Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus viêm não nhật bản ở các vùng địa lý khác nhau của việt nam và ấn độ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƢ





TÊN NHIỆM VỤ

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU ĐẶC
ĐIỂM VỀ GEN CỦA VIRUS
VIÊM NÃO NHẬT BẢN Ở CÁC
VÙNG ĐỊA LÝ KHÁC NHAU
CỦA VIỆT NAM VÀ ẤN ĐỘ




CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS. TS. PHAN THỊ NGÀ

Hà Nội - 2010
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƢ


TÊN NHIỆM VỤ

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU ĐẶC
ĐIỂM VỀ GEN CỦA VIRUS
VIÊM NÃO NHẬT BẢN Ở CÁC
VÙNG ĐỊA LÝ KHÁC NHAU
CỦA VIỆT NAM VÀ ẤN ĐỘ

Chủ nhiệm nhiệm vụ




PGS. TS. PHAN THỊ NGÀ
Cơ quan chủ trì đề tài




PGS. TS. ĐẶNG ĐỨC ANH

Bộ Y tế






Bộ Khoa học và Công nghệ


Hà Nội - 2010
BỘ Y TÊ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN
ĐỀ TÀI KHCN CẤP NHÀ NƢỚC THEO NGHỊ ĐỊNH THƢ

1. Tên đề tài, dự án: “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus Viêm
não Nhật Bản ở các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam và Ấn Độ”
Mã số: 36/2008/HĐ - NĐT
Thuộc: Đề tài hợp tác quốc tế về Khoa học và Công nghệ theo Nghị định thƣ
2. Thời gian thực hiện : 01/2008- 11/2010
3. Tổ chức chủ trì: Bộ Y tế
4. Cơ quan chủ quản: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng

5. Tác giả thực hiện đề tài trên gồm những ngƣời có tên trong danh sách sau:
Số
TT
Chức danh khoa học, học vị,
họ và tên
Tổ chức công tác
Chữ ký
1
PGS. TS. Phan Thị Ngà
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

2
PGS. TS. Nguyễn Trần Hiển
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

3
BS. Đỗ Phƣơng Loan
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

4
CN. Nguyễn Viết Hoàng
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

5
KS. Bùi Minh Trang
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

6
CN. Lê Thị Hiền Thu
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

7
Ths. Hoàng Minh Đức
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

8
TS. Nguyễn Thị Lan Anh
Viện Vệ sinh dịch tễ TƢ

9
TS. Vũ Thị Quế Hƣơng
Viện Pasteur TP. HCM

10
ThS. Huỳnh Thị Kim Loan
Viện Pasteur TP. HCM


Chủ nhiệm đề tài
Thủ trƣởng tổ chức chủ trì đề tài




PGS. TS. Phan Thị Ngà
PGS. TS. Đặng Đức Anh

BỘ Y TÊ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG
__________________

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THAM GIA
ĐỀ TÀI KHCN CẤP NHÀ NƢỚC THEO NGHỊ ĐỊNH THƢ

1. Tên đề tài, dự án: “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus Viêm
não Nhật Bản ở các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam và Ấn Độ”
Mã số: 36/2008/HĐ - NĐT
Thuộc: Đề tài hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo Nghị định
thƣ
2. Thời gian thực hiện : 01/2008- 11/2010
3. Tổ chức chủ trì: Bộ Y tế
4. Cơ quan chủ quản: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng
5. Tác giả tham gia đề tài trên gồm những ngƣời có tên trong danh sách sau:

Số
TT
Chức danh khoa học, học vị,
họ và tên
Tổ chức công tác
1
Ths. Tống Thị Hà
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
2
Ths. Trần Thị Nguyệt Lan
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
3

Ths. Đặng Thu Thảo
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
4
TS. Nguyễn Thị Thùy Dƣơng
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
5
BS. Nguyễn Thị Kim Khánh
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
6
Ths. Lại Thị Minh
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
7
Ths. Nguyễn Hoàng Lê
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
8
CN. Nguyễn Thị Yên
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng
9
BS. Đặng Thanh Minh
Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Bắc Giang
10
BS. Lâm Văn Tuấn
Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Bắc Giang
11
Ths. Nguyễn Thị Hiển
Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Bắc Giang
12
TS. Đặng Đình Thoảng
Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Hà Nam
13

Ths. Lê Phụng Đại
Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Thanh Hoá
14
CN. Phan Thị Tuyết Nga
Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên
15
BS. Đỗ Thị Tam Giang
Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên
16
GS. TS. Đặng Tuấn Đạt
Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên
17
BS. Nguyễn Thị Nam Liên
Bệnh viện đa khoa Trung ƣơng Huế

Chủ nhiệm đề tài







Thủ trƣởng tổ chức chủ trì đề tài

PGS. TS. Phan Thị Ngà
PGS. TS. Đặng Đức Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài …………………
3
1.1.1. Sự lan rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý ……
3
1.1.2. Dịch tễ học phân tử sự xuất hiện virus VNNB ở khu vực châu Á ……
10
1.1.3. Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu
trên thế giới …………………………………………………………

13
1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài …………………
16
1.2.1. Bệnh VNNB và véc- tơ truyền VNNB tại Việt Nam ……………….
16
1.2.2. Tình hình nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB ở Việt Nam
18
1.2.3. Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu
virus VNNB ở Việt Nam ……………………………………………………
20
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………
21
2.1. Vật liệu, trang thiết bị hóa chất sử dụng cho nghiên cứu……………….
21
2.1.1. Dụng cụ, trang thiết bị………………………………………………
21
2.1.2. Hóa chất, sinh phẩm………………………………… ………………
21
2.1.3. Trình tự nucleotide vùng gen E…….…………………………………
22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………….………………
24
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thực hiện mục tiêu 1: “Xác định đặc điểm
các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ”.
24
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu phân tích để thực hiện mục tiêu 2: “Xác

định sự liên quan giữa những biến thể genotype khác nhau”………………
39
2.2.3. Nghiên cứu phân tích để thực hiện mục tiêu 3: “Xác định sự thay đổi

genotype virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở hai nước (Ấn Độ và
Việt Nam)”…………………………………………………………………
41

2.2.4. Nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu phân tích để thực hiện mục
tiêu 4: “Xác định sự tác động qua lại giữa virus và véc-tơ”…………………
43
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………
45
3.1. Xác định đặc điểm các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam
và Ấn Độ ……………………………………………………………………
45
3.2. Xác định sự liên quan di truyền giữa những biến thể genotype khác
nhau của virus VNNB ở Việt Nam …………………………………………
52
3.2.1. So sánh cặp và sắp xếp đa trình tự các chủng virus VNNB phân lập từ
bệnh nhân …………………………………………………………………
52
3.2.2. So sánh cặp và sắp xếp đa trình tự các chủng virus VNNB phân lập từ
muỗi, lợn…………………………………………………………………
53
3.3. Xác định sự thay đổi trong genotype của virus VNNB ở một số vùng
dịch khác nhau ở hai nước (Ấn Độ và Việt Nam) …………………………
57
3.3.1. Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau
ở Việt Nam …………………………………………………………………
57
3.3.2. Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau
tại Ấn độ …………………………………………………………………
67

3.4. Sự tác động qua lại giữa virus và véc- tơ ………………………………
69
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN
72
4.1. Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định đặc điểm genotype của
virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ………………………………

73
4.1.1. Bàn luận về phương pháp sử dụng để xác định đặc điểm genotype của

virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ…………………………
73
4.1.2. Bàn luận về kết quả xác định đặc điểm genotype của virus VNNB lưu
hành ở Việt Nam và Ấn Độ………………………………………………….

77
4.2. Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định sự liên quan di truyền
giữa những biến thể genotype khác nhau ở Việt Nam
82
4.2.1. Bàn luận về phương pháp xác định sự liên quan di truyền giữa những
biến thể genotype khác nhau ở Việt Nam…………………………………
82
4.2.2. Bàn luận về kết quả xác định sự liên quan di truyền giữa những biến
thể genotype khác nhau ở Việt Nam…………………………………………
83
4.3. Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định sự thay đổi của virus
VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở Ấn Độ và Việt Nam……………….
88
4.3.1. Bàn luận về phương pháp xác định sự thay đổi của virus VNNB ở
một số vùng dịch khác nhau ở Ấn Độ và Việt Nam…………………………

88
4.3.2. Bàn luận về kết quả xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số
vùng dịch khác nhau ở Ấn Độ và Việt Nam…………………………………
89
4.4. Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định sự tác động qua lại giữa
virus và vec-tơ………………………………………………………………
92
4.4.1. Bàn luận về phương pháp xác định sự tác động qua lại giữa virus và
vec-tơ………………………………………………………………………
92
4.4.2. Bàn luận về kết quả xác định sự tác động qua lại giữa virus và vec-
tơ……………………………………………………………………………
94
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN
98
5.1. Xác định đặc điểm các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam
và Ấn Độ……………………………………………………………………
98
5.2. Xác định sự liên quan di truyền giữa những biến thể genotype khác
nhau ở Việt Nam……………………………………………………………
98
5.3. Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở
hai nước (Ấn Độ và Việt Nam)………………………………………………

99
5.4. Xác định sự tác động qua lại giữa virus và véc-tơ………………………
99
6. Kiến nghị…………………………………………………………………
100
6.1. Sử dụng chủng sản xuất vaccin phòng bệnh VNNB…………………….

100
6.2. Ứng dụng qui trình chẩn đoán và nghiên cứu virus VNNB……………
100
TÀI LIỆU THAM KHẢO
101

CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Chữ viết tắt
Chú giải tiếng Anh
Chú giải tiếng Việt
A.a
Acid amin
Axit amin
ADN
Acid desoxyribonucleic
Axit desoxyribonucleic
ARN
Acid ribonucleic
Axit Ribonucleic
Arbo virus
Arthropod borne virus
Virus truyền do côn trùng tiết túc
BSA
Bovine Serum Albumin
Albumin huyết thanh bò
CDC
Center for Disease Control
and Prevention

Trung tâm kiểm soát bệnh dịch
CTTT

Côn trùng tiết túc
cDNA
Complement DNA
ADN bổ sung
ELISA
Enzyme Linked
Immunosorbent Assay
Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn
enzym
EMEM
Eagle Minimum Essential
Medium
Môi trường EMEM
HCNC

Hội chứng não cấp
HT

Huyết thanh
KN

Kháng nguyên
KT

Kháng thể
kD
kilo Dalton

MAC – ELISA
IgM capture ELISA
Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn
enzym tóm bắt IgM
MTase
Enzyme methyltransferase

Nucleotide/bp
base pair
Cặp bazơ
PBS
Phosphate-buffered saline
Đệm muối phốt phát
PBS- T
Phosphate-buffered saline –
Tween
Đệm muối phốt phát có Tween
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng khuếch đại chuỗi
PFU
Plaque Forming Unit
Đơn vị tạo đám hoại tử
RT - PCR
Reverse Transcriptase
polymerase chain reaction
Phản ứng khuếch đại chuỗi sao chép
ngược
RdRP

RNA dependent RNA
polymerase
ARN polymerase phụ thuộc ARN
Rnase H
ARNase Inhibitor
Enzym ức chế ARNase
RTse
Reverse Transcriptase
Enzym sao chép ngược
Tế bào BHK
21

Baby Hamster Kidney cells

Tế bào có nguồn gốc thận chuột
Hamster mới đẻ
Tế bào RD
18


Rhabdomyosarcoma

Tế bào ung thư có nguồn gốc từ
nguyên bào cơ vân
Tế bào Vero


Tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ
xanh châu Phi
VNNB/JE

Japanese encephalitis
Viêm não Nhật Bản

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1
Thông tin về các chủng virus VNNB được sử dụng để so sánh
trình tự vùng gen E và xây dựng cây phả hệ …………………
23
Bảng 3.1
Phân lập và định loại virus VNNB ở Việt Nam, 2005-2009….
45
Bảng 3.2
Các chủng virus VNNB ở Việt Nam dùng để giải trình tự gen
E ………………………………………………………………
46
Bảng 3.3
Xác định genotype virus VNNB phân lập từ bệnh nhân trong
các năm từ 1986-2007 ở Việt Nam (dựa trên trình tự một phần
vùng gen E) …………………………………………………
47
Bảng 3.4
Xác định genotype virus VNNB phân lập từ muỗi, lợn trong
các năm từ 1993-2007 ở Việt Nam(dựa trên trình tự một phần
vùng gen E) …………………………………………………
49
Bảng 3.5
Phân lập virus VNNB ở Ấn Độ từ muỗi 2006-2009 …………
50
Bảng 3.6

Các chủng virus VNNB ở Ấn Độ sử dụng trong nghiên cứu…
51
Bảng 3.7
Xác định genotype virus VNNB phân lập từ người, muỗi
trong các năm 1956-2005 ở Ấn Độ (dựa trên trình tự toàn bộ
vùng gen E) …………………………………………………
51
Bảng 3.8
Tỷ lệ sự tương đồng về nucleotide của một số chủng virus
VNNB phân lập từ người, 1986-2007 ………………………
52
Bảng 3.9
Tỷ lệ sự tương đồng về nucleotide của 19 chủng virus VNNB
phân lập từ muỗi, lợn, 1993-2007 ……………………………
54
Bảng 3.10
Thông tin về số đăng ký trình tự nucleotide vùng gen E của
32 chủng virus VNNB trong ngân hàng gen quốc tế …………
56
Bảng 3.11
So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide vùng gen E của các
chủng virus VNNB cùng genotype phân lập ở Việt Nam


1986-2007 ……………………………………………………
57
Bảng 3.12
Thông tin về kết quả thiết kế mồi để giải trình tự genome của
virus VNNB genotype 1 ………………………………………
60

Bảng 3.13
Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của toàn bộ
genome của chủng có ký hiệu 90VN70 so với chủng
Consensus* …………………………………………………
63
Bảng 3.14
Đặc điểm các acid amin thay thế của chủng virus VNNB có
ký hiệu 90VN70 so sánh với chủng Consensus ………………
64
Bảng 3.15
Sự tương đồng về nucleotide vùng gen E của các chủng virus
VNNB genotype 1 phân lập từ người ở Việt Nam 1990 và
Trung Quốc trong các năm 2006-2009 ……………………….
66
Bảng 3.16
Sự tương đồng về nucleotide vùng gen E của 12 chủng virus
VNNB phân lập ở Ấn Độ trong khoảng thời gian 1956-2005
67
Bảng 3.17
Kết quả thử nghiệm xác định sự nhậy cảm của muỗi với véc-
tơ……………………………………………………………
69
Bảng 3.18
So sánh trình tự nucleotide toàn bộ vùng gen E của mẫu gốc
chủng Nakayama với mẫu virus nhân lên ở Culex
tritaeniorhynchus ……………………………………………
71

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1
Mô hình cấu trúc gen của Flavivius và sự phiên mã…………
5
Hình 1.2
Bản đồ xuất hiện và lan rộng virus VNNB ở một số nước……
9
Hình 1.3
Sự phân bố 8 tiểu phân nhóm của genotype 1 virus VNNB…
11
Hình 1.4
Sự chuyển đổi kháng thể kháng virus VNNB trong quần thể
lợn và kết quả phân lập được virus VNNB từ máu lợn ở Hà
Tây 2001-2003 ………………………………………………
18
Hình 2.1
Quy trình phân lập và phát hiện virus VNNB ………………
27
Hình 2.2
Tóm tắt sơ đồ thực hiện giải trình tự gen virus ………………
34
Hình 2.3
Sơ đồ quy trình xây dựng cây phát sinh loài (cây di truyền)….
41
Hình 3.1
Cây di truyền của các chủng virus VNNB dựa trên trình tự
nucleotide toàn bộ gen E, của virus VNNB ở bệnh nhân,
1986-2007 ……………………………………………
53
Hình 3.2
Cây di truyền phả hệ các chủng virus VNNB dựa trên trình tự

nucleotide toàn bộ gen E, của virus VNNB ở muỗi, lợn, 1993-
2007 …………………………………………………………
55
Hình 3.3
Xác định các phân nhóm virus VNNB genotype 1 lưu hành ở
muỗi và lợn tại Việt Nam, 2001-2007 ………………………
58
Hình 3.4
Mô phỏng cấu trúc genome virus VNNB và vị trí thiết kế mồi.
59
Hình 3.5
Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR được tổng hợp từ các cặp
mồi thiết kế đặc hiệu với virus VNNB ………………………
61
Hình 3.6
Cây di truyền phả hệ các chủng virus VNNB dựa trên trình tự
nucleotide genome chủng có ký hiệu 90VN70 và một số
chủng virus VNNB khác ……………………………………
62
Hình 3.7
Cây di truyền phả hệ các chủng virus VNNB dựa trên trình tự

toàn bộ vùng gen E của một số chủng virus VNNB phân lập ở
Ấn Độ, 1956-2005 …………………………………………

68
Hình 3.8
Xác định sự nhạy cảm của vỉrus VNNB ở muỗi thực nghiệm
bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu gen E …………
70

Hình 4.1
Bản đồ địa lý và địa điểm thu thập muỗi để phân lập ở Ấn Độ
79
Hình 4.2
Đường di cư của chim từ châu Á tới Đại Tây Dương…………
85




1
MỞ ĐẦU


Theo bảng phân loại năm 1990, virus viêm não Nhật Bản (VNNB)
thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae. Virus VNNB chỉ có một type huyết
thanh duy nhất nhưng có 5 genotype, sự phân bố của các genotype cũng
khác nhau tuỳ theo từng vùng địa lý. Nghiên cứu về dịch tễ phân tử của một
số chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam cho thấy: Các chủng virus
VNNB phân lập từ muỗi, từ bệnh nhân trước năm 1990 thuộc nhóm
genotype 3. Những nghiên cứu mới về dịch tễ phân tử các chủng virus
VNNB phân lập ở miền Bắc Việt Nam cho thấy có sự xuất hiện virus VNNB
genotype 1 trong số các chủng virus phân lập từ muỗi, từ lợn trong những
năm đầu thế kỷ 21. Ngược lại ở Ấn Độ, chỉ có virus VNNB genotype 3 lưu
hành, cho đến nay vẫn chưa phát hiện được virus VNNB genotype khác. Mặt
khác những chủng virus VNNB phân lập và giải mã trình tự vùng gen E ở
Ấn Độ chủ yếu là những chủng virus VNNB genotype 3 phân lập từ bệnh
nhân [67], [72], [93]. Nghiên cứu dịch tễ phân tử các chủng virus VNNB
phân lập ở Ấn Độ trong các nghiên cứu trước đây xác định các chủng virus
VNNB genotype 3 phân lập chủ yếu từ bệnh nhân, nhưng tạo thành hai phân

nhóm của genotype 3, có sự xuất hiện virus VNNB thuộc các phân nhóm
genotype 3 ở tiểu lục địa Ấn Độ [80], [81], [91]. Do vậy, cần có sự tiếp tục
giám sát các chủng virus VNNB ở Ấn Độ để có thông tin về sự lưu hành của
các chủng virus “địa phương”. Với sự xuất hiện của các chủng “mới” cho
thấy cần có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của các chủng virus VNNB
lưu hành ở một số nước trong khu vực châu Á, đặc biệt những nghiên cứu
đặc điểm về gen của các chủng virus VNNB ở những nước vùng Nam Á như
Ấn Độ với những nước vùng Đông Nam Á như Việt Nam. Hiện tại, có ít
nhất 3 giả thiết về sự mới xuất hiện của virus VNNB genotype 1 ở Nhật Bản,

2
Triều Tiên, Việt Nam hoặc sự xuất hiện các chủng mới “địa phương” đó là:
(1) Do chim di cư mang virus từ vùng này sang vùng khác; (2) Sự tương tác
giữa muỗi và virus VNNB xảy ra ở những vùng địa lý nhất định đã tạo ra
một genotype mới; (3) Do thay đổi môi trường sinh thái.
Trên thực tế bằng chứng khoa học để chứng minh cho giả thiết thứ
nhất “Do chim di cư mang virus từ vùng này sang vùng khác” tuy chưa phân
lập được virus VNNB từ chim di cư, nhưng có bằng chứng về mặt huyết
thanh học đã làm sáng tỏ cho giả thiết này [47]. Còn giả thiết thứ ba là “Do
thay đổi môi trường sinh thái”, đây là một vấn đề đã có nhiều bằng chứng
khoa học chỉ ra sự liên quan về thay đổi môi trường và bệnh dịch [8], [22],
67], [99], [100]. Do vậy, “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus
viêm não Nhật Bản ở các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam và Ấn Độ”
để phân tích cũng như tìm bằng chứng khoa học cho giả thiết thứ hai “Sự
tương tác giữa muỗi và virus VNNB xảy ra ở những vùng địa lý nhất định đã
tạo ra một genotype mới”, nhằm làm sáng tỏ sự mới xuất hiện của các
genotype virus VNNB ở những vùng địa lý mới, định hướng trong phòng
bệnh.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
1. Xác định đặc điểm các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt

Nam và Ấn Độ;
2. Xác định sự liên quan di truyền giữa những biến thể genotype khác
nhau ở Việt Nam;
3. Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác
nhau ở hai nước (Ấn Độ và Việt Nam);
4. Xác định sự tác động qua lại giữa virus và vec-tơ.

3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc liên quan đến đề tài
1.1.1. Sự lan rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý
1.1.1.1. Tác nhân gây bệnh
Bệnh VNNB là bệnh viêm não cấp tính, với triệu chứng lâm sàng đa
dạng, tác nhân gây bệnh là virus VNNB, một loại virus Arbo do muỗi
truyền. Theo bảng phân loại cũ trước những năm 1970, virus VNNB thuộc
họ Togaviridae, thuộc nhóm B các Flavivirus. Theo cách phân loại mới
(thập kỷ 90) virus VNNB thuộc họ Flaviviridae, là một trong 5 họ lớn của
virus Arbo. Họ Flaviviridae gồm có 3 chi (Genera) được phân loại dựa vào
một trong những cơ sở hình thái học hoặc cấu trúc vật liệu di truyền hoặc
liên quan tính kháng nguyên, đó là các chi Hepacivirus, chi Flavivirus và chi
Pestivirus. Riêng chi Flavivirus được chia thành 7 phức hệ huyết thanh học,
gần một nửa trong số các virus này gây bệnh cho người. Những virus gây
bệnh cho người thuộc 1 trong 3 phức hệ: phức hệ Tây sông Nil, phức hệ
Dengue và phức hệ viêm não do ve; còn virus Sốt vàng chưa được xếp là
một phức hệ kháng nguyên, mặc dù nó là chủng virus đầu tiên được phát
hiện và nghiên cứu trong chi Flavivirus. Phân loại bằng huyết thanh học, chi
Flavivirus được chia ra thành những phân nhóm nhỏ. Virus VNNB thuộc về
phân nhóm virus Tây sông Nil, cùng phân nhóm với các virus viêm não
thung lũng Murray, virus viêm não St. Louis [5], [47], [60].

Nghiên cứu siêu cấu trúc virus VNNB bằng kính hiển vi điện tử xác
định hạt virus có dạng hình cầu, capsid đối xứng hình khối, đường kính hạt
virus 40 - 50 nm, có vỏ bọc là màng lipid kép. Vật liệu di truyền của virus
VNNB là ARN sợi đơn dương, chứa toàn bộ thông tin di truyền của virus,

4
chiếm khoảng 6 % trọng lượng của virion. Chiều dài sợi ARN của virus
VNNB là 10.976 nucleotide (bp) tương ứng với 3.432 acid amin (a.a), mã
hoá cho 10 loại protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc
[15], [16], [20].
Đặc điểm của các protein cấu trúc (structural protein):
- Protein màng - Membrane (M) còn gọi là V
1
.Glycoprotein membrane
(prM) – glycoprotein màng có trọng lượng  26 kD.
- Protein lõi - Nuleocapsid (C) còn gọi là V
2
. Protein lõi là protein cơ
bản, trọng lượng 11kD. Protein C gấp vào trong một nhị hợp kết
thành khối với mỗi một đơn thể có chứa 4 hình xoắn alpha.
- Protein vỏ bao - Envelop (E) còn gọi là V
3
. Glycoprotein Envelope
(E) có trọng lượng  53 kD, là protein chủ yếu trên bề mặt của virus
VNNB, là những receptor kết hợp trung gian và làm biến đổi màng, là
kháng nguyên tạo kháng thể trung hoà và kháng thể ức chế ngưng kết
hồng cầu. Những nghiên cứu trước đây cho thấy protein vỏ bao đóng
vai trò quan trọng cho sự xâm nhiễm của virus VNNB và sự khác
nhau về độc lực của virus VNNB trong tự nhiên.

Đặc điểm protein phi cấu trúc NS (non-structural protein): Có 7 protein
phi cấu trúc với ký hiệu: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.
- Protein NS1 là glycoprotein rất kỵ nước, trọng lượng khoảng 46 kD,
trong giai đoạn nhiễm virus, NS1 là kháng nguyên kích thích sự đáp
ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ để kháng lại protein này.
- Protein NS2a & NS2b: Protein NS2a nhỏ khoảng 22 kD là protein kỵ
nước, còn protein NS2b cũng rất nhỏ khoảng 14 kD.
- Protein NS3 rất lớn khoảng 70kD là protein có nhiều chức năng, giúp
cho sự xâm nhiễm và sự nhân lên của ARN virus trong tế bào vật chủ.

5
- Protein NS4a và NS4b rất nhỏ (khoảng 16 kD và 27 kD, tương ứng),
là protein kỵ nước.
- Protein NS5 rất lớn khoảng 103kD, rất bền vững, là protein có nhiều
chức năng với enzym methyltransferase (MTase) và hoạt tính RdRP
(RNA dependent RNA polymerase).



Hình 1.1. Mô hình cấu trúc gen của Flavivirus và sự phiên mã [60]

Mỗi một loại protein sẽ tương ứng với một loại kháng nguyên virus
VNNB. Có ba loại kháng nguyên của virus VNNB được quan tâm và có tên
gọi theo phương pháp In-vitro phát hiện ra nó đó là: Kháng nguyên ngưng
kết hồng cầu, kháng nguyên trung hoà, đây là một glycoprotein trên bề mặt
hạt virus (mã hoá bởi vùng gen E), là những kháng nguyên kích thích cơ thể
tạo kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể trung hoà, nói một
cách khác đây chính là kháng nguyên kích thích cơ thể sinh kháng thể bảo
vệ; Kháng nguyên kết hợp bổ thể NS1, là một kháng nguyên kết hợp bổ thể

6
ở dạng hoà tan hoặc kết hợp với thành phần màng nhưng không kết hợp với
hạt virus (virion), nó đóng vai trò bảo vệ hạt virus. Các nghiên cứu cho thấy
virus VNNB có tính kháng nguyên chung với những virus cùng chi
Flavivirus (genus). Tùy từng loại kỹ thuật có thể xác định phản ứng chéo
hoặc tính đặc hiệu của kháng nguyên. Ví dụ nếu sử dụng kỹ thuật ức chế
ngưng kết hồng cầu để xác định virus VNNB, nó sẽ có phản ứng chéo rộng
với các virus trong phân nhóm virus Tây sông Nil, với các virus Dengue
trong phân nhóm virus Dengue; Nhưng nếu sử dụng kỹ thuật MAC-ELISA
thì ít có phản ứng chéo với những virus thuộc phân nhóm virus Dengue,
nhưng có thể có phản ứng chéo ở mức độ thấp với những virus cùng phân
nhóm với virus Tây sông Nil [1], [5], [60].

1.1.1.2. Véc-tơ, ổ chứa virus VNNB trong tự nhiên
Bệnh VNNB do muỗi truyền, các loài muỗi Culex được xác định là
véc-tơ truyền virus VNNB. Bệnh chỉ xuất hiện ở người khi có điều kiện sinh
thái thích hợp, virus VNNB không truyền từ người sang người mà qua trung
gian muỗi đốt. Chu trình sinh thái của virus VNNB trong tự nhiên là liên tục,
đối với các vùng nhiệt đới bệnh VNNB xuất hiện rải rác quanh năm, nhưng
đối với những vùng ôn đới hoặc cận nhiệt đới thì dịch VNNB thường xảy ra
vào mùa hè. Cho đến nay, có nhiều bằng chứng khoa học cho thấy virus
VNNB lưu hành trong một vùng địa lý được xác định do tồn tại trong tự
nhiên ở muỗi véc-tơ với nghiên cứu xác định muỗi Culex truyền virus
VNNB sang thế hệ sau qua trứng, hoặc do chim di cư mang virus từ nơi
khác đến qua bằng chứng có kháng thể kháng virus VNNB từ chim và phân
lập được virus VNNB từ một số loài dơi di cư [40], [54], [55], [73], [77].
Virus VNNB đã được phân lập từ khoảng 30 loài muỗi thuộc 5 giống
Culex, Anopheles, Aedes, Mansonia và Amergeres; trong đó Culex (Cx), đặc

7

biệt là Cx. Tritaeniorhynchus đã được chứng minh là véc-tơ chính truyền
virus VNNB, còn một số loại muỗi khác như Anopheles, Aedes tuy phân lập
được virus VNNB từ chúng nhưng có thể là do những loài muỗi này bị
nhiễm virus VNNB khi hút máu động vật trong giai đoạn nhiễm virus huyết.
Theo y văn, virus VNNB thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi ở 27
0
C–
30
0
C, mỗi lần muỗi đốt có tới 100.000 MLD (liều chí tử tối thiểu) đối với
chuột nhắt. Đây cũng chính là cơ sở để xác định hiệu lực của vắc-xin khi
tiêm cho người phải tạo ra được hiệu giá kháng thể trung hoà phải đạt trên
1/10, là ngưỡng hiệu giá kháng thể để có thể bảo vệ khi bị muỗi véc-tơ mang
virus đốt. Nghiên cứu cho thấy, sự nhân lên của virus VNNB trong muỗi liên
quan đến nhiệt độ, dưới 20
0
C sự nhân lên của virus VNNB bị chậm hoặc
ngừng lại, nên bệnh VNNB thường xuất hiện về mùa hè ở các vùng cận
nhiệt đới, đó là khoảng thời gian thích hợp cho virus nhân lên trong cơ thể
muỗi và cũng là thời gian chỉ số mật độ muỗi cao nhất trong năm [1], [8],
[58]. Còn ở các nước vùng nhiệt đới, các trường hợp VNNB thường tản phát
xuất hiện quanh năm. Đối với một vùng lưu hành virus VNNB, có một số
yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xẩy ra dịch như mối quan hệ giữa véc-tơ và
ổ chứa, mật độ véc-tơ, khả năng truyền virus của véc-tơ, tập quán sinh hoạt
của dân cư, việc sử dụng vắc-xin VNNB để phòng bệnh [88], [89], [94]. Với
kết quả nghiên cứu đã phân lập được virus VNNB từ ổ chứa virus VNNB
trong tự nhiên như một số loài chim, muỗi và nhiều loài động vật máu nóng
khác đặc biệt là lợn - vật chủ khuếch đại mầm bệnh [8], [30], [66], [83],
[92], [101]. Như vậy, sự lưu hành của virus VNNB trong tự nhiên ở động
vật có xương sống hoang dại hoặc động vật nuôi trong nhà và muỗi hút máu

là chu trình liên tục, nên không thể thanh toán được bệnh VNNB như một số
loại bệnh khác (bại liệt, đậu mùa ) chỉ có vật chủ duy nhất là người, mà chỉ
có thể khống chế và kiểm soát bệnh VNNB bằng các chương trình vắc-xin

8
dự phòng rộng rãi trong vùng lưu hành dịch, đặc biệt cho đối tượng trẻ em
dưới 15 tuổi [2], [9], [13], [51], [67].

1.1.1.3. Sự lan rộng và xuất hiện của genotyp mới virus VNNB ở một số
vùng địa lý trên thế giới
Bệnh viêm não do virus VNNB được ghi nhận ở Nhật Bản từ những
năm 1870, nhưng mãi đến năm 1935, chủng virus VNNB đầu tiên mới được
phân lập từ bệnh nhân - chủng Nakayama, đây là chủng virus VNNB đầu
tiên được phát hiện (Prototype) thuộc genotype 3. Theo thời gian, virus
VNNB từ Nhật Bản có thể qua những phương tiện vận chuyển hoặc chim di
cư đã lan rộng từ nước này sang nước khác Tuy nhiên, có thể liên quan
đến điều kiện sinh thái, véc-tơ truyền bệnh mà virus VNNB đã xuất hiện và
được ghi nhận ở hầu hết các nước châu Á trong khoảng thời gian 1950 –
1990 với sự lan truyền rộng rãi ở những nước như Trung Quốc, Triều Tiên,
Philippin, vùng Viễn đông, hầu hết các nước ở Đông Nam châu Á và Ấn Độ.
Ngoài ra, trong những năm cuối của thế kỷ 20 có sự xuất hiện virus VNNB ở
miền Bắc nước Úc, vùng trước đây không có bệnh dịch này như quần đảo
thuộc eo biển Torres cách xa lục địa Australia [17], [23], [98]. Cho đến nay,
chưa phát hiện được sự lưu hành của virus VNNB ở những châu lục khác
như châu Âu, châu Phi, Châu Mỹ. Chính vì vậy, người dân ở những châu lục
này khi đến châu Á, đặc biệt đến những vùng lưu hành virus VNNB đều
được khuyến cáo nên tiêm phòng vắc-xin VNNB [40], [69], [88], [89], 92].
Mặc dù chủng virus VNNB đầu tiên được phát hiện là virus VNNB
genotype 3, nhưng hơn nửa thế kỷ phát tán ra những vùng địa lý mới, cho
đến nay đã xác định virus VNNB có 5 genotype. Tuy nhiên, sự lưu hành của

5 genotype virus VNNB khác nhau tùy từng nước, tuỳ khoảng thời gian, có
nước chỉ lưu hành một loại genotype virus VNNB, nhưng có nước phát hiện

9
có sự lưu hành 2 hoặc 3 genotype virus VNNB như Indonesia lưu hành 3
genotype khác nhau của virus VNNB [11], [15], [24], [39], [53], [90], [98].
Đây là minh chứng cho thấy có thể do sự thay đổi về môi trường sinh thái,
sự tương tác giữa muỗi và virus VNNB ở những vùng địa lý nhất định, trong
một điều kiện nào đó đã tạo ra một genotype mới, hoặc có sự xâm nhập của
genotype mới do chim di cư. Ở Nhật Bản, nơi phát hiện virus VNNB đầu
tiên, trong khoảng thời gian 60 năm từ 1935 đến 1994 (khoảng 60 năm), các
chủng virus VNNB phân lập được từ bệnh nhân, từ muỗi, lợn ở Nhật Bản
đều thuộc genotype 3 [39], [41], [79], [80], [91].

Hình 1.2. Bản đồ xuất hiện và lan rộng virus VNNB ở một số nước [1]