương pháp
4.2.1 Vật liệu, hóa chất

4.2.2 Thiết kế nghiên cứu
4.2.3 Quy trình tổng hợp phức hợp hạt nano vàng – protein A (Au/PrA)
4.2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của Au/PrA trong dung dịch
4.2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học của Au/PrA trên bề mặt điện cực
4.2.5.1 Hiển vi điện tử quét
4.2.5.2 Hiển vi huỳnh quang
4.2.6 Khảo sát tín hiệu cảm biến miễn dịch sử dụng phức hợp Au/PrA

110
111
113
113
114
114
115
115
115
116

4.4. Kết luận
KẾT LUẬN CHUNG

116
117
117
118
120
121
123
126

128
129

KIẾN NGHỊ

131

TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

132
148

4.3. Kết quả và thảo luận
4.3.1 Tổng hợp hạt nano vàng
4.3.2 Sự ổn định và sự phân bố kích thước hạt nano Au
4.3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến (UV–vis) của phức hợp Au/PrA
4.3.4 Hoạt tính sinh học của phức hợp Au/PrA trong dung dịch
4.3.5 Hoạt tính sinh học của phức hợp Au/PrA trên bề mặt điện cực
4.3.6 Tín hiệu cảm biến miễn dịch sử dụng phức hợp Au/PrA


vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TT Viết tắt

Từ tiếng Anh đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Ab
ADB
ADN
AFM
Ag
APTES
ARN
ATP
Au
BSA

Antibody
Asian development bank
Deoxyribonucleic acid
Atomic force microscopy
Antigen
3-aminopropyl–triethoxy-silane
Ribonucleic acid

Adenosine triphosphate
Gold
Bovine serum albumin

Kháng thể
Ngân hàng phát triển châu Á
Axit deoxyribonucleic
Hiển vi lực nguyên tử
Kháng nguyên
3-aminopropyl–triethoxy-silan
Axit ribonucleic
Adenosin triphosphat
Vàng
Albumin huyết thanh bị

11
12

EID50
EIS

Liều nhiễm trùng phơi gà 50%
Phổ tổng trở điện hóa

13

ELISA

14
15

16
24
17

EMS
FET
FITC
FM
FTIR

18
19

GA
HBsAg

50% embryo infective dose
Electrochemical impedance
spectroscopy
Enzyme linked immuno sorbent
assay
Electron microscopy science
Field effect transistor
Fluorescein isothiocyanate
Fluorescence microscopy
Fourier transform infrared
spectroscopy
Glutaraldehyde
Hepatitis B surface antigen

20

HIV

Human immunodeficiency virus

22
23
25

HPV
HRP
IOP

Human papillomavirus
Horseradish peroxidase
Institute of Physics, UK

Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch
gắn men
Khoa học hiển vi điện tử
Tranzito hiệu ứng trường
Fluorescein isothiocyanat
Hiển vi huỳnh quang
Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi
Fourier
Glutaraldehyt
Kháng nguyên bề mặt virus
viêm gan B
Virus gây suy giảm miễn dịch

cho người
Virus papilloma ở người
Peroxidaza cải ngựa
Viện vật lý, vương quốc Anh


viii

TT Ký hiệu

Từ tiếng Anh đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

26
27

ISE
ISFET

Ion selective electrode
Ion sensitive field effect transistor

28
29

ISI
ITIMS

30

31

LOD
MAC-

Institute of Scientific Information
International Training Institute for
Materials Science
Limit of detection
IgM antibody capture ELISA

Điện cực chọn lọc ion
Tranzito hiệu ứng trường nhạy
ion
Viện thông tin khoa học
Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa
học vật liệu
Giới hạn phát hiện
Thử nghiệm miễn dịch gắn men

32
33

ELISA
MeOH
NADH

34
35

NHS
NIHE

36
37
38
39
40
41
42
43

PANi
PBS
PCR
Ppy
PrA
QCM
SAM
SARS

44

SARS-CoV

45
46
47

SAW

SD
SEM

N-Hydroxysuccinimit
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung
ương
Polyanilin
Muối đệm phốt phát
Phản ứng chuỗi polymeraza
Polypyrrol
Protein A
Vi cân tinh thể thạch anh
Đơn lớp tự sắp xếp
Hội chứng viêm đường hô hấp
cấp
Severe acute respiratory syndrome Virus corona kết hợp gây hội
associated coronavirus
chứng viêm đường hơ hấp cấp
Surface acoustic wave
Sóng âm bề mặt
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
Scanning electron microscopy
Hiển vi điện tử quét

48
49
50
52
51

SJR
SPR
TEM
UV-vis
WHO

Scientific journal rankings
Surface plasmon resonance
Transmission electron microscopy
Ultraviolet-visible
World Health Organization

Methanol
Nicotinamide adenine
dinucleotide
N-Hydroxysuccinimide
National Institute of Hygiene and
Epidemiology
Polyaniline
Phosphate buffered saline
Polymerase chain reaction
Polypyrrole
Protein A
Quartz crystal microbalance
Self-assembled monolayer
Severe acute respiratory syndrome

phát hiện kháng thể IgM
Metanol

Nicotinamit adenin dinucleotit

Xếp hạng tạp chí khoa học
Cộng hưởng plasmon bề mặt
Hiển vi điện tử truyền qua
Tử ngoại-khả kiến
Tổ chức y tế thế giới


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
TT

Tên bảng biểu

Trang

1

Bảng 1.1 Bệnh mới nổi và tái phát do virus ở khu vực Đông Nam Á

10

2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về cảm biến miễn dịch để phát hiện virus
gây bệnh

14

3

Bảng 1.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa dựa trên loại hình chuyển đổi tín
hiệu và đối tượng phân tích

17

4

Bảng 1.4 Một số nhóm chức phổ biến của protein và bề mặt chức năng

34

5

Bảng 1.5 Một số kết quả nghiên cứu sử dụng hạt nano Au để tăng cường
tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa nhằm phát hiện virus gây bệnh

43

6

Bảng 2.1. Cỡ mẫu kiểm tra các đặc trưng bề mặt điện cực

53

7

Bảng 2.2 Số lượng điểm ảnh huỳnh quang trung bình (APTES–serum)

66

8

Bảng 2.3 Số lượng điểm ảnh huỳnh quang trung bình (APTES–GA–
serum)

67

9

Bảng 2.4 Số lượng điểm ảnh huỳnh quang trung bình (APTES–GA–
antiHIgG–serum)

68

10

Bảng 2.5 Số lượng điểm ảnh huỳnh quang trung bình (APTES–GA–
PrA–serum)

68

11

Bảng 2.6 So sánh số lượng điểm ảnh huỳnh quang (G) trung
bình/ơ/phương pháp cố định

71

12

Bảng 3.1 Số liệu tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch thay đổi theo
thời gian và các nồng độ chất phân tích xác định đo bằng phương pháp
tổng trở khơng faraday

104

13

Bảng 3.2 Số liệu tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch thay đổi theo
nồng độ chất phân tích đo bằng phương pháp tổng trở khơng faraday

106

14

Bảng 3.3 So sánh kết quả dị tìm kháng nguyên virus gây bệnh của một số
loại cảm biến miễn dịch.

108


x

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

Trang

1

Hình 1.1 (a) 20.562 cơng trình liên quan đến cảm biến sinh học công bố từ
năm 1991 – 2010; (b) phân bố cơng trình cơng bố từ các nước.

7

2

Hình 1.2 (a) 2.937 cơng trình liên quan đến cảm biến miễn dịch công bố từ
năm 1991–2010; (b) chỉ số đánh giá chất lượng cơng trình về cảm
biến miễn dịch đã cơng bố.

8

3

Hình 1.3 Đáp ứng miễn dịch (sinh kháng thể IgM, IgG) sau khi nhiễm virus

9

TT

Dengue.
4

Hình 1.4 Bản đồ địa lý vùng lưu hành các bệnh truyền nhiễm: (a) bệnh bắt
nguồn từ động vật hoang dại; (b) bệnh bắt nguồn từ động vật nuôi;
(c) bệnh kháng thuốc và (d) bệnh do vectơ truyền.

9

5

Hình 1.5 Chiến lược phát hiện virus gây bệnh

15

6

Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch.

16

7

Hình 1.7 Một số kiểu điện cực sử dụng cho cảm biến miễn dịch điện hóa

16

8

Hình 1.8 Sự dịch chuyển điện tử trong protein.

22

9

Hình 1.9 Chuyển điện tử trực tiếp (xuyên hầm) từ tâm hoạt động của enzym

tới điện cực.

23

10

Hình 1.10 Gắn kết bước đơn của kháng nguyên đơn trị trong dung dịch và
kháng thể đơn trị gắn trên bề mặt cảm biến.

24

11

Hình 1.11 Gắn kết bước kép của kháng nguyên đơn trị trong dung dịch và
kháng thể 2 trị gắn trên bề mặt cảm biến.

26

12

Hình 1.12 Gắn kết của kháng nguyên hai trị trong dung dịch và kháng thể hai
trị gắn trên bề mặt cảm biến (bước kép).

27

13

Hình 1.13 Gắn kết của kháng nguyên 3 trị trong dung dịch và kháng thể hai trị
gắn trên bề mặt cảm biến.

28

14

Hình 1.14 (a) Cấu trúc kháng thể IgG và (b) tương tác kháng nguyên – kháng
thể.

30

15

Hình 1.15 Kỹ thuật miễn dịch: (a) cạnh tranh đồng thể, (b) không cạnh tranh dị
thể, (c) cạnh tranh dị thể và (d) đo miễn dịch cạnh tranh dị thể.

32


xi

16

Hình 1.16 Sử dụng nhóm amin để cố định kháng thể lên bề mặt rắn đã được
biến đổi để tạo nhóm –NSH (a) và nhóm –CHO (b)

35

17

Hình 1.17 Sử dụng nhóm thiol để cố định protein lên bề mặt rắn được biến đổi
để tạo maleimide (a), nhóm disulfide (b) và nhóm vinyl sulfone (c)

36

18

Hình 1.18 Hoạt hóa nhóm –COOH để cố định protein lên bề mặt rắn đã biến
đổi để tạo nhóm amin

37

19

Hình 1.19 Cấu trúc chung của một bề mặt cảm biến trên cơ sở cố định đoạn
ADN sợi đơn (ssDNA) đã được biotin hóa thơng qua cầu nối
streptavidin

39

20

Hình 1.20 Cố định kháng thể thông qua phần tử trung gian protein A

39

21

Hình 2.1 (a) Mơ phỏng cách tạo vi điện cực đan xen có cấu hình 10 m x 10

48

m, (b) vi điện cực thành phẩm kiểu trên dưới sau khi cắt phiến và
phóng đại một phần với các thanh điện cực đan xen; (c) vi điện cực
được gắn lên đế, sẵn sàng cho quá trình đo.
22

Hình 2.2 Hình ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực trước và sau khi cố
định với nồng độ huyết thanh thay đổi: 0,1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1
mg/ml (hàng dọc) tương ứng với từng phương pháp cố định (hàng
ngang): A) APTES–serum; B) APTES–GA–serum; C) APTES–GA–
antiHIgG–serum; D) APTES–GA–PrA–serum.

57

23

Hình 2.3 Hình ảnh hiển vi lực nguyên tử bề mặt điện cực: A) trước khi silan
hóa và B) sau khi silan hóa bằng APTES: C) APTES–serum; C)
APTES–GA–serum; D) APTES–GA–antiHIgG–serum; E) APTES–
GA–PrA–serum.

60

24

Hình 2.4 Phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier trong vùng số sóng
1800–1300 cm-1 của bề mặt điện cực trước và sau khi cố định với 1
mg/ml huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB: (a) Bề mặt
điện cực sau khi silan hóa; (b) APTES–serum; (c) APTES–GA–
serum; (d) APTES–GA–antiHIgG–serum; (e) APTES–GA–PrA–
serum.

62

25

Hình 2.5 Hình ảnh hiển vi huỳnh quang bề mặt điện cực sau khi ủ với FITC–
Ab: A) APTES–serum; B) APTES–GA–serum; C) APTES–GA–
antiHIgG–serum; D) APTES–GA–PrA–serum. Cột thứ nhất cố định
với 1 mg/ml BSA thay cho huyết thanh bệnh nhân; cột thứ 2, 3, 4
tương ứng với các nồng độ huyết thanh bệnh nhân chứa kháng thể

65


xii

kháng virus VNNB: 0,1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml.
26

Hình 2.6 So sánh số lượng điểm ảnh huỳnh quang (G) trung bình/ơ giữa các
phương pháp theo từng nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng
virus VNNB cố định

69

27

Hình 3.1 Tóm tắt quá trình cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân lên bề
mặt điện cực. 1) điện cực trước khi silan hóa, 2) điện cực sau khi
silan hóa bằng APTES; cố định kháng thể bằng các phương pháp: (a)

APTES–serum, (b) APTES–GA–antiHIgG–serum, (c) APTES–GA–
serum và (d) APTES–GA–PrA–serum.

76

28

Hình 3.2 (a) Cảm biến vi điện cực trong q trình đóng gói trên đế thiết kế với
khe cắm 3 chân; (b) lưu giữ cảm biến miễn dịch trong túi nilon hút
chân không và (c) bảo quản ở 40C.

77

29

Hình 3.3 Sơ đồ hệ đo sử dụng bộ khuếch đại Lock-in RS 830

78

30

Hình 3.4 Cảm biến miễn dịch trên cơ sở cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh
nhân bằng phương pháp APTES–GA–PrA–serum để phát hiện gián
tiếp virus: (a) bề mặt điện cực sau khi cố định kháng thế; (b) sau khi
ủ với kháng nguyên virus; (c) ủ với kháng thể thứ hai gắn enzym
HRP (Ab-HRP) và nguyên lý đo độ dẫn.

80

31

Hình 3.5 Cảm biến miễn dịch trên cơ sở cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh
nhân bằng phương pháp APTES–GA–PrA–serum để phát hiện trực
tiếp virus: (a) bề mặt điện cực sau khi cố định với kháng thể; (b) mô
phỏng mạch điện tương đương đo sự thay đổi tổng trở khơng
faraday.

81

32

Hình 3.6 Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của các hạt virus VNNB (kích
thước 45 nm) trong mẫu phân tích sau khi siêu ly tâm

82

33

Hình 3.7 Sự thay đổi độ dẫn của cảm biến miễn dịch theo nồng độ H2O2 trong
dung dịch 0,02 M PBS (pH 7,0) chứa 0,05 M KI và 0,15 M NaCl:
(a) ủ với với huyết thanh chuột khỏe mạnh; ủ với 50 ng/ml kháng
nguyên virus VNNB: (b) APTES–serum, (c) APTES–GA–
antiHIgG–serum, (d) APTES–GA–serum và (e) APTES–GA–PrA–
serum.

85

34

Hình 3.8 Tín hiệu của cảm biến miễn dịch phụ thuộc vào nồng độ KI (A) và độ

pH của dung dịch phân tích (B); (a) APTES–serum; (b) APTES–
GA–antiHIgG–serum; (c) APTES–GA–serum và (d) APTES–GA–

87


xiii

PrA–serum.
35

Hình 3.9 Thay đổi tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo thời gian để
phát hiện kháng nguyên virus VNNB (25 ng/ml, 50 ng/ml; 0,1
µg/ml, 0,5 µg/ml và 1 µg/ml), tương ứng với các phương pháp cố
định kháng thể: (a) APTES–serum; (b) APTES–GA–serum; (c)
APTES–GA–antiHIgG–serum; (d) APTES–GA–PrA–serum.

89

36

Hình 3.10 Thay đổi tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo nồng độ
kháng nguyên virus VNNB tương ứng với các phương pháp cố
định kháng thể: (a) APTES–serum; (b) APTES–GA–antiHIgG–
serum; (c) APTES–GA–serum và (d) APTES–GA–PrA–serum.

91

37

Hình 3.11 So sánh khả năng phát hiện virus của cảm biến miễn dịch trên cơ sở
cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân sử dụng phương pháp
APTES–GA–PrA–serum trước và sau 3 tháng bảo quản ở 40C.

93

38

Hình 3.12 (a) Mạch điện tương đương của vi điện cực Pt trên cơ sở cố định
kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân, trong đó Cdl, Rsol, Rcs và Cdi
tương ứng cho điện dung lớp kép, điện trở dung dịch, điện trở bề
mặt của phức hợp các phần tử sinh học giữa hai vi điện cực và điện
dung lớp điện môi; (b) Phổ tổng trở của cảm biến vi điện cực trên
cơ sở kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân trong dải tần số từ 1 Hz
đến 1 MHz

99

39

Hình 3.13 Sự thay đổi tổng trở trên bề mặt cảm biến khi tiếp xúc với các nồng
độ khác nhau của kháng ngun virus VNNB.

101

40

Hình 3.14 Tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo thời gian tương ứng
với chất phân tích: (SM) huyết thanh chuột pha lỗng 50 lần; kháng
ngun virus VNNB: (J10) 10 µg/ml, (J20) 20 µg/ml, (J30) 30 µg/ml

và (J50) 50 µg/ml.

102

41

Hình 3.15 Thay đổi tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo nồng độ
kháng nguyên virus VNNB và kháng nguyên virus Dengue.

105

42

Hình 4.1 Thiết kế quá trình tổng hợp phức hợp hạt nano vàng gắn protein A
(Au/PrA) và khảo sát các đặc trưng liên quan.

114

43

Hình 4.2 (a1) Sự tạo thành hạt nano Au trước khi xử lý với PrA theo quy trình
1 và (a2) lược đồ phân bố kích thước của 386 hạt Au trong dung
dịch (quy trình 1); (b1) Sự tạo thành hạt nano Au trước khi xử lý
với PrA theo quy trình 2 và (b2) lược đồ phân bố kích thước của

118


xiv

283 hạt Au trong dung dịch (quy trình 2)
44

Hình 4.3 (a1) Phân bố hạt nano Au khử theo quy trình 1 và bao bọc bởi PrA,
các hạt Au có kích thước đồng đều cỡ 10 nm, có ảnh phóng đại góc
trái dưới và (a2) độ ổn định của phức hợp Au/PrA sau 6 tháng lưu
giữ ở – 200C (quy trình 1); (b1) Phân bố hạt nano Au khử theo quy
trình 2 và bao bọc bởi PrA, các hạt Au có kích thước đồng đều cỡ 15
nm, có ảnh phóng đại góc trái dưới và (b2) độ ổn định của phức hợp
Au/PrA sau 6 tháng lưu giữ ở – 200C (quy trình 2)

119

45

Hình 4.4 (a1) Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến (UV-vis) của phức hợp Au/PrA
sau khi mới tổng hợp và sau 6 tháng, (a2) hình ảnh hạt nano Au lưu
giữ sau 6 tháng ở -200C (quy trình 1); (b1) Phổ hấp thụ tử ngoại-khả
kiến (UV-vis) của phức hợp Au/PrA sau khi mới tổng hợp và sau 6
tháng, (b2) hình ảnh hạt nano Au lưu giữ sau 6 tháng ở -200C (quy

121

trình 2).
46

Hình 4.5 (a) Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của virus VNNB (mũi tên)
trước và (b) sau khi phản ứng với phức hợp Au/PrA (đầu mũi tên),
hình dưới phía trái phóng đại hai hạt virus VNNB gắn bởi các hạt
nano Au; (c) mơ phỏng q trình hình thành liên hợp giữa Au/PrA

và hạt virus.

122

47

Hình 4.6 (a) Ảnh hiển vi điện tử quét của điện cực ở độ phóng đại thấp và (b)
một phần bề mặt điện cực sau khi gắn với phức hợp Au/PrA được
phóng đại có các hạt nano Au kích thước 10 nm phân bố đều.

124

48

Hình 4.7 (a) Điểm sáng huỳnh quang khơng xuất hiện trên bề mặt điện cực khi
ủ với BSA và FITC–Ab; (b) hình ảnh huỳnh quang của điện cực sau
khi gắn với Au/PrA, kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân kháng virus
VNNB và FITC–Ab; (c) Mơ hình điện cực cố định với kháng thể:
(c1) ủ trực tiếp với kháng thể, (c2) qua hạt nano Au, (c3) định hướng
qua protein A và (c4) qua phức hợp Au/PrA.

125

49

Hình 4.8 A) Tín hiệu cảm biến miễn dịch không sử dụng phức hợp Au/PrA
bằng phương pháp APTES-GA-serum (a) và phương pháp APTES-

127

GA-PrA-serum (b); tín hiệu cảm biến sau khi sử dụng phức hợp
Au/PrA (phương pháp APTES-Au/PrA-serum) (c). B) Phát hiện
kháng nguyên virus của cảm biến miễn dịch sử dụng phức hợp
Au/PrA.


1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ về kinh tế và tốc độ tồn cầu hóa
nhanh chóng, dịch bệnh truyền nhiễm mới nổi và tái phát cũng không ngừng tăng và
mang nhiều yếu tố bất ngờ như: sự biến chủng, độc tính cao hay tốc độ lây lan
mạnh, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng và kinh tế- xã hội
[59,66]. Châu Á là khu vực thường xuyên phải đối mặt và tiềm ẩn nguy cơ xảy ra
các vụ dịch nguy hiểm như: viêm đường hơ hấp cấp tính (SARS), cúm A/H5N1, cúm
A/H1N1, HIV, sốt xuất huyết Dengue, viêm não, tiêu chảy cấp... [8,66,101]. Khống
chế và ngăn chặn kịp thời tác nhân gây bệnh truyền nhiễm luôn là yêu cầu cấp thiết
không chỉ đối với ngành y tế mà của tồn xã hội. Khi có dịch xảy ra, mẫu bệnh
phẩm thu thập từ những bệnh nhân nghi mắc thường được chuyển tới phịng thí
nghiệm chẩn đoán bệnh để xác định căn nguyên. Một số kỹ thuật chẩn đốn phịng
xét nghiệm được sử dụng phổ biến hiện nay như: phân lập, trung hòa, hấp phụ miễn
dịch gắn men (ELISA), miễn dịch huỳnh quang, các kỹ thuật sinh học phân tử
(PCR)...[23,30,65,110]. Tuy nhiên, hầu hết kỹ thuật trên đều yêu cầu mẫu bệnh
phẩm phải được xử lý trước, thời gian phân tích lâu, cho kết quả sau hàng giờ tới
vài ngày. Hơn nữa, những kỹ thuật này cịn địi hỏi trang thiết bị, sinh phẩm và hóa
chất đắt tiền, người thao tác phải được đào tạo chuyên nghiệp và xét nghiệm phải
được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chẩn đốn đạt tiêu chuẩn an tồn sinh học
cao. Trong khi đó, dịch truyền nhiễm thường xảy ra một cách bất ngờ, số lượng
bệnh nhân có thể tăng lên nhanh chóng trong khoảng thời gian ngắn, do vậy hầu hết

kỹ thuật chẩn đốn phịng xét nghiệm hiện nay cũng như hóa chất, sinh phẩm cần
thiết rất khó có thể đáp ứng kịp thời cho số lượng lớn mẫu bệnh phẩm cần xét
nghiệm. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao và thường
xuyên chịu sự hoành hành của các vụ dịch truyền nhiễm [101]. Chỉ riêng bệnh viêm
não Nhật Bản, mặc dù đã có vắc xin phịng bệnh, nhưng tỷ lệ mắc hàng năm do
virus này trong cả nước vẫn chiếm khoảng 30% trong tổng số các ca viêm não do
virus [118]. Chính vì vậy, đối với bệnh truyền nhiễm do virus nói chung, việc sử
dụng kỹ thuật chẩn đốn nhanh có khả năng sàng lọc tại chỗ bằng một thiết bị đơn
giản, dễ chế tạo, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thao tác mẫu dễ dàng vẫn là mấu
chốt quan trọng để ngăn chặn q trình lây nhiễm, từ đó có biện pháp cách ly bệnh
nhân kịp thời và/hoặc đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả [23]. Một trong những thiết
bị được kỳ vọng đáp ứng được hầu hết yêu cầu trên và có triển vọng thay thế một


2

phần hay hồn tồn các phương pháp chẩn đốn truyền thống được gọi là cảm biến
miễn dịch [48,49,73,115]. Cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học được
thiết kế dựa trên phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, thiết bị này có
những ưu điểm vượt trội như: dễ dàng tạo kiểu dạng đơn hoặc mảng [31,174]; dị
tìm trực tiếp mầm bệnh tại chỗ mà khơng cần đến bệnh viện [36]; không sử dụng
chất đánh dấu hay hóa chất, sinh phẩm đắt tiền [147]; dễ chế tạo phần tử dò...
[14,83,126]. Theo Yang và Bashir [189], cảm biến miễn dịch điện hóa có thể được
chế tạo dựa trên nhiều kiểu điện cực với các vật liệu khác nhau, nhưng việc sử dụng
vi điện cực kim loại với cấu hình đan xen có nhiều ưu điểm vượt trội, bởi cấu hình
này có khả năng cho tỉ lệ tín hiệu/nhiễu cao, thể tích mẫu phân tích nhỏ, tạo ra sự
thay đổi tổng trở tối đa trên bề mặt vùng điện cực. Ngoài ra, hầu hết các cảm biến
miễn dịch hiện nay đều sử dụng kháng thể tinh chế để làm phần tử dò, phần tử này
được cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi khác nhau như: điện hóa, quang học, vi
khối lượng hay nhiệt [83,115]. Tuy nhiên, sự thay đổi tín hiệu sinh hóa trên bề mặt

này thường rất nhỏ. Do vậy, để phát triển thành công một bộ cảm biến miễn dịch
không những phụ thuộc vào sự nhạy cảm của bề mặt điện cực được chế tạo như thế
nào, kỹ thuật dị tìm ra sao mà cịn phụ thuộc rất lớn vào quá trình chọn lựa phương
thức cố định kháng thể hay kháng nguyên lên bề mặt điện cực làm phần tử dị cũng
như q trình tăng cường tín hiệu cảm biến. Cơng việc này là sự kết hợp đa ngành
giữa vật lý, hóa học, khoa học vật liệu, điện tử và y sinh... Trong đó, q trình cố
định quyết định tới số lượng và chất lượng phần tử dò trên bề mặt điện cực, đảm
bảo sự định hướng tốt nhất cũng như nâng cao được hiệu suất phát hiện của cảm
biến miễn dịch [25,116,125]. Theo Jones và cộng sự [59], bệnh truyền nhiễm chủ
yếu bắt nguồn từ động vật sau đó lây truyền sang người (60,3%), trong đó 71,8%
mầm bệnh bắt nguồn từ động vật hoang dại, nên khó có thể dự đốn khi nào sẽ xảy
ra dịch, dẫn đến khó khăn trong việc chủ động nguồn sinh phẩm, hóa chất hay loại
kháng thể tinh chế cần thiết. Chính vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng trực tiếp kháng
thể thu thập từ huyết thanh bệnh nhân mà khơng cần phải tinh chế để làm phần tử
dị cho cảm biến miễn dịch sẽ mang lại lợi ích to lớn cả về kinh tế, xã hội cũng như
giảm thiểu thiệt hại về sức khỏe cộng đồng. Hơn nữa, theo Frost & Sullivan [38],
doanh thu từ cảm biến sinh học năm 2009 đạt 6,72 tỷ đô la Mỹ và dự đốn rằng con
số này sẽ tăng lên 14,42 tỷ đơ la vào năm 2016. Về mặt khoa học, có khoảng 3000
cơng trình từ các nước nghiên cứu về cảm biến miễn dịch phát hiện tác nhân gây
bệnh đã được công bố trong khoảng 20 năm trở lại đây (1991 – 2010) [56]. Tuy


3

nhiên, khái niệm “cảm biến miễn dịch” vẫn còn mới ở Việt Nam và chưa có cơng
trình nào được cơng bố quốc tế tính đến năm 2008.
Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài nghiên cứu với tiêu đề: “Nghiên cứu và phát
triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não Nhật Bản”
đã được đề xuất cho luận án tiến sĩ. Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về lĩnh
vực cảm biến miễn dịch hướng tới phát hiện virus gây bệnh trong các vụ dịch truyền

nhiễm. Đề tài được thực hiện với 02 mục tiêu chính: (1) phát triển bộ cảm biến miễn
dịch điện hóa trên cơ sở cấu hình vi điện cực đan xen để phát hiện virus gây bệnh;
(2) sử dụng trực tiếp kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân không qua tinh chế làm
phần tử dò cho cảm biến miễn dịch để phát hiện virus viêm não Nhật Bản (VNNB).
Đối tượng được tập trung nghiên cứu gồm: cảm biến điện hóa trên cơ sở vi điện cực
có cấu trúc đan xen, huyết thanh bệnh nhân chứa kháng thể kháng virus viêm não
Nhật Bản. Ngoài ra, hạt nano vàng gắn protein A cũng được nghiên cứu nhằm
hướng tới khả năng tăng cường độ nhạy và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện
hóa. Nội dung nghiên cứu được chia thành ba phần: (1) nghiên cứu các phương
pháp cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân lên bề mặt vi điện cực có cấu hình
đan xen; (2) phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng kháng thể từ huyết
thanh bệnh nhân để phát hiện kháng nguyên virus VNNB; (3) thử nghiệm tổng hợp
hạt vàng có kích thước nano gắn protein A hướng tới tăng cường khả năng phát hiện
và tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa. Đề tài được thực hiện tại Viện đào tạo
quốc tế về khoa học vật liệu (ITIMS), Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Thành công của đề tài sẽ mở ra một hướng nghiên cứu
mới nhằm phát triển một thiết bị chẩn đốn có độ nhạy, độ chọn lọc cao, kích thước
nhỏ gọn, tiện dụng, có khả năng phát hiện và sàng lọc mầm bệnh tại chỗ trong các
vụ dịch bệnh truyền nhiễm.
Kết quả nghiên cứu về lý thuyết và thực nghiệm được trình bày trong 4 chương
của luận án:
Chương 1: Lý thuyết về cảm biến miễn dịch
Chương 1 tổng quan về lý thuyết cơ bản liên quan đến việc phát triển bộ cảm
biến miễn dịch như: nguyên lý hoạt động, cơ chế chuyển điện tử, động học tương
tác của phản ứng kháng nguyên – kháng thể, các phương pháp cố định phần tử dò
sử dụng phổ biến hiện nay. Một số khái niệm cơ bản cũng được đề cập như: virus
gây bệnh; kháng thể; kháng nguyên; hạt nano vàng, protein A (để tăng cường khả
năng phát hiện và tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa). Hơn nữa, chương này

4

cũng trình bày về tính cấp thiết và cơ sở lý luận cho việc đưa ra giả thuyết nghiên
cứu của đề tài thơng qua việc tổng quan những cơng trình liên quan được cơng bố
gần đây trên các tạp chí khoa học ở trong và ngoài nước.
Chương 2: Cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân cho cảm biến miễn dịch
Chương 2 trình bày về những kết quả nghiên cứu về khả năng sử dụng kháng
thể từ huyết thanh bệnh nhân để cố định lên bề mặt vi điện cực có cấu hình đan xen.
Thơng qua các phép phân tích đặc trưng bề mặt điện cực của 4 phương pháp cố định
khác nhau nhằm tìm ra phương pháp tối ưu nhất cho mục đích phát triển bộ cảm
biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus gây bệnh.
Chương 3: Phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng kháng thể từ huyết
thanh bệnh nhân để phát hiện virus viêm não Nhật Bản
Chương 3 trình bày những kết quả nghiên cứu phát triển bộ cảm biến miễn dịch
điện hóa trên cơ sở vi điện cực có cấu hình đan xen sử dụng kháng thể từ huyết
thanh bệnh nhân làm phần tử dò. Hai bộ cảm biến miễn dịch điện hóa đã phát triển
thành cơng để phát hiện virus viêm não Nhật Bản thông qua hai kỹ thuật đo tín hiệu:
đo gián tiếp dựa trên sự thay đổi độ dẫn và đo trực tiếp dựa trên sự thay đổi tổng trở
khơng faraday.
Chương 4: Tăng cường tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng hạt nano
vàng gắn protein A
Chương 4 trình bày quá trình thử nghiệm tổng hợp hạt vàng có kích thước nano
gắn với protein A (Au/PrA) hướng tới ứng dụng để tăng cường tín hiệu cảm biến
miễn dịch điện hóa. Đặc trưng hình thái, kích thước, độ ổn định và hoạt tính sinh
học của phức hợp Au/PrA tổng hợp cũng được trình bày. Kết quả khảo sát ban đầu
về khả năng sử dụng phức hợp Au/PrA để tăng cường giới hạn phát hiện kháng
nguyên virus và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện hóa trong dung dịch cũng như
từ bề mặt điện cực.

5

Chương 1
LÝ THUYẾT VỀ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH

Tóm tắt:
Cảm biến miễn dịch được thiết kế trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng
thể, khi phản ứng này xảy ra trên bề mặt điện cực sẽ dẫn tới sự thay đổi về sinh hóa hay
vật lý và được cảm nhận, chuyển đổi thành tín hiệu điện ở đầu ra. Chương 1 tổng quan lý
thuyết cơ bản liên quan đến quá trình phát triển bộ cảm biến miễn dịch như: nguyên lý
hoạt động, cơ chế chuyển điện tử, động học tương tác của phản ứng kháng nguyên – kháng
thể, các phương pháp cố định kháng thể phổ biến hiện nay, sử dụng hạt nano vàng và
protein A để tăng cường khả năng phát hiện và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện hóa.
Hơn nữa, chương này cũng trình bày về tính cấp thiết và cơ sở lý luận cho việc đưa ra giả
thuyết nghiên cứu của đề tài thơng qua những cơng trình nghiên cứu đã được cơng bố gần
đây trên các tạp chí khoa học trong và ngoài nước.


6

1.1. Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến miễn dịch
Theo từ điển bách khoa toàn thư về khoa học và công nghệ McGraw-Hill
(McGraw-Hill Encyclopedia of Science & Technology) [88]: cảm biến sinh học là
thiết bị tích hợp gồm một yếu tố nhận biết sinh học gắn trên một phần tử chuyển
đổi, có khả năng dị tìm sự thay đổi từ các phản ứng sinh học và chuyển đổi thành
tín hiệu điện ở đầu ra. Yếu tố nhận biết sinh học thường là enzym, thụ thể, peptide,
oligonucleotide, tế bào sống, kháng thể hoặc kháng nguyên. Trong đó, nếu yếu tố
nhận biết sinh học là kháng thể hay đoạn kháng thể thì được gọi là cảm biến miễn
dịch. Phần tử chuyển đổi được thiết kế trên đế pha rắn để cảm nhận sự thay đổi sinh
ra từ các phản ứng sinh hóa trên bề mặt đế và chuyển đổi thành tín hiệu điện. Phản

ứng sinh hóa có thể dẫn tới sự thay đổi về độ pH, chuyển điện tử hoặc ion, chỉ số
khúc xạ, sự phát quang, huỳnh quang, thay đổi vi khối lượng hay truyền tải nhiệt...
Bốn loại chuyển đổi chính thường được thiết kế để cảm nhận sự thay đổi này bao
gồm: điện hóa, quang học, vi khối lượng và nhiệt [83,95].
North là người đầu tiên đề xuất khái niệm cảm biến miễn dịch (immunosensor)
trong một cơng trình cơng bố trên tạp chí “Trends in Biotechnology” năm 1985
[105], tác giả định nghĩa cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học trên cơ
sở kháng thể. Tuy nhiên, hiểu theo nghĩa đầy đủ hơn thì cảm biến miễn dịch là một
loại cảm biến sinh học được phát triển trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên –
kháng thể. Trong đó, kháng thể hay phức hợp gắn kháng thể hoặc kháng nguyên
được lựa chọn để cố định lên bề mặt phần tử chuyển đổi và đóng vai trò là yếu tố
nhận biết sinh học (phần tử dò) nhằm phát hiện phần tử miễn dịch còn lại (phần tử
đích).
Cảm biến sinh học chủ yếu được thiết kế dựa trên hai cơ sở: xúc tác sinh học
(sử dụng enzym để xúc tác một phản ứng sinh hóa) hoặc ái lực sinh học (dựa trên
sự gắn kết đặc hiệu của protein, lectin, thụ thể, axit nucleic, tế bào sống, kháng thể
hoặc cơ chất có liên hệ với kháng thể) [83].
Theo tra cứu trên trang “ISI Web of Science” của Viện thông tin khoa học
(Institute of Scientific Information, Thomson Reuters) [56], tác giả đã phân tích mối
liên hệ từ những cơng trình cứu cơng bố quốc tế liên quan đến cảm biến sinh học
trong 20 năm trở lại đây (1991-2010). Với từ khóa “biosensor” (cảm biến sinh học)
có 20.562 cơng trình cơng bố được tìm thấy, trong đó số lượng cơng bố lớn nhất từ
Hoa Kỳ với 4885 cơng trình (24%), Trung Quốc: 3703 cơng trình (18%), Nhật Bản:


7

1490 cơng trình (7%), Đức: 1352 cơng trình (7%), Pháp: 1026 cơng trình (5%) và
Anh: 1022 cơng trình (5%), số cịn lại từ các quốc gia khác. Chỉ có tổng cộng 400
cơng trình (2%) cơng bố từ các nước thuộc khu vực Đơng Nam Á, trong đó

Singapore: 260 cơng trình, Thái Lan: 67 cơng trình, Malaysia: 42 cơng trình và Việt
Nam có 17 cơng trình được cơng bố. Hình 1.1 mơ tả số lượng cơng trình liên quan
tới cảm biến sinh học được công bố từ năm 1991 – 2010, hình này cho thấy lĩnh vực
cảm biến sinh học thực sự được quan tâm và phát triển nhanh chóng trong khoảng
10 năm trở lại đây.

Hình 1.1 (a) 20.562 cơng trình liên quan đến cảm biến sinh học công bố từ năm 1991 –
2010; (b) sự phân bố cơng trình cơng bố từ các nước.

Tra cứu với từ khóa “immunosensor” (cảm biến miễn dịch), có 2.937 cơng trình
được tìm thấy cơng bố từ năm 1991 đến 2010 và tập trung chủ yếu trong khoảng 10
năm trở lại đây (hình 1.2a). Tổng số trích dẫn khoảng 49.164 lượt, trung bình mỗi
cơng trình được trích dẫn 16,74 lượt, chỉ số Hirsch (H-index) là 79 (hình 1.2b). Chỉ
số Hirsch là một trong những chỉ số quan trọng, gần đây được sử dụng để đánh giá
chất lượng nghiên cứu của các nhà khoa học, cơ quan nghiên cứu hay tạp chí khoa
học chuyên ngành dựa trên số lượng cơng trình cơng bố được trích dẫn [51].


8

Hình 1.2 (a) 2.937 cơng trình liên quan đến cảm biến miễn dịch công bố từ năm 1991 2010; (b) chỉ số đánh giá chất lượng cơng trình về cảm biến miễn dịch đã công bố.

Cảm biến miễn dịch được chứng minh là thiết bị phân tích có triển vọng lớn để
thay thế một phần hay toàn phần những thiết bị và phương pháp chẩn đốn truyền
thống trong các phịng thí nghiệm nhằm phát hiện nhanh, chính xác tác nhân gây
bệnh [73,95,115]. Ngồi ra, cảm biến miễn dịch cịn được hướng tới ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như: kiểm sốt ơ nhiễm mơi trường [132,135], phân tích
an tồn thực phẩm [131], phát hiện tác nhân gây khủng bố sinh học [42,141],...
Theo thông tin nghiên cứu thị trường của Frost & Sullivan, doanh thu từ cảm biến
sinh học năm 2009 đạt 6,72 tỷ đơ la Mỹ và dự đốn rằng con số này sẽ tăng lên

14,42 tỷ đô la vào năm 2016 [38].

1.2. Cảm biến miễn dịch phát hiện virus gây bệnh
1.2.1 Khái niệm về virus gây bệnh
Virus là thực thể sinh học có kích thước rất nhỏ (khoảng 20 ÷ 300 nm) có khả
năng xâm nhiễm vào cơ thể sống. Virus tự nhân lên bằng cách sử dụng bộ máy hoạt
động của tế bào vật chủ sau khi xâm nhiễm. Virus mang duy nhất một loại vật liệu
di truyền (ADN hoặc ARN), được bao quanh bởi lớp áo ngồi (vỏ capsid) có cấu
tạo bằng protein, glycoprotein [23]. Khi người hay động vật bị nhiễm virus, cơ thể
sẽ có sự đáp ứng miễn dịch (sinh ra kháng thể) để chống lại sự xâm nhập này.
Kháng thể sinh ra chủ yếu bao gồm IgG và IgM, thường đạt hiệu giá cao nhất sau
khoảng 1 – 2 tuần kể từ khi bị nhiễm virus (hình 1.3) [23,46].


9

Hình 1.3 Đáp ứng miễn dịch (sinh kháng thể IgM, IgG) sau khi nhiễm virus Dengue [46].

1.2.2 Bệnh truyền nhiễm do virus
Bệnh truyền nhiễm do virus là những bệnh nguy hiểm có khả năng gây ra
những hậu quả nặng nề đến sức khỏe cộng đồng, kinh tế xã hội và môi trường
[10,94]. Bệnh truyền nhiễm tăng nhanh theo thời gian và chủ yếu xuất phát từ các
loài động vật (chiếm 60,3%) sau đó lây truyền sang người, trong đó 71,8% mầm
bệnh bắt nguồn từ động vật hoang dại [59]. Do vậy, dịch bệnh truyền nhiễm thường
mang yếu tố bất ngờ và khó dự đốn trước.
Hình 1.4 mơ tả những điểm nóng (vàng và đỏ, theo cấp độ) của vùng, miền địa
lý lưu hành bệnh truyền nhiễm.

Hình 1.4 Bản đồ địa lý vùng lưu hành các bệnh truyền nhiễm: (a) bệnh bắt nguồn từ động
vật hoang dại; (b) bệnh bắt nguồn từ động vật nuôi; (c) bệnh kháng thuốc và (d) bệnh do

vectơ truyền [59].


10

Đơng Nam Á nằm trong điểm nóng của sự lưu hành các bệnh truyền nhiễm mới
nổi và tái phát, là nơi thường xuyên xảy ra đại dịch. Trong 10 năm trở lại đây, khu
vực này chịu tác động của các vụ dịch lớn do virus như: virus Nipah (1998 – 1999)
[81], viêm đường hơ hấp cấp tính – SARS (2002-2003) [180], cúm A H5N1 (2004
đến nay) [178], cúm A H1N1 (2009 đến nay) [180]... Các vụ dịch truyền nhiễm tái
phát khác xảy ra hàng năm như sốt xuất huyết Dengue, HIV/AIDS, dại, viêm não
Nhật Bản... Gần đây, Koker và cộng sự [66] đưa ra những con số thiệt hại khổng lồ
trong bài tổng quan về tình hình dịch bệnh truyền nhiễm ở khu vực Đông Nam Á
(bảng 1.1), đồng thời cảnh báo những thách thức phải đối mặt nhằm ngăn chặn và
khống chế các dịch bệnh này.
Bảng 1.1 Bệnh mới nổi và tái phát do virus ở khu vực Đông Nam Á [8,45,66]
Nguồn lây truyền

Nhận xét

Bệnh truyền nhiễm mới nổi

Cúm gia cầm A/H5N1

Từ động vật sang người (có
liên hệ gần với gia cầm)

Đại dịch cúm A/H1N1
(2009)

Hô hấp

SARS

Hô hấp

Bệnh do virus Nipah

Từ động vật sang người (có
lên hệ gần với lợn)

325 trường hợp được báo cáo, 224 trường hợp tử
vong ở Indonesia, Việt Nam, Thái Lan,
Campuchia, Lào và Myanma.
5290 trường hợp được báo cáo, 8 trường hợp tử
vong
331 trường hợp được báo cáo, 44 trường hợp tử
vong ở Singapore, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia
và Indonesia.
Trường hợp đầu tiên được ghi nhận ở Malaysia;
276 trường hợp được báo cáo, trong đó 106 tử
vong ở Malaysia và Singapore.

Bệnh truyền nhiễm tái phát
Sốt do virus
Chikungunya

Vectơ truyền

Sốt Dengue

Vectơ truyền

Viêm não Nhật Bản

Vectơ truyền và lây truyền
từ động vật

Dại

Từ động vật sang người
(qua vết cắt hoặc vết xước)

HIV/AIDS

Tiêm chích, quan hệ tình
dục, từ mẹ sang con

Dịch xảy ra ở nhiều nước Đông Nam Á, tái phát ở
Malaysia (2007), Singapore (2008), Thái Lan
(2009) và Indonesia (2010).
Bắt nguồn từ Đông Nam Á; 398.340 trường hợp
nhiễm và 1.596 trường hợp tử vong năm 2008 với
sự bùng phát cao ở Indonesia, Việt Nam, Thái Lan,
Malaysia, Philipin, Myanma và Campuchia.
68 trường hợp ghi nhận ở Thái Lan năm 2009 và
dịch thường xảy ra ở các nước khác trong khu vực
587 trường hợp nhiễm và tử vong năm 2009 ở
Indonesia, Philipin, Việt Nam, Myanma và Thái
Lan.

Hơn 200.000 người dương tính với HIV ở Thái
Lan, Việt Nam, Indonesia và Myanma.