Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú her2 trong tảo chlamydomonas reinhardtii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

TRẦN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN KHÁNG THỂ TÁI TỔ
HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ VÚ HER2
TRONG TẢO CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

Chuyên ngành :

Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN

Hà Nội – 2010


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà bản thân tôi đã trực tiếp thực
hiện.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa
từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010
Tác giả luận văn

Trần Thị Huyền Trang

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS Lê
Quang Huấn- Trưởng phòng công nghệ Tế bào Động vật, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy trực tiếp hướng dẫn
tôi trong suốt quá trình làm khoá luận này.
Trong quá trình thực tập và thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của KS. Đặng Thị Minh Lụa và toàn thể cán bộ
nhân viên phòng Công nghệ Tế bào Động vật, nhân dịp này tôi muốn gửi lời cảm
ơn chân thành nhất vì sự giúp đỡ quý báu đó.
Để hoàn thành khoá luận này không thể không nói tới công lao của các
thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, Viện Đào tạo
Sau đại học - Đại học Bách Khoa - Hà Nội đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi
những kiến thức và tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập
tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đồng
nghiệp cơ quan công tác Chi cục Bảo vệ Bảo vệ thực vật – Hà Nội đã luôn bên
cạnh động viên, chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành khoá học và thực
hiện tốt khoá luận này.
Một lần nữa cho tôi xin cảm ơn về mọi sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010
Học viên

Trần thị Huyền Trang

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………. 1
Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………………………...... 3
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư vú……………………………………………….....

3

1.1.1. Khái niệm ung thư vú (UTV)............................................................................

3 

1.1.2. Phân loại............................................................................................................

3 

1.1.3. Nguyên nhân gây UTV......................................................................................

6 

1.1.4. Các phương pháp điều trị ung thư vú…………………………………………

8

1.2. Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú………………………………. 

9

1.2.1. Cấu trúc của gen HER2...................................................................................... 

9

1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên HER2………………………………………………... 

9

1.2.3. Cơ chế hoạt động của thụ thể HER2………………………………………..... 

11

1.3. Ung thư vú dương tính HER2..............................................................................

11

1.4. Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2…………………………….

13

1.4.1 Khái niệm............................................................................................................

13

1.4.2. Kháng thể đơn dòng và ứng dụng điều trị ung thư vú.......................................

16

1.5. Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng………………………………...

18

1.5.1. Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma………………………………….

18

1.5.2. Phương pháp tái tổ hợp……………………………………………………......

19

1.6. Các hệ thống biểu hiện gen truyền thống……………………………………….

20

1.6.1. Hệ thống biểu hiện tế bào vi khuẩn…………………………………………...

20

1.6.2. Hệ thống biểu hiện tế bào nấm men…………………………………………..

21

1.6.3. Hệ thống biểu hiện tế bào động vật có vú…………………………………......

21

1.6.4. Hệ thống biểu hiện tế bào thực vật……………………………………………

21

1.6.5. Hệ thống biểu hiện vi tảo…………………………………………………......

22

1.7. Hệ biểu hiện tảo Chlamydomonas reinhardtii………………………………......

23

1.7.1. Đặc điểm sinh học………………………………………………………….....

23

1.7.2. Ứng dụng của tảo Chlamydomonas reinhardtii trong công nghệ gen……......

25

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

1.8.Phương pháp chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardti thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens…………………………………………………..

27

1.8.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………………………………...

28

1.8.2. Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens…………………………

29

1.8.3. Hệ thống vector dùng trong chuyển gen………………………………………

29

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP…………………………………….

31

2.1. VẬT LIỆU............................................................................................................

31

2.1.1. Sinh phẩm..........................................................................................................

31

2.1.2. Hoá chất và môi trường……………………………………………………….

31

2.1.3. Thiết bị máy móc ……………………………………………………………..

33

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………

33

2.2.1. Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli ……………………………….

33

2.2.2. Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR……………………………………… 35
2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ………………………………………... 36
2.2.4. Phương pháp thu DNA từ gel agarose………………………………………... 36
2.2.5. Phương pháp cắt, gắn AND…………………………………………………... 37
2.2.6. Phương pháp biến nạp plasmid vào E. coli…………………………………… 38
2.2.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA…………………………. 39
2.2.8. Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp vào Agrobacterium tumefaciens bằng
phương pháp xung điện……………………………………………………………… 39
2.2.9. Phương pháp chuyển gen vào tảo C. reinhardtii nhờ A. Tumefaciens………... 41
2.2.10. Phương pháp đếm tế bào…………………………………………………….. 42
2.2.11. Phương pháp kiểm tra biểu hiện gen GUS bằng nhuộm hoá mô tế bào…….

42

2.2.12. Phương pháp tách ADN tổng số của tảo…………………………………….. 42
2.2.13. Phương pháp tách protein tổng số từ tảo…………………………………….

43

2.2.14. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide………………………. 43
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………………………………...

45

3.1. Khuếch đại đoạn gen mã hoá kháng thể tái tổ hợp từ vector
pStrepHis1525/antiHER2 ...………………………………………………………...

CNSHK810

45


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng
nguyên HER2………………………………………………………………………... 51
3.3. Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp vào vi khuẩn A. tumefaciens…………... 58
3.4. Chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardtii……………………...

60

3.4.1. Phương pháp và điều kiện chuyển gen vào tảo C. reinhardtii thông qua A.
tumefaciens…………………………………………………………………………..

60

3.4. 2. Kiểm tra sự chuyển gen antiHER2 vào tảo C. reinhardtii bằng phản ứng
PCR…………………………………………………………………………….......... 63
3.5. Kiểm tra sự biểu hiện gen GUS…………………………………………………

66

3.6. Kiểm tra sự biểu hiện của gen antiHER2 trong tảo C. reinhardtii……………...

68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………………..

71

Kết luận……………………………………………………………………………… 71
Kiến nghị…………………………………………………………………………….. 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 73
PHỤ LỤC…………………………………………………………………………………...

CNSHK810

80


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. tumefaciens
DNA
RNA
AS
bp
BRCA

C. reinhardtii
CBB
CBD
CTAB
ddNTP
dNTP
E. coli
EDTA
EGFR
ER
EtBr
Fab
Fc
Fv
GF
GUS
HER2
Ig
Kb
kDa
LB
MAbs
MAPK
mARN

Agrobacterium tumefaciens
Deoxyribonucleic Acid
Ribonucleic Acid
Acetosyringone
Base pair

Breast cancer = ung thư vú
Chlamydomonas reinhardtii
Coomasie Brilliant Blue
Chitin Binding Domain
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
Dideoxyonucleotit triphosphat
Deoxyonucleotit triphosphat
Escherichia coli
Ethylenediaminetetraacetic acid
Epidermal Growth Factor Receptor = Thụ thể các yếu tố
tăng trưởng biểu bì
Estrogen
Ethidium bromide
Fragment antigen binding
Fragment cristallisable
Fragment constant
Growth Factor
β-glucuronidase
Human Epidermal Growth Factor Receptor
Immunoglobulin
Kilobases
kiloDaltons
Left Border
Monoclonal antibody = Kháng thể đơn dòng
Mitogen-activated protein kinases
Messenger acid ribonucleic

CNSHK810

TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

Nos
NPTII
PCR
PI3K
PR
RB
scFv
SDS
SDS-Page
Taq
T-DNA
TAE
TAP
TE
Ti-plasmid
TNM
UTV
v/ph
VH
Vir
VL
X- Glu

Nospaline synthease
Neomycin phosphotransferase gene
Polymerase chain reaction
Phosphoinositide 3-kinases
Progesterone receptor

Right border
single chain Fv
Sodium Dodecyl Sulphate
SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis
Thermus aquaticus polymerase
Transfer- DNA
Tris acid acetic EDTA
Tris-Acetate-Phosphate
Tris- EDTA
Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u
Tumor- nodes - metastasis
Ung thư vú
Vòng/phút
Variable region of heavy chain = vùng biến đổi của chuỗi
nặng
Virulence region = vùng gây độc
Variable region of light chain = vùng biến đổi của chuỗi
nhẹ
5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Một số mảnh kháng thể đơn chuỗi

16

3.1

Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen AntiHER 2

47

3.2

3.3

3.4
3.5

Thành phần phản ứng cắt plasmid pBI101 và pJet1.2 mang
gen antiHER2 bằng BamH I và Sac I
Thành phần phản ứng ghép nối giữa gen antiHER2 vào
pBI101
Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại đoạn AntiHER2 từ
ADN tổng số của tảo C. reinhardtii
Tỷ lệ chuyển gen GUS

53

55

64
67

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên Hình

Trang

1.1

Các dạng ung thư vú

5

1.2

Cấu trúc của protein HER2

10

1.3

Cơ chế gây ung thư do biểu hiện quá mức HER2

12

1.4

Sơ đồ cấu tạo của kháng thể

14

1.5

Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi

16

1.6

Cấu tạo tế bào tảo Chlamydomonas reinhardtii

24

1.7

Vòng đời của Chlamydomonas

25

3.1

Cấu trúc kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu HER2

46

3.2

Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi AntiHER2F /AntiHER2R

48

3.3

Sơ đồ vector PJET1.2/blunt

48

3.4

Vi khuẩn E. coli mang vector tái tổ hợp mọc trên môi trường có

49

chứa Amppicllin sau 15 giờ nuôi cấy ở 370C
3.5

Sản phẩm cắt pJet1.2 tái tổ hợp bằng Enzyme giới hạn BamH I,

50

Sac I
3.6

Đoạn T- DNA của vector chuyển gen pBI101

52

3.7

Sản phẩm cắt loại bỏ gen GUS của pBI101 bằng 2 enzyme

54

BamH I, Sac I
3.8

Kết quả tách plasmid từ E. coli TG1 đã biến nạp pBI101 tái tổ hợp

55

3.9

Kết quả sản phẩm PCR từ plasmid tách từ khuẩn lạc E. coli TG1

56

sau biến nạp
3.10

Một đoạn Chromatograph của gen antiHER2

57

3.11

Kết quả biến nạp vector pBI101 tái tổ hợp vào A. tumefaciens

59

sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC
3.12

Kết quả sản phẩm PCR từ khuẩn lạc A. tumefaciens biến nạp

59

3.13

Hình thái tế bào tảo C. reinhardtii trên môi trường TAP sau 7

61

ngày nuôi cấy.

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

3.14

Tảo C. reinhardtii chuyển gen sau 2 tuần nuôi cấy trên môi

63

trường TAP
3.15

Kết quả tách ADN tổng số của tảo C. reinhardtii chuyển gen

63

3.16

Kết quả sản phẩm PCR từ ADN tổng số tảo C. reinhardtii

65

chuyển gen
3.17

Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen GUS trong tảo C. reinhardtii

67

chuyển gen
3.18

Kết quả điện di kiểm tra protein tổng số của tảo C. reinhardtii

CNSHK810

68


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghiệp, đời
sống vật chất của con người ngày một nâng cao, nhưng mặt trái của sự phát triển
đó là tạo ra hàng loạt các yếu tố gây ô nhiễm môi trường như hoá chất, phóng xạ
là những nhân tố đầy rủi ro có thể gây ung thư - căn bệnh hiểm nghèo và là nỗi
hoang mang của toàn nhân loại. Ước tính, năm 2010, Việt Nam có ít nhất
126.300 ca ung thư mắc mới trong đó, ung thư vú, dạ dày, phổi, đại trực tràng
vẫn gặp nhiều nhất [71].
Ung thư vú là loại ung thư thường thấy ở phụ nữ, chiếm 25% tỷ lệ tử vong do
ung thư ở các nước phát triển. Theo tổ chức y tế thế giới WHO, năm 2004, ước
tính có khoảng 1,2 triệu người trên toàn thế giới bị ung thư vú. Trên toàn thế
giới, tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư vú gia tăng đều đặn hằng năm, ung thư vú ở
phụ nữ được xếp vào hạng nguy cơ hàng đầu, nguyên nhân gây tử vong thứ hai
sau ung thư phổi. Nếu không được điều trị, dạng ung thư này nhanh chóng gây
nguy hiểm tới tính mạng, nhưng có phản ứng tốt nếu được điều trị sớm [52,59].
Liệu pháp kháng thể đơn dòng đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu
và đã tìm ra nhiều kháng nguyên đích để điều trị bệnh ung thư. Đối với mỗi dạng
ung thư có một vài kháng nguyên đặc trưng cho từng loại, với ung thư vú đó là
kháng nguyên HER2. Protein HER2 được mã hoá bởi gen HER2 (Human
Epidermal Growth Factor), thuộc họ các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu
bì. Khi biểu hiện quá mức thụ thể HER2 sẽ làm tế bào phân chia không thể kiểm
soát dẫn đến ung thư. Sự biểu hiện quá mức của HER2 được xác định trong 25 35% bệnh nhân ung thư vú và một số bệnh ung thư khác như ung thư buồng

trứng, ung thư tử cung... Vì vậy, trên thế giới rất nhiều nhà khoa học đã nghiên
cứu để sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp tạo ra các kháng thể đơn dòng tái tổ
hợp đặc hiệu với HER2 giúp cho sự chẩn đoán và mang lại hiệu quả cao hơn
trong điều trị ung thư vú [52,59].
Tuy nhiên, sau khi có được gen tái tổ hợp thì việc biểu hiện để thu nhận và
tinh sạch các kháng thể tái tổ hợp này là một vấn đề nan giải. Hiện nay, có rất
nhiều hệ biểu hiện được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm cả

1

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

prokaryote và eukaryote. Trong những năm gần đây, khả năng chuyển gen vào
tảo để sản xuất kháng thể tái tổ hợp, vaccin, protein diệt sâu hay sản xuất hydro
sinh học đã được chứng minh. Tảo lục đơn bào Chlamydomonas reinhardtii được
biết đến là một hệ thống biểu hiện có khả năng sản xuất các phân tử protein hiệu
quả với chi phí thấp, tốc độ phát triển nhanh, có khả năng lắp ráp các phân tử
phức tạp để hình thành phân tử hoạt tính, rất an toàn và khả năng tinh sạch
protein tái tổ hợp đơn giản [14,47]. Vì vậy, tảo này được xem là tế bào chủ có
tiềm năng rất lớn cho việc sản xuất các protein thuốc cho điều trị bệnh trong đó
có kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2.
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu
kháng nguyên ung thư vú HER2 trong tảo Chlamydomonas reinhardtii”
Mục tiêu của đề tài:
- Thiết kế được vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu
kháng nguyên HER2.

- Nghiên cứu chuyển gen kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 vào trong
tảo Chlamydomonas reinhardtii.
- Nghiên cứu khả năng biểu hiện của kháng thể trong tảo Chlamydomonas
reinhardtii.

2

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư vú
1.1.1. Khái niệm ung thư vú (UTV)
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh
ung thư tế bào tăng sinh một cách vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo các cơ
chế phát triển bình thường. Ða số bệnh ung thư sẽ hình thành nên các khối u.
Khác với các khối u lành tính chỉ phát triển tại chỗ, có vỏ bọc xung quanh và
thường rất chậm, các khối u ác tính (ung thư) có xu hướng xâm lấn sang các tố
chức lành tính xung quanh. Hiện nay, có trên 200 loại ung thư khác nhau đã được
phát hiện [3].
Ung thư vú là bệnh ung thư bắt nguồn từ mô vú. Nguyên nhân chủ yếu của
bệnh UTV là do sự phát triển bất thường của các tế bào kiến tạo nên các thành
phần của vú, cụ thể như do sự bất thường bắt nguồn từ ống tuyến được gọi là ung
thư ống tuyến (ductual carcinomas), hay sự phát triển bất thường của các tiểu
thuỳ dẫn đến ung thư tiểu thuỳ (lobular carcinomas) [65]. Có nhiều loại ung thư
vú khác nhau với mức độ lan truyền, mức độ xâm lấn và mức độ tác động đến
gen khác nhau và mỗi loại ung thư lại có mức độ lành tính, ác tính khác nhau.
Tuy nhiên, có 1 điểm chung là UTV nếu không được chẩn đoán sớm và chữa trị

kịp thời, các tế bào ung thư sẽ phát triển nhanh chóng trong vú, đi vào các mạch
máu hay mạch bạch huyết, chạy tới các hạch, có thể xâm lấn sang các bộ phận
khác, gây ra đau đớn cho bệnh nhân và cuối cùng sẽ dẫn đến tử vong [3,31].
1.1.2. Phân loại
UTV có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau phụ thuộc vào các giai
đoạn phát triển, bệnh học, mức độ bệnh, thụ thể, sự có mặt hay vắng mặt của các
gen đặc trưng cho bệnh.
- Theo giai đoạn phát triển (TNM): Là phương pháp phân loại UTV dựa
vào kích thước của khối u (T), khối u dù có hay không lan sang u hạch (N) ở
nách, và khối u đã di căn (M) hay lây lan sang các phần khác của cơ thể. Các giai
đoạn chính:

3

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

Giai đoạn Tis là ung thư biểu mô tại chỗ, giai đoạn tiền ác tính, có biểu hiện.
Giai đoạn từ 1-3 là giai đoạn ung thư sớm và có khả năng chữa khỏi được.
Giai đoạn 4 là giai đoạn ung thư di căn và không có khả năng chữa khỏi [65].
- Theo bệnh học: Theo phương pháp này UTV được chia thành 2 dạng chính
là ung thư biểu mô ống dẫn hay tiểu thùy. Ung thư ở các mô khác được xem như
là loại ung thư hiếm gặp [65].
Ung thư biểu mô tại chỗ (Carcinoma in situ): Các tế bào ung thư trong biểu
mô tăng sinh nhanh chóng, không xâm lấn sang các mô xung quanh.
Ung thư xâm lấn (Invasive carcinoma) thì có sự xâm lấn sang các mô xung
quanh.
- Theo cấp độ bệnh: Các tế bào bình thường qua quá trình biệt hóa sẽ hình

thành nên các cơ quan khác nhau trong cơ thể với các chức năng riêng biệt. Với
các tế bào ung thư, do mất đi sự phân hoá, tế bào trở nên hỗn độn, mất trật tự, các
tế bào sẽ phân chia không kiểm soát được. Các nhà nghiên cứu bệnh học cho
rằng các tế bào có sự phân hoá tốt (giai đoạn thấp), mức phân hoá ở mức độ vừa
phải (giai đoạn trung bình), và mức phân hoá kém (giai đoạn cao). Các trường
hợp ung thư ở mức độ phân hoá kém thì được chẩn đoán là bệnh rất nặng [65].
- Theo tình trạng thụ thể: Mỗi tế bào đều có các thụ thể đặc trưng trên bề
mặt tế bào, trong tế bào chất và nhân. Với các tế bào UTV, 3 loại thụ thể đặc
trưng là thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và HER2/neu. Tùy
thuộc vào sự có mặt hay không của các loại thụ thể này các nhà khoa học đã chia
UTV thành các dạng dương tính ER (ER+), âm tính ER (ER-), PR+, PR-,
HER2+, HER2-. Các tế bào mà không có các thụ thể này thì được gọi là dạng cơ
bản hay âm tính với cả ba thụ thể. Căn cứ vào tình trạng thụ thể có thể chẩn đoán
loại ung thư vú và xác địch chính xác mục tiêu điều trị [17,58,65].
Như vậy, UTV rất đa dạng về cả khía cạnh triệu chứng lâm sàng, tác nhân
gây bệnh và đặc điểm hình ảnh. Hiện nay có nhiều hệ thống phân loại UTV,
trong đó hệ thống phân loại phổ biến hiện nay là hệ thống phân loại của Tổ chức
Y tế thế giới WHO. Hệ thống này phân loại UTV thành 4 kiểu chính [63].

4

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

- Ung thư không xâm lấn (tại chỗ) :

ung thư ống tuyến tại chỗ
ung thư tiểu thùy tại chỗ

- Ung thư xâm nhiễm:

ung thư ống tuyến xâm nhiễm
ung thư tiểu thùy xâm nhiễm

- Ung thư viêm nhiễm
- Bệnh paget núm vú .
Các dạng ung thư vú được thể hiện ở Hình 1.1.

I

II

III

IV

Hình 1.1. Các dạng ung thư vú
I-ung thư ống tuyến tại chỗ; II- ung thư tiểu thùy tại chỗ; III- ung thư ống tuyến
thâm nhiễm; IV- ung thư tiểu thùy thâm nhiễm. Trong đó: ở hình ảnh tuyến vú: A: ống
tuyến; B: tiểu thuỳ; C: vùng giãn nở của ống tuyến để giữ sữa; D: núm vú; E: mô mỡ;
F: cơ ngực; G: thành ngực, ở hình phóng to: A: tế bào ống/tiểu thuỳ bình thường; B: tế
bào ống/tiểu thuỳ ung thư; C: màng rìa; D: lõi ống.

5

CNSHK810

TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

1.1.3 . Nguyên nhân gây UTV
Có rất nhiều nguyên nhân gây nên UTV tiêu biểu như giới tính, tuổi tác, mức
độ hormone. Trong một nghiên cứu công bố năm 1995, những nguyên nhân nêu
trên chiếm khoảng 47% trong tổng số các ca UTV, chỉ 5% là do yếu tố di truyền
[65].
Tuổi tác và tiền sử sinh sản
- Tiền sử bệnh nhân: Những phụ nữ đã bị ung thư vú ở 1 bên thì nguy cơ mắc
bệnh ở bên vú còn lại sẽ cao hơn [65].
- Tiền sử gia đình: nếu trong gia đình có mẹ, chị hay em gái bị ung thư vú thì
nguy cơ bị bệnh ung thư vú của họ là rất cao. Các nguy cơ sẽ cao hơn nếu các
thành viên của gia đình bị ung thư vú trước 40 tuổi [65].
- Tuổi tác: Tuổi càng cao thì nguy cơ UTV càng cao. Phần lớn phụ nữ da
trắng mắc bệnh UTV ở tuổi 50 đến 60. Tuổi dậy thì, tuổi mãn kinh và tiền sử
mang thai là những yếu tố liên quan chặt chẽ với UTV. Người ta đã chứng minh
rằng ở những phụ nữ có kinh lần đầu sớm thì thường có hàm lượng estradiol cao
hơn so với phụ nữ bình thường, hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá
trình phát triển UTV. Mãn kinh muộn sau tuổi 55 và mãn kinh muộn một năm tỉ
lệ UTV tăng 3 %. Phụ nữ chưa mang thai có nguy cơ mắc UTV cao gấp 1,4 lần
so với phụ nữ có mang thai. Phụ nữ sinh con lần đầu càng sớm thì nguy cơ mắc
UTV càng thấp và tỉ lệ này tăng 3% cho mỗi năm chậm sinh con lần đầu. Sinh
con sau 30 tuổi có nguy cơ bị UTV cao gấp từ 2 - 5 lần so với nhóm sinh con
trước tuổi 19 [23,37,43].
Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thai trong
thời gian dài với UTV. Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy cơ mắc UTV
tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng đến 4,1 lần. Những cuộc
nghiên cứu mới nhất cho thấy phụ nữ dùng các loại thuốc như Prempro, Provera
hay Premarin sau khi tắt kinh có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTV [37,43].

6

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

Yếu tố di truyền
Đột biến ở một số gen có thể làm cho tế bào bình thường chuyển thành dạng ác
tính. Năm 1994, người ta tìm thấy sự liên quan giữa đột biến gen ức chế khối u
BRCA-1 và BRCA-2 nằm trên nhiễm sắc thể 17 và 13 với bệnh UTV, ung thư
buồng trứng và một số loại ung thư khác. Do nằm trên nhiễm sắc thể thường, các
gen này có thể di truyền từ bố hoặc mẹ (xác suất là 1/2). Những phụ nữ mang các
gen này có nguy cơ bị UTV cao. Nếu nguyên nhân do những rủi ro trong cuộc
sống thì khả năng ung thư vú là 12% thì phụ nữ có 1 trong những gen này thì có
nguy cơ bị khoảng 60%. Khoảng 5% các trường hợp UTV có đột biến gen BRCA1 và thường bị bệnh khi còn trẻ. Đột biến gen BRCA-2 cũng có nguy cơ gây UTV
ở nữ tương đương với nguy cơ đột biến gen BRCA-1 [23,37,43].
Đột biến gen p53 và một số gen khác cũng liên quan với nguy cơ UTV.
Những hội chứng do các rối loạn về di truyền như hội chứng Li-Fraumeni, hội
chứng Cowden, hội chứng Muir, giãn mạch thất điều cơ cũng có thể làm xuất
hiện UTV. Những nghiên cứu gần đây cho thấy có khoảng 10% UTV do di
truyền [23].
Các yếu tố dinh dưỡng và môi trường
Chế độ và thói quen ăn uống ăn thức ăn giàu chất béo, sử dụng rượu bia,
thuốc lá, phóng xạ có ảnh hưởng tới khả năng mắc UTV. Một số loại thực phẩm,
thuốc reserpin, cafein, thuốc xịt tóc, sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hóa từ nguồn
tự nhiên hay nhân tạo sẽ làm tăng nguy cơ phát triển UTV. Nhiều nghiên cứu gần
đây cũng cho thấy các hợp chất hữu cơ chứa Clo như PCBs (polychlorinated
biphenyls) cũng làm tăng nguy cơ mắc UTV [9,43].
Ngoài ra, còn một số yếu tố rủi ro khác như vấn đề liên quan đến chủng tộc

như phụ nữ da trắng thì mắc ung thư vú nhiều hơn là phụ nữ Châu Á, Châu phi,
Châu Mỹ La tinh [65].

7

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

1.1.4 . Các phương pháp điều trị ung thư vú
Các phương pháp truyền thống: bao gồm phương pháp phẫu thuật, hóa trị
và xạ trị. Trong điều trị ung thư vú chúng ta nên kết hợp các phương pháp trên
thì mới đạt hiệu quả tốt. Việc lựa chọn phương pháp điều trị cần dựa vào mức độ
xâm lấn theo sự chẩn đoán và khả năng tái phát lại bệnh. Ung thư giai đoạn 1
được điều trị với phương pháp phẫu thuật cắt khối u kết hợp hoặc không kết hợp
với chiếu phóng xạ. Ung thư giai đoạn 2 và 3 với tiên lượng xấu và rủi ro bị tái
phát bệnh cao thì phải điều trị bằng cách phẫu thuật (phẫu thuật cắt khối u hay
cắt toàn bộ vú có hoặc không kết hợp với việc cắt cả u hạch), phóng xạ, và hoá trị
liệu. Nếu ở giai đoạn 4, ung thư đã di căn thì không có khả năng chữa trị và sẽ
được kiềm chế bằng cách kết hợp của tất cả các cách điều trị trên từ phẫu thuật,
phóng xạ, hoá trị và các liệu pháp mục tiêu. Các cách điều trị này sẽ làm kéo dài
thời gian sống của bệnh nhân ung thư giai đoạn 4 lên khoảng 6 tháng [35,50,65].
Các phương pháp hiện đại: hiện nay, trong điều trị ung thư vú liệu pháp
ngăn cản hormone và sử dụng kháng thể đơn dòng đang được chú ý.
- Liệu pháp ngăn cản hormone: một số loại ung thư vú yêu cầu cần phải có
estrogen để có thể tiếp tục phát triển. Chúng có thể được nhận diện bằng cách xác
định sự có mặt của thụ thể estrogen (ER+) và thụ thể progesterone (PR+) trên bề
mặt của chúng. Loại ung thư vú này có thể điều trị bằng thuốc ngăn cản quá trình
tạo ra estrogen hay ngăn cản các thụ thể như loại thuốc tamoxifen hay loại ức chế

aromatase [65].
- Kháng thể đơn dòng: Đây là phương pháp khá phát triển trong việc điều trị
ung thư vú do HER2+. Trastuzumab (Herceptin), một loại kháng thể đơn dòng
của HER2 đã được sử dụng rất hiệu quả và rộng rãi trong điều trị UTV dương
tính HER2. Tuy nhiên giá cả các loại kháng thể đơn dòng này rất cao vì vậy các
kháng thể đơn dòng khác cũng đang được nghiên cứu và thử nghiệm nhằm nâng
cao hiệu quả và giảm giá thành sản phẩm [35,65].

8

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

1.2. Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú
1.2.1. Cấu trúc của gen HER2
Gen HER2 thuộc họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu bì
HER (Human Epidermal Growth Factor Receptor) được nghiên cứu phát hiện ra
với tên HER-2 và c-erbB-eerG bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985
(Coussens et al., 1985; Semba et al., 1985). Tuy nhiên các nghiên cứu sau đó cho
thấy hai gen này hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọi HER-2/neu
(HER2). Nó còn có các tên gọi khác như v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL. HER2 nằm
ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm động, ở vị trí q11.2 q12.0, HER2 là một gen
tiền ung thư (proto-oncogen) có chiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài
các exon là 4477 bp trong đó exon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều
dài 48 bp, gen này có 3 bản sao tương đồng tương ứng với 3 allele B1( Ile654/Ile655); allele B2 (Ile-654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655). Mặc dù
kích thước gen HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình hiệu chỉnh sau khi
phiên mã tạo ra mRNA trưởng thành với khoảng 1800 bp [18,31,34,53,68].
1.2.2 . Cấu trúc kháng nguyên HER2

HER2 là thành viên của họ thụ thể các yếu tố tăng trưởng biểu bì có hoạt tính
tyrosine kinase (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trên bề mặt tế
bào ở người, nó tương đương với protein neu ở chuột [18,34,68]. Các thành viên
của họ thụ thể này có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản, biệt hóa và phát triển
của tế bào. Thụ thể có hoạt tính tyrosine kinase là các thụ thể nằm trên bề mặt tế
bào có ái lực cao đối với các yếu tố phát triển (GF – Growth Factor) có bản chất
là polypeptide, các cytokine và các hormone. Thụ thể tyrosine kinase có vai trò
điều hòa, giúp cho các quá trình trong tế bào được diễn ra bình thường, ngoài ra
nó còn có vai trò quan trọng trong việc hình thành và phát triển của nhiều dạng
ung thư trong đó có UTV [10,11,12].
Họ các thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô gồm 4 loại thụ thể: HER-1,
HER-2, HER-3 và HER-4. Trong đó được biết đến và được nghiên cứu nhiều

9

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

nhất là HER-2, khối lượng phân tử khoảng 185 kDa (còn được gọi là
p185HER2), cấu trúc không gian của nó gồm 3 phần:
+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể. Nằm ở
vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu tố tăng
trưởng biểu mô.
+ Vùng xuyên màng lipit.
+ Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được phosphoryl
hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc của protein HER2 [46]

Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm
ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2);
(3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine
kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)

Thụ thể HER2 bao gồm phần ngoại bào khoảng 632 amino acid, vùng chuyển
màng đơn chuỗi dài 22 amino acid và vùng tyrosine kinase nội bào được gồm
580 amino acid. Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I bao
gồm các gốc amino acid từ vị trí số 1 đến vị trí 195 (SEQ1); tiểu vùng II từ 196 319 (SEQ2); tiểu vùng III từ 320 - 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489 -630

10

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

(SEQ4). Thụ thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt. Sự hoạt
hóa thụ thể xảy ra khi có ligand bám vào và làm hoạt hóa một dãy các quá trình
dẫn đến sự nhị hợp (dimer) giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian cho các
quá trình sinh học như sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào [10,15,16].
1.2.3 . Cơ chế hoạt động của thụ thể HER2
HER2 là một thụ thể không cần liên kết phối tử, có thể biểu hiện trong nhiều
loại mô của con người và biểu hiện quá mức trong 25-35% các ca ung thư vú.
Thụ thể HER2 không cần có các chất liên kết để hoạt hóa mà cấu trúc của nó
luôn luôn trong trạng thái “mở”, bắt chước trạng thái liên kết với ligand, làm cho
nó có khả năng bắt cặp hình thành trạng thái dimer với bản thân nó hoặc với các
thành viên khác trong họ như HER1, HER3, HER4 ở trạng thái đã liên kết với
ligand để hoạt động. Quá trình nhị hợp vùng ngoại bào làm hoạt hoá vùng xuyên
màng của thụ thể, dẫn đến sự tự phosphoryl hóa hàng loạt gốc Tyrosine của vùng

nội bào. Các gốc đã được phosphoryl hoá đó hoạt động như một trung tâm liên
kết của protein có chứa Src homology 2 (SH2) hoặc vùng liên kết
phosphotyrosine (PTB). Nó còn gồm có các protein liên kết như Shc, Crk, Grb2,
Grb7, kinase như phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein phosphatase
tyrosine SHP1 và SHP2 và yếu tố trao đổi nucleotide guanidin như SOS. Mỗi thụ
thể đều có một vùng liên kết riêng khác biệt, qua đó sẽ hình thành các phức hệ
protein nối khi có sự phosphoryl hóa. Điều này dẫn đến hàng loạt các con đường
mà chúng kích hoạt. Hai con đường quan trọng nhất được hoạt hoá bởi sự nhị
phân trong họ HER là PI3K/Akt kích hoạt cho các tế bào khối u sống sót và con
đường hoạt hoá MAPK (mitogen – Activated protein kinase) kích thích quá trình
biệt hoá tế bào. Cả hai con đường này đều dẫn truyền tín hiệu đến đích cuối cùng
là nhân và kích hoạt sự hoạt động của gen đích [10,11,18,34,53].
1.3 . Ung thư vú dương tính HER2
Sự biểu hiện quá mức của HER2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữa HER2
với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3). Đó cũng là những tín hiệu khởi

11

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau. Tuy nhiên mối liên quan giữa
các con đường đó là rất khó để có thể xác định. Dưới đây là một đề xuất của
Moasser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của HER2 (Hình
1.3).

Hình 1.3. Cơ chế gây ung thư do biểu hiện quá mức HER2

Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa. Tăng
dimer HER2-EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào. Sự tăng dimer
hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào. Sự tăng dimer HER2HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng
trao đổi chất của tế bào. Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 làm tăng isoform
hiếm ∆HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu. Một vài yếu tố phiên mã
được cảm ứng trong những tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết quả của
những sự thay đổi biểu hiện gen ở mức dư thừa [52].

12

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

Feldman và cs đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu của những thụ
thể hoạt động này. Ở trạng thái hoạt động nó kích thích con đường truyền tín hiệu
phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc gắn tiểu phần p85 vào Akt,
dẫn tới hoạt hóa Akt. Akt làm bất hoạt các phân tử tiền apoptosis bao gồm Bad,
caspase-9, và p53. Thêm vào đó, dưới tác động của Akt, các hoạt động chuyển
hóa glucose, các kênh vận chuyển glucose (GLUT) (nhờ sự phosphoryl GSK3)
và sự tổng hợp protein, chu trình phát triển của tế bào (thông qua sự phosphoryl
hóa của protein p90RSK, p70S6K, mTOR) đều tăng lên là những nhân tố ngăn
chặn quá trình apoptosis. Hơn thế nữa, sự hoạt hóa các yếu tố phiên mã κB
(nuclear factor κB) còn kích ứng sự biểu hiện của các gen anti-apoptosis thông
qua các protein c-IAP1-2, TRAP 1-2, và A1/Bfl-1. Kết quả của sự tăng sinh này
cũng là một trong những nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành ung thư
[52,59].
Vùng thiết yếu của HER2 trong hệ thống truyền tín hiệu đã được nghiên cứu tạo
ra các kháng thể đơn dòng (MAbs) kháng lại HER2 cho liệu pháp điều trị ung

thư. Đặc biệt là kháng thể đơn dòng trastuzumab (Herceptin) có hoạt tính kháng
lại khối u chống lại sự biểu hiện quá mức HER2 và được sử dụng rộng rãi trong
điều trị [63].
1.4. Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2
1.4.1 Khái niệm
Kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào
lympho B, các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn
dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus.
Các kháng thể có cấu tạo hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân”.
Các đầu của Y (Fab) được gọi là các vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các
vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là một
vùng hằng định. Kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi
nhẹ. Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được nối với nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi

13

CNSHK810


TrÇn ThÞ HuyÒn Trang

nặng được nối với nhau bởi 2 cầu disulfide. Kiểu của chuỗi nặng quyết định phụ
dạng của Ig (IgA, IgD, IgG, IgM và IgE). Mỗi chuỗi có vùng biến đổi và vùng
hằng định (vùng không biến đổi). Vùng biến đổi nằm ở đầu amino (NH2-) của
chuỗi polypeptide (các amino axit từ 1-110) (Hình 1.4) [4,55].

VH

H2N

H2N

Vùng gắn kết với kháng nguyên

Chuỗi nặng

CH 1

VL

Chuỗi nhẹ

CL
κ hoặc λ

CH 2

Hoạt hoá bổ thể

CH 3
µ, γ, δ, α hoặc ε

Gắn đại thực bào
COO-

COO-

Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo của kháng thể

Kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là thuật ngữ chỉ các kháng thể thu nhận được từ một tập
hợp các kháng thể đồng nhất với nhau về bản chất, nghĩa là kháng thể đơn dòng
là tập hợp các kháng thể đồng nhất cùng nhận biết và gắn kết với một epitope.
Ngược lại, các kháng thể đa dòng là tập hợp nhiều loại kháng thể không đồng
nhất và nhận biết các epitope khác nhau [4].
Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể
Trong cấu tạo của bất kỳ một kháng thể tự nhiên nào đều có 4 vùng biến đổi
(V - Variable) ở đầu tận hai "cánh tay" của chữ Y. Sự kết hợp giữa 1 vùng biến
thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí
nhận diện kháng nguyên (paratope). Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí
gắn kháng nguyên. Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có
thể gắn được với 2 kháng nguyên giống nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi

14

CNSHK810