Nghiên cứu công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường bằng tế bào cố định theo phương pháp lên men liên tục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------

NGUYỄN MINH THU

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỒN
TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG TẾ BÀO CỐ ĐỊNH THEO
PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN LIÊN TỤC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Công nghệ Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Vũ Nguyên Thành

Hà Nội - 2010
i


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả trong báo cáo này là trung thực và
chưa hề được sử dụng.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện báo cáo này đã được
ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả

Nguyễn Minh Thu

ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành tới ThS. Nguyễn Thúy
Hường - Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh, Viện Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Vũ Nguyên Thành cùng tập
thể cán bộ bộ môn Vi sinh, bộ môn Công nghệ Đồ uống - Viện Công nghiệp Thực
phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian qua.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 27 tháng 10 năm 2010
Học viên

Nguyễn Minh Thu

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ................................................................................... vii
MỞ ĐẦU.................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................. 3
1.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CỒN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM.................... 3
1.1.1. Xu thế phát triển công nghiệp cồn trên thế giới ...................................................... 3
1.1.2. Tình hình sản xuất cồn ở Việt Nam......................................................................... 5

1.1.3. Tình hình nghiên cứu công nghệ lên men cồn ........................................................ 8
1.2. KHÁI QUÁT VỀ LÊN MEN LIÊN TỤC ................................................................. 11
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của hệ thống lên men liên tục............................................ 12
1.2.2. Đặc điểm của phương pháp ................................................................................... 12
1.2.3. Các phương pháp lên men liên tục ........................................................................ 13
1.3. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ..................................................................................................... 14
1.4. RỈ ĐƯỜNG MÍA......................................................................................................... 16
1.4.1. Thành phần của rỉ đường....................................................................................... 16
1.4.2. Vi sinh vật tạp nhiễm trong rỉ đường .................................................................... 17
1.4.3. pH và lực đệm của rỉ đường mía ........................................................................... 18
1.4.4. Các phương pháp xử lý rỉ đường........................................................................... 18
1.5. VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT CỒN TỪ RỈ ĐƯỜNG MÍA ......................... 19
1.6. CÁC VI SINH VẬT TẠP NHIỄM THƯỜNG GẶP KHI LÊN MEN CỒN.......... 19
1.7. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN LÊN MEN LIÊN TỤC ........................... 21
1.7.1. Nồng độ rỉ đường .................................................................................................. 21
1.7.2. Tốc độ pha loãng ................................................................................................... 21
1.7.3. Nhiệt độ ................................................................................................................. 21
1.7.4. pH .......................................................................................................................... 22
1.7.5. Tỷ lệ và chất lượng tế bào cố định ........................................................................ 22
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................................ 23
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................................................. 23
2.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men tạo cồn cao...................... 23
2.2.1.1. Sơ tuyển các chủng nấm men có khả năng lên men ở nhiệt độ cao............... 23
2.2.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo cồn trong môi trường rỉ
đường chứa chất sát khuẩn.......................................................................................... 24

iv

2.2.2. Xử lý rỉ đường ....................................................................................................... 24
2.2.3. Xác định mật độ tế bào nấm men .......................................................................... 24
2.2.4. Cố định tế bào nấm men........................................................................................ 25
2.2.5. Xác định số lượng tế bào nấm men được cố định trong hạt gel canxi alginat ...... 25
2.2.6. Xác định lượng đường khử.................................................................................... 25
2.2.7. Xác định lượng cồn tạo thành................................................................................ 27
2.2.8. Xác định độ chua của dấm chín............................................................................. 28
2.2.9. Xác định các thông số của quá trình lên men........................................................ 28
2.2.10. Hệ thống lên men liên tục.................................................................................... 28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................ 30
3.1. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG RỈ ĐƯỜNG MÍA TAM HIỆP.................................. 30
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO
CỒN CAO ........................................................................................................................... 30
3.2.1. Sơ tuyển các chủng nấm men có khả năng lên men ở nhiệt độ cao ...................... 30
3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men cồn trong môi trường rỉ đường
chứa chất sát khuẩn. ........................................................................................................ 32
3.3. XỬ LÝ RỈ ĐƯỜNG .................................................................................................... 33
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ TẾ BÀO CỐ ĐỊNH/DỊCH LÊN MEN....................... 34
3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CỒN TỪ RỈ ĐƯỜNG MÍA BẰNG TẾ
BÀO CỐ ĐỊNH TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN LIÊN TỤC .................................... 35
3.5.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ hạt tế bào cố định/ thể tích bình lên men trong hệ thống lên
men liên tục ..................................................................................................................... 35
3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hàm lượng cồn thu được trong hệ thống lên
men liên tục ..................................................................................................................... 39
3.5.3. Ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến lượng cồn thu được trong hệ thống lên men
liên tục ............................................................................................................................. 42
3.5.4. Nghiên cứu sự ổn định của quá trình tạo cồn tại bình thu sản phẩm F5 theo thời
gian trong hệ thống lên men liên tục ............................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 48
KẾT LUẬN.......................................................................................................................... 48

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 49
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 53

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu từ năm 2008 đến năm 2012............................... 5
Bảng 1.2. Một số công trình nghiên cứu về lên men liên tục trên thế giới................................. 9
Bảng 1.3. Phạm vi ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào. ....................................................... 14
Bảng 1.4. Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật............................................................ 17
Bảng 1.5. Một số vi sinh vật thường dùng trong sản xuất cồn từ rỉ đường mía ....................... 19
Bảng 3.1. Thành phần hóa học và vi sinh vật của rỉ đường mía Tam Hiệp.............................. 30
Bảng 3.2. Khả năng lên men ở nhiệt độ 30ºC của các chủng nấm men. .................................. 31
Bảng 3.3. Khả năng chịu chất sát trùng của hai chủng nấm men. ............................................ 33
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các chế độ xử lý rỉ đường tới khả năng lên men của chủng CNTP
7028. ......................................................................................................................................... 33
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ tế bào cố định/ thể tích dịch lên men đến khả năng lên men của
chủng CNTP 7028. ................................................................................................................... 35
Bảng 3.6. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình
lên men là 30 %. ....................................................................................................................... 36
Bảng 3.7. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình
lên men là 80 %w/v. ................................................................................................................. 37
Bảng 3.8. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình
lên men là 50 %w/v. ................................................................................................................. 37
Bảng 3.9. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình
lên men là 40 %w/v. ................................................................................................................. 38
Bảng 3.10. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với nồng độ cơ chất là 170 g/l............. 39

Bảng 3.11. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với nồng độ cơ chất là 190 g/l............. 40
Bảng 3.12. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với nồng độ cơ chất là 210 g/l............. 40
Bảng 3.13. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với nồng độ cơ chất là 230 g/l............. 41
Bảng 3.14. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với ....................................................... 42
tốc độ pha loãng 0,102 l/l/giờ. .................................................................................................. 42
Bảng 3.15. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với ....................................................... 43
tốc độ pha loãng 0,128 l/l/giờ. .................................................................................................. 43
Bảng 3.16. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với ....................................................... 43
tốc độ pha loãng 0,154 l/l/giờ. .................................................................................................. 43
Bảng 3.17. Khả năng lên men của tế bào cố định ứng với ....................................................... 43
tốc độ pha loãng 0,171 l/l/giờ. .................................................................................................. 43

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Sản lượng cồn nhiên liệu ở một số nước trên thế giới (1975 - 2010) ......................... 3
Hình 1.2. Quy trình sản xuất cồn từ rỉ đường ............................................................................. 6
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Nelson - Somogi ........................... 27
Hình 2.2. Mô hình hệ thống lên men liên tục ........................................................................... 29
Hình 3.1. Khả năng lên men ở nhiệt độ 37oC của các chủng nấm men.................................... 32
Hình 3.2. Khả năng lên men ở nhiệt độ 40oC của các chủng nấm men.................................... 32
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ tế hạt tế bào cố định : thể tích bình lên men (w/v) đến lượng cồn
thu được trong hệ thống lên men liên tục ................................................................................. 38
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng tạo cồn và hiệu suất lên men của tế
bào cố định trong hệ thống lên men liên tục............................................................................. 41
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến sản lượng cồn thu được trong hệ thống lên men
liên tục....................................................................................................................................... 44
Hình 3.6. Thời gian ổn định lượng cồn thu được trong hệ thống lên men liên tục .................. 45

Hình 3.7. Hình ảnh tế bào nấm men được cố định trong hạt gel canxi alginat trong một chu kỳ
lên men...................................................................................................................................... 46
Hình 3.8. Sự phát triển của tế bào nấm men S. cerevisiae CNTP 7028 trong hạt gel alginat
được chụp trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) ở các giai đoạn lên men khác nhau .............. 47

vii


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ethanol (rượu cồn) chiếm một vị trí đáng kể trong công nghiệp thực phẩm.
Ngoài công dụng làm đồ uống, rượu - cồn còn có khả năng làm nguyên liệu cho một số
ngành kinh tế quan trọng như: Làm dung môi hữu cơ, nhiên liệu, dùng trong y tế, trong
mỹ phẩm pha nước hoa, trong dược phẩm để trích ly các hoạt chất sinh học, sản xuất
axit axetic và giấm ăn, sản xuất các loại este có mùi thơm, trong tổng hợp cao su và
nhiều hợp chất khác v.v… Đặc biệt, trong bối cảnh nguồn nhiên liệu hóa thạch đang
ngày càng cạn kiệt thì ethanol được coi như nguồn nhiên liệu sinh học thay thế đầy hứa
hẹn. Hiện nay, một số hãng ô tô trên thế giới đã thử nghiệm thành công các mẫu động
cơ chạy bằng cồn hoặc hỗn hợp xăng pha cồn [29].
Ở Việt Nam, bên cạnh các nhà máy sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột,
một số nhà máy của các công ty mía đường cũng tận dụng nguồn nguyên liệu rỉ đường
để sản xuất cồn. Công nghệ sản xuất cồn đang được áp dụng hiện nay là lên men gián
đoạn hoặc lên men bán liên tục, sử dụng tế bào tự do. Sản lượng cồn tạo ra chỉ đáp ứng
được một phần nhu cầu của thị trường [5].
Trong những năm gần đây, công nghệ lên men cồn liên tục, sử dụng tế bào cố
định đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Các hệ thống lên men liên tục cho
phép tăng hiệu quả sản xuất, giảm giá thành chế tạo các thùng lên men, giảm chi phí
bảo dưỡng, giảm công lao động và nâng cao hiệu suất lên men. Việc bao bọc trong lớp
chất mang giúp tế bào chống chịu với các tác nhân bất lợi tốt hơn so với tế bào tự do.
Ngoài ra, việc cố định tế bào giúp cho các tế bào luôn được giữ lại trong thiết bị phản

ứng và không bị thoát ra theo dịch đầu ra [20]. Cho đến nay, khoảng 30% ethanol sản
xuất tại Braxin là theo quá trình lên men liên tục (Monte et al, 2003). Với mong muốn
nâng cao hiệu suất lên men và giảm chi phí sản xuất cồn từ rỉ đường, đề tài “Nghiên
cứu công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường bằng tế bào cố định theo phương pháp lên
men liên tục” được thực hiện.
1


2. Mục đích của đề tài
Xây dựng được công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường bằng tế bào cố định trong hệ
thống lên men liên tục.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
9 Đồi tượng nghiên cứu:
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae từ Sưu tập giống Vi sinh vật, Viện Công
nghiệp Thực phẩm.
- Rỉ đường mía của nhà máy Tam Hiệp - Hà Tây.
9 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu quá trình lên men cồn từ rỉ đường của tế bào
nấm men cố định trong hệ thống lên men liên tục.
4. Các luận điểm cơ bản và đóng góp mới của luận văn
9 Các luận điểm cơ bản:
- Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men S. cerevisiae có khả năng lên men tạo
cồn ở nhiệt độ cao trong môi trường chứa chất sát khuẩn.
- Nghiên cứu quy trình xử lý rỉ đường thích hợp cho quá trình lên men cồn.
- Xác định điều kiện lên men cồn bằng tế bào cố định theo công nghệ lên men
liên tục.
9 Đóng góp mới của luận văn:
Ở Việt Nam, công nghệ cố định tế bào còn đang trong giai đoạn nghiên cứu
phòng thí nghiệm. Rất ít nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng rỉ đường và kết quả
chưa đưa ra được quy mô công nghiệp. Việc kết hợp giữa kỹ thuật cố định tế bào và
quá trình lên men liên tục trong sản xuất cồn là một hướng đi có triển vọng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CỒN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.1.1. Xu thế phát triển công nghiệp cồn trên thế giới
Năm 2003, toàn thế giới đã sản xuất được 38,5 tỷ lít ethanol (châu Mỹ chiếm
khoảng 70%, châu Á 17%, châu Âu 10%), trong đó 70% được dùng làm nhiên liệu,
30% được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, y tế, hoá chất. Đến năm 2007, lượng
ethanol sản xuất đã tăng lên 56 tỷ lít, trong đó tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên
75% [32].

Hình 1.1. Sản lượng cồn nhiên liệu ở một số nước trên thế giới (1975 - 2010) [35]
Braxin là nước tiên phong trong công tác nghiên cứu sản xuất cồn nhiên liệu.
Những năm gần đây, chính phủ Braxin đã tập trung phát triển, đa dạng hóa nguồn năng
lượng nhằm bảo đảm sự ổn định và phát triển kinh tế đất nước. Trong chương trình
phát triển kinh tế năm 2007 - 2010, chính phủ Braxin sẽ đầu tư tới 236 tỷ USD vào hạ
tầng cơ sở, trong đó, giao thông vận tải, nhà ở và năng lượng được ưu tiên hàng đầu.
Trong lĩnh vực năng lượng, Braxin tập trung đầu tư xây dựng 121 nhà máy sản xuất
dầu sinh học mới nhằm đẩy mạnh phát triển nhiên liệu ethanol. Theo kế hoạch, tới
năm 2015, Braxin dự kiến sẽ sản xuất 36,9 tỷ lít ethanol, tương đương với 636 nghìn
thùng xăng/ngày, với hy vọng nguồn nhiên liệu thay thế này có thể cạnh tranh với thị
trường xăng thế giới [15, 32, 33, 34].
3


Mỹ là quốc gia tiêu thụ hàng năm 25 % năng lượng trên thế giới (trong khi chỉ
có 6 % trữ lượng dầu mỏ). Hàng năm, Mỹ sản xuất khoảng 1 - 3 tỷ lít cồn nhiên liệu
trong đó 95% được sản xuất từ tinh bột ngô [28]. Sản lượng ethanol được sản xuất ở

Mỹ tăng từ 1,63 triệu gallon năm 2000 tới 7,22 tỷ gallon năm 2007. Riêng năm 2007,
6,5 triệu gallon ethanol sản xuất trong nước đã thay thế 228 tỷ thùng dầu nhập khẩu.
Năm 2005, Quốc hội Mỹ yêu cầu tăng gấp đôi sản lượng cồn vào năm 2012, lên 7,5 tỷ
gallon mỗi năm, từ mức 4 tỷ gallon hiện nay [35]. Giá cồn năm 2005 là 1,35
USD/gallon, năm nay đã tăng lên 2,8 USD/ gallon và trong thời gian đó giá xăng cũng
tăng từ 2,2 lên 3,5 USD/ gallon [15]. Nước Mỹ có đất đai và khí hậu thuận lợi để sản
xuất một lượng lớn cồn nhiên liệu từ cây ngô, góp phần hữu hiệu vào việc giảm nhẹ sự
phụ thuộc ngày càng lớn vào dầu nhập khẩu. Hiện nay Mỹ và Braxin đang cung cấp tới
70% nhu cầu ethanol của thế giới với sản lượng 17 tỷ lít/năm/nước [32].
Công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu cũng đang phát triển mạnh mẽ ở các nước
châu Âu. Với mục tiêu giảm phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch, EU đặt mục tiêu đến
năm 2010 các loại nhiên liệu sinh học sẽ chiếm 5,7 % tổng mức tiêu thụ nhiên liệu
trong giao thông vận tải. Tofield cho biết nếu chuyển tất cả diện tích trồng cây cải dầu
ở vương quốc Anh sang sản xuất cồn thì sẽ thay thế được 5% khối lượng xăng tiêu thụ
ở Anh hiện nay, còn nếu chuyển sang trồng ngô thì con số này là 10%. Hiện một công
ty đường của Anh đã có một nhà máy sản xuất cồn ở Norfolk từ củ cải đường và nước
Anh còn dự định xây dựng không ít hơn 15 nhà máy như thế trong thời gian tới [28,
31, 32].
Ở Châu Á, Trung Quốc là quốc gia sản xuất cồn lớn nhất. Chính phủ Trung
Quốc đang tăng cường hỗ trợ cho năng lượng sinh khối và hoạt động sản xuất cồn.
Trong kế hoạch phát triển kinh tế - xã hội 5 năm lần thứ 11 (2006 - 2010) đã xác định
rõ nhiệm vụ sản xuất nhiên liệu này cần tăng mạnh trong những năm tới. Trung Quốc
bắt đầu sản xuất cồn nhiên liệu từ 1990 thông qua sử dụng phế liệu ngũ cốc [16]. Trong
kế hoạch 2006 - 2010, chính phủ đặt mục tiêu sản xuất 6 triệu tấn cồn, phục vụ cho vận
tải trong các thành phố lớn trong đó có Bắc Kinh, Thượng Hải, Thiên Tân. Chi phí sản
xuất cồn hiện nay vẫn ở mức cao, giá thành một tấn cồn là 4.500 Nhân dân tệ (563
USD) nếu sử dụng ngũ cốc và khoảng 4.000 NDT nếu sử dụng kê, sắn làm nguyên liệu
4

thô. Như vậy, sản xuất cồn nhiên liệu chỉ mang lại lợi nhuận khi giá xăng trên 6
NDT/lít (12.000 VND). Hiện nay giá xăng đã cao hơn mức này. Hàng năm, Trung
Quốc trợ cấp cho sản xuất cồn nhiên liệu 1,5 tỷ NDT và với khuynh hướng giá dầu còn
tiếp tục cao trong dài hạn thì trợ cấp này sẽ giảm [28, 29, 32, 35].
Thái Lan đã có chính sách sản xuất nhiên liệu sinh học từ 10 năm nay. Công ty
PAT đã bán trên thị trường loại xăng pha cồn 10% với giá rẻ hơn so với xăng thông
thường 3,3%. Từ năm 2002, Thái Lan đã xây dựng thêm 4 nhà máy sản xuất cồn, chi
phí 2,7 tỷ bath/nhà máy (64 triệu USD) nhằm giảm chi phí nhập khẩu xăng dầu [35].
Hiện nay, Thái Lan sản xuất 2 triệu lít cồn/ngày từ mía và phế phẩm nông nghiệp, tiết
kiệm cho nước này 10 tỷ bath/năm. Công ty Mỹ Ford Motor cũng đã ký hợp đồng với
Chính phủ Thái Lan nhằm thử nghiệm dùng cồn cho xe tải Ranger [30]. Bảng 1.1 cho
biết sản lượng cồn thế giới từ năm 2008 - 2012.
Bảng 1.1. Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu từ năm 2008 đến năm 2012 [35].
Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu từ năm 2008 - 2012 (Tỷ lít)
Năm
Braxin
Mỹ
Trung Quốc
Ấn Độ
Pháp
Tây Ban Nha
Đức
Canada
Inđônêxia
Italia
Các nước khác
Thế giới

2008

2009

18,880 19,826
23,460 25,958
4,069
4,167
2,010
2,086
1,079
1,139
0,617
0,696
1,207
1,442
0,871 1,045
0,288
0,318
0,189
0,201
8,713
9,644
61,376 66,520

2010
20,776
28,456
4,270
2,161
1,200
0,780

1,681
1,219
0,348
0,208
10,575
71,667

2011

2012

21,723 22,673
30,955 33,453
4,368
4,470
2,237
2,313
1,260
1,321
0,859
0,942
1,915
2,154
1,393
1,567
0,379
0,409
0,220
0,227
11,506 12,437

76,811 81,959

Tăng trưởng
hàng năm (%)
2,8
5,7
1,4
2,2
3,2
6,9
9,7
9,9
5,6
2,8
5,7
4,6

1.1.2. Tình hình sản xuất cồn ở Việt Nam
Hiện nay ở Việt Nam, công suất sản xuất cồn mới đạt khoảng 50 triệu lít/năm,
trong khi lượng mật rỉ đường hiện có thể sản xuất trên 100 triệu lít cồn/năm [30]. Nếu
5


chương trình năng lượng sinh học đến năm 2020 được thực hiện tốt, nhu cầu cồn nhiên
liệu sẽ rất lớn. Đây cũng là cơ hội lớn để phát triển trồng trọt, cung cấp nguyên liệu sản
xuất cồn, tạo doanh thu cho cả vùng nguyên liệu sản xuất cồn và năng lượng sinh học
khoảng 1,9 tỷ USD vào năm 2020 [20]. Hiện tại cả nước có 11 nhà máy chế biến cồn
từ rỉ mật, tổng công suất 297.000 lít/ngày, 42,2 triệu lít/năm [30].
Để sản xuất được 1 lít cồn 96%v/v chỉ cần tối đa 4 - 5 kg rỉ đường [4]. Tuy
nhiên, sản xuất cồn từ rỉ đường ở nước ta vẫn chỉ áp dụng công nghệ lên men gián

đoạn hoặc bán liên tục [5].

Rỉ đường

Pha loãng và axit hóa

Cặn

Pha chế rỉ đường nuôi men và lên men

Men giống

Lên men rỉ đường

Chưng cất

Tinh chế

Cồn thành phẩm

Hình 1.2. Quy trình sản xuất cồn từ rỉ đường
Có thể thấy rằng, công nghệ sản xuất cồn hiện nay mới chỉ hướng tới mục đích
chủ yếu là cung cấp cho thị trường đồ uống của Việt Nam. Trong khi đó với tình hình
nhiên liệu ngày càng cạn kiệt, xu thế thế giới là phải nghiên cứu và sản xuất ra các
6


nhiên liệu sinh học thay thế một phần cho xăng dầu. Hiện nay ở Việt Nam, mô hình
sản xuất cồn nhiên liệu chủ yếu mới dừng lại ở các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
Các nhà máy cồn trên cơ sở trang thiết bị hiện có cần phải được nghiên cứu đầu tư

thêm công nghệ, thiết bị hiện đại để nâng cao công suất, hiệu suất thu hồi, giảm chi phí
sản xuất đến mức tối thiểu để có thể sản xuất ra cồn nhiên liệu có khả năng cạnh tranh
thay thế một phần xăng dầu [29, 30].
Với mục tiêu tìm kiếm nguồn năng lượng mới cho phát triển bền vững của đất
nước, Việt Nam cũng đã có chủ trương nghiên cứu và ứng dụng sản xuất cồn nhiên
liệu. Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học của Việt
Nam đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025”. Trong khuôn khổ của đề án này, tháng 6
năm 2009, một nhà máy sản xuất Bio-ethanol khu vực phía Bắc được xây dựng. Đây là
nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học đầu tiên được xây dựng ở miền Bắc Việt Nam có
quy mô đầu tư lớn, công nghệ tiên tiến, thiết bị hiện đại với tổng mức đầu tư khoảng 80
triệu USD, công suất 100 triệu lít ethanol/năm, thời gian xây dựng 18 tháng, tại huyện
Tam Nông, tỉnh Phú Thọ, sử dụng nguyên liệu sắn, mía để sản xuất ethanol [28, 31].
Trong “Kế hoạch và Chương trình triển khai các dự án Nhiên liệu sinh học” của Tập
đoàn Dầu khí Việt Nam (Petrovietnam), tháng 3 năm 2010, tỉnh Bình Phước khởi công
xây dựng Nhà máy Sản xuất Ethanol (cồn nhiên liệu sinh học) với tổng mức đầu tư
trên 80 triệu USD, có công suất thiết kế 100 triệu lít/năm, tiêu thụ khoảng 240.000 tấn
sắn lát khô/năm. Sản phẩm ethanol của nhà máy sẽ được pha trộn với xăng của nhà
máy lọc dầu Dung Quất để phân phối trên thị trường cả nước [31].
Nhiên liệu sinh học chứa lượng lưu huỳnh cực nhỏ so với xăng dầu sẽ giảm
khoảng 70% khí CO2 và 30% khí độc hại nên cháy sạch hơn. Riêng nhiên liệu sinh học
sản xuất từ mía đường giảm đến 89% khí CO2 [5].
PGS.TS Đỗ Huy Định, Ủy viên Hội đồng Chính sách Khoa học và Công nghệ
Quốc gia cho rằng: Để đảm bảo nguyên liệu dùng sản xuất nhiên liệu sinh học trong
giai đoạn 2010 - 2025, một số loại nguyên liệu chủ lực cần được phát triển đó là mía,
sắn, tảo, cao lương ngọt, cây cọc rào... Trong đó mía có tiềm năng phát triển để sản
xuất đường - cồn [31]. Nước mía, bã mía, mật rỉ đường đều sản xuất được cồn. Mía
7


cho hiệu suất cao (5.000 - 7.000 lít/ha/năm). Diện tích trồng mía hiện nay trên 300

ngàn ha, với năng suất 50 - 60 tấn/ha và sản lượng gần 17 triệu tấn. Hiện tại cả nước
mới có 4 trong số 37 nhà máy đường có sản xuất cồn với sản lượng trên 30 triệu lít từ
mật rỉ đường. Để có khoảng 0,5 tỷ lít cồn từ mía vào năm 2010 làm nhiên liệu sinh học
và các mục đích khác, Việt Nam cần mở rộng diện tích thêm 200 ngàn ha, sử dụng
giống cao sản và áp dụng kỹ thuật canh tác tiến bộ để sản lượng khoảng 30 triệu
tấn/năm [28].
1.1.3. Tình hình nghiên cứu công nghệ lên men cồn
Công nghệ lên men cồn có thể chia thành quá trình gián đoạn, quá trình bán liên
tục và quá trình liên tục. Quá trình gián đoạn thường dùng trong sản xuất cồn nhiên
liệu là quá trình Melle-Boinot. Quá trình này bao gồm cân và thanh trùng nguyên liệu,
chỉnh pH bằng H2SO4 pha loãng để giảm độ Brix xuống còn 14 - 22. Sau khi lên men,
dịch lên men được lắng, ly tâm và chuyển qua khâu tách ethanol. Theo quá trình này,
hàm lượng cơ chất sẽ giảm đi và ethanol được tích tụ dần trong môi trường lên men.
Để giảm sự ức chế quá trình lên men do nồng độ cơ chất ban đầu hay nồng độ cồn cao
lúc cuối, người ta đưa ra phương pháp bán liên tục, điều khiển lưu lượng dòng cơ chất
cung cấp theo dạng tuyến tính hoặc hàm mũ và kết quả làm tăng năng suất ethanol lên
từ 10 - 14% (Echegaray et al., 2000).
Các hệ thống lên men liên tục cho phép tăng hiệu quả sản xuất. Quá trình này có
nhiều ưu điểm so với lên men gián đoạn ở chỗ giảm giá thành chế tạo các bioreactor,
giảm chi phí bảo dưỡng và nâng cao năng suất. Lên men gián đoạn có năng suất 1 - 3
g/l/giờ, trong khi đó lên men liên tục có thể đến 20 g/l/giờ (Oscar, 2007). Khoảng 30%
ethanol sản xuất tại Braxin là theo quá trình lên men liên tục (Monte et al, 2003). Ưu
điểm của lên men liên tục chủ yếu là do mật độ tế bào cao được tạo ra do cố định tế
bào (cell-immobilisation), do khả năng phục hồi và tái sử dụng sinh khối tế bào. Nhược
điểm chính của quá trình này là tế bào hoạt động dài ngày trong môi trường yếm khí sẽ
giảm khả năng tổng hợp ethanol. Mặt khác, để tăng năng suất cần tăng hệ số pha loãng
và điều này làm giảm tỷ lệ sử dụng cơ chất và do đó giảm hiệu suất. Lên men liên tục
cho phép giảm hiệu ứng ức chế của sản phẩm lên men. Trong hệ thống ghép tầng các
8

bioreactor, sản phẩm từ bình phản ứng (bioreactor) thứ nhất được chuyển qua bình tiếp
theo và do đó giảm ảnh hưởng ức chế. Một cách tiếp cận mới là liên tục tách ethanol ra
khỏi dịch lên men bằng phương pháp chân không hoặc phương pháp màng nhưng làm
tăng chi phí đầu tư.
Một trong các chiến lược cải tiến quá trình lên men ethanol là áp dụng kỹ thuật cố
định tế bào để tăng năng suất và hiệu suất quá trình lên men. Hiện tại kỹ thuật này đã
được phát triển theo 4 hướng chính: Gắn tế bào vào bề mặt chất nền, bẫy tế bào trong
chất nền có lỗ, chứa tế bào trong chất mang và cho các tế bào tự kết dính. Trong số các
chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào, canxi alginat được sử dụng rộng rãi nhất do có
các ưu điểm. Thứ nhất là hạt gel có độ xốp cao, cho phép cơ chất và sản phẩm lên men
đi vào và đi ra dễ dàng, tạo thuận lợi cho việc trao đổi chất. Sự khuếch tán của glucoza
và ethanol vào và ra khỏi mạng lưới gel rất cao, khoảng 90 % so với khuếch tán trong
nước. Thứ hai là tính tương thích sinh học rất tốt, cho phép các tế bào sống duy trì hoạt
động của mình khi cố định trên mạng lưới gel, không độc và không gây ức chế hoạt
động sống của tế bào. Chính vì tính chất này mà alginat được sử dụng để cố định nhiều
loại tế bào sống khác nhau như vi khuẩn, tảo, tế bào thực vật và tế bào của động vật có
vú để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm khác nhau từ ethanol, bia, alkaloid, insulin và
interferon (Olav, 1990).
Bảng 1.2. Một số công trình nghiên cứu về lên men liên tục trên thế giới.
Tác giả

Đặc điểm công nghệ

Gerald R. Cysewski & Charles R. Lên men liên tục trong điều kiện chân không và tái sử
W., 1978.

dụng tế bào nấm men. Mật độ tế bào 124 g khô/l, sản
lượng cồn cực đại 82 g/l/giờ.

Minoru et al, 1983.

Hệ thống lên men liên tục từ rỉ đường với năng suất 2,4
nghìn lít ethanol/ngày, sử dụng kỹ thuật cố định tế bào
S. cerevisiae trên hạt gel canxi alginat. Hệ thống vận
hành ổn định trên 400 giờ với hệ điều khiển tự động mà
không cần thanh trùng cơ chất.

Koutinas

A.,

Gourdoupis

Psarianos

C.,

Kaliafas

A.

C., Cố định tế bào nấm men trên xốp sứ. Tốc độ pha loãng
& từ 0,06 - 0,26 l/l/giờ, sản lượng cồn 3,0 - 7,4 g/l/giờ,

9


Kanellaki M.H., 1990.

nồng độ chất khô 29,6%.

Wieczorek A. & Michalski H., Sử dụng chủng nấm men S. cerevisiae có khả năng kết
1994.

chùm cao. Tỉ lệ giống 50 kg men khô/1000 lít, nồng độ
đường tổng số 17%, sản lượng cồn 79 - 80 g/l/giờ, tốc
độ tiếp dịch < 0,2 l/l/giờ.

Gilson & Thomas, 1995, Mỹ.

Lên men liên tục bằng tế bào nấm men S. cerevisiae cố
định trong hạt canxi alginat, hàm lượng ethanol trong
dịch lên men từ rỉ đường bằng phương pháp này là từ
47,4 - 55,3 g/l, năng suất 7,3 - 10,4 g/l/giờ, hiệu suất
(yield) 62 - 74%

Szajni B., Buzs Z., Dallmann K., Tế bào nấm men được cố định trong hạt celluloza. Nồng
Gimesi I., Krisch J., Taxth M., độ đường 10%, tốc độ tiếp dịch 0,015 l/l/giờ, nồng độ
1996, Hungari.

cồn cồn đạt được 40 g/l.

Sheoran A., B.S.Yaday, P. Nigam Nấm men S. cerevisiae được cố định trong canxi alginat.
& D. Singh, 1997, Anh.

Nồng độ đường 10%, tốc độ tiếp dịch 0,2 l/l/giờ, cồn 5,4
%v/v.

Bayrock and Michael Ingledew Lên men liên tục với nồng độ đường cao: Nồng độ

W., 2001, Canada.

đường 32% w/v, nồng độ cồn cực đại là 16,73 %v/v.

Plessas S., Bekatorou A., Koutinas Nấm men S. cerevisiae được cố định trên vỏ cam. Cơ
A.A., Soupioni M., Banat I.M., chất lên men glucoza, rỉ đường, chất chiết quả nho ở các
Marchant R., 2007, Anh.

nhiệt độ 15 - 30ºC, thời gian lên men ngắn 5 - 15 giờ và
hoạt tính tạo ethanol khá cao (trung bình 150,6 g/l), cho
thấy đây là mô hình phù hợp cho cho ứng dụng thực
tiễn.

Latifa

Jamai,

Jamal

El

Khalil

Yamani,

Ettayebi, Candida tropicallis là vi sinh vật có ứng dụng rất tiềm
Mohamed năng trong sản xuất cồn do khả năng lên men tinh bột ở

Ettayebi, 2007.

tốc độ thấp. Sản xuất cồn từ tinh bột sử dụng C.
tropicallis tự do và cố định không đòi hỏi giai đoạn
đường hóa, từ dung dịch 9 % tinh bột tan đã thu được
43,1 g ethanol/lít trong 65 giờ.

Bai F.W., Anderson W.A., Moo- So với S. cerevisiae, hiệu suất tạo cồn của Zymomonas
Young M., 2008, Canada.

mobilis là cao hơn do tạo ít sinh khối và tốc độ trao đổi

10


chất tạo thành cao hơn. Tuy nhiên, do việc sử dụng cơ
chất đặc biệt và sinh khối không dùng được cho chăn
nuôi nên loài này chưa thể thay thế cho S. cerevisiae
trong sản xuất cồn.
Svetlana Nikoli, Ljiljana Mojovi, Quá trình lên men và đường hóa diễn ra đồng thời sử
Marica Rakin, Dusanka Pejin, dụng tế bào cố định S. cerevisiae var ellipsoideus. Tế
2009, Serbia.

bào được cố định trong Ca-alginat bằng phương pháp
tạo giọt tĩnh điện. Nồng độ cồn đạt được 10,23 %v/v,
hiệu suất lên men đạt 98,98 %, hiệu suất tạo cồn 0,55,
hoạt tính tạo sản phẩm theo thể tích 2,13 g/l/giờ.

Yu

J.,

Zhang

X.,

Tan

2009,Trung Quốc.

T., Đã tối ưu hóa thành phần môi trường 0,77 g/l phosphat,
2,15 g/l nitơ, pH 6,39, tốc độ lên men đạt 122,85 g/l/giờ.

Liu Chun-Zhao, Wang Feng, Fan Lên men bằng tế bào vi khuẩn cố định trong các hạt từ
Ou-Yang, 2009, Trung Quốc.

tính được thực hiện thành công trong thiết bị phản ứng
dòng chảy ổn định từ tính. Để phát triển hệ thống sản
xuất cồn từ nguyên liệu rẻ tiển, rỉ đường được làm
nguyên liệu chính cho quá trình lên men liên tục.

Có thể nhận thấy rằng các nghiên cứu gần đây trên thế giới tập trung chủ yếu
vào nghiên cứu một số yếu tố để nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình lên men như
lựa chọn các chất mang dùng cho việc cố định tế bào, lựa chọn các chủng vi sinh vật,
tối ưu hoá điều kiện môi trường. Quá trình lên men liên tục có sử dụng tế bào vi sinh
vật cố định được tập trung nghiên cứu nhiều vì những ưu điểm nổi trội của phương
pháp này. Việc cố định tế bào giúp cho các tế bào luôn được giữ lại trong thiết bị phản
ứng không bị thoát ra theo dịch đầu ra nên rất thích hợp cho quá trình lên men liên tục,
giúp cho nồng độ tế bào trong thiết bị lên men liên tục luôn ổn định, không cần phải bổ
sung thêm dịch nhân giống tế bào định kỳ để bù cho lượng bị mất theo dòng chảy ra.
Điều này giúp cho việc điều khiển quá trình lên men được diễn ra đơn giản hơn. Sản
xuất cồn nhiên liệu bằng phương pháp cố định tế bào nói chung phụ thuộc vào 3 yếu tố

chính: sinh lý nấm men, thiết kế hệ thống lên men và phương pháp cố định tế bào.
1.2. KHÁI QUÁT VỀ LÊN MEN LIÊN TỤC
11


Nghiên cứu công nghệ lên men liên tục đã được thực hiện vào những năm đầu
của những năm năm mươi với các công trình khoa học của Mono, sau đó vấn đề được
mở rộng và phát triển bởi Herbert, Malckm Yerusalimsky, Nowik, Brycon và nhiều tác
giả khác [17]. Trong một số ngành sản xuất, phương pháp này đã được ứng dụng rộng
rãi và thu được nhiều kết quả hết sức to lớn như: sản xuất bia liên tục, công nghệ sản
xuất sinh khối, sản xuất rượu cồn, lên men axeton-butanol…
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của hệ thống lên men liên tục [17]
Có hai hệ thống lên men liên tục, hoạt động theo hai nguyên tắc khác nhau:
Nguyên tắc thứ nhất: Môi trường dinh dưỡng (cơ chất) chảy qua thiết bị phải
chứa ở mức dư thừa các chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.
Môi trường này được gọi là nhân tố không thay thế, hay nhân tố điều khiển. Tốc độ
dòng cơ chất chảy vào thiết bị lên men phải nhỏ hơn tốc độ cần thiết bảo đảm sự sinh
trưởng cực đại của vi sinh vật. Do bị khống chế như vậy, rõ ràng khả năng phát triển
cực đại của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào tốc độ dòng cơ chất chảy vào
mà chỉ phụ thuộc vào nồng độ của nhân tố điều khiển. Vì vậy, thông qua việc điều
chỉnh nồng độ của nhân tố này ta hoàn toàn có khả năng điều khiển được tốc độ sinh
sản. Những hệ thống như vậy được Herbert và Nowik gọi là chemostat, còn Mono thì
gọi chúng là bactogen.
Nguyên tắc thứ hai: Thể tích dịch nuôi (dịch lên men) và mật độ tế bào trong đó
(độ đục) được duy trì ổn định nhờ việc điều chỉnh tốc độ dòng môi trường đi vào bình
lên men, thông qua một tế bào quang điện và dòng điện chạy qua nó. Những hệ thống
như vậy được Bryson gọi là turbidostat.
1.2.2. Đặc điểm của phương pháp
¾ Đặc điểm của phương pháp: Môi trường liên tục đưa vào thiết bị lên men và sản
phẩm liên tục lấy ra từ thiết bị lên men.

¾ Ưu điểm của phương pháp:
-

Rút ngắn được thời gian lên men.

-

Giảm bớt thể tích của toàn bộ thiết bị.
12


-

Thao tác dễ dàng và tạo nhiều khả năng tự động hóa.

-

Hiệu suất thu hồi rượu tăng so với các phương pháp lên men khác.

¾ Nhược điểm của phương pháp:
-

Cần độ vô trùng tuyệt đối cao.

-

Nếu bị nhiễm khuẩn thì khó xử lý.

-

Cần có các nhân viên chuyên nghiệp có trình độ tay nghề vững vàng để vận

hành hệ thống thiết bị.
1.2.3. Các phương pháp lên men liên tục [17]
Yerusalimsky phân chia các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong các thiết bị
hoạt động theo nguyên lý liên tục thành bốn nhóm sau:
-

Các phương pháp, trong đó môi trường nuôi cấy được khuấy đảo cho đến lúc
nồng độ của các chất trong dòng vào giảm, còn nồng độ của các sản phẩm trao
đổi chất thì tăng lên đến một mức xác định.

-

Các phương pháp, trong đó môi trường nuôi cấy được nạp vào thiết bị lên men,
có thể gián đoạn hoặc liên tục. Nồng độ của các chất dinh dưỡng và các sản
phẩm trao đổi chất luôn luôn cố định ở những mức nào đó nhưng thể tích của
dịch lên men thì tăng dần. Đến một lúc nào đó, khi thể tích đạt đến mức cần
thiết thì dòng vào của cơ chất dừng lại. Nhóm phương pháp này được ứng dụng
chủ yếu trong công nghệ sản xuất sinh khối.

-

Các phương pháp bán liên tục, trong đó quá trình nuôi cấy được lặp lại theo chu
kỳ.

-

Các phương pháp, trong đó cơ chất được liên tục nạp vào còn sản phẩm liên tục
đi ra khỏi thiết bị lên men (chảy vào bao nhiêu thì chảy ra bấy nhiêu). Nhóm các

phương pháp này bao gồm hai loại: hệ đồng nhất và hệ không đồng nhất.
Ở hệ đồng nhất, nồng độ của chất dinh dưỡng và các sản phẩm của quá trình

trao đổi thay đổi phụ thuộc vào tốc độ của dòng vào. Ở tốc độ không đổi, thành phần
của môi trường là một đại lượng thay đổi theo không gian, tức là ở các vị trí khác nhau
13


trong thiết bị lên men thì thành phần của chúng khác nhau. Nhưng tại một vị trí thì
thành phần của dịch lên men là những đại lượng không thay đổi theo thời gian. Mặc dù
xét theo quan điểm công nghệ thì quá trình đó mang đầy đủ tính chất liên tục, nhưng
nếu xét theo quan điểm sinh lý thì nó lại mang tính gián đoạn. Các hoạt động sống của
tế bào diễn ra, thực chất là trong mội môi trường bất động.
Ở các phương pháp nuôi cấy liên tục đồng nhất, tế bào vi sinh luôn luôn ở trạng
thái di động do được đảo trộn bằng cánh khuấy. Ở điều kiện này tế bào có đủ cơ hội để
sinh sản ở mức cao nhất. Xét theo quan điển công nghệ và sinh lý, các quá trình ở
trong hệ này mới thực sự mang đầy đủ ý nghĩa của thuật ngữ liên tục.
1.3. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
Kỹ thuật cố định xúc tác sinh học nói chung và cố định tế bào nói riêng tuy mới
ra đời nhưng đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời
sống. Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào đã được nhiều nhà khoa học
nghiên cứu. Đã có khá nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến việc sử dụng tế bào cố
định để lên men đồ uống, trong đó có cồn, vang và sâm banh. Trên cơ sở đó, nhiều dây
truyền thiết bị có quy mô từ nhỏ tới lớn đã ra đời và ít nhiều thương mại hóa, bước đầu
khẳng định tính ưu việt của công nghệ mới so với công nghệ truyền thống. Đó là hệ
thống thiết bị không phức tạp lắm và xúc tác sinh học có thể sử dụng liên tục trong thời
gian dài. Hơn nữa, lên men nhờ các tế bào cố định diễn ra nhanh hơn, thu được sản
lượng cồn cao hơn, ít phụ phẩm hơn và dễ dàng làm trong hơn so với lên men nhờ tế
bào tự do [18, 13, 24].
Cố định tế bào được định nghĩa là: “Cố định các cơ thể sống lên trên những khu

vực xác định của bề mặt chất mang nào đó nhưng vẫn giữ nguyên được hoạt tính xúc
tác và sức sống của các cơ thể sống này” [27].
Bảng 1.3. Phạm vi ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào.
Lĩnh vực
1. Sản xuất công nghiệp
Dược phẩm

Nội dung
Thủy phân chọn lọc Penicillin G, chuyển hóa Steroid, sản xuất
kháng thể đơn dòng, sản xuất vacxin cho động vật.

14


Thực phẩm

Đồng phân hóa glucoza thành fructoza, thủy phân tinh bột và
polimer thành glucoza, sinh tổng hợp axit amin, sản xuất cồn,
vang, bia, bia không cồn, enzim.

Hóa chất

Sản xuất các alpha-xeto-axit, axeto, butanol, thực hiện các phản
ứng nhờ hệ enzim dehydrogenaza.

2. CN môi trường

Xử lý nước thải

3. Phân tích

Sản xuất các kít phân tích, phân tích các hoocmon, các chất ảnh
hưởng khác đến trao đổi chất của tế bào, phân tích một số gốc
hóa học đặc trưng, phân tích sắc ký hấp thụ, đếm nhanh tế bào.

4. Y học

Nuôi cấy trong ống nghiệm điều trị bệnh thận, tụy, phát triển
nhân tạo một số các cơ quan.

5. Hóa sinh cơ bản

Phân tích chọn lọc các polimer sinh học, nuôi cấy và nghiên
cứu đặc tính sinh lý của tế bào.

Kỹ thuật cố định tế bào nấm men phổ biến nhất hiện nay là bao gói tế bào trong
khuôn đuợc tạo ra từ gel của một loại polymer không độc (ví dụ như: alginat, chitosan,
thạch, pectin, gelatin, silicagel...). Kỹ thuật này được thực hiện sau khi tế bào nấm men
phát triển trong môi trường dinh dưỡng để cho các tế bào này có thể xâm nhập và
chiếm đầy trong khuôn. Phương pháp này có một ưu điểm là có thể đưa vào trong
khuôn cố định một lượng sinh khối tế bào lớn hơn đáng kể so với phương pháp cố định
trong hay trên các chất mang [22].
Một số đặc điểm cần lưu ý của phương pháp này [29]:
-

Các khuôn chứa đủ rỗng: cho phép sự khuếch tán các cơ chất và sản phẩm diễn
ra liên tục, đảm bảo sự phát triển của các tế bào không bị hạn chế.

-

Độ bền cơ học của các khuôn gel: giảm tối thiểu lượng vỡ gel làm mất các tế
bào nấm men khỏi khuôn gel khi xuất hiện các bọt CO2 sinh ra trong quá trình
lên men.

-

Hiện tượng mài mòn: do sự tiếp xúc giữa các hạt với nhau (trong các thiết bị
khuấy).

-

Sự chèn ép giữa các hạt trong các bộ phận phản ứng khép kín cũng có thể phá
vỡ mối liên kết giữa các tế bào đã được cố định.
15


1.4. RỈ ĐƯỜNG MÍA
Rỉ đường mía là phần còn lại của dung dịch đường sau khi tách phần đường kết
tinh. Số lượng và chất lượng rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, vị
trí địa lý và trình độ kĩ thuật chế biến của nhà máy đường. Thông thường rỉ đường mía
thu được bằng 3 - 4 % trọng lượng mía đưa vào chế biến [4].
1.4.1. Thành phần của rỉ đường [4, 7]
Thành phần chính của rỉ đường là đường, các chất phi đường và nước.
-

Hàm lượng nước: Nước trong rỉ đường tồn tại ở trạng thái tự do hoặc trạng thái
liên kết (dạng hydrat hóa) chiếm khoảng 18 - 30 %.

-

Hàm lượng chất khô: Tổng lượng chất khô trong rỉ đường chiếm khoảng 75 - 82
%, trong đó có 40 - 70% đường tổng số. Trong số này có 25 - 40 % là đường
saccharoza, 15 - 20% là đường khử, ngoài ra lượng đường không lên men chiếm
khoảng 3 - 5% (trong phần này có 30 - 32 % hợp chất hữu cơ, 8 - 10 % hợp chất
vô cơ). Rỉ đường càng để lâu thì lượng đường càng tăng (từ 0,5 - 2 %). Ngoài ra
trong rỉ đường còn có rafinoza (0,01 - 0,3 %).

-

Các chất hữu cơ không chứa nitơ: Lượng arabinoza, chất nhầy, chất màu và chất
thơm.

-

Các hợp chất vô cơ: Chủ yếu là các muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ
đường như muối kali, natri, canxi.

-

Các hợp chất màu : Rỉ đường thường có màu nâu sẫm hay nâu đen, chủ yếu là
do hỗn hợp các chất màu tạo thành.

+ Hợp chất caramen : Tạo thành do sự mất nước của đường saccharoza dưới tác
dụng của nhiệt độ. Khi pH không đổi thì cường độ mài tỉ lệ thuận với nhiệt độ và
thời gian đun nóng.
+ Phức chất phenol-Fe2+: có màu vàng xanh, không thể loại hết ở giai đoạn làm
sạch nước mía và sau đó đi vào rỉ đường.
+ Melannoidin: là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và axit amin.
16

+ Melanin: là sản phẩm oxi hóa khử các axit amin ở dạng vòng có trong rỉ đường
(chủ yếu là tyrozin) dưới tác dụng của enzim polyphenoloxydaza khi có mặt oxi và
Cu2+.
-

Chất keo: Chủ yếu là các chất pectin, chất sáp, chất nhờn. Các chất này có ảnh
hưởng xấu tới nấm men vì nó tạo màng nhầy bao bọc quanh tế bào và sẽ ngăn
cản quá trình hấp thụ dinh dưỡng, làm giảm hoạt tính sinh học, ức chế quá trình
lên men, hạn chế tạo sinh khối. Ngoài ra chất keo còn là nguyên nhân chính tạo
bọt trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật.

-

Các axit hữu cơ: axit aconitic, các sản phẩm phân hủy đường nghịch đảo như
metyl furfurol, axit acetic, axit lactic, axit malic...

-

Các nguyên tố vi lượng : Fe, Cu, Br, Mn, Pb, Bo, As, Ag, Zn, Co...

-

Vitamin: thimin, riboflavin...

-

Chất kích thích sinh trưởng: biotin, axit pantotinic, inozit...

-

Các chất thơm: Rỉ đường có mùi thơm đặc trưng dễ chịu của caramen và các
chất cháy khác. Khi phân tích rỉ đường người ta thu được khoảng 20 % chất
thơm chủ yếu ở dạng aldehit, axit butyric, axit furic, axetaldehit, axeton...

1.4.2. Vi sinh vật tạp nhiễm trong rỉ đường
Mật rỉ nhận được từ sản xuất luôn chứa một lượng lớn vi sinh vật. Một phần
chúng được đưa vào từ nguyên liệu đầu, một số từ không khí, đất, nước. Phần lớn vi
sinh vật có trong rỉ đường là do nhiễm tạp trong quá trình chế biến, bảo quản và vận
chuyển rỉ đường. Trong số vi sinh vật bị nhiễm, nguy hiểm nhất là vi khuẩn lactic và
acetic. Lượng vi sinh vật nhiễm tạp có thể chia thành 3 loại.
Bảng 1.4. Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật [4].
Loại rỉ đường

Lượng vi sinh vật
nhiễm tạp (CFU/g)

I

< 105

II

105 ÷ 106

Đánh giá và xử lý
Loại tốt không cần xử lý
Loại trung bình, cần xử lý, qua sơ chế
và thanh trùng.

17


Nhiễm tạp mạnh, cần phải qua sơ
chế, xử lý bằng nhiệt, chất sát trùng...

> 106

III

1.4.3. pH và lực đệm của rỉ đường mía
Rỉ đường có pH khoảng từ 4,5 - 6.5. Sự giảm pH là do các vi sinh vật nhiễm tạp
có trong rỉ đường gây ra. Trong quá trình bảo quản, các vi sinh vật này chuyển hóa
đường thành các axit hữu cơ. Khi ta cho thêm HCl hoặc H2SO4 vào rỉ đường, các axit
này sẽ tác dụng với muối kiềm của axit hữu cơ tạo thành các muối vô cơ như KCl,
NaCl, K2SO4, Na2SO4 và các axit hữu cơ tự do làm pH của rỉ đường thay đổi rất ít. Lực
đệm này được biểu hiện mạnh nhất ở pH = 3 - 5 và rất ít ở pH = 6 - 7.
Như vậy, lực đệm của rỉ đường có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình lên
men vì nó giữ cho pH của môi trưởng ít bị biến động trong khoảng nhất định nên tạo
được sự ổn định cho nấm men phát triển. Nhưng ngược lại, lực đệm của rỉ đường cũng
có ảnh hưởng xấu cho việc xử lý rỉ đường trước khi lên men rượu vì phải tốn nhiều axit
để axit hóa rỉ đường.
1.4.4. Các phương pháp xử lý rỉ đường
Việc xử lý rỉ đường nhằm loại bỏ tạp khuẩn, đồng thời phá hủy hoặc loại bớt
các hợp chất có hại cho quá trình lên men như chất keo, SO2, chất màu, axit hữu cơ là
rất cần thiết. Nếu rỉ đường được xử lý tốt, quá trình lên men diễn ra nhanh chóng, hạn
chế được khả năng nhiễm tạp, nâng cao hiệu suất lên men. Hiện nay, có hai phương
pháp xử lý chính:
a. Phương pháp hóa học
Người ta sử dụng H2SO4 có khả năng làm đông tụ, kết tủa các chất keo. Lượng

H2SO4 cho vào phụ thuộc vào tính chất kiềm hay axit của rỉ đường.
CaCO3 + H2SO4 → CaSO4 + H2O + SO2
Một số muối của axit hữu cơ như oxalat, lactat dưới tác dụng của axit sunfuric
sẽ tạo thành axit hữu cơ tự do. Axit hóa kết hợp tác dụng của nhiệt độ nhằm loại bớt
các tạp chất tro, keo và tạp trùng, thủy phân một phần saccharoza thành glucoza và
18