Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và tách chiết kháng sinh dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn streptomyces KCTC 0041BP

MỞ ĐẦU
Từ xa xưa người ta biết sử dụng nấm để chữa trị các chứng viêm, chữa trị vết
thương bằng cách áp rêu lên vết thương cho chóng khỏi, thậm chí ngay cả những
mẩu bánh mỳ mốc cũng được sử dụng để chữa trị vết thương nhưng đó là chuyện
xảy ra trước khi Alexander Flemming phát hiện ra tác dụng của kháng sinh.
Nhà vi khuẩn học người Anh - Alexander Flemming cùng với Howara
Walter Florey và Ernst Boris Chaen đã mở ra kỷ nguyên mới cho ngành y học Công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng trong điều trị bệnh - nhờ phát hiện ra
penicillin. Tuy nhiên cho đến khi chiết được penicillin tinh khiết thì nó mới được
thử nghiệm trên người. Đến năm 1941, penicillin được lên men trên quy mô công
nghiệp để phục vụ và điều trị cho thương binh trong chiến tranh.
Ngày nay con người đã phát hiện ra hơn 10000 chất kháng sinh nhưng chỉ có
khoảng hơn 50 loại là được sử dụng rộng rãi.
Hiện nay, do tình trạng lạm dụng kháng sinh cùng nhiều nguyên nhân khác
đã dẫn tới nguy cơ vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng. Vì vậy, đi kèm với các
biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý thì việc nghiên cứu sản xuất ra kháng
sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt thực sự rất cần thiết. Cùng với việc tạo ra kháng
sinh bằng con đường tổng hợp hoặc bán tổng hợp thì việc tìm ra kháng sinh có
nguồn gốc vi sinh vật vẫn giữ một vị trí quan trọng.
Chi Streptomyces gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
đa dạng về cấu trúc, đặc điểm kháng khuẩn. Một số loài còn có khả năng kháng tế
bào ung thư và HIV. Bởi vậy mà hiện nay, không chỉ ở Việt Nam mà các nước trên
thế giới đang phân lập và nghiên cứu rộng rãi đặc biệt phù hợp với định hướng phát
triển công nghiệp dược của nước ta.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng
sinh tổng hợp và tách chiết kháng sinh Dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. KCTC0041BP”.

1


Mục tiêu nghiên cứu là:

1. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp. KCTC0041BP.
2. Nghiên cứu tách chiết và thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí
nghiệm.
Nội dung nghiên cứu:
1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
KCTC0041BP.
2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh
kháng sinh.
3. Nghiên cứu quy trình lên men và quy trình thu nhận kháng sinh thô.
4. Nghiên cứu phân tích sản phẩm kháng sinh.
Những điểm mới của luận văn:
+ Đây là nghiên cứu đầu tiên về sinh tổng hợp Dihydrochalcomycin từ xạ
khuẩn ở Việt Nam.
+ Bước đầu nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khảo sát khả năng sinh kháng
sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041BP và từ đó xây dựng được
quy trình thu nhận kháng sinh thô Dihydrochalcomycin.

2


Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1. KHÁNG SINH
1.1.1. Khái niệm về kháng sinh
Theo Waksman (1942), kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên
được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối
với các vi sinh vật khác.
Tuy nhiên ngày nay để khái quát thuật ngữ này, người ta định nghĩa kháng
sinh là các hợp chất nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu
diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác

dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung (Cao
Văn Thu, 2000).
Nồng độ thấp nhất của một chất kháng sinh (CKS) có khả năng ức chế hoàn
toàn sự sinh trưởng của một hoặc một vài chủng vi sinh vật xác định, được gọi là
nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC). Chất kháng
sinh có giá trị nồng độ ức chế tối thiểu với vi sinh vật nào mà thấp thì có hoạt tính
kháng sinh cao đối với vi sinh vật ấy (Hopwood, 2007).
Các chất kháng sinh có phổ tác dụng khác nhau, ví dụ: cloramphenicol và
các tetracyclin có tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nên được xếp vào loại
kháng sinh có phổ tác dụng rộng, một số kháng sinh khác chỉ có tác dụng trên một
hoặc một số loại vi khuẩn nên được xếp vào loại có phổ tác dụng hẹp. Có chất
kháng sinh chỉ ức chế vi khuẩn Gram (+), có loại chỉ ức chế vi khuẩn Gram (-), có
loại ức chế cả nấm men, nấm mốc nên phổ kháng khuẩn của chúng rộng hẹp khác
nhau. Phổ kháng khuẩn cũng được xem như là một chỉ tiêu để phân loại chất kháng
sinh (Hopwood, 2007).
Độ lớn giá trị hoạt tính kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1
mg chế phẩm (đơn vị/mg) thường được thể hiện bằng đơn vị kháng sinh. Đơn vị
kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi trường xác
3


định (µg/ml), có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định, trong thời gian
xác định. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI
streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các chất
kháng sinh do việc tìm ra các chất kháng sinh ngày càng nhiều. Nhờ đó tiết kiệm
thời gian khi nghiên cứu các chất kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác
dụng và khả năng ứng dụng trong chữa bệnh. Có thể phân loại kháng sinh dựa trên
nhiều phương diện như phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh

tổng hợp hay cấu trúc hóa học. Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là
phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm
kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính (Cao Văn
Thu, 2000):
1) Các kháng sinh cacbonhydrat
2) Các lacton macrocyclic
3) Các kháng sinh quinon và dẫn xuất
4) Các kháng sinh peptid và axit amin
5) Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
6) Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
7) Các kháng sinh mạch vòng no
8) Các kháng sinh chứa nhân thơm
9) Các kháng sinh mạch thẳng

4


1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh ức chế khả năng sinh trưởng của vi sinh vật qua việc ức chế
các phản ứng sinh tổng hợp hoặc con đường trao đổi chất của tế bào vi sinh vật gây
bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh
vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất.
Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong
nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng
khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: thành tế bào, màng nguyên sinh chất,
tổng hợp gen (sao chép và dịch mã ADN), tổng hợp protein phiên mã mARN, trao
đổi chất hô hấp và trao đổi chất trung gian (Kiều Hữu Ảnh, 2007).
Bảng 1.1: Cơ chế tác dụng của một số kháng sinh
Mức tác dụng

Ví dụ kháng sinh

1) Ức chế sự tổng hợp thành tế bào
- Transpeptid hóa

β-lactam (penicillin)

- Tổng hợp murein

Vancomycin, phosphomycin

2) Ức chế quá trình trao đổi chất của màng tế bào
- Thay đổi cấu trúc

Polymicin, amphotericin

- Thay đổi chức năng

Gramicidin, sideromycin

3) Ức chế sự tổng hợp ADN
- Phân chia

Actinomycin, antracyclin

- Dịch mã

Anzamycin (rifamicin)

4) Ức chế sự tổng hợp protein
- Ribosome

Aminoglycosid

- Liên kết t-RNA

Erythromycin, chlorocid

- Kéo dài

Tetracyclin, axit fuzidic

5) Ức chế quá trình trao đổi chất hô hấp

Antimycin, oligomycin

6) Ức chế quá trình trao đổi chất folat

Sulfamid

5


1.1.4. Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh
1.1.4.1. Trên thế giới
Năm 1999 kháng sinh liposomal HA-1-92 ra đời, được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces CDRIL - 312; tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối
với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây
bệnh mạnh (Jyoti Harindran và cs, 1999).

Năm 2002 tại Ấn Độ các nhà khoa học đã phân lập được chủng Streptomyces
sp. 201 có khả năng sinh chất kháng sinh mới là z - methylheptyl isonicotinate, chất
kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium
oxysporum, Fusarium solani,... (Gojen và cs 2002).
Tại Nhật năm 2003, yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp sắc ký cột. Chất kháng sinh này có
khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất này
còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị MIC là 0,01 - 0,3 mg/ml (Đỗ
Thu Hà, 2004).
Tại Hàn Quốc năm 2007, người ta đã phân lập được loài xạ khuẩn
Streptomyces sp. C684 sinh chất kháng sinh laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả
những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin (Yoo và cs,
2007).
Việc sử dụng chất kháng sinh trong trồng trọt nhằm mục đích như chống
bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng; chống bệnh do vi khuẩn gây ra; diệt
côn trùng và cỏ dại; kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hóa học,
dùng các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy,
có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả
năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học. Chất kháng sinh và dịch lên
men các chất kháng sinh còn dùng xử lý các hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn
bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và
khử trùng đất (Đỗ Thu Hà, 2004).
6


1.1.4.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, năm 1950 trong kháng chiến chống Pháp, giáo sư Đặng Văn
Ngữ đã nuôi cấy Penicillium chrysogenum và dung dịch chiết môi trường nuôi cấy
để điều trị vết thương cho thương binh.
Năm 1968, bộ môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) được

thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp
kháng sinh và năm 1970 đơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh được thành lập.
Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ), Trung
Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh xong
cũng không thành công do nhiều nguyên nhân.
Năm 1985 - 1990 một chương trình nghiên cứu Nhà nước 64C Bộ Y tế
nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh oxytetracyclin và tetracyclin nhưng kết quả đạt
được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất.
Từ năm 2000 đến nay, ở nước ta cũng có một số nhóm đã và đang tham gia
nghiên cứu về kháng sinh và thu được một số kết quả như: nghiên cứu quy trình lên
men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis
4912 (Nguyễn Phương Nhuệ, 2010); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế
Doxorubicin được tạo ra từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung
thư và hệ bạch huyết (Tạ Thị Thu Thủy, 2010)
Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật
nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ
khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn (Lê Như Kiểu và cs,
2008) và Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật (Bùi Việt Hà, 2006). Tuy
nhiên việc sử dụng chất kháng sinh trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở
mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật
nhất định.

7


1.2. XẠ KHUẨN
1.2.1. Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên (Biền Văn Minh, 2000)
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo ra độ
phì nhiêu cho đất, chúng đảm nhiệm nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu
mỡ đất.

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp
chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, chất mùn kitin, keratin. Hầu hết
các xạ khuẩn thuộc giống Actiomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh như:
streptomycin, oramycin, terramycin,… Đây là một đặc điểm rất quan trọng của xạ
khuẩn nên được sử dụng rộng rãi trong y học, thú y và trong bảo vệ thực vật.
Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ
như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số axit hữu cơ như axit lactic,
axit acetic; axit amin như axit glutamic, metionin, tryptophan, lizin.
Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế tạo
các sản phẩm lên men hoặc ứng dụng các men do xạ khuẩn sinh ra nhiều như
proteinase, amylase, cellulase, kitinase,… Một số khác có khả năng tạo thành các
chất kích thích sinh trưởng thực vật.
Tuy nhiên bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các
chất độc kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng cũng như sự phát triển
của hệ vi sinh vật có ích trong đất, một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số
bệnh khó chữa ở người và gia súc. Các bệnh này được gọi tên chung là
Actinomycosis.
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Trước đây vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận
giữa các nhà vi sinh vật học, do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa
giống nấm. Tuy nhiên đến nay xạ khuẩn đã được chứng minh là vi khuẩn.

8


* Khuẩn lạc (Lê Xuân Phƣơng, 2008)
Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, kích thước khuẩn
lạc có thể thay đổi tùy thuộc từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc thường
chắc, xù xì, có dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp: lớp
ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa cấu trúc tổ ong.

Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám,
trắng ,… tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào
điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm,… Đường kính mỗi
khuẩn lạc chỉ chừng 0,52 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm
hoặc lớn hơn.
* Bào tử:
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử với phương pháp phân đoạn
hay cắt khúc, thường có hình trụ, oval, hình cầu, với bề mặt nhẵn, xù xì, có gai,…
(Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002). Nếu môi trường giàu dinh dưỡng thì quá trình hình
thành bào tử bị kìm hãm. Ngoài ra độ ẩm, nhiệt độ cũng ảnh hưởng tới sự hình
thành bào tử (Đỗ Thu Hà, 2004). Hình dạng và kích thước cuống sinh bào tử, bề
mặt bào tử là một tính chất quan trọng trong phân loại xạ khuẩn.
* Khuẩn ty:
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại
cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất) với chức năng chủ
yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt môi trường gọi là hệ sợi khí sinh
(khuẩn ty khí sinh) với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại
chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ
dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1978).

9


Hệ sợi xạ khuẩn giống như hệ sợi của nấm sợi phân nhánh và không có vách
ngăn. Sợi của xạ khuẩn mảnh hơn sợi của nấm mốc (hệ sợi cơ chất: 0,3 - 0,8 µm; hệ
sợi khí sinh: 1,14 µm). Xạ khuẩn phát triển theo phương pháp mọc chồi phân nhánh
(khoảng 30 µm phân một nhánh). Độ dài sợi xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển
khoảng 11 µm/h và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài

của sợi (Waskman, 1961). Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ
khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng
hợp ARN, nhân, các gen cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như
vậy sợi được hình thành và phát triển.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm
trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu
cơ,… có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra
trong môi trường.

(A)

(B)

Hình 1.1. Hình dạng khuẩn lạc (A) và các dạng khuẩn ty của xạ khuẩn (B)
(Nguồn: />
10


1.2.3. Cấu tạo xạ khuẩn
Cấu trúc tế bào xạ khuẩn tương tự vi khuẩn Gr (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một
tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh
chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có tác dụng duy trì hình dạng của tế bào và bảo vệ tế
bào, thường có dạng kết cấu lưới, cấu tạo gồm 3 lớp: lớp ngoài dày 60 - 120 A° khi
già có thể dày 150 A°, lớp giữa rắn chắc dày 50 A°, lớp trong dày khoảng 50 A°.
Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptid gồm các gốc N-acetylglucosid.
Khi xử lý bằng enzym lizozym các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá hủy
(Lê Gia Hy, 1994; Vi Thị Đoan Chính, 2000) .
Căn cứ vào kết cấu hóa học, thành tế bào chia thành 4 nhóm chính (Vi Thị
Đoan Chính, 2000):

Nhóm I: Thành phần chính của tế bào là L - 2,6 diaminopimelie (L - DAP)
và glixin gồm các chi Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia, Nocardioides.
Nhóm II: Thành phần chính của tế bào là mezo - 2,6 diaminopimelie (mezo DAP) và gluxin gồm có các chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella,
Dactylosporangium.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là mezo - DAP gồm các chi
Actinomadura, Actinobifida, Dermatophilus.
Nhóm IV: Có chứa mezo - DAP, arabinoza gồm có các chi: Nocardia,
Overskovia, Sacharomonospora.
Dưới lớp thành tế bào là màng nguyên sinh chất chủ yếu bao gồm 2 thành
phần: phospholipid và protein. Màng sinh chất dày khoảng 7,5 - 10 nm chức năng
chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào, tham gia vào quá
trình hình thành bào tử. Tế bào chất của xạ khuẩn gồm một số thành phần chủ yếu
như: thể nhân, không bào và thể ẩn nhập.

11


Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển hình, chỉ là nhiễm sắc thể
không có màng bao bọc. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau
đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.
Thành phần tế bào xạ khuẩn còn chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình
trao đổi chất và quá trình vận chuyển các chất qua màng. .
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác vi sinh vật khác
của nhóm nhân sơ là tỷ lệ nucleotid G - X cao (> 70 %) trong khi đó ở vi khuẩn là
25 - 45 % (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002).
Một trong những đặc điểm đáng lưu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền
vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại phần tử ADN. Điều này gây
ra một số hiện tượng kỳ lạ khác, tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc
do sự xuất hiện plasmid. Hơn nữa sự tự nhân lên của các đoạn ADN còn làm phức
tạp thêm việc nghiên cứu.

1.2.4. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Trong tự nhiên, sự phát triển của vi sinh vật liên quan mật thiết đến thức ăn ở
môi trường sống và mối quan hệ giữa chúng với nhau. Do vậy cuộc sống của các vi
sinh vật trong quần thể là hoàn toàn khác nhau. Chúng luôn luôn đấu tranh để sinh
tồn: giành nguồn thức ăn, không gian phát triển, oxy,… và nói chung vì tất cả
những gì cần thiết cho sự phát triển của chúng. Trong đó mối quan hệ đối kháng
giữa các vi sinh vật đã được Paster (1987) khẳng định đó là hiện tượng phổ biến.
Trong quá trình tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ mới để đấu tranh sinh tồn
của vi sinh vật trong quần thể. Hiện tượng đối kháng là loại vi sinh vật này ức chế
hoặc kiềm chế hoàn toàn khả năng sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật khác. Nó
liên quan chặt chẽ với đấu tranh sinh tồn và là nhân tố giúp đỡ và xác định khả năng
biến dị và liên quan đến loài vi sinh vật.
Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng
một vi sinh vật với sản phẩm trao đổi chất của mình đưa ra điều kiện không thuận

12


lợi cho sự phát triển của vi sinh vật khác. Các chất mà vi sinh vật sinh ra đó là chất
kháng sinh.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh. Một
số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là do cơ chế giúp cho vi sinh vật
tồn tại trong môi trường tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh
là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng (Đỗ Thu Hà, 2004). Hầu hết các
tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào
cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng (Nguyễn Hoàng Chiến,
2000).
Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng
cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất
định:

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua
một chuỗi phản ứng enzym.
- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp
khác nhau.
- Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất
chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất
kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau (Egorov, 1983). Quá
trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài
các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu trách
nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor.

13


1.2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và sinh kháng sinh của
xạ khuẩn
Chất kháng sinh là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp chất kháng
sinh phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng. Trước hết là nguồn
cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng,... (Hopwood và cs, 1997).
1.2.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là nguyên tố quan trọng nhất trong sinh trưởng và phát triển của vi
sinh vật. Vi sinh vật sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon hết sức khác nhau. Chỉ trừ
một số dạng đường, hầu hết các hợp chất cacbon có trong tự nhiên đều được các vi
sinh vật khác nhau sử dụng (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2003).
Các nguồn cacbon dễ hấp thu nhất đối với đa số vi sinh vật là các loại đường,
sau đó là tinh bột, glycerin và một số axit hữu cơ như axit lactic, axit citric,… Tuy
vậy nồng độ chất dinh dưỡng cacbon quá cao lại có thể ức chế khả năng sinh trưởng
của vi sinh vật (nồng độ đường 30 - 70 % ức chế sinh trưởng của nhiều loài vi sinh
vật). Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon là khác nhau

phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn
thức ăn, hai là đặc điểm sinh lý của từng loài vi sinh vật. Cụ thể vi khuẩn có thể sử
dụng được các hợp chất đơn giản như đường đơn, đường đôi. Nhưng ngược lại nấm
men chỉ sử dụng được các hợp chất hydrocacbon đơn giản như đường đơn và một
số đường đôi (Lê Xuân Phương, 2008).
1.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nguồn nitơ có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật.
Nguồn nitơ dễ hấp thu nhất là ion NH4+ và NO3-, chúng thâm nhập vào tế bào dễ
dàng và ở đó chúng tạo nên các nhóm amin và amon. Các muối amon của axit hữu
cơ thích hợp đối với dinh dưỡng của vi sinh vật hơn là muối amon vô cơ (Lê Xuân
Phương, 2008). Các muối NO3- không có độ chua sinh lý, sau khi sử dụng NO3- sẽ
còn các ion kim loại (K+, Na+, Mg2+,…) sẽ làm kiềm hóa môi trường.

14


Nguồn nitơ khó hấp thụ hơn cả là nitơ trong không khí. Để sử dụng nguồn
nitơ này vi sinh vật phải có khả năng cố định nitơ, nghĩa là chuyển hóa nitơ phân tử
thành NH3. Người ta đã xác định được khả năng cố định nitơ của nhiều loài vi sinh
vật. Cùng với nguồn nitơ vô cơ, đa số vi sinh vật có khả năng sử dụng nitơ trong các
hợp chất hữu cơ. Sự sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ thường gắn liền với sự tách
nhóm NH3 ra sau đó sẽ thấm vào tế bào vi sinh vật. Do vậy NH3 là trung tâm của tất
cả con đường dinh dưỡng nitơ. Tùy theo nguồn nitơ được sử dụng, người ta chia vi
sinh vật ra làm hai nhóm:
- Vi sinh vật tự dưỡng amin: là những vi sinh vật tổng hợp nguồn nitơ vô cơ
hay hữu cơ sau chuyển thành NH3 để xây dựng cơ thể.
- Vi sinh vật dị dưỡng amin: xây dựng protein, nguyên sinh chất của mình từ
các axit amin sẵn có. Axit amin được sử dụng một cách nguyên vẹn, không bị phân
giải thành NH3. Protein là hợp chất cao phân tử, không thâm nhập vào được tế bào
vi sinh vật. Vì vậy, chỉ những vi sinh vật nào có khả năng tiết vào môi trường

enzym protease mới có khả năng đồng hóa protein.
1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH
pH có quan hệ rất lớn đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Giới hạn pH của sự
sinh trưởng: là giới hạn pH từ cực tiểu đến cực đại mà vi sinh vật có thể sinh trưởng
được. Trong giới hạn này có pH thích hợp nhất mà tại đó vi sinh vật có thể sinh
trưởng và phát triển cao nhất. Tác dụng của pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình
trao đổi chất của tế bào. pH cần cho hoạt động của nhiều enzym. Nồng độ ion H+
còn ảnh hưởng trực tiếp đến sự hòa tan của một số muối khoáng K, Na, Mg,… Do
đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Đa số vi sinh vật thích
ứng ở pH 4,5 - 9,0. Tùy từng chủng giống vi sinh vật khác nhau mà có độ thích ứng
khác nhau (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2003; Lê Xuân Phương, 2008).
Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường. pH
thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là trung tính, pH kiềm hay axit

15


đều ức chế quá trình tổng hợp chất kháng sinh (Demain. A.L.A., 1974; Weinberrg
E.D, 1973).
1.2.5.4. Ảnh hưởng của độ ẩm
Hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan đến nước, tỷ lệ nước trong tế
bào vi sinh vật rất cao, nước trong vi khuẩn chiếm từ 75 - 85 %, nấm men 72 - 82 %,
nấm mốc 84 - 90 %. Vi sinh vật cần nước ở trạng thái tự do, do đó quá trình trao đổi
chất nếu thiếu nước có hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào, làm cho tế bào có thể bị
chết.
Sức đề kháng của vi sinh vật ở trạng thái khô là khác nhau. Sức đề kháng của
vi sinh vật không khí > vi sinh vật đất > vi sinh vật nước. Sức đề kháng của xạ
khuẩn > vi khuẩn > nấm mốc. Sức đề kháng của bào tử > tế bào sinh dưỡng.
1.2.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối
Natri và clo là các nguyên tố mà nhiều vi sinh vật đòi hỏi với số lượng không

nhỏ. Nhưng cho đến nay người ta còn biết rất ít về vai trò sinh lý của chúng. Đa số
vi sinh vật sinh trưởng tốt hơn trong môi trường chứa ít hơn 2 % muối, nồng độ cao
hơn có thể có hại cho tế bào. Nhưng cũng có một số ít vi sinh vật lại sinh trưởng tốt
nhất trong môi trường chứa tới 3 % muối (halophilic bacteria).
Mg++ tham gia vào thành phần của các trung tâm hoạt động ở các enzym của
vi sinh vật. Đối với xạ khuẩn, muối MgCl2 còn đóng vai trò quan trọng trong quá
trình tạo khuẩn ty. Nếu thiếu muối này, khuẩn ty của xạ khuẩn sẽ bị gãy không liền
mạch ảnh hưởng tởi khả năng sinh chất kháng sinh.
1.2.5.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có dải nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của riêng nó.
Nhiệt độ sinh trưởng cực tiểu và cực đại là nhiệt độ thấp và cao nhất mà ở đó vi sinh
vật có thể duy trì được sự sinh trưởng và phát triển. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là
nhiệt độ mà ở đó vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tốt nhất (Nguyễn Xuân Thành và
cs, 2003).
16


Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất
kháng sinh của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 30°C,
nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong
khoảng 18 - 28°C (Biền Văn Minh, 2000).
1.2.5.7. Ảnh hưởng của độ thông khí
Xạ khuẩn là loại vi sinh vật có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh
vật khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của
quá trình nuôi cấy) (Lương Đức Phẩm, 1998). Do vậy để đảm bảo thông khí tốt,
người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả
năng hòa tan oxy. Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh là 2 - 8
ml O2/100ml môi trường lên men (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1972).
1.2.6. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Ngày nay lên men được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như dược

phẩm, hóa học, năng lượng, thực phẩm, nông nghiệp,… để sản xuất ra nhiều sản
phẩm hữu ích. Kỹ thuật lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong các điều kiện
tối ưu để sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất nhờ chính các vi sinh vật hoặc
thành phần tế bào của chúng.
Hiện nay người ta thường sử dụng 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và
lên men chìm.
1.2.6.1. Lên men bề mặt
Là quá trình vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn. Vi sinh
vật hấp thu chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp
trên bề mặt môi trường. Vì vậy yêu cầu của công nghệ lên men bề mặt là bề mặt
môi trường phải rộng và lớp môi trường không quá sâu (5 - 10 cm). Các ứng dụng
chủ yếu của kỹ thuật lên men bề mặt là: nuôi cấy nấm mốc sản xuất enzym, vi sinh
vật sản xuất axit hữu cơ, xạ khuẩn nuôi trên gạo hoặc bột ngô để sản xuất kháng

17


sinh phục vụ cho chăn nuôi, sản xuất kháng sinh cho người ở giai đoạn đầu của
công nghiệp kháng sinh (Cao Văn Thu, 2000).
+ Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp.
+ Nhược điểm: hiệu suất thấp, tốn diện tích, khó cơ giới hóa, tự động hóa.
Vì những nhược điểm này mà ngày nay công nghiệp kháng sinh không áp
dụng kỹ thuật bề mặt để lên men sản xuất, chỉ sử dụng trong các phòng thí nghiệm
để chọn giống (Cao Văn Thu, 2000).
1.2.6.2. Lên men chìm
Đa số kháng sinh ngày nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên men
chìm. Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi trong môi trường lỏng, phát
triển cả 3 chiều, trong điều kiện môi trường dinh dưỡng tốt nhất để phát triển và
tổng hợp sản phẩm (Cao Văn Thu, 2000).
- Ưu điểm của phương pháp:

+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tốt nhất, đáp ứng được nhu cầu sinh lý của
vi sinh vật.
+ Hiệu suất sử dụng không gian cao (3 chiều), lượng hoạt chất được tổng
hợp trong một thể tích môi trường cao, hiệu suất lên men cao.
+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm được mặt bằng nhân
công.
- Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.
- Lên men gián đoạn
Quá trình lên men gián đoạn được xem như là một hệ thống kín. Trong suốt
thời gian lên men không có tác động hay bổ sung chất dinh dưỡng vào môi trường
lên men trừ việc cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH.
Vi sinh vật trong bình lên men phát triển qua các giai đoạn: pha tiềm tàng,
pha log, pha cân bằng, pha suy vong.
18


Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng
hợp chất dừng lại ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật hoặc việc sinh
tổng hợp chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men liên tục
Vi sinh vật được nuôi trong một thiết bị đặc biệt sao cho khi vi sinh vật phát
triển đến một giai đoạn nhất định, khi đó lấy đi một thể tích môi trường lên men
cùng các tế bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng đồng thời bổ sung thêm đúng
một thể tích môi trường dinh dưỡng như thế vào bình nuôi cấy.
1.2.7. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam
Ở Việt Nam xạ khuẩn đã được quan tâm nghiên cứu khá nhiều trong đó các
nghiên cứu tập trung vào đặc điểm sinh học (Biền Văn Minh, 2000-2004), tối ưu
hóa môi trường nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998; Lê Gia Hy, 1994…), khả năng sinh
kháng sinh kháng các vi sinh vật gây bệnh thực vật (như vi khuẩn héo lá, nấm thực
vật, nấm đạo ôn, nấm thối cổ rễ,…) (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs,

1992, 1994, 2005), kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện (Nguyễn Phú Hùng
và cs, 2009). Ngoài ra còn có công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế
bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng sinh của xạ khuẩn (Vi Thị Đoan Chính,
2000), hay sản xuất kháng sinh β - lactam (Lê Gia Hy và Phạm Thị Bích Hợp,
2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số xạ khuẩn (Lại Thúy Hiền và
cs, 1998), nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs, 2005).
1.3. KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN
1.3.1. Tầm quan trọng của kháng sinh macrolid 16 Cacbon và các ứng dụng
Kháng sinh thuộc nhóm Macrolid (PKS - Polyketide synthase) là nhóm có
cấu trúc cực kỳ đa dạng và được tìm thấy rất nhiều trong các sản phẩm tự nhiên sinh
ra từ vi khuẩn. Nhóm kháng sinh này có hoạt tính sinh học với phổ kháng khuẩn
cực kỳ rộng và đã được quan tâm nghiên cứu trong suốt 50 năm qua (Henninger và
cs, 2003). Một số kháng sinh nhóm này được sử dụng rất thông dụng trong điều trị

19


các bệnh về nhiễm khuẩn đường hô hấp bởi kháng sinh này có ưu điểm rất an toàn
và thải trừ nhanh (Zhanel và cs, 2001). Rất nhiều nhóm đã tập trung nghiên cứu và
tìm ra được cơ chế hoạt động của nhóm kháng sinh này. Chúng có khả năng ức chế
hoạt động của vi khuẩn rất mạnh bằng cách liên kết với tiểu phần lớn 50S ribosom
của vi khuẩn từ đó ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn (Poehlsgaard
và cs, 2003; Poulsen và cs, 2000).
Hiện nay đã có rất nhiều chủng xạ khuẩn được phân lập và có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh thuộc nhóm PKS, đồng thời nhóm gen tham gia sinh tổng hợp
kháng sinh này cũng đang được nghiên cứu để cho các ứng dụng trong ngành công
nghiệp hóa dược và sản xuất kháng sinh.
Kháng sinh nhóm 16 - cacbon cũng thuộc nhóm PKS nhưng có vai trò ứng
dụng quan trọng hơn và vượt trội hơn so với các kháng sinh thuộc nhóm PKS 12
hay 14 cacbon bởi kháng sinh nhóm này chưa có hiện tượng kháng thuốc của vi

khuẩn (Kirst và cs, 1989).
1.3.2. Cấu trúc
Dihydrochalcomycin có công thức phân tử là C35H58O14 tan trong aceton,
benzen, chloroform, ethylacetat, methanol; không tan trong nước và n - hexan. Ở
bước sóng cực đại 217 nm cùng với sự hỗ trợ của dải hấp thụ IR 1700 cm-1 đã chỉ ra
sự có mặt của nhóm carbonyl α,β không no (Kim và cs, 1996).
Về cấu trúc, dihydrochalcomycin được tạo ra bởi 3 phần cấu trúc liên kết với
nhau trong đó phần trung tâm hoạt động là macrocyclic lacton, phần này sau đó
được gắn với 2 gốc đường khử là D - mycinose và D - chalcose thông qua cầu nối O
- glycosydic (Hình 1.2). Hai gốc đường này tham gia tạo ra tính tan và tính gắn với
đích tác dụng của thuốc (Thuy và cs, 2008).

20


Hình 1.2. Cấu trúc của Dihydrochalcomycin
1.3.3. Cơ chế tác dụng
Dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm 16 - cacbon PKS tạo ra bởi
con đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc 2 từ chủng Streptomyces sp. KCTC0041BP.
Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh này đã biểu hiện hoạt tính kháng
khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn gram âm và gram dương (Kim
và cs, 1996). Chủng xạ khuẩn tạo ra dihydrochalcomycin đã được phân lập, đồng
thời cấu trúc hóa học của chúng cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn
Quốc (Kim và cs, 1996). Kháng sinh này được xác định là chất dẫn xuất của kháng
sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác (Asolkar và
cs, 2002). Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng của dihydrochalcomycin chưa được
nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh
học của dihydrochalcomycin hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng sinh
chalcomycin (Goo và cs, 1997) và mycinamycin (Kenji và cs, 1985).
Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động của

kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic
lacton của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của ribosom
vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polipeptid ra khỏi tâm hoạt động của enzym
petidyltransferase. Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp protein
của vi khuẩn (Hansen và cs, 2002; Poehlsgaard và cs, 2002).

21


1.3.4. Các nghiên cứu về Dihydrochalcomycin
1.3.4.1. Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp
dihydrochalcomycin
Kháng sinh dihydrochalcomycin được xác định cấu trúc bằng NMR và được
phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I. Nhóm nghiên cứu đã tách được toàn
bộ nhóm gen tham gia con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP và lập được thư viện gen. Toàn bộ nhóm
gen sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5 kb đã được xác định trong đó có chứa 23
khung đọc mở chứa thông tin di truyền và mã hóa của các gen tham gia con đường
sinh tổng hợp dihydrochalcomycin. Đồng thời các gen này cũng được dự đoán cấu
trúc. Trình tự các gen này đã được đăng bản quyền trên GeneBank với mã số
AY118081 (Jaishy và cs, 2006).
1.3.4.2. Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp D-chalcose
và D-mycinose
Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-mycinose đã
được xác định trong cosmid Ger5 và đã giải trình tự từ cosmid. So sánh độ tương
đồng về trình tự các chuỗi axit amin của các gen với trình tự axit amin của các gen
đã biết trên ngân hàng gen thế giới GenBank. Các gen trong nhóm sinh tổng hợp 2
gốc đường khử này đã được dự đoán cấu trúc, cũng từ đó dự đoán được con đường
sinh tổng hợp gốc đường này.
Trong con đường sinh tổng hợp, 4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường trung

gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, với hoạt tính xúc
tác của các enzym GerD và GerE có chức năng là dTDP-glucose synthase và dTDPglucose 4,6-dehydratase.
- Quá trình sinh tổng hợp đường chalcose bắt đầu từ gốc trung gian 4-keto-6deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzym 3,4-isomerase (GerY) để tạo
đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4-dehydratase (GerB) và phản
ứng khử của enzym 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4,6-dideoxyglucose.
22


Bước cuối cùng là gốc đường này được gắn vào nhân macrolid với hoạt động của
chalcosylglycosyltransferase (GerT2).
- Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh
tylosin vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu
về kháng sinh này (Bate và cs, 1999). Phản ứng sinh tổng hợp được bắt đầu từ
dTDP-4-keto-6-deoxyglucose để tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác của 2 enzym
3-epimerase (GerF) và 4-ketoreductase (GerK1). Phản ứng tiếp theo là gắn gốc
đường allose vào nhân macrolacton được thực hiện với hoạt tính xúc tác của
glycosyltransferase (GerT1). Bước cuối cùng là hoàn thành cấu trúc kháng sinh
dihydrochalcomycin với xúc tác của các enzym biến đổi cấu trúc (post PKS).
1.3.4.3. Sinh tổng hợp dTDP-6-deoxy-β-D-allose, chứng minh hoạt tính của dTDP4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI)
Trong nghiên cứu này nhóm đã chứng minh hoạt tính và vai trò của gen
gerK1 trong sinh tổng hợp D-Mycinose. GerK1 có tên là 4-ketoreductase, được mã
hóa bởi gen gerK1, tham gia phản ứng xúc tác chuyển gốc đường 4-keto-6deoxyglucose thành 6-deoxy-D-allose. Cùng với kết quả này sản phẩm được tạo
thành đó là dTDP-6-deoxy-D-allose, cấu trúc đường này đã được xác định bằng
phân tích NMR và HPLC. Kết quả nghiên cứu này có ý‎ nghĩa khoa học rất quan
trọng bởi vì đây là đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên được tổng hợp nhờ phản
ứng enzym invitro và nhờ đó đã tìm ra phương pháp sinh tổng hợp 1 gốc đường
quan trọng (Thuy và cs, 2007).

23

O H3C

H3C

O

O

HO

GerY

HO

OH
OdTDP

OH

O

H3C

GerB
GerN
OdTDP

O

O
OH

H3C

?

HO

GerSV

O dTDP

OH

GerD

GerM1
GerTII

OdTDP

GerF

OH

O H3C

O

HO
HO

Dihydro
Acyl- CoA
chalconolide GerSI- precusors

O

OH

OdTDP

H3C

O
OH

HO

5-O-chalcosyl(dihydro)chalconolide

O

HO

GerK1
OdTDP

OH

OdTDP

HO

GerE

GerTI
OH
O

HO
HO

5-O-chalcosyl-20-6-deoxyallosyl(dihydro)chalconolide

OH

OH

8

O

OCH3

OPO-3

6

HO

11

O
O
H3C

14

O
OCH3

CH3
Chalcose
GerP1
GerP2

2

O

HO

O

O

OCH3

Mycinose

GerM2
GerM3

5-O-chalcosyl-20-O-micinosyl(dihydro)chalconolide

O

Dihydrochalcomycin

Hình 1.3. Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn
thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin
1.3.4.4. Chứng minh hoạt tính của gen glycosyltransferases gerTI và gerTII bằng
phương pháp gây đột biến gen
Theo kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen gerT1 và gerT2 đã
được sáng tỏ bằng phương pháp đột biến gen để tạo chủng đột biến không có chứa
gerT1 và gerT2. Chức năng của gen này là mã hóa cho sinh tổng hợp enzym
glycosyltransferase. Các enzym này tham gia vận chuyển và gắn gốc đường
mycinose và chalcose vào gốc macrolacton. Phân tích đánh giá sản phẩm trung gian
từ chủng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được bước cuối cùng của quá
trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có hoạt tính sinh học mới (Thuy
và cs, 2009).

24


Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041BP được phân lập tại Hàn

Quốc do khoa Hoá học trường Đại học Sun Moon - Hàn Quốc cung cấp. Đây là
chủng hoang dại sinh tổng hợp Dihydrochalcomycin.
2.1.2. Giống vi sinh vật kiểm định
Nhóm nghiên cứu sử dụng một số chủng vi sinh vật Gram(+) và Gram(-) để
thử hoạt tính kháng sinh.
2.1.2.1. Vi khuẩn Gram dương
Bacillus subtilis ATCC 11778, Bacillus cereus ATCC 6633, Bacillus pumilus
ATCC 14882 - Khoa vi sinh - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW.
2.1.2.2. Vi khuẩn Gram âm
E. coli PA2 (Phòng công nghệ lên men - Viện công nghệ sinh học).
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
2.1.3.1. Hóa chất
- Hoá chất làm thành phần môi trường:
+ Trypton, cao nấm men, cao malt, glycerol, Difco casaminoacids, L -proline,
TES - buffer, NaOH, NaCl, Trace element solution (ZnCl2, FeCl2.6H2O,
CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, Na2B4O7.10 H2O và (NH4)6Mo7O24.4 H2O) và R solution (K2SO4, MgCl2.6 H2O, KH2PO4, CaCl2.2 H2O) của hãng Merck, Đức.
+ Sucrose của hãng WAKO - Nhật Bản
+ Glucose của Việt Nam
+ Agarose của hãng VWR Prolabo
- Các dung môi:
25