Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza của một số chủng vi khuẩn phân lập được từ đậu tương lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------

ĐINH THỊ THU TRANG

ĐỀ TÀI:NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYM
FIBRINAZA CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP
ĐƯỢC TỪ ĐẬU TƯƠNG LÊN MEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.NGUYỄN LAN HƯƠNG

HÀ NỘI - 2010


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Mục lục
Mục lục........................................................................................................................1
Lời mở đầu ..................................................................................................................6
Chương I......................................................................................................................8
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................8
I.1. Fibrin ................................................................................................................8
I.1.1. Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thể.......................................................8
I.1.2. Cơ chế phân hủy Fibrin trong cơ thể người ...........................................12

I.2. Enzym fibrinaza……………………………………………………………14
I.2.1. Cấu tạo và tính chất ................................................................................14
I.2.2. Cơ chế tác động của Fibrinaza ...............................................................15
I.3. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme Fibrinaza .......................16
I.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzym Fibrinaza trên thế giới và tại Việt
Nam .......................................................................................................................20
I.5. Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp ..........................22
I.5.1. Vector tách dòng .....................................................................................22
I.5.2. Tế bào chủ ...............................................................................................24
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................26
II.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................26
II.1.1. Chủng vi khuẩn ......................................................................................26
II.1.2. Vector pET22b(+)..................................................................................26
II.1.3. Môi trường .............................................................................................27
II.1.4. Hóa chất.................................................................................................28
II.1.5. Thiết bị sử dụng .....................................................................................28
II.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................29
II.2.1. Phương pháp vi sinh vật ........................................................................29
II.2.3. Phương pháp hóa sinh ...........................................................................31
II.2.4. Điện di DNA trên gel agarose ..............................................................34
II.2.5. Tách chiết DNA của vi khuẩn ................................................................35

Khoa Công nghệ Sinh học

1

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

II.2.6. Phương pháp khuyếch đại DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase
(Polymerase Chain Reaction- PCR).................................................................36
II.2.7. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn..........................................................39
II.2.8. Ghép nối DNA........................................................................................40
II.2.9. Biến nạp vector tái tổ hợp và tế bào vi khuẩn E.coli bằng phương pháp
sốc nhiệt............................................................................................................41
II.2.10. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid..................................................42
II.2.11. Kiểm tra plasmid mang sản phẩm PCR mong muốn...........................44
Chương III.................................................................................................................45
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................45
III.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza ............................45
III.2. Định tên chủng vi khuẩn nghiên cứu ...........................................................48
III.3. Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza .....................52
III.3.1. Tách DNA của vi khuẩn........................................................................52
III.3.2. Nhân đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza ..............................................53
III.3.3. Xử lý sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn ..........................................55
III.3.4. Ghép nối gen mã hóa enzym fibrinaza và vector pET-22b(+).............56
III.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc
nhiệt. .................................................................................................................57
III.3.6. Chọn lọc dòng pET-22b(+) mang gen mã hóa fibrinaza. ....................58
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................................62

Khoa Công nghệ Sinh học

2

Lớp cao học k810

Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Danh mục các kí hiệu và chữ cái viết tắt
Amp

Ampicilin

Bp

Cặp bazơ

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

DNA

Deoxynucleic acid

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EtBr

Ethidium bromide

Kb

kilo bazơ

LB

Luria – Bertani

PCR

Phản ứng dây chuyền polymerase
(Polymerase Chain Reaction)

RNA

Ribomuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

Tris – acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

tPA

Tissue – type plasminogen activator (chất
hoạt hóa plasminogen mô)

uPA

Urokinase – type plasminogen activator
(Chất hoạt hóa urokinase)

Khoa Công nghệ Sinh học

3

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Danh mục các bảng
Bảng 1.1: Vi khuẩn Bacillus sp. phân lập được từ một số thực phẩm lên men
truyền thống
Bảng 1.2. Đặc tính của một số enzym fibrinaza sinh tổng hợp từ vi sinh vật
Bảng 1.3.

Bảng 2.1. Thành phần cấu tạo của vector pET-22b(+)
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen
Bảng 2.3. Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng xử lý plasmid bằng enzym giới hạn
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng xử lý sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn
Bảng 3.1. Khả năng lên men của các chủng nghiên cứu
Bảng 3.2. Hoạt lực của enzym tách chiết được từ các chủng bằng phương pháp đo
vòng thủy phân và phương pháp so màu
Bảng 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng

Khoa Công nghệ Sinh học

4

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Danh mục các hình
Hình 1.1: Các sợi fibrin làm đông tụ máu
Hình 1.2 Quá trình hình thành fibrin
Hình 1.3 Cấu trúc vòng xoắn của nattokinase
Hình 2.1. Vector pET-22b(+)
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu
Hình 3.2. Kết quả định tên bằng bộ Kit API 50CHB của 3 chủng T19, T21 và T23
Hình 3.3. DNA tổng số của M1

Hình 3.4. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza của chủng M, T19, T21
và T23
Hình 3.5. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza của chủng M1
Hình 3.6. Kết quả xử lý bằng enzym giới hạn
Hình 3.7. Kết quả tinh sạch plasmid
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli.
Hình 3.9. Chọn dòng pET-22b(+) mang gen ngoại lai mã hóa enzym fibrinaza
Hình 3.10. Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza bằng
phương pháp xử lý enzyme giới hạn
Hình 3.11. Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza bằng kỹ
thuật PCR

Khoa Công nghệ Sinh học

5

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Lời mở đầu
Trong những năm gần đây, bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử
vong trên thế giới. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chết vì
bệnh tim mạch, cứ 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và cứ 6 giây thì có
một trường hợp đột quỵ [46]. Nguyên nhân chính của các căn bệnh này do sự mất
cân bằng giữa hai quá trình: quá trình đông tụ máu và quá trình hòa tan các cục máu
đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đông máu nhưng chỉ có mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasmin [34].
Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hóa sinh trường đại học Dược
Chicago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng thủy phân
fibrin (nguyên nhân chính gây đông máu) do vi khuẩn Bacillus trong quá trình lên
men đậu tương tiết ra. Đó chính là enzym fibrinaza, enzym này được chiết xuất từ
đậu tương lên men truyền thống của Nhật Bản - Natto nên còn được gọi là
Nattokinase.
Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tại các bệnh viện trong cả nước những
năm gần đây cho thấy, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tim mạch khá cao.
Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một
số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Nattokinase, NattoK, Fibrinaza… tuy nhiên
các sản phẩm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam.
Tính đến nay trên thế gới đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các
chủng vi sinh vật sinh enzym fibrinaza cũng như nghiên cứu đặc điểm của enzym
này. Bên cạnh đó để thu được enzym fibrinaza có hoạt lực cao việc nghiên cứu để
tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza là rất cần thiết. Tuy nhiên ở
nước ta các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh
trưởng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fibrinaza, chưa có một nghiên cứu
nào về tạo chủng tái tổ hợp của enzym này. Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương
dồi dào đây là điều kiện thuận lợi để chúng ta tiến hành các nghiên cứu nhằm tạo ra
sản phẩm mang thương hiệu Việt Nam.

Khoa Công nghệ Sinh học

6

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài ”Nghiên cứu tách dòng
gen mã hóa enzym fibrinaza của một số chủng vi khuẩn phân lập từ đậu tương
lên men”.

Khoa Công nghệ Sinh học

7

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. 1. Fibrin
Fibin là một loại protein dạng sợi được polyme hóa để tạo thành dạng lưới bao
quanh vết thương có tác dụng cầm máu. Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay
còn gọi là fibrinogen nhờ sự hoạt động của thrombin. Khi đó, fibrin được tạo thành
sẽ liên kết với nhau bởi nhân tố VIII để tạo thành các cục máu. Ngoài ra, fibrin còn
tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tín hiệu, đông tụ
máu trong mạch máu và polyme hóa protein…[34].

Hình 1.1: Các sợi fibrin làm đông tụ máu [44]
I.1.1. Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thể

Khi cơ thể bình thường fibrin tồn tại ở dạng tiền chất không có hoạt tính, đó là
dạng fibrinogen. Khi cơ thể bị tổn thương, dạng tiền chất fibrinogen hòa tan trong
máu sẽ được chuyển hóa thành fibrin không hòa tan trong máu tạo nên cục máu
đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc. Quá trình này có sự tham gia của

Khoa Công nghệ Sinh học

8

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

các thành phần gây đông máu có trong huyết tương theo hai con đường nội sinh và
ngoại sinh.
Fibrinogen là một loại glycoprotein 340-HD được sinh tổng hợp ở gan và có
nồng độ khoảng 1,5 ÷4,0 g/l trong huyết tương. Do đó đối với những người bệnh
suy gan hoặc mắc các bệnh về di truyền liên quan đến gen ở nhiễm sắc thể số 4 có
thể dẫn đến việc giảm nồng độ và chất lượng fibrinogen gây ra bệnh trầm kha về
máu. Fibrinogen đóng vai trò chính trong việc tạo cầu nối các sợi tơ huyết bằng
việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IIIa của chúng lại với nhau và hình thành
fibrin để cầm máu [34] .
Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta và
gramma). Trên chuỗi alpha và beta có một trình tự peptit ngắn được gọi là
fibrinopeptit. Chính các chuỗi peptit ngắn này cản trở việc fibrinogen bị polyme hóa
bởi chính nó một cách tùy tiện [34].
™ Một số yếu tố chính tham gia vào quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin

- Nhóm yếu tố tiếp xúc: gồm các yếu tố XI, XII, prekallikrein. Các yếu tố thuộc
nhóm này hoạt động không cần sự có mặt của ion Ca2+ cũng như vitamin K.
- Nhóm yếu tố prothrombin: gồm các yếu tố II, VII, IX, X. Đặc điểm chung của
nhóm này là cần sự có mặt của vitamin K để các yếu tố này gắn được với ion Ca.
- Nhóm fibrinogen: gồm fibrinogen, V, VIII, XIII. Nhóm này chịu tác dụng của
thrombin, kém bền vững.
Tên của một số yếu tố chính tham gia vào quá trình đông máu:
+ Yếu tố I: fibrinogen
+ Yếu tố 2: prothrombin
+ Yếu tố 3: throboplastin của mô
+ Yếu tố IV: ion Ca2+
+ Yếu tố V: proacceletin

Khoa Công nghệ Sinh học

9

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

+ Yếu tố VII: proconvertin
+ Yếu tố VIII: globulin A
+ Yếu tố IX: globulin B
+ Yếu tố X: Stuart – Power
+ Yếu tố XI: globulin C
+ Yếu tố XII: Hageman

+ Yếu tố XIII: ổn định fibrin
Quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin được mô tả dưới hình sau:

Hình 1.2 Quá trình hình thành fibrin

Khoa Công nghệ Sinh học

10

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

™ Quá trình hình thành fibrin trong cơ thể diễn ra theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn tạo thành phức hợp prothrombinase: đây là quá trình phức tạp và
kéo dài nhất thông quá 2 cơ chế nội sinh và ngoại sinh tạo ra phức hợp
prothrombinase. Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thương thành mạch hoặc
các mô kế cận. Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chấn thương máu hoặc máu lấy ra
ngoài cơ thể từ lòng mạch.
+ Cơ chế ngoại sinh: khi mạch máu bị tổn thương, máu tiếp xúc với vị trí bị
tổn thương. Mô ở vị trí bị thương sẽ giải phóng ra yếu tố III và phospholipids. Yếu
tố III, IV cùng yếu tố VII và phospholipids mô sẽ hoạt hóa yếu tố X tạo yếu tố X
hoạt hóa (Xa).
Yếu tố Xa cùng với yếu tố V, phospholipids mô và ion Ca2+ tạo thành phức
hợp prothrombinase. Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối
giữa các yếu tố.
+ Cơ chế nội sinh: đồng thời khi máu tiếp xúc với vị trí bị tổn thương sẽ làm

hoạt hóa yếu tố XII và tiểu cầu làm giải phóng ra phopspholipid. Yếu tố XII hoạt
hóa yếu tố XI, yếu tố XI sẽ hoạt hóa yếu tố IX. Yếu tố IX cùng với phopspholipid
tiểu cầu và ion Ca2+ sẽ hoạt hóa yếu tố X. Yếu tố X hoạt hóa cùng với yếu tố V,
phospholipids, Ca2+ sẽ tạo thành phức hợp prothrombinase.
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh chậm hơn rất
nhiều (1-6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây).
- Giai đoạn tạo thành thrombin: prothrombinase theo cơ chế nội sinh và ngoại
sinh cùng với ion Ca2+ sẽ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin.
- Giai đoạn tạo thành fibin: thrombin sau khi được hình thành đã chuyển
fibrinogen thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở
dạng sợi. Một mạng lưới fibrin đã hình thành và được ổn định nhờ yếu tố XIII. Giai
đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới
fibrin và tạo nên cục máu đông.

Khoa Công nghệ Sinh học

11

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

I.1.2. Cơ chế phân hủy Fibrin trong cơ thể người
Trong cơ thể người, fibrin có thể được thủy phân bởi plasmin. Plasmin là một
enzym phân hủy protein, chúng có tác dụng làm tan các sợi fibrin và làm tan các
chất khác có tác dụng gây đông máu như fibrinogen, yếu tố V, VIII hay prothrobin.
Do đó khi plasmin được hình thành bên trong cục đông máu nó có thể làm tan cục

đông, đồng thời làm giảm khả năng đông máu. Vì vậy, quá trình này cho phép dọn
sạch những cục máu đông hình thành ở các mô trong một số ngày.
Khi cơ thể bình thường thì plasmin tồn tại ở dạng không hoạt động là
plaminogen. Chỉ khi tế bào mạch bị tổn thương cơ thể sẽ giải phóng chất hoạt hóa
plasminogen để chuyển hóa plasminogen thành plasmin, hoạt hóa hệ thống thủy
phân fibrin. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzym duy nhất chuyển chất xúc
tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen
gồm bốn nhóm chính.
- Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type
plasminogen activator, uPA): chất này là sản phẩm chính của thận, có liên quan đến
kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy chất hoạt hóa này được
cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết
thanh. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase chỉ có thể hoạt hóa plasminogen khi có
mặt của fibrin. Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy
fibrin. Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7 µg/ml [28].
- Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen
activator, tPA): chất này có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và
kết hợp với tơ máu. Ở người và động vật khác, tPA đóng vai trò quan trong trọng hệ
thống tiêu hủy fibrin [37, 38]. Đối với các trường hợp mắc bệnh khối huyết, dưới
tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành khối huyết,
nên tránh được tình trạng phân huyết ở những vùng khác trong cơ thể, tuy nhiên
hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [26].

Khoa Công nghệ Sinh học

12

Lớp cao học k810

Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

- Cuối cùng là enzym phân hủy tơ máu fibrinaza: được giải phóng nhanh khi
huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa.
Trong cơ thể có hơn 20 loại enzym gây đông máu nhưng chỉ có duy nhất
plasmin có khả năng phá vỡ cục máu đông. Đồng thời, sự có mặt của vi khuẩn,
virus, nấm mốc và các độc tố ở trong máu cũng tạo ra liên kết chồng chéo quá tải
của fibrin. Khi không có hiện tượng mất máu hoặc các vết thương hở, các sợi fibrin
liên kết chéo này sẽ luân chuyển trong máu và dính vào thành mạch máu, làm giảm
sự vận chuyển lưu thông máu, đồng thời làm tăng độ nhớt của máu gây ra huyết áp
cao. Những cục máu đông trong tim người làm cản trở sự vận chuyển máu tới các
mô cơ tim. Nếu dòng máu bị chặn lại, khả năng cung cấp oxy tới các mô này sẽ bị
cắt giảm một cách cục bộ (gây ra thiếu máu cục bộ), nguyên nhân chính gây ra các
cơn đau thắt tim hoặc nhồi máu cơ tim. Nếu hiện tượng này kéo dài có thể gây tử
vong. Các cục máu có mặt trong tim có thể ảnh hưởng tới não, tạo ra sự thiếu máu
và oxy từng phần, thường gặp ở những người có tuổi. Như vậy sự tích tụ fibrin ở
thành mạch máu tạo ra các cục máu làm tăng các chứng bệnh nghẽn mạch máu, gây
ra các bệnh về tim mạch đặc biệt quan trọng. Người ta đã sử dụng những chất hoạt
hóa như là một loại thuốc để chuyển hóa tạo tơ huyết thành plasmin có tác dụng
phân hủy fibrin trong máu. Tuy nhiên, những loại thuốc này đều rất đắt tiền và
không hiệu quả trực tiếp. Bản thân tPA và uPA cũng bị ức chế việc hoạt hóa tạo
plasmin. Hơn nữa, các chất chống plasmin cũng đã được tìm thấy là α2macroglobulin ức chế quá trình thủy phân fibrin làm giảm hoạt lực của plasmin [10].
Như vậy, quá trình phân hủy fibrin trong cơ thể người phụ thuộc rất nhiều và
khả năng tạo các chất hoạt hóa plasmin. Những chất này kích thích việc hình thành
plasmin. Tuy nhiên, sự có mặt của plasmin chưa đảm bảo cho việc phân giải fibrin
cũng như các cục máu đông hiệu quả bởi có rất nhiều các chất kìm chế quanh nó,
đặc biệt là trong cơ thể người già, khi mà các chất kích thích cho quá trình chuyển
hóa tạo thành plasmin thì ít mà các chất ức chết hoạt lực plasmin thì nhiều [10].

Khoa Công nghệ Sinh học

13

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Do vậy, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các chất có khả năng phân
hủy fibrin, làm tan các cục máu đông. Một trong số đó là enzym fibrinaza - enzym
có khả năng thủy phân trực tiếp fibrin.
I.2. Enzym fibrinaza
I.2.1. Cấu tạo và tính chất
Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hóa sinh trường đại học dược
Chicago (Mỹ) và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để tìm ra hợp chất tự nhiên
có tính chất làm giảm chứng nghẽn mạch gây ra nhồi máu cơ tim. Ông đã phát hiện
ra enzym thủy phân fibrin (fibrinaza) do vi sinh vật sinh ra và công trình được công
bố đầu tiên vào năm 1987. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về
enzym fibrinaza và một trong số các nghiên cứu ấy đã chỉ ra rằng: enzym fibrinaza
có hoạt tính thủy phân fibrin cao gấp 4 lần enzym plasmin trong cơ thể.
Enzym fibrinaza là một loại proteaza có khả năng tương tự như plasmin trong
việc làm tan các cục đông máu loại fibrin trong huyết tương – nguyên nhân chính
gây ra hiện tượng tắc mạch máu. Fibrinaza được chiết xuất từ một loại thực phẩm
lên men truyền thống của Nhật Bản có tên là natto nên còn có tên là nattokinase.

Hình 1.3 Cấu trúc vòng xoắn của fibrinaza [44]

Khoa Công nghệ Sinh học

14

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Fibrinaza là enzym ngoại bào, có khối lượng M = 27,4 – 44 kDa [44].
Điểm đẳng điện pI = 8,6
Theo nghiên cứu của Kim W và các cộng sự năm 1996, pH tối ưu cho hoạt
tính thủy phân fibrin của fibrinaza trong khoảng từ 7 đến 12 và hoạt tính của enzym
giảm rất nhanh ở pH nhỏ hơn 6,0 và lớn hơn 11. Enzym bền trong dải pH từ 7 đến
10,5 và thích hợp nhất là ở pH là 7,4 [20].
Kim W và các cộng sự (1996) cũng đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của
nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền vững của enzym thủy phân fibrin. Dải nhiệt độ thử
nghiệm là từ 10oC đến 80oC. Nhiệt độ thích hợp cho độ bền của enzym là dưới 40oC.
Ở nhiệt độ trên 40oC hoạt lực của enzym giảm rất nhanh. Theo một số nghiên cứu
khác, hoạt tính enzym cao nhất trong khoảng nhiệt độ từ 30oC đến 40oC và nhiệt độ
tối ưu là 37oC [20].
Cũng theo một số nghiên cứu, hoạt lực của enzym fibrinaza tăng khi môi
trường có tồn tại ion Ca2+. Deepak V. đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ion
Ca2+ và thu được hoạt lực fibrinaza lớn nhất tại nồng độ 0,5g/l [13].
Fibrinaza không chỉ thủy phân fibrin mà còn có khả năng phân hủy cả cơ chất
plasmin H-D-Val-Lcu-Lys-pNA (S-2251) (cơ chế tổng hợp) – một chất nhạy cảm
với enzym hơn các cơ chất khác nhau [27].

I.2.2. Cơ chế tác động của Fibrinaza
Fibrinaza có thể làm tan những protein loại fibrin trong huyết thanh người một
cách trực tiếp. Sự tác dụng của fibrinaza theo ba con đường:
- Con đường A, bản thân nó cản trở sự hình thành các cục máu và làm tan các
cục máu đông (bản chất là fibrin) đã tồn tại trong huyết thanh người.
- Con đường B, fibrinaza kích thích tạo thành enzym urokinase từ tiền tố
prourokinase. Urokinase sẽ tạo nên các phân tử plasminogen rồi hình thành nên
enzym plasmin, và enzym plasmin sẽ thủy phân fibrin.

Khoa Công nghệ Sinh học

15

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

- Con đường C, fibrinaza kích thích tạo thành các tiền tố t-PA, tiền tố này là
tác nhân hoạt hóa enzym plasmin [27].
Ngoài ra enzym fibrinaza còn có khả năng ngăn chặn sự sinh ra của các chất
ức chế hoạt hóa enzym plasmin.Theo một số nghiên cứu, fibrinaza có hoạt tính cao
gấp 4 lần enzym plasmin .
Fibrinaza
A
Fibrin degration
product
(FDP)

Fibrin

C
Plasmin

Thrombin
t-PA

Urokinaza

B
Fibrinogen

Plasminoge

Pro-urokinaza

Hình 1.4: Cơ chế phân hủy fibrin của fibrinaza [10]
Hoạt tính sinh học của fibrinaza đã được nhiều nghiên cứu ứng dụng trên động
vật và người chứng minh. Người ta đã đo được các chỉ số về hoạt độ phân giải
fibrin của euroglobulin và hàm lượng sản phẩm phân giải fibrin (FDP) tăng lên,
đồng thời hàm lượng kích thích tố của plasminogen tPA được giải phóng trong tế
bào màng trong của thành mạch và ở tế bào gan cũng tăng lên khi có mặt fibrinaza
[10].
I.3. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme fibrinaza
Các vi sinh vật có khả năng tạo ra enzym thủy phân cơ chất fibrin bao gồm vi
khuẩn, xạ khuẩn và tảo. Streptomyces megasporus SD5, được phân lập từ suối nước

Khoa Công nghệ Sinh học

16

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

nóng có thể cho enzym fibrinaza có khả năng chịu nhiệt. Một số loại nấm cũng cho
thấy có thể sinh ra proteaza có hoạt tính fibrinaza cao, ví dụ như Aspergillus
ochraceus 513, Fusarium oxysporum, Penicillum chrysogenum, Rhizopus chinesis
12,… Ngoài ra Matsubara cùng các đồng sự (1998, 1999, 2000) đã tìm thấy hoạt
tính fibrinaza trong tảo biển Codium divaricatum và Codium intricatum [27].
Bảng 1.1: Vi khuẩn Bacillus sp. phân lập được từ một số thực phẩm
lên men truyền thống [27]
Vi sinh vật

Nguồn phân lập

Tên enzyme

Bacillus natto

Natto, Nhật Bản

Nattokinase

B. amyloliquefaciens DC-4

Douchi, Trung Quốc

Subtilisin DEF

Bacillus sp. CK

Chungkook-jang, Hàn Quốc CK

Bacillus sp. DJ-4

Doen-jang, Hàn Quốc

Subtilisin DJ-4

Bacillus sp. DJ-2

Doen-jang, Hàn Quốc

bpDJ-2

Bacillus sp. KA38

Joet-gal, Hàn Quốc

Enzym joet-gal

Bacillus subtilis QK02

Đậu nành lên men

QK-1 và QK-2

Vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất về khả năng sinh enzym fibrinaza đó
là loài Bacillus. Loài Bacillus tổng hợp ra fibrinaza đã được tìm thấy lần đầu tiên
bởi Sumi và cộng sự vào năm 1987 từ natto. Tương tự một số vi khuẩn khác được
phát hiện có khả năng sinh tổng hợp fibrinaza, chúng bao gồm Bacillus
amyloliquefaciens DC-4 từ một loại thực phẩm làm từ đậu tương lên men có xuất sứ
từ Trung Quốc tên là douche, Bacillus sp. CK từ nước chấm đậu nành lên men của
Hàn Quốc có tên là chungkook-jang, các chủng Bacillus sp. DJ-2 và DJ-4 từ món
doen-jang và Bacillus sp. KA38 từ cá muốn lên men có tên là jeot-gal cũng của
Hàn Quốc [27].

Khoa Công nghệ Sinh học

17

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp fibrinaza đều được phân lập từ
đậu tương lên men như natto, douchi hay chungkook-jang.
Ở Việt Nam, tương là sản phẩm lên men truyền thống từ đậu tương rất được ưa
chuộng, Đã có nghiên cứu của Đặng Thu Hương và Nguyễn La Anh (2005) về các
chủng vi khuẩn phân lập từ Tương Bần có hoạt tính fibrinaza . Nguyễn Lan Hương
và cộng sự đã phân lập được 11 chủng vi khuẩn có hoạt tính fibrinaza cao từ tương,

natto và chao.
Dưới đây là đặc tính của một số enzym fibrinaza được sinh tổng hợp từ vi sinh
vật (bảng 1.2)
Bảng 1.2. Đặc tính của một số enzym fibrinaza sinh tổng hợp từ vi sinh vật [27].
Enzym

Khối lượng phân

pH, nhiệt độ ổn

tử, pI, nhiệt độ tối

định (t)

Cơ chất

ưu
Nattokinase

M = 27,7 kDa

pH = 7÷ 12

Cơ chất tốt nhất là

pI = 8,6

t < 50

Subtilisin

M = 28 kDa; pI = 8

pH = 6 ÷ 10

DFE

pH = 9,0; t = 48

t<50 trong 60 phút

plasmin và subtilisin
Cơ chất tốt nhất là
subtilisin, không phân
hủy đông máu.

CK

M=28,2kDa; pH = pH= 7 ÷ 10,5

Cơ chất plasmin hoạt

10

tính cao gấp 8 lần

t<50 trong 60 phút

fibrinaza của subtilisin

T= 70

Carlsberg
Subtilisin

M=29kDa; pH=10, pH= 4 – 11

DJ4

t=40

Khoa Công nghệ Sinh học

nhiệt

18

độ

Hoạt tính fibrinaza cao
2,2
lần
phòng gấp
subtilisin BPN

của

Lớp cao học k810

Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

trong 48 giờ
Subtilisin

M=28kDa; pH 8,5; pH= 3 -12; t=40 Hoạt tính mạnh hơn với

QK-2

t=55

BK – 17

M= 31 kDa

trong 30 phút

cơ chất là subtilisin
Sử dụng phần lớn các
cơ chất

AMMP

M= 21kDa; pH= 6;

Ưu tiên thủy phân chuỗi

t=33

Aα

fibrinogen

trước

chuỗi Bβ và γ
Từ Bacillus M= 45kDa; pH= 7; pH= 7 – 9

Có giá trị Km thấp khi

sp. KDO-13

t=60

phân giải fibrin

Từ

M=18kDa,

R.chinensis

10,5; t=45

t= 50
pH= pH= 6,8 – 8,8
t=37 trong 24 giờ

Phân giải fibrin cũng
đồng thời phân chia các
chuỗi α, β và γ của
fibrinogen

SW – 1

M= 30kDa, pI= 8,5; pH= 4 – 9; t=4-37

Phân giải trực tiếp fibrin

pH=8
Ở Việt Nam, tỷ lên người mắc bệnh tim mạch ngày càng gia tăng nên một số
hãng dược của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một số sản phẩm chứa enzym
fibrinaza như: Nattokinase, NattoK, Fibrinaza… tuy nhiên các sản phẩm này
thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam. Hơn nữa, nước ta với
nguồn đậu tương dồi dào và chúng ta cũng có tương là sản phẩm lên men truyền
thống từ đậu tương, đây là điều kiện thuận lợi để chúng ta tiến hành các nghiên cứu
nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiệu Việt Nam đáp ứng đầy đủ yêu cầu và thị
hiếu của người tiêu dùng.

Khoa Công nghệ Sinh học

19

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

I.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzym Fibrinaza trên thế giới và tại Việt
Nam
Nghiên cứu về enzym fibinaza do vi sinh vật sinh ra có khả năng làm tan fibrin
được công bố vào năm 1987. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu khác nhau về khả
năng cũng như ứng dụng của enzym này [27].
Enzym fibrinaza đã chứng tỏ là có tác dụng lâu dài hơn các thuốc chống đông
máu khác từ 8 đến 12 giờ bởi hai cơ chế tác dụng: vừa ngăn ngừa sự đông máu và
vừa làm tan các khối máu đã đông.
Tiến sĩ H. Sumi và các cộng sự của ông đã thực hiện một thí nghiệm trên chó
để chứng minh điều này. Họ đã tạo ra các cục đông máu trong cơ thể chó và sau đó
cung cấp một lượng enzym fibrinaza vào cơ thể chúng bằng được miệng. Phim
chụp X-quang của những thành mạch máu đã cho thấy những con chó đã được uống
thuốc chứa fibrinaza đã trở lại tình trạng vận chuyển máu bình thường (không còn
những cục máu đông) sau 5 giờ xử lý. Trong khi đó, các cục máu đông trong cơ thể
những con chó không được bổ sung fibrinaza vẫn hoàn toàn không có dấu hiệu hòa
tan 18 giờ sau đó [33].
Các nhà nghiên cứu của phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ sinh học
thuộc công ty Dược phẩm JCR, Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm thành công về khả
năng hòa tan các mạch máu nghẽn trong động mạch chuột bằng enzym fibrinaza.
Những con chuột được xử lý bằng enzym fibrinaza đã đạt được tốc độ dòng chảy
của máu là 62% trong khi xử lý bằng plasmin chỉ đạt 15,8% [16].
Một nhóm các nhà nghiên cứu khác từ trường Đại học Oklahoma (Mỹ) và
trường Dược Miyazaki (Nhật Bản) cũng làm những thử nghiệm về hoạt tính thủy
phân fibrin trên 12 người tình nguyện viên khỏe mạnh (6 nam và 6 nữ ở lứa tuổi từ
21 đến 55) và cũng cho kết quả tương tự như các thí nghiệm đối với động vật [27].
Đặc biệt, tại trường Đại học Tottori (Nhật Bản), người ta đã sử dụng enzym
fibrinaza như là một loại thực phẩm chức năng để chữa các bệnh do chứng nghẽn
mạch máu gây ra ở vùng đáy mắt. Các bệnh nhân này đều đã bị mù sau khi các cục

Khoa Công nghệ Sinh học

20

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

máu đông cản trở sự luân chuyển máu và làm yếu các dây thần kinh của mắt. Sau
10 ngày sử dụng enzym fibrinaza, các bệnh nhân này đã lấy lại được thị lực và
không có một dấu hiệu bất thường nào được quan sát sau 2 tháng.
Gần đây, một nhóm các nhà khoa học người Hàn Quốc và Thái Lan cũng có
công bố tên một loại rau quả bản xứ của Thái Lan có chứa enzym thủy phân fibin.
Những loại rau này được đánh giá là có khả năng chống oxy hóa cao. Từ kết quả đó,
họ đưa ra khuyến cáo cho người dân ở đất nước đang có tỷ lện những người mắc
các bệnh về tim mạch gia tăng một cách nhanh chóng như Thái Lan nên bổ sung
thực phẩm trong khẩu phần ăn hàng ngày tuy nhiên việc nấu rau chín quá 10 phút ở
100oC sẽ làm mất hoạt lực enzyme [38].
Các nhà khoa học tại hai trường Đại học của Nhật Bản là Miyazaki và
Kurashiki cũng đã nghiên cứu những ảnh hưởng của enzym fibrinaza đối với huyết
áp ở cả người và động vật. Thí nghiệm trên chuột cho thấy huyết áp tâm thu đã
giảm từ 166mmHg xuống còn 145 mmHg chỉ sau 2 giờ đưa enzym fibrinaza vào cơ
thể chuột và tiếp tục giảm còn 144 mmHg sau 3 giờ, trung bình đã giảm được
12,7%. Thí nghiệm đối với người được thử với 4 tình nguyện viên có bệnh huyết áp
cao. Huyết áp tâm thu của họ đã giảm từ 173,8 ± 20,5mmHg xuống 154,8 ± 12,6 và
huyết áp tâm trương giảm từ 101,0± 11,4 mmHg xuống còn 91,2± 6,6. Như vậy,

tính trung bình huyết áp tâm thu giảm 10,9% và huyết áp tâm trương giảm khoảng
9,7%. [23].
Hiện nay trên thế giới, fibrinaza thường được sử dụng trong sản xuất thuốc
chống các bệnh về đường thành mạch, thuốc bổ dưỡng chức năng chống lão hóa.
Công nghệ sản xuất fibrinaza tuân theo một quy trình sản xuất enzym chung từ khâu
chuẩn bị giống, lên men, thu hồi tinh sạch, ổn định và bảo quản sản phẩm. Thị
trường Mỹ, Nhật và các nước phát triển đã chấp nhận và lưu hành thực phẩm chức
năng dòng này. Mới đây, các quốc gia phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Hàn
Quốc, Singapor, Thái Lan cũng bắt đầu quan tâm đến lĩnh vực dược phẩm và thực

Khoa Công nghệ Sinh học

21

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

phẩm chức năng trong công nghệ sinh học này, tuy nhiên các nghiên cứu này cũng
mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm [16].
Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh tim mạch khá cao và có xu hướng tăng
trong vài năm tới do sử dụng các thực phẩm ăn nhanh. Hiện nay, một số sản phẩm
thuốc của Việt Nam có bổ sung fibrinaza như Tuần Hoàn Não, Tây Thi, Tamado do
công ty Dược Sao Thái Dương, hay Nattospec của Dược phẩm Á Âu, Nattotech của
DETECH. Tuy nhiên, nguồn enzym phần lớn vẫn nhập từ Mỹ và Nhật Bản với giá
khá cao. Do đó việc hoàn thiện nghiên cứu sản xuất fibrinaza từ nguồn vi sinh vật
có ý nghĩa rất lớn trong việc chủ động nguồn enzym dùng để sản xuất các sản

phẩm thực phẩm chức năng chứa fibrinaza có tác dụng hỗ trợ và phòng chống các
bệnh tim mạch.
I.5. Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp
Các protein hay enzyme được tạo ra trong tế bào chỉ ở mức vừa đủ và cần phải
được xử lý sau dịch mã, có vậy chức năng của protein mới được đảm bảo và sinh lý
của tế bào hay sinh vật mới được duy trì ở trạng thái bình thường. Do chỉ được tạo
ra với hàm lượng rất thấp nên việc tinh chế protein/enzym nội bào thường khó khăn,
điều đó đưa giá thành sản phẩm lên rất cao.
Một trong những liệu pháp để khắc phục sự thiếu hụt đó là sử dụng công nghệ
DNA tái tổ hợp. Công nghệ này về lý thuyết cho phép con người tạo ra bất cứ
protein nào với một lượng không giới hạn.
Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường là được tạo thành từ việc gắn
những đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng. Những
vector tách dòng mang DNA tái tổ hợp này có thể biểu hiện thành các protein tái tổ
hợp trong các sinh vật.
I.5.1. Vector tách dòng
-

Khái niệm vector tách dòng

Khoa Công nghệ Sinh học

22

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

Vector tách dòng là các phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài các đoạn
DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào,
tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen của vật chủ
[4].
Vector tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc hiện duy nhất cho các loại enzym
giới hạn khác nhau, đồng thời mang các gen chỉ thị (chỉ thị màu hoặc chỉ thị kháng
sinh) để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp [4].
- Nguyên tắc chọn vector tách dòng
Tách dòng gen là một quá trình phức tạp, gồm nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn
phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau. Chọn vector tách dòng thích hợp có vai trò quyết
định sự thành công hay thất bại trong tách dòng gen. Để đảm bảo tách dòng gen
thành công, khi chọn vector tách dòng cần chú ý một số nguyên tắc:
Dựa vào kích thước và bản chất của đoạn DNA cần tách dòng làm căn cứ chọn
vector. Nếu đoạn cài DNA có nguồn gốc từ gen của sinh vật prokaryod có thể chọn
plasmid, phage, comid,... làm vector tách dòng, tùy thuộc kích thước của đoạn cài
DNA. Sử dụng đoạn cài DNA có nguồn gốc từ các gen sinh vật bậc cao cần chọn
vector tách dòng là phage, nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, virus...[4]
Khi chọn vector tách dòng cần lưu ý đến sự tương đồng các vị trí cắt đặc hiệu
của các enzym giới hạn giữa đoạn cài DNA và vector tách dòng. Nghĩa là đoạn cài
DNA và vector tách dòng phải có các vị trí cắt đặc hiệu của cùng một loại enzym
giới hạn (để đảm bảo quá trình cắt và nối đoạn DNA vào vector tách dòng dễ dàng
và thuận lợi)
Vector tách dòng phải thích hợp với loại tế bào chủ, có khả năng tái bản trong tế
bào chủ, tạo số lượng bản sao lớn nhưng không gây ảnh hưởng tới hoạt động của tế
bào chủ. Gen chỉ thị trong vector tách dòng càng dễ nhận biết càng tốt. Các điểm cắt
của enzym giới hạn hoặc vùng đa cắt nối MCS thường nằm trong các gen chỉ thị,
giúp cho sự nhận biết và sàng lọc thể tái tổ hợp thuận lợi [4].

Khoa Công nghệ Sinh học

23

Lớp cao học k810


Luận văn cao học

Đinh Thị Thu Trang

I.5.2. Tế bào chủ
Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng, quyết
định sự thành bại của kỹ thuật gen. Hệ thống các tế bào chủ thường được sử dụng
trong biểu hiện gen gồm: tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào trứng động vật có
vú và Baculovirus. Trong đó phổ biến tế bào chủ phổ biến và ưa chuộng nhất trong
biểu hiện gen đó là vi khuẩn E. coli.
Một số ưu điểm khi chọn E. coli làm tế bào chủ:
- Vi khuẩn E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái
tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein
tái tổ hợp. Khả năng tạo sản phẩm gen cao từ 50mg/l đến 500mg/l.
- Biểu hiện gen trong tế bào E. coli có thể giảm được các chi phí cho công
nghệ và hóa chất, nên giá thành sản phẩm hạ.
- Cấu trúc bộ gen E. coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy
đủ, tạo nên nhiều thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli.
Có rất nhiều chủng vi khuẩn E. coli được sử dụng trong biểu hiện gen, trong
đó chủng E. coli BL21 là một trong những chủng E. coli được ưa chuộng và sử
dụng rộng rãi để biểu hiện các loại gen khác nhau [4].
I.5.3. Các nghiên cứu về chủng tái tổ hợp
™ Gen mã hóa enzym fibrinaza
Theo Nakamura và cộng sự

thì gen mã hóa enzym fibrinaza của chủng

Bacillus natto (aprN) có độ dài khoảng 1473 bp. Trong đó vùng mang mã di truyền
bắt đầu bằng bộ ba mở đầu GTG, tiếp theo là khung đọc mã mở (ORF- Open
reading frame) với 1143 nucleotid và cuối cùng là kết thúc bằng ba bộ ba TAA
TAG TAA [25].

Khoa Công nghệ Sinh học

24

Lớp cao học k810