nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su thiên nhiên

Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

LỜI CAM ĐOAN
Tôi Đỗ Công Thịnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài
“Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy
cao su thiên nhiên” là công trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi thực hiện
dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Lan Hương. Số liệu, kết quả trình bày
trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa công bố trong bất cứ công trình khoa
học nào khác.

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
i


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

LỜI CẢM ƠN
Tôi Đỗ Công Thịnh xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS.Nguyễn
Lan Hương – Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học & Công
nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hướng dẫn chỉ bảo tận
tình trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học C10 đã giúp đỡ
dạy bảo tôi trong thời gian làm việc tại phòng thí nghiệm.
Bên cạnh đó người thân và bạn bè luôn là động lực, là nguồn động viên tôi đặc
biệt là các anh chị và các bạn làm việc cùng tôi tại Phòng thí nghiệm Công nghệ
sinh học C10 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn này.
Chân thành!

Đỗ Công Thịnh

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
ii


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ......................................................................................3
1.1 Giới thiệu về cao su thiên nhiên ............................................................................3
1.1.1 Cây cao su ..........................................................................................................3
1.1.2 Mủ cao su thiên nhiên ........................................................................................3
a. Thành phần hóa học ................................................................................................3
b. Cấu trúc và tính chất ...............................................................................................4
1.1.3 Tình hình sản xuất cao su ...................................................................................4
a. Tình hình sản xuất cao su trên thế giới ...................................................................4
b. Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam ....................................................................5
1.2. Vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên ..............................................................6
1.2.1. Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su trên thế giới .......................................6
1.2.2 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su ở Việt Nam.......................................11
1.2.3. Sự phân hủy cao su bằng tập hợp vi sinh vật ..................................................12

1.3 Con đường phân hủy cao su ................................................................................13
1.4 Một số phương pháp đánh giá KNPH cao su bằng vi sinh vật ...........................14
1.5. Một số phương pháp xác định sự biến động của hệ vi sinh vật bằng kỹ thuật
sinh học phân tử ........................................................................................................16
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
iii


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

1.5.1. Kỹ thuật DGGE ...............................................................................................18
1.5.2. Metagenomics .................................................................................................19
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................21
2.1 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................21
2.1.1. Nguồn vi sinh vật ............................................................................................21
2.1.2 Cơ chất thử KNPH cao su của vi sinh vật ........................................................21
2.1.3 Thiết bị .............................................................................................................21
2.1.4 Môi trường nuôi cấy .........................................................................................22
2.1.5 Hóa chất ...........................................................................................................23
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...............................................................23
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................23
2.2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................24
2.2.2.1. Làm giàu tập hợp vi sinh vật ........................................................................24
2.2.2.2. Sự giảm khối lượng miếng cao su ................................................................24
2.2.2.3. Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt miếng cao su bằng kỹ
thuật SEM. .................................................................................................................25
2.2.2.4. Phân tích sản phẩm phân hủy cao su tổng hợp bằng kỹ thuật GPC ...........25
2.2.2.5. Xác định sự biến động về thành phần vi sinh vật trong mẫu làm giàu theo

thời gian. ...................................................................................................................26
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................29
3.1. Làm giàu tập hợp vi sinh vật trong bể làm giàu .................................................29
3.2. Đánh giá sự phân hủy cao su của canh trường làm giàu ....................................29
3.2.1. Sự giảm khối lượng miếng cao su ...................................................................29
3.2.3. Đánh giá khả năng phân hủy cao su tổng hợp ................................................33
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
iv


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

3.3.1. Nghiên cứu sự biến động thành phần vi sinh vật theo thời gian bằng kỹ thuật
DGGE ........................................................................................................................35
3.3.2. Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật bằng phương pháp
metagenomics ............................................................................................................37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................50
PHỤ LỤC .................................................................................................................54

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
v


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
KNPH

Khả năng phân hủy

GPC

Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography)

SEM

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy)

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

TLC

Sắc ký bản mỏng (Thin-Layer chromatography)

HPLC

Sắc lý lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography)

MSM

Môi trường muối khoáng (mineral salt medium)

LB

Luria – Bertani Broth

DGGE

Điện di biến tính Gradient nồng độ (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis)

HPLC-MS

Sắc ký lỏng cao áp- khối phổ (High-pressure liquid
chromatography- mass spectrometry)

UV

Tia tử ngoại (Ultra violet)

GC

Sắc ký khí (Gas Chromatography)

MS

Khối phổ (Mass spectrometry)

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
vi

Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1 : Thành phần hóa học của mủ nước ...........................................................3
Bảng 2. 1: Thành phần môi trường MSM .................................................................22
Bảng 2. 2: Thành phần môi trường LB .....................................................................22
Bảng 2. 3: Trình tự mồi 806Ri sử dụng trong nghiên cứu ........................................28
Bảng 3. 1: Sự đa dạng vi sinh vật trong quá trình phân hủy sinh học cao su thiên
nhiên của mẫu làm giàu theo thời gian .....................................................................37
Bảng 3. 2: Tỷ lệ một số chi vi sinh vật chính trong mẫu làm giàu theo thời gian nuôi
cấy .............................................................................................................................42
Bảng 3. 3: Các chủng vi sinh vật phân lập được ......................................................45

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
vii


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1: Công thức hóa học của cao su thiên nhiên ............................................4
Hình 1. 2: Sản lượng cao su toàn cầu hàng năm .....................................................5
Hình 1. 3: Thị phần sản xuất cao su thiên nhiên của Việt Nam .............................6
Hình 1. 4 Con đường phân hủy mủ cao su .............................................................13
Hình 1. 5: Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng để nghiên cứu tính đa
dạng về cấu trúc và chức năng của vi sinh vật trong môi trường .........................17
Hình 2. 1: Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................23

Hình 2. 2: Quá trình tiến hành giải trình tự bằng metagenomics.........................27
Hình 3. 1: Sự biến đổi về sinh khối vi sinh vật của bể làm giàu theo thời gian
nuôi cấy .....................................................................................................................29
Hình 3. 2: Sự giảm khối lượng miếng cao su theo thời gian .................................30
Hình 3. 3: Ảnh chụp SEM bề mặt miếng cao su theo thời gian nuôi cấy trong
mẫu làm giàu ............................................................................................................32
Hình 3. 4: Sản phẩm phân hủy cao su tổng hợp của mẫu làm giàu theo thời gian
nuôi cấy bằng phân tích GPC ..................................................................................34
Hình 3. 5: Phổ DGGE của mẫu làm giàu theo thời gian .......................................36
Hình 3. 6: Một số ngành chính trong mẫu làm giàu theo thời gian ....................39
Hình 3. 7: Một số bộ vi sinh vật chính trong mẫu làm giàu theo thời gian ..........40
Hình 3. 8: Tỷ lệ loài N. facinica trong mẫu làm giàu theo thời gian ...................43
Hình 3. 9: Sự giảm khối lượng miếng cao su sau 30 ngày nuôi cấy của các chủng
phân lập và các chủng chuẩn (NVL3, E2)..............................................................46
Hình 3. 10: Kết quả chạy GPC khi nuôi cấy các chủng đơn trên MSM với nguồn
cacbon là cao su tổng hợp sau 30 ngày ...................................................................47

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
viii


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

MỞ ĐẦU
Cao su là thành phần chính của nhiều loại sản phẩm: lốp xe, găng tay cao su,
ủng… bởi những đặc tính vượt trội như độ đàn hồi cao, tính chống rách và chống
mài mòn. Sản lượng cao su toàn cầu năm 2014 đạt khoảng 27,5 triệu tấn bao gồm
cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp. Dự kiến trong năm 2015 nhu cầu tiêu thụ cao

su thiên nhiên trên toàn thế giới là khoảng 12,3 triệu tấn. Các nước Thái Lan,
Indonesia, Malaysia, Việt Nam là những nước sản xuất cao su thiên nhiên hàng đầu
khu vực Đông Nam Á. Năm 2014, Việt Nam đã vươn lên trở thành nước đứng thứ 3
trên thế giới về sản xuất cao su thiên nhiên và giữ vị trí thứ 4 về xuất khẩu cao su.
Tại Việt Nam ngành công nghiệp sản xuất cao su thiên nhiên đang mang lại
hiệu quả kinh tế cao. Từ năm 2006 đến nay xuất khẩu cao su thiên nhiên đạt trên 1
tỷ USD chiếm trung bình khoảng 2 - 3 % tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nước và
đã tạo công ăn việc làm cho nhiều lao động. Cùng với những lợi ích từ ngành công
nghiệp này thì chất thải cao su là một vấn đề đáng lo ngại. Chất thải từ ngành công
nghiệp sản xuất cao su cũng như các sản phẩm có chứa cao su rất kém phân hủy,
dẫn đến các nguy cơ ô nhiễm nghiêm trọng. Các biện pháp xử lý cao su thải hiện
nay đang được sử dụng rộng rãi là chôn lấp và nhiệt phân. Tuy nhiên, các biện pháp
này còn nhiều bất cập, việc chôn lấp gây tốn diện tích của bãi chôn lấp, đốt cao su
phế liệu để làm nhiên liệu trong các nhà máy gây ra ô nhiễm môi trường và không
hiệu quả về kinh tế. Phân hủy sinh học cao su đã nhận được sự quan tâm lớn của các
nhà khoa học vì không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng. Ngoài ra
phân hủy sinh học cao su còn tận dụng được các nguồn cao su phế thải để tái tạo
như là nguồn nguyên liệu mới thay thế cho cao su thiên nhiên hiện nay.
Các nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cao su được tiến hành trong gần 100
năm qua đã tìm ra nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân hủy cao su mạnh như:
Streptomyces, Micromonosopora, Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium,
Gordonia…. Các vi sinh vật này được chia làm 2 nhóm theo đặc tính sinh trưởng
khác nhau trên cao su. Nhóm thứ nhất là xạ khuẩn với vòng sáng xung quanh khuẩn

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
1

Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

lạc khi phân lập trên môi trường thạch mủ cao su. Nhóm thứ 2 không có vòng sáng
và không phát triển trên môi trường thạch mủ cao su, nhưng chúng phát triển trên
cao su như một chất kết dính bắt buộc.
Tuy nhiên, việc phân hủy đặc biệt đối với các chất khó phân hủy trong thiên
nhiên cần sự tham gia đồng thời của một tập hợp các chủng vi sinh vật với tập hợp
các enzyme của quá trình, chứ không phải chỉ là tác động đơn lẻ của một chủng hay
của một enzyme. Bức tranh này, cho tới nay vẫn chưa được sáng tỏ. Để góp phần
tìm hiểu khả năng phân hủy cao su cũng như vai trò của tập hợp vi sinh vật phân
hủy cao su chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân
hủy cao su thiên nhiên”
Các vấn đề cần giải quyết bao gồm:
1. Làm giàu tập hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy cao su
2. Đánh giá khả năng phát triển và phân hủy cao su của canh trường làm
giàu
3. Nghiên cứu sự biến động về thành phần vi sinh vật trong canh trường làm
giàu theo thời gian bằng kỹ thuật điện di gel biến tính gradient nồng độ
(DGGE) và metagenomics.
4. Phân lập vi sinh vật từ mẫu làm giàu.

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
2


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về cao su thiên nhiên
1.1.1 Cây cao su
Cao su (tên khoa học : Hevea brasiliensis), là cây thân gỗ có thể cao trên 30
m, thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae) và là thành viên có tầm quan trọng kinh tế
lớn nhất trong chi Hevea. Nó có tầm quan trọng kinh tế là do chất lỏng chiết ra tựa
như nhựa cây (gọi là mủ) được dùng để sản xuất cao su thiên nhiên. Nhựa cao su
(mủ cao su) màu trắng hay vàng có trong các mạch nhựa mủ ở vỏ cây. Các mạch
này tạo thành xoắn ốc quanh thân cây theo hướng tay phải, tạo thành một góc
khoảng 30 độ với mặt phẳng. Khi cây đạt độ tuổi 5 - 6 năm thì người ta bắt đầu thu
hoạch mủ. Mủ cao su được thu thập trong các bát nhỏ. Các cây cao su trồng càng
lâu năm thì cho mủ càng nhiều, nhưng chúng sẽ ngừng sản xuất mủ khi đạt độ tuổi
26 - 30 năm [2].
1.1.2 Mủ cao su thiên nhiên
a. Thành phần hóa học
Mủ cao su thiên nhiên là dạng nhũ tương trong nước của các hạt cao su,
chúng có màu trắng đục hay hơi vàng. Các hạt cao su có kích thước rất nhỏ khoảng
0,05– 3 μm và có hình cầu, đường kính trung bình của các hạt này khoảng 0,26 μm.
Các thành phần hóa học của mủ nước được thể hiện ở bảng 1.1 sau:
Bảng 1. 1 : Thành phần hóa học của mủ nước [2]
% theo khối lƣợng

Thành phần
Cao su nguyên chất

30 – 40

Nước

52 – 70

Protein

2–3

Axit béo và dẫn xuất

1–2

Glucid và heterosid

1
0,3 – 0,7

Khoáng chất

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
3


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

b. Cấu trúc và tính chất
Mủ cao su (latex) gồm hai phần cơ bản: phần lỏng và phần rắn. Phần lỏng chủ
yếu là nước và một số chất hòa tan trong nước gọi là serum. Phần rắn bao gồm
những hạt cao su nguyên chất, các chất không tan trong nước cấu thành hạt huyền
phù lơ lửng trong serum. Các hạt huyền phù được cấu tạo gồm 2 lớp: lớp bên trong
gồm cao su nguyên chất, lớp bên ngoài gồm các protein, lipid,… làm cho các hạt

này không dính vào nhau và lơ lửng trong serum. Khi lớp ngoài này bị phá hủy thì
gây nên hiện tượng đông tụ. Tỷ trọng của mủ nước trong khoảng 0,8 – 0,975 g/ml.
Tỷ trọng của cao su 0,914 g/ml, tỷ trọng của serum 1,02 g/ml [2].
Cao su thiên nhiên là một hợp chất cao phân tử (polymer) có trong mủ cao su
với các đơn phân (monomer) là isoprene có công thức C5H8. Các isoprene liên kết
với nhau tại vị trí cis-1, 4 bằng phản ứng trùng ngưng tạo thành một chuỗi dài có
công thức cấu tạo như sau:

Hình 1. 1: Công thức hóa học của cao su thiên nhiên [2]
Ngoài đồng phân cis -1, 4, trong cao su thiên nhiên còn có khoảng 2% mắt
xích liên kết với nhau ở vị trí cis - 3, 4. Cao su thiên nhiên tan tốt trong các dung
môi hữu cơ mạch thẳng, mạch vòng và chlorofom. Tuy nhiên, cao su thiên nhiên
không tan trong rượu và xetone [2].
1.1.3 Tình hình sản xuất cao su
a. Tình hình sản xuất cao su trên thế giới
Sản lượng cao su toàn cầu tính từ năm 2000 đến nay luôn luôn tăng cao. Từ
năm 2010, sản lượng cao su thiên nhiên thế giới hàng năm đã vượt 10 triệu tấn/năm,
chiếm trên 40% tổng lượng cao su sử dụng. Những quốc gia thuộc hiệp hội sản xuất
cao su thiên nhiên (ANRPC) như: Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Ấn

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
4


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

Độ, Campuchia… có sản lượng cao su thiên nhiên tăng hàng năm, đóng góp khoảng
92 - 94% sản lượng cao su thiên nhiên toàn thế giới. Tính đến cuối năm 2011, tổng

diện tích cao su thiên nhiên trên thế giới đạt 11,84 triệu ha, châu Á chiếm 92,42 %
tập trung vào các quốc gia thuộc ANRPC, châu Mỹ: 5,14 % và châu Phi 2,44 %.
Trong đó đứng đầu là Thái Lan, đạt 3,4 triệu tấn, kế đến là Indonesia, Malaysia,
Việt Nam [3].
Tuy nhiên, dẫn đầu năng suất khai thác là Ấn Độ với khoảng 1,8 tấn / ha rồi
mới đến Thái Lan 1,77 tấn / ha, Việt Nam đạt 1,7 tấn / ha. Nhóm 5 quốc gia tiêu thụ
cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới là Trung Quốc (33,5%), Mỹ (9,5%), Ấn Độ
(8,7%), Nhật Bản (6,6%) và Malaysia (4,6%). Bốn quốc gia xuất khẩu cao su thiên
nhiên lớn nhất thế giới hiện nay là Thái Lan (gần 3 triệu tấn), Indonesia (2,13 triệu
tấn), Malaysia (0,95 triệu tấn) và Việt Nam (0,82 triệu tấn), chiếm 87,35% tổng sản
lượng xuất khẩu cao su thiên nhiên toàn cầu. Theo thống kê của Hiệp hội nghiên
cứu cao su Quốc tế - International Rubber Study Group (IRSG) trong năm 2014 ước
tính sản lượng cao su thiên nhiên toàn cầu đạt 12,1 triệu tấn [3].

Hình 1. 2: Sản lượng cao su toàn cầu hàng năm [3]
b. Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam
Ngành cao su xuất hiện ở Việt Nam từ trước năm 1975 và phát triển mạnh
mẽ khi tham gia vào nền kinh tế thị trường. Tính từ năm 2000 diện tích trồng cao su
tăng từ 400 – 1000 ha vào năm 2014. Cây cao su là một trong 3 sản phẩm nông sản
đóng góp nhiều nhất vào kim ngạch xuất nhập khẩu trong những năm qua chỉ sau
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
5


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

gạo và cà phê. Giá trị xuất khẩu cao su đã tăng gấp đôi từ 787 triệu USD năm 2005
lên 2,5 tỷ USD năm 2013 và đóng góp khoảng 2,7% trên tổng giá trị xuất khẩu. Sản

lượng khai thác cao su của Việt Nam có mức tăng trưởng khá cao trung bình 10%
hàng năm tính từ năm 2000. Mức sản lượng tăng cao một phần nhờ diện tích trồng
liên tục được mở rộng và năng suất cũng không ngừng tăng từ 1,2 lên 1,7 tấn / ha
chỉ sau Ấn Độ và Thái Lan [3].
Do không ngừng gia tăng về diện tích trồng cũng như năng suất của cây cao su
nên tính đến năm 2014 Việt Nam đã vượt lên trở thành quốc gia sản xuất cao su
thiên nhiên cao thứ 3 trên thế giới với sản lượng cả năm đạt khoảng 1 triệu tấn [3].

Hình 1. 3: Thị phần sản xuất cao su thiên nhiên của Việt Nam [3]
1.2. Vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên
1.2.1. Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su trên thế giới
Các nhà khoa học trên thế giới đã trải qua hàng trăm năm nghiên cứu về vi
sinh vật phân hủy cao su từ những nghiên cứu đầu tiên về nấm mốc. Hiện nay rất
nhiều nơi trên thế giới đã và đang thực hiện các nghiên cứu liên quan đến phân hủy
sinh học cao su bằng vi sinh vật bao gồm cả Nhật Bản, Đức, Ấn Độ, Malaisia, Ai
Cập, Hàn Quốc... cho thấy rõ ràng có rất nhiều sự quan tâm xoay quanh chủ đề này.
Một số vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy (KNPH) cao su đã được tìm ra
nhưng quá trình phân hủy sinh học diễn ra chậm. Năm 1936, nhà khoa học Spence
người Đức đã đưa ra phương pháp phân lập sử dụng đĩa thạch hai lớp, phương pháp
này cho phép xác định nhanh các chủng có KNPH cao su nhờ vòng sáng được tạo
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
6


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

thành xung quanh khuẩn lạc [34]. Tuy nhiên, một số vi sinh vật có KNPH cao su
nhưng không tạo ra vòng sáng xung quanh khuẩn lạc và không phát triển trên môi

trường thạch mủ cao su, nhưng chúng phát triển trên cao su như một chất kết dính
bắt buộc [5].
Dựa vào đặc tính sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật phân hủy cao
su người ta chia chúng làm hai nhóm khác nhau [27] [28]. Nhóm thứ nhất có khả
năng chuyển hóa các polyisoprene và tạo vòng sáng trên môi trường thạch mủ cao
su. Hầu hết xạ khuẩn thuộc nhóm này, chúng phát triển tương đối yếu trên cao su
thiên nhiên hay cao su tổng hợp bao gồm Streptomyces, Micromonosopora [27]
[22] [23]. Nhóm thứ 2 không có vòng phân giải và không phát triển trên môi trường
thạch mủ cao su, nhưng chúng phát triển trên cao su như một chất kết dính bắt buộc
[5]. Các chủng vi sinh vật trong nhóm này phát triển mạnh trên polyisoprene và
thuộc nhóm Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium. Một số chủng tiêu biểu
của nhóm này như chủng Gordonia polyisoprenivorans VH2 và Y2K, chủng G.
wesfalica Kb1, và chủng Mycobacterium fortuitum NF4 đã được phân lập [26] [4].
Các loài của chi Gordonia được biết đến là các loài có KNPH cao su tốt [5].
Hầu hết vi sinh vật có KNPH cao su là các vi khuẩn Gram dương, trong khi đó
sự phân hủy cao su quan sát được ở vi sinh vật Gram âm là rất ít. Hiện tại, chỉ có 2
vi khuẩn Gram âm được tìm thấy là có khả năng phân hủy cao su là chủng
Xanthomonas sp. 35Y và chủng Methylibiumsp. NS21 [21] [20].
Một số vi sinh vật điển hình phân hủy cao su
 Streptomyces sp.
Streptomyces là vi khuẩn Gram dương và hình thành vòng sáng quanh khuẩn
lạc khi nuôi cấy trên môi trường thạch hai lớp. Các loài vi sinh vật thuộc chi
Streptomyces thường được nghiên cứu nhiều về khả năng phân hủy sinh học cao su.
Năm 2000, Bode HB và cộng sự đã nghiên cứu khả năng phân hủy cao su của
chủng Streptomyces coelicolor 1A. Khi cấy chủng S. coelicolor 1A trên môi trường
thạch hai lớp ở 300C sau 1 tuần đã nhận thấy chủng này có khả năng phân hủy cao
su nhờ sự hình thành vòng sáng quanh khuẩn lạc. Bên cạnh đó nhóm tác giả còn
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B

7


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

tiến hành khảo sát sự phân hủy của chủng S. coelicolor 1A với cao su tổng hợp. Sau
10 tuần nuôi S. coelicolor 1A ở 300C với cao su tổng hợp thì hàm lượng protein của
canh trường tăng từ 250 μg/ml lên đến 800 μg/ml. Kết quả phân tích sắc ký lọc gel
(GPC) sau 6 tuần cho thấy sự xự xuất hiện của các khối pic khác nhau ngoài khối
pic cơ sở đại diện cho cao su tổng hợp. Qua đó chứng tỏ chủng S. coelicolor 1A có
khả năng phân hủy cao su tổng hợp. Phân tích sản phẩm phân hủy khi ủ S.
coelicolor 1A với cao su lưu hóa bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) nhận thấy sự xuất
hiện của một số hợp chất. Ba hợp chất được xác định bằng cộng hưởng từ hạt nhân
(1H-MNR) là: axit 2, 6 – dimethyl – 10 – oxo – undec – 6 - enoic; 5, 6 – methyl –
undec – 5 – ene - 2, 9 - dione; 5, 9 - 6, 10 – dimethyl – pentadec - 5, 6, 9 – diene - 2,
13 - dione. Tuy nhiên chủng này sau khi bị xử lý đột biến bằng tia tử ngoại (UV) thì
không còn KNPH cao su [6].
Chủng Streptomyces sp. K30 được phân lập từ đất tại thành phố Münster
(Đức). Khi cấy chủng này trên đĩa thạch hai lớp thì chúng tạo ra vùng sáng xung
quanh khuẩn lạc. Tiến hành gây đột biến Streptomyces sp. K30 bằng tia UV thì
chủng vẫn còn giữ được khả năng phân hủy cao su. Chủng Streptomyces sp. K30 có
chứa gen lcp được coi là chìa khóa của quá trình phân hủy cao su. Tách dòng gen
lcp từ chủng Streptomyces sp. K30 và biểu hiện thành công trên chủng S. lividans
TK23, chủng này vẫn giữ được KNPH cao su [32].
S. coelicolor CH13 là vi khuẩn được phân lập từ đất và có khả năng phân hủy
cao su, chủng này tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường
thạch hai lớp. Khi ủ S. coelicolor CH13 với miếng găng tay cao su sau 6 tuần nhận
thấy khối lượng của miếng găng tay giảm đi khoảng 14,3%. Ngoài ra khi quan sát
miếng găng tay cao su bằng ảnh chụp từ kính hiển vi điện tử quét (SEM) thấy sự tạo
thành các lỗ trống và sự phát triển bám dính của chủng S. coelicolor trên bề mặt

miếng găng tay cao su [33].
 Gordonia sp.
Gordonia sp. là vi khuẩn Gram dương, các loài Gordonia được phân lập từ
nhiều nguồn khác nhau như: đất, vùng rễ của các cây trồng ngập mặn, đất ô nhiễm
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
8


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

hydrocacbon, người bệnh…. Hầu hết các loài thuộc chi Gordonia đều có lợi cho
môi trường vì chúng có khả năng phân hủy các polymer thiên nhiên. Gordonia là
chi có nhiều chủng được biết đến với KNPH cao su mạnh như: G.
polyisoprenivorans VH2 và Y2K và G. wesfalica Kb1.
G. polyisoprenivorans là vi khuẩn hiếu khí, Gram dương có khả năng phân
hủy cao su và được phân lập từ nguồn nước bẩn trong lốp ô tô thải đã bị phân hủy.
Khi nhuộm Schiff’s với các mẫu găng tay cao su thiên nhiên được ủ cùng chủng G.
polyisoprenivorans VH2 sau 6 tuần thấy găng tay có màu hồng. Chứng tỏ sự xuất
hiện oligomers isoprene có chứa nhóm aldehyde, ketone trong miếng găng tay cao
su, đồng thời có sự phá vỡ số lượng các liên kết đôi trong chuỗi polyisoprene. Quan
sát sự phát triển của chủng G. polyisoprenivorans VH2 trên cao su thiên nhiên và
cao su tổng hợp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) sau 2 tuần nuôi cấy nhận thấy
sự phân hủy rõ ràng. Sau khoảng 6 tuần nuôi cấy thì có sự hình thành của lớp màng
sinh học trên bề mặt miếng găng tay cao su thiên nhiên. G. polyisoprenivorans VH2
là một trong những vi khuẩn phân hủy cao su tốt nhất và bộ gen của VH2 đã được
giải toàn bộ trình tự bộ gen. G. polyisoprenivorans VH2 chứa 5110 trình tự mã hóa
protein, người ta đã phát hiện ra sự có mặt của gen lcp [10] [9].
Phân tích các đột biến plasmid của chủng G. westfalica Kb1 cho thấy rằng

chủng này đã mất khả năng phát triển trên cao su thiên nhiên như nguồn cacbon duy
nhất, các gen ở vị trí 101 kbp megaplasmid gồm 105 khung đọc mở, đóng một vai
trò thiết yếu trong phân hủy cao su [9].
 Nocardia sp.
Nocardia sp. là vi khuẩn Gram đương có mặt trong đất giàu chất hữu cơ. Một
số loài thuộc chi Norcadia có khả năng phân hủy cao su như: Nocardia sp. 835A,
Nocardia farcinica, Nocardia sp. MBR.
Nocardia sp. 835A phát triển tốt trên cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp, là
một trong những chủng đầu tiên được nghiên cứu về KNPH cao su. Các thí nghiệm
cho thấy khi ủ chiếc găng tay cao su với chủng Nocardia sp. 835A thì sau 2 tuần
khối lượng cao su giảm đến 75% và 100% sau 8 tuần nuôi cấy. Kết quả phân tích
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
9


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

sản phẩm phân hủy bằng sắc ký lọc gel (GPC) đã cho thấy 2 phân đoạn có trọng
lượng phân tử 1x104 và 1,6x103 Da, tương ứng với 114 và 19 phân tử isoprene. Cả
hai phân đoạn được phân tích trên máy quang phổ hồng ngoại cho thấy đó là những
dẫn xuất của dolichol aldehyde. Các kết quả này được khẳng định khi sử dụng cộng
hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) và (13C-NMR), chúng gồm các nhóm aldehyde và
ketone có công thức như sau: OHC - CH2[CH2 - C( - CH3)SH - CH2]n - CH2 - C(O)
- CH3. Tuy nhiên, những nghiên cứu phân hủy sinh học cao su của chủng này không
được tiếp tục ở mức độ hóa sinh cũng như mức độ phân tử [37] [24].
Nocardia sp. MBR là một loại vi khuẩn được phân lập từ các mẫu lốp xe được
thải ra môi trường khu vực Alexandria, Ai Cập. Khi tiến hành ủ chủng Nocardia sp.
MBR với miếng găng tay cao su (1x1 cm) sau 3 tuần và tiến hành quan sát bằng

SEM thì nhận thấy sự sinh trưởng và phát triển nhanh của chủng Nocardia sp. MBR
tạo thành một lớp màng vi sinh vật trên bề mặt miếng găng tay cao su. Ở một thí
nghiệm khác Berekaa đã tiến hành nhuộm Schiff’s cho các miếng găng tay cao su
có kích thước khác nhau khi ủ với chủng Nocardia sp. MBR sau 8 tuần và nhận
thấy cả hai miếng găng tay đều có màu tím. Điều này chứng tỏ rằng đã có sự tạo
thành nhóm aldehyde trong sản phẩm phân hủy cao su. Bên cạnh đó tác giả còn tiến
hành khảo sát sự tạo thành CO2 trong khi nuôi cấy chủng Nocardia sp. MBR với
miếng găng tay cao su sau 8 tuần là 1,2% [29].
 Xanthomonas sp. 35Y
Chủng Xanthomonas sp. 35Y là vi khuẩn Gram âm, hình thành vùng sáng
quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch mủ cao su. Tiến hành ủ 0,2 mg enzyme thô
được lấy từ chủng Xanthomonas sp. 35Y với 5 mg cao su thiên nhiên trong ống
nghiệm (đường kính trong là: 25 mm) ở 300C. Khoảng 60% trọng lượng của cao su
thiên nhiên giảm đi chỉ sau 7 ngày nuôi. Phân tích sản phẩm phân hủy bằng GPC
cho thấy các hợp chất có trọng lượng dưới 104 và 103 tương ứng với 113 và 2 đơn vị
isoprene. Kết quả phân tích bằng cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR)
cho thấy các sản phẩm phân hủy có mặt của hai nhóm chức aldehyde và ketone và
có công thức sau đây: OHC - CH2 [CH2 - C(- CH3)SH - CH2]n - CH2 - C(O) - CH3.
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
10


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

Phân tích sắc ký khí (GC) và phân tích khối phổ (MS) đã xác định các hợp chất ở
phân đoạn có trọng lượng phân tử thấp là acetonyldiprenylacetoaldehyde [38].
Chủng Xanthomonas sp. 35Y có chứa gen roxA được cho là chìa khóa của sự
phân hủy cao su của nhóm vi khuẩn Gram âm [7] [21].

 Methylibium sp. NS21
Methylibium sp. NS21 là vi khuẩn Gram âm được phân lập từ đất bởi Imai và
cộng sự (2011). Chủng Methylibium sp. NS21 tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc khi
được phân lập trên môi trường thạch mủ cao su. Khi ủ chủng Methylibium sp. NS21
ở 300C trong 3 ngày trên đĩa thạch hai lớp và tiến hành nhuộm Schiff’s thì nhận
thấy xung quanh các khuẩn lạc của chủng Methylibium sp. NS21 thì có màu tím.
Chứng tỏ đã có sự tạo thành của aldehyde trong quá trình phân hủy cao su của
chủng Methylibium sp. NS21. Ngoài các thí nghiện trên nhóm tác giả còn tiến hành
khảo sát các sản phẩn tạo thành của chủng Methylibium sp. NS21 khi ủ với cao su
tổng hợp poly(cis - 1, 4 - isoprene) sau 50 và 70 ngày bằng GPC. Kết quả cho thấy
chủng Methylibium sp. NS21 có khả năng phân hủy yếu ở 50 ngày và tạo ra sản
phẩm có khối lượng khoảng 400 kDa. Tuy nhiên sau 70 ngày nuôi cấy thì sản phẩm
phân hủy của chủng Methylibium sp. NS21 có khối lượng phân tử khoảng 13 kDa
[20].
1.2.2 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su ở Việt Nam
Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên đã được thế giới quan
tâm và biết đến từ rất lâu, nhưng ở Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ.
Những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về vi sinh vật phân hủy cao su mới được
nghiên cứu bởi Trang và cộng sự (2013). Nghiên cứu đã tiến hành phân lập vi sinh
vật từ chất thải của nhà máy sơ chế cao su Cẩm Thủy và tìm ra được một số chủng
vi sinh vật có KNPH cao su là: Streptomyces griseorubens, S. albogriselus,
Nocardiopsis alba. Các chủng này được tìm ra nhờ các kết quả phân tích sự giảm
khối lượng, sự tăng hàm lượng nitơ và sự phát triển của các chủng trên bề mặt găng
tay cao su bằng SEM. Kết quả giảm khối lượng của các miếng cao su khi ủ với 4
chủng trong 30 ngày thấy khối lượng giảm đi khoảng 2,05 – 4,02%. Hàm lượng nitơ
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
11

Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

tổng trong các mẫu được ủ với găng tay cao su thu được gấp khoảng 10 – 20 lần so
với mẫu kiểm chứng. Khi quan sát bằng SEM nhận thấy các chủng không chỉ sinh
trưởng và phát triển bám dính mà chúng còn ăn sâu vào các miếng găng tay cao su.
Đây là công trình công bố đầu tiên về vi sinh vật phân hủy cao su và là một trong số
ít những công trình công bố về vi sinh vật phân hủy các hợp chất khó phân hủy ở
Việt nam. Tuy nhiên hiện tại nhóm chưa đi sâu vào phân tích các enzyme có liên
quan đến sự phân hủy cao su của các chủng này [11].
Đào Việt Linh (2013) đã phân lập thành công một tập hợp vi khuẩn phân hủy
cao su từ canh trường làm giàu với nguồn cacbon là cao su thiên nhiên. Tập hợp này
gồm 3 chủng vi khuẩn riêng biệt là: H2DA1, H2DA2, NVL3. Khả năng phân hủy cao
su của chúng đã được đánh giá bằng thí nghiệm phân hủy cao su thiên nhiên cũng
như cao su tổng hợp. Phân tích các sản phẩm phân hủy bằng GPC nhận thấy chỉ có
chủng NVL3 thể hiện khả năng phân hủy cao su, trong khi đó H2DA1và H2DA2
không thể hiện khả năng phân hủy. Chủng NVL3 khi phân hủy tạo ra các sản phẩm
có khối lượng phân tử khoảng 50 – 100 kDa [25].
Khi toàn bộ genome của NVL3 đã được giải bằng hệ thống giải trình tự thế
hệ mới, cho thấy sự tồn tại của một trình tự tương đồng gene lcp trong NVL3. Trình
tự này có độ tương đồng tương ứng là 54, 63 - 65 và 73 - 77% so với các gene lcp ở
các loài Streptomyces, Gordonia và Nocardia. Giải trình tự gen 16S rRNA của
chủng NVL3 nhận thấy chủng này thuộc loài Nocardia farcinica với 99% tương
đồng so với các chủng Nocardia farcinica đã biết [25].
1.2.3. Sự phân hủy cao su bằng tập hợp vi sinh vật
Mặc dù đã có lịch sử hơn 100 năm nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cao
su. Nhưng hầu hết tất cả nghiên cứu đều tập chung vào KNPH của các chủng đơn
cùng các gen liên quan mà chưa quan tâm đến KNPH của tập hợp vi sinh vật trong
quá trình phân hủy cao su. Các tài liệu liên quan đến sự phân hủy cao su của tập hợp
vi sinh vật gần như là không có.

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
12


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

1.3 Con đƣờng phân hủy cao su
Hiện nay, các nghiên cứu đã chỉ ra con đường cơ bản phân hủy cao su là
chuyển hóa poly (cis - 1, 4 - isoprene) thành dẫn xuất oligo (cis - 1, 4 - isoprene)
bao gồm các nhóm aldehyde, ketone…. Có sự tham gia của 2 enzyme là Lcp (latexclearing zone) và RoxA (rubber – cleavage - oxygenase). Con đường phân hủy sinh
học cao su thiên nhiên được mô tả như hình sau:

Hình 1. 4 Con đường phân hủy mủ cao su [20]
Hiện tại, có hai loại enzyme đã được phát hiện và được xem như chìa khóa
của quá trình phân hủy cao su thiên nhiên. Đầu tiên là enzyme Lcp được mã hóa bởi
gen lcp. Loại enzyme này được tìm thấy trong chủng Streptomyces sp. K30 [32].
Trong quá trình phân hủy bởi chủng này poly (cis - 1, 4 - isoprene) được phân hủy
thành dẫn xuất oligo (cis - 1, 4 - isoprene) bao gồm nhóm aldehyde, keton và sau đó
là acid tương ứng bởi enzyme oxidoreductase OxiAB được mã hóa bởi gen oxiAB
bên cạnh gen lcp theo con đường phân hủy ß oxi hóa. Gen lcp được tìm thấy trong
Nocardia farcinia E1, Gordonia polyisopreneivorans VH2, Gordinia westfalica
Kb1 [10] [19].
Enzyme thứ hai là enzyme RoxA được tìm thấy trong Xanthomonas sp. 35Y
[21]. RoxA được dự đoán tham gia vào quá trình cắt nối đôi trong poly (cis - 1, 4 -

Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
13


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

isoprene) thành dẫn xuất oligo (cis - 1, 4 - isoprene) với nhóm aldehyde và keton
bao gồm 12 – oxo - 4, 8 – dimethyltrideca - 4, 8 – diene – 1 - al. Mặc dù chức năng
của RoxA và Lcp là tương tự nhau nhưng trình tự amino axit của RoxA là không
tương đồng với Lcp [7] [38].
1.4 Một số phƣơng pháp đánh giá KNPH cao su bằng vi sinh vật
 Đánh giá sự giảm khối lƣợng của miếng cao su
Tsuchii và cộng sự (1996) khi nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước, diện
tích bề mặt của các miếng găng tay cao su tới KNPH của chủng Nocardia sp. 835A
bằng sự giảm khối lượng của những miếng găng tay cao su. Nghiên cứu đã chỉ ra
KNPH những miếng dài của chủng Nocardia sp. 835A tuyến tính với diện tích bề
mặt của các miếng găng tay. Khi nuôi cấy với những miếng mỏng và rộng thì chủng
Nocardia sp. 835A sẽ phát triển nhanh và phân hủy mạnh, với những miếng ngắn
và hẹp KNPH phân hủy miếng găng tay cao su chậm và kém hơn [36]. Claudia
Gallert (2000) đã sử dụng phương pháp giảm khối lượng để đánh giá KNPH của
Streptomyces sp. La7 khi nuôi cấy với găng tay cao su. Kết quả sau 70 ngày nuôi
cấy, khối lượng miếng găng tay cao su giảm 30% [13]. Năm 2012, Watcharakul và
cộng sự khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình phân hủy găng tay cao su của chủng
S. coelicolor CH13 bằng cách xét sự giảm khối lượng của miếng găng tay cao su ở
các điều kiện nguồn dinh dưỡng khác nhau [33]. Năm 2013, Trang và cộng sự đã
tiến hành đánh giá sự giảm khối lượng của cao su thiên nhiên và cao su loại protein
khi ủ với các chủng S. griseorubens, S. albogriselus, Nocardiopsis alba trong 4
tuần. Sau 4 tuần khối lượng của cao su thiên nhiên giảm khoảng 2,05 – 4,28%, khối
lượng của các miếng cao su loại protein giảm được 2,05 – 5,65% [11].
 Quan sát sự thay đổi bề mặt của cao su bằng kỹ thuật SEM

Claudia Gallert (2000) cho thấy sự thay đổi bề mặt của miếng găng tay cao
su sau 70 ngày nuôi cấy với Streptomyces sp. La7 bằng kính hiển vi điện tử quét
(SEM) [13]. Warneke và cộng sự (2007) đánh giá KNPH của các chủng G.
polyisoprenivorans VH2, N. takedensis WE30 và N. nova L1b bằng cách quan sát
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
14


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

sự thay đổi bề mặt của cao su sau 5 tuần nuôi cấy bằng SEM [39]. Watcharakul và
cộng sự (2012) cũng đã dùng SEM để nhận biết sự thay đổi bề mặt của miếng găng
tay cao su sau 4 tuần nuôi cấy với S. coelicolor CH13 [33]. Cả ba nghiên cứu trên
đều nhận thấy sự phát triển của vi sinh vật trên miếng găng tay cao su và hình thành
một lớp màng vi sinh vật trên đó. Trang và cộng sự (2013) tiến hành quan sát sự
sinh trưởng và phát triển của các chủng S. griseorubens, S. albogriselus,
Nocardiopsis alba trên các miếng găng tay cao su thiên nhiên. Nhận thấy sự sinh
trưởng và phát triển bám dính của các chủng trên bề mặt không chỉ vậy chúng còn
ăn sâu vào miếng găng tay cao su sau 30 ngày nuôi cấy [11].
 Khảo sát các sản phẩm tạo thành của quá trình phân hủy
Sản phẩm của quá trình phân hủy cao su vẫn còn là một ẩn số. Tuy nhiên
cũng có rất nhiều phương pháp khác nhau để nhận biết sản phẩm của quá trình phân
hủy được tạo ra.
 GPC: dựa vào pic xuất hiện khi chạy sắc ký lọc gel, người ta có thể
đánh giá được mức độ phân hủy của các chủng, dự đoán được kích thước sản phẩm
phân hủy tương ứng với pic đó. Để từ đó có sự so sánh KNPH giữa các chủng.
Ibrahim và cộng sự (2006) dùng GPC để phân tích sản phẩm của quá trình phân hủy
mủ cao su bởi các chủng N. farcinia và Thermomonospora curvata [19]. Broker và

cộng sự (2008) khi đánh giá KNPH của các chủng S. lividans TK23 tái tổ hợp sau 8
tuần nuôi cấy với 0,25% cao su và 0,5% glucose cũng đã dùng GPC để xác định
khối lượng của sản phẩm phân hủy [10]. Imai và cộng sự (2011) dùng GPC để phân
tích sản phẩm của quá trình phân hủy găng tay cao su bởi các chủng Streptomyces
sp. LCIC4, Actinoplanes sp. OR16 và Methylibium sp. NS21 có KNPH cao su thiên
nhiên và cao su tổng hợp. Kết quả phân tích GPC sau khi nuôi cấy các chủng này
với cao su tổng hợp poly(cis - 1, 4 - isoprene) cho thấy chủng LCIC4 sau 50 ngày
nuôi cấy xuất hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng lượng phân tử 23 kDa,
chủng OR16 sau 50 ngày nuôi cấy xuất hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng
lượng phân tử 12 kDa và chủng Methylibium sp. NS21 sau 50 ngày nuôi cấy xuất
hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng lượng phân tử xung quanh khoảng 400
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
15


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

kDa (pic ban đầu của poly(cis - 1, 4 - isoprene) tương ứng với sản phẩm có trọng
lượng phân tử 700 kDa). Dựa và kết quả phân tích GPC các tác giả đã kết luận
chủng Methylibium sp. NS21 phân hủy khá yếu sau 50 ngày so với LCIC4, OR16.
Tuy nhiên kết quả phân tích phổ GPC của Methylibium sp. NS21 ở 70 ngày có xuất
hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng lượng phân tử 13 kDa [20].


1

HNMR: Imai và cộng sự (2011) khi nghiên cứu sản phẩm phân hủy

găng tay cao su sau 70 ngày bởi Methylibium sp. NS21, sau 50 ngày bởi
Streptomyces sp. LCIC4, Actinoplanes sp. OR16 đã sử dụng 1HNMR để nhận biết
sự có mặt của nhóm aldehyte. Kết quả các tác giả đã kết luận có nhóm aldehyte
trong sản phẩm mà chủng Methylibium sp. NS21 phân hủy còn chủng LCIC4 và
OR16 thì không. Kết hợp với kết quả chạy GPC, Imai và cộng sự đã kết luận có thể
sự phân hủy chậm của chủng Methylibium sp. NS21 đã giúp họ nhận biết được
nhóm aldehyte trong sản phẩm phân hủy [20].
 TLC 2 chiều: Braaz và cộng sự, 2004 đã dùng kỹ thuật sắc ký bản mỏng
2 chiều để xác định sản phẩm của quá trình dùng enzyme RoxA từ Xanthomonas sp.
35Y để phân hủy mủ cao su. Sản phẩm được chiết bằng ethyl acetate sau đó sấy khô
rồi hòa tan trong methanol, tiếp đó được phân tách với benzene - acetone (20:1) ở
chiều thứ nhất và chloroform - methanol ở chiều thứ hai và cuối cùng được kéo lên
bởi anisaldehyte - H2SO4 ở 1000C [7].
 HPLC, HPLC - MS: Braaz và cộng sự, 2004 cũng đã dùng kỹ thuật này
khi phân tích sản phẩm của quá trình phân hủy mủ cao su bởi enzyme RoxA từ
Xanthomonas sp. 35Y [7].
1.5. Một số phƣơng pháp xác định sự biến động của hệ vi sinh vật bằng kỹ
thuật sinh học phân tử
Trước đây khi các kỹ thuật sinh học phân tử chưa phát triển thì việc nghiên
cứu cấu trúc và sự đa dạng của tập hợp vi sinh vật trong tự nhiên thường dựa trên
các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật. Khi đó phương pháp nuôi cấy có
vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật.
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
16


Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su

Ngày nay nhờ những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng
dụng hữu hiệu trong phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các
phương pháp nuôi cấy truyền thống chỉ xác định được thấp hơn 1% các loài vi sinh
vật có mặt trong tự nhiên. Trong khi đó bằng các phương pháp sinh học phân tử
hiện nay các nhà nghiên cứu có thể phát hiện hầu hết các vi sinh vật có mặt trong tự
nhiên. Hiện nay, hàng loạt các kỹ thuật phân tử như: DGGE, DNA microarrays, lai
huỳnh quang tại chỗ (FISH), metagenomic, metaproteomic,… đã được ứng dụng để
nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của quần xã vi sinh vật. Dựa trên khả năng
phân loại và nhận biết về sự đa dạng của quần xã vi sinh vật những phương pháp
này được chia thành loại: Phương pháp phân tích một phần quần xã vi sinh vật và
phương pháp phân tích toàn bộ quần xã vi sinh vật [15]. Phân loại và các phương
pháp sinh học phân tử được thể hiện và phân loại như hình 1.4.

Hình 1. 5: Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng để nghiên cứu tính đa
dạng về cấu trúc và chức năng của vi sinh vật trong môi trường [15]
Các phương pháp trên có những ưu nhược điểm riêng cho quá trình nghiên
cứu sự biến động của hệ vi sinh vật. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu sự
Đỗ Công Thịnh

CNSH2013B
17