Phát hiện Virus Viêm Não mới từ dịch não tủy của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam pdf

TCNCYH 29 (3) - 2004

13
Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ của
bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam

Phan Thị Ngà
1
, Kouichi Morita
2
1
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng, Hà Nội
2
Viện Y học Nhiệt đới, Trờng Đại học Nagasaki Nhật Bản

Trong năm 2002, có 2 chủng virut Arbo mới đợc phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân
có hội chứng não cấp (HCNC) ở miền Bắc Việt Nam bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Virut hình cầu, có
vỏ (envelop), kích thớc khoảng 50 nm, vật liệu di truyền là ARN. Trình tự vật liệu di truyền của chủng
virut có ký hiệu 02VN208 không giống trình tự của các chủng virut đã công bố trên thế giới. Cặp mồi
đặc hiệu (specific) đợc thiết kế từ một phần trình tự clone gen của chủng virut có ký hiệu 02VN208
để định loại những chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi năm 2002 bằng kỹ thuật RT-PCR.
Có 2 chủng virut phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân HCNC và có 4 chủng virut phân lập
từ muỗi đợc xác định dơng tính; Kết quả này là một bằng chứng cho thấy đây có thể là một loại virut
Arbo do muỗi truyền gây viêm não, mới đợc phát hiện ở Việt Nam. Virut Nam Định là tên của virut
đợc đặt theo tên địa phơng của bệnh nhân. Những nghiên cứu về huyết thanh học, siêu cấu trúc
của virut cần đợc thực hiện để có cơ sở phân loại virut Arbo mới này.

I. Đặt vấn đề
Viêm não do virut là một trong những
nguyên nhân gây tử vong ở trẻ em trong khu
vực châu á, đặc biệt là viêm não do virut viêm

não Nhật Bản (VNNB), tuy nhiên chỉ có
khoảng 20 60% trờng hợp bị viêm não
đợc xác định là do virut VNNB, số còn lại có
thể là viêm não do virut khác [3, 8]. Tơng tự
nh vậy ở Việt Nam, theo số liệu thống kê
hằng năm có khoảng 2000 3000 trờng hợp
bị hội chứng não cấp (HCNC) do virut,
khoảng 30 50% số trờng hợp bị HCNC
đợc xác định là do virut VNNB bằng kỹ thuật
MAC-ELISA, các virut gây viêm não tiềm ẩn
khác vẫn cha đợc phát hiện ngoài virut
VNNB và virut đờng ruột [1, 2]. Năm 1971,
một số chủng virut thuộc nhóm Alpha đợc
phân lập từ muỗi ở miền Bắc Việt Nam, có giả
thiết rằng nó có thể là một virut Arbo mới gây
HCNC [6], tuy nhiên cho đến nay vẫn cha
phân lập đợc virut Alpha từ bệnh nhân Việt
Nam (số liệu phòng thí nghiệm). Do vậy mục
tiêu nghiên cứu của đề tài là phát hiện virut
viêm não mới do muỗi truyền từ DNT của
bệnh nhân có HCNC cha rõ căn nguyên.
II. Nguyên vật liệu và phơng
pháp
1. Vật liệu:
Có 148 mẫu DNT đợc lấy từ bệnh nhân
có HCNC (3/2002 11/2002) tại Khoa Lây,
Viện Nhi trung ơng. Các mẫu DNT này đợc
xác định không có kháng thể IgM kháng virut
VNNB bằng kỹ thuật MAC-ELISA.
Huyết thanh đợc lấy vào ngày thứ 5 của

bệnh và sau khi khỏi bệnh trên một năm (của
bệnh nhân - chủng virut có ký hiệu 02V208
đợc phân lập từ DNT).
Kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi,
Bunya, kháng thể gắn FITC do trung tâm
kiểm soát bệnh tật CDC, Colorado Mỹ cung
cấp.
Kháng thể định loại virut VNNB do Viện
VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp.
Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR và cặp
mồi đặc hiệu định loại virut VNNB do Viện Y
học Nhiệt đới, Nagasaki cung cấp (841 N và
2670 R).
TCNCYH 29 (3) - 2004
Cặp mồi đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu
02VN208 đợc thiết kế từ chuỗi kéo dài để tổng
hợp một sản phẩm PCR khoảng 400 bp.
Hoá chất cho kỹ thuật nhuộm âm bản do
Viện VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp.
Dòng tế bào muỗi C6/36. tế bào Vero và
BHK 21, tế bào thần kinh chuột (Mouse
neuronal cells) môi trờng nuôi tế bào, các
trang thiết bị và vật liệu cần thiết khác.
2. Phơng pháp:
Phân lập virut: Mẫu DNT đợc làm tan
băng, gây nhiễm vào tế bào C6/36 [4, 7],
quan sát tế bào trong 5 ngày. Chai tế bào gây
nhiễm có hình ảnh huỷ hoại tế bào, nớc nổi
tế bào gây nhiễm đợc lọc qua lọc 0,22 nm,
hỗn dịch lọc đợc cấy truyền lần thứ hai trên

tế bào C6/36. Nếu có hình ảnh huỷ hoại tế
bào sau lần cấy truyền này chai tế bào đợc
lu giữ ở 70
o
C để định loại virut.
Định loại virut bằng kỹ thuật ELISA, huỳnh
quang, kỹ thuật RT-PCR.
Xác định hình thái virut bằng kính hiển vi
điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản.
Xác định sự thích ứng của virut trên động
vật phòng thí nghiệm (chuột ổ), các dòng tế
bào thờng trực bằng thử nghiệm đám hoại tử
(Plaque Assay).
Sử dụng dòng tế bào BHK 21 để thực hiện
kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử, kết quả
dơng tính khi huyết thanh ở độ pha loãng
1/10 làm giảm 90% đám hoại tử.
Virut đợc tinh chế từ nớc nổi tế bào gây
nhiễm virut bằng Polyethylene Glycol (PEG)
6.000 Sucrose Gradient để tách chiết vật
liệu di truyền theo phơng pháp của Chapon
[5], sử dụng enzym Dnase và Rnase xác định
vật liệu di truyền của virut.
Trình tự vật liệu di truyền của virut đợc
xác định bằng những bộ mồi ngẫu nhiên sử
dụng TOPOTA cloning kit của In-Vitrogen,
Mỹ. So sánh trình tự nucleotit của virut với
trình từ nucleotit của những virut đã đợc
công bố trong ngân hàng số liệu.
IV. Kết quả

Kết quả phân lập virut bằng tế bào
C6/36.


Hình 1. Hình ảnh chủng virut có ký hiệu 02VN208 đợc phát hiện bằng kính hiển vi
điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản (mũi tên chỉ hạt virut X 150.000 )

14
TCNCYH 29 (3) - 2004
Từ 148 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân
có HCNC năm 2002, không phát hiện đợc
kháng thể IgM kháng virut VNNB bằng kỹ
thuật MAC-ELISA, sử dụng tế bào C6/36
phân lập đợc 4 chủng virut VNNB và 2
chủng virut không định loại đợc với các
kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi,
Bunya. Hai chủng virut không định loại đợc
có ký hiệu 02VN193 và 02VN208. Hình thái
virut đợc xác định bằng kính hiển vi điện tử
theo phơng pháp nhuộm âm bản, hai chủng
virut này có hình thái giống nhau: virut hình
cầu, có vỏ, kích thớc khoảng 50 nm.
Kết quả xác định virut.
Trong nghiên cứu này chủng virut có ký
hiệu 02VN208 đợc chọn để xác định các đặc
tính của virut. Kết quả thực nghiệm cho thấy
chủng virut này không gây liệt chuột, nhng
virut thích ứng trên tế bào C6/36 và nhiều
dòng tế bào của động vật có vú khác đặc biệt
là dòng tế bào thần kinh chuột. Sự thích ứng

của virut trên các dòng tế bào thờng trực
đợc khẳng định bằng thử nghiệm đám hoại
tử tế bào và kỹ thuật RT-PCR.
Bằng kỹ thuật trung hoà, xác định ở độ
pha loãng 1/10 của huyết thanh làm giảm
90% đám hoại tử, nh vậy kháng thể trung
hoà kháng virut trong mẫu huyết thanh đợc
lấy sau khi khỏi bệnh hơn một năm vẫn còn
tồn tại và có phản ứng đặc hiệu với chủng
virut có ký hiệu 02VN208.
Vật liệu di truyền của virut đợc kiểm tra với
enzym Rnase và Dnase. Enzym Rnase đã tiêu
huỷ toàn bộ vật liệu di truyền của virut, khẳng
định virut có vật liệu di truyền là ARN. So sánh
với trình tự vật liệu di truyền của chủng virut này
với các chủng virut đã công bố trên thế giới
trong ngân hàng số liệu, xác định trình tự vật
liệu di truyền của nó không giống với trình tự vật
liệu di truyền của các chủng virut đã công bố,
chỉ có 40% tơng tự nh trình tự vật liệu di
truyền của virut Corona.
Cặp mồi đặc hiệu đợc thiết kế từ chủng
virut có ký hiệu 02VN208 đợc dùng để kiểm
tra với những chủng virut phân lập trong năm
2002 từ DNT của bệnh nhân có HCNC và từ
muỗi bằng kỹ thuật RT-PCR. Xác định có 6
chủng virut dơng tính với cặp mồi này trong
đó có 2 chủng virut phân lập từ DNT bệnh
nhân HCNC (chủng virut có ký hiệu 02VN193,
02VN208) và 4 chủng virut phân lập từ muỗi

Culex Tritaeniorhynchus và Culex Vishnui
(chủng virut có ký hiệu 02VN9, 02VN18,
02VN178 và 02VN108).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 2. Kết quả định loại các chủng virut phân lập năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu
với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp)

15
TCNCYH 29 (3) - 2004
Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm
PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA
100 bp; 2: Chứng dơng (02VN208); 3:
02VN193, 4: 02VN 9; 5: 02VN18,
6: 02VN178, 7: 02VN180, 8: vi rut VNNB;
9: Chứng âm; 10: Thang chuẩn DNA 1 kb)
IV. Bàn luận
Trong nghiên cứu này có 2 chủng virut
Arbo mới có vật liệu di truyền là ARN đợc
phân lập bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Trình
tự vật liệu di truyền của chủng virut này đợc
xác định không giống trình tự vật liệu di truyền
của các virut đã đợc công bố trong ngân
hàng số liệu, nh vậy đây là một chủng virut
mới đợc phát hiện ở Việt Nam cũng nh trên
thế giới. Kết quả xác định dơng tính với các
chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi
năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu với chủng
virut có ký hiệu 02VN208 là cơ sỏ để khẳng
định đây là virut gây HCNC do muỗi truyền

[hình 2]. Kiểm tra một số chủng virut phân lập
từ DNT của bệnh nhân HCNC trong năm
2003, xác định có 1 chủng dơng tính với cặp
mồi này (số liệu phòng thí nghiệm). Tên của
virut đợc đặt theo tên địa phơng của bệnh
nhân, chủng virut có ký hiệu 02VN208 có tên
là virut Nam Định.
Hai chủng virut Arbo mới phân lập từ bệnh
nhân HCNC trong mùa dịch viêm não hè năm
2002, cả hai bệnh nhân hồi phục hoàn toàn
sau điều trị. Do chẩn đoán bằng phân lập
virut thờng ít đạt kết quả (bảng 1), nên việc
chế tạo sinh phẩm cho kỹ thuật chẩn đoán và
giám sát huyết thanh học cần đợc đề cập tới
trong những nghiên cứu tiếp theo để ứng
dụng cho chẩn đoán, giám sát huyết thanh
học làm cơ sở để xác định dịch tễ, lâm sàng
HCNC do virut Arbo mới này.

1
2
3
4
5
6
7
8
Hình3. Kết quả xác định sự nhân lên của virut trên tế bào thần kinh chuột gây nhiễm
với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp)
Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm

PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA
100 bp; 2: Chứng dơng (02VN208); 3 - 7:
ARN của virut trong nớc nổi tế bào gây
nhiễm chủng virut có ký hiệu 02VN208 sau 1,
2, 3, 4 và 5 ngày; 8: Chứng âm.

V. Kết luận
1. Virut Arbo mới đợc phân lập từ DNT
của bệnh nhân có HCNC năm 2002 có đặc
điểm: hình cầu, có vỏ, kích thớc khoảng 50
nm, vật liệu di truyền đợc xác định là ARN.
2. Virut thích ứng trên tế bào muỗi C6/36,
BHK-21và đặc biệt là tế bào thần kinh chuột.
Trình tự vật liệu di truyền của virut không giống

16
TCNCYH 29 (3) - 2004

17
trình tự của các chủng virut đã công bố trong
ngân hàng số liệu, nó là một chủng Arbo virut
mới đợc phát hiện ở Việt Nam.
Đề tài đợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm
virut Viêm não, Khoa Virut, Viện VSDTTƯ, Hà
Nội, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Y tế và Viện
VSDTTƯ.
Các tác giả xin trân trọng cảm ơn sự hợp
tác trong nghiên cứu này của:
- Tập thể cán bộ Khoa lây Viện Nhi
Trung ơng.

- PGS TS. Nguyễn Kim Giao, các
đồng nghiệp của Phòng Kính hiển vi điện tử,
Phòng thí nghiệm Virut viêm não, Khoa Virut
Viện VSDTTƯ.
- Tiến sĩ Manmohan Parida, Khoa
Virut, Viện Y học Nhiệt đới, Nagasaki, Nhật
Bản cho sự trợ giúp về kỹ thuật sequencing
tại Nagasaki.
- Trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC,
Colorado Mỹ.
Tài liệu tham khảo
1. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh,
Vơng Đức Cờng, Vũ Sinh Nam, Phạm Thị
Minh Hằng, Trần Văn Tiến. 2002. Giám sát,
chẩn đoán Viêm não Nhật Bản ở Việt Nam
(2000 2001), Tạp chí Y học dự phòng, tập
XII, số 4 (55 ), 2002, tr 5 11.
2. Nguyễn Thị Hiền Thanh. 2003. Bớc
đầu tìm hiểu căn nguyên gây viêm màng não
ở trẻ em do một số virut đờng ruột. Tạp chí Y
học dự phòng, tập XIII, số 4 (61): 5-12.
3. Boquan C. and Sanju T. 1996.
Arbovirus survey in China in recent ten years.
Chinese Medical Journal, 109 (1): 13 15.
4. Calisher C. H., Shope R. E., and
Walton T.E. 1988. Cell cultures for diagnosis
of Arbovirus infections in livestock and
wildlife. Journal of Tissue Culture Methods,
Vol. 11, No. 3: 157 - 163.
5. Chapon C., Cech T. R., Zaug A. J.

1997. Polyadenylation of telomerase RNA in
budding yeast. RNA 3:1337 1351.
6. Ha D. Q., Calisher C. H., Tien P. H.,
Karabatsos N., and Gubler D. J. 1995.
Isolation of a newly recognized Alphavirus
from mosquitoes in Vietnam and evidence for
human infection and disease. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 53 (1): 100 -104.
7. Igarashi, A. (1978). Isolation of singls
Aedes Albopictus cell clone sensitive to
Dengue and Chikungunyaviruses. J. Gen.
Virol. 40: 531 544.
8. Mackenzie J. S., Chua K. B., Daniels
P. W., Eaton B. T., field H. E., Hall R. A.,
Halpin K., Johansen C. A., Kirkland P. D.,
Lam S. K., McMinn P., Nisbet D. J., Paru R.,
Pyke A. T., ritchie S. A., siba P. Smith d. w.,
Smith G. a., Hurk A. F., Wang L. F., Williams
D. T. 2001. Emerging viral Diseases of
Southeast Asia and the Western Pacific.
Emerging Infectious Disease, Vol. 7, No.
3:497 504.
Summary
Detection of new viral encephalitis from Cerebrospinal fluids
of acute encephalitis syndrome patients in North Vietnam

Two new Arbo viruses were isolated from cerebrospinal fluids of acute encephalitis syndrome
patients in the North Vietnam in 2002 by C6/36 cells. It was determined spherical, envelope and RNA
virus. The sequence of the virus did not homology with any known sequences that are available in the
data bank. Specific primer pair was designed for RT-PCR to examine unknown human and mosquito

isolates in 2002. Four mosquito and 2 human isolates were confirmed positive by the primer pair
indicating the virus to be a new Arbovirus. Nam Dinh virus was named after patients locality. Further
study on serology, ultramorphology should be needed in order to have sufficient data to classify this
new Arbovirus in Vietnam.