Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp có khả năng lên men ethanol từ đường c5 và c6
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.77 MB, 84 trang )
Luận văn thạc sĩ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VŨ THỊ THU HÀ
VŨ THỊ THU HÀ
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP CÓ
KHẢ NĂNG LÊN MEN ETHANOL TỪ ĐƯỜNG C5 VÀ C6
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS. TRƯƠNG QUỐC PHONG
2009 - 2011
HÀ NỘI - 2011
i
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trương Quốc Phong, phòng
Hóa sinh và Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm,
trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, truyền thụ cho tôi kiến thức
cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ
sinh học – Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học vô
cùng bổ ích trong suốt quá trình học tập.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong phòng thí nghiệm thuộc Viện
Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã
nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn mỗi khi tôi gặp khó khăn trong làm thí nghiệm.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn
động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Hà Nội ngày 30/03/2011
Học viên: Vũ Thị Thu Hà
ii
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, không sao chép
của ai. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng
được công bố trong bất kỳ công trình nào. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận
văn đã được ghi rõ nguồn gốc.
Vũ Thị Thu Hà
iii
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
MỤC LỤC
Mục lục ……………………………………………………………………………
iv
Bảng thuật ngữ viết tắt …………………………………………………………….
vii
Danh mục các bảng sử dụng trong luận văn ………………………………………
viii
Danh mục các hình vẽ sử dụng trong luận văn ……………………………………
ix
Mở đầu …………………………………………………………………………….
1
Phần I : Tổng quan tài liệu ………………………………………………………...
3
1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới và ở Việt Nam………………………
3
1.1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới. …………………………………...
3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol ở Việt Nam. ……………………
4
1.2. Các vấn đề gặp phải khi sản xuất bioethanol. ……………………………….
5
1.2.1. Sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu thế hệ I ……………………………
5
1.2.2. Sản xuất ethanol đi từ nguồn nguyên liệu thế hệ II………………………...
5
1.3. Tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng nguồn cacbon đa dạng có
7
khả năng lên men tạo thành ethanol.
1.4. Phát triển chủng vi sinh vật có khả năng lên men đồng thời cả hai loại đường
9
C5 và C6
1.4.1. Vi khuẩn Zymomonas mobilis tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol …...
11
1.4.2. Vi khuẩn Klebsiella oxytoca tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol. ……
13
1.4.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp cho quá trình lên men
13
ethanol.
1.4.4. Vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol. ……… 15
1.5. Đặc điểm và tính chất hóa sinh của alcohol dehydrogenase (ADH) và
16
pyruvate decacboxylase (PDC)
1.5.1. Nguồn gốc và vai trò của ADH và PDC trong tự nhiên ……………………
16
1.5.1.1. Lịch sử nghiên cứu ……………………………………………………….
16
1.5.1.2. Nguồn gốc và vai trò của enzyme ADH ………………………………….
17
1.5.2. Nguồn gốc và vai trò của enzyme PDC …………………………………….
18
iv
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
1.5.3. Đặc điểm cấu trúc của ADH II và PDC …………………………………….
20
1.5.3.1. Đặc điểm cấu trúc của enzyme ADH2 …………………………………
20
1.5.3.2. Đặc điểm cấu trúc của enzyme PDC ……………………………………... 21
1.5.3.3.Vai trò của enzyme ADH II và PDC trong con đường sinh tổng hợp 23
ethanol
Phần II: Vật Liệu và phương pháp nghiên cứu……………………………………
26
2.1. Vật liệu ……………………………………………………………………….
26
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật …………………………………………………….
26
2.1.2. Hóa chất …………………………………………………………………….
26
2.1.3. Trang thiết bị ………………………………………………………………..
27
2.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………..
28
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật ……………………………………………………. 28
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ……………………………………………..
29
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số…………………………………….
29
2.2.2.2. Phương pháp nhân gen đặc hiệu (Polymerase chain reaction-PCR) ……..
30
2.2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose .........................................................
31
2.2.2.4. Phương pháp cắt enzyme giới hạn ..............................................................
31
2.2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR …………………………………..
32
2.2.2.6. Phương pháp nối ghép gen .........................................................................
32
2.2.2.7. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn ...........................................................
32
2.2.2.8. Phương pháp tách chiết plasmid ………………………………………….
33
2.3. Phương pháp tin sinh …………………………………………………………
34
2.4. Phương pháp lên men ethanol ………………………………………………... 35
2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng ethanol trong dịch lên men …………….
36
Phần III: Kết quả và thảo luận …………………………………………………….
37
v
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
3.1. Tách chiết DNA tổng số ...................................................................................
37
3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu gen pdc và adhB của Zymomonas mobilis …………… 39
3.3. Tách dòng gen mã hóa hai enzyme alcohol dehydrogenase II và pyruvate
41
decarboxylase từ Zymomonas mobilis
3.3.1. Khuếch đại gen mã hóa enzyme PDC và ADH II .........................................
41
3.3.2. Kết quả cắt nối ghép gen PDC và ADH II vào vector ……………..............
42
3.3.3. Biến nạp và sàng lọc dòng tái tổ hợp ……………………………………….
45
3.4. Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli tái tổ hợp mang gen mã hóa PDC và 54
ADH II.
3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pdc và adhB ………………………….. 54
3.4.2. Tạo chủng E. coli tái tô hợp mang vector biểu hiện chứa hai gen pdc và 57
adhB
3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện enzyme pyruvate decarboxylase và alcohol 60
dehydrogenase II trong chủng chủ
3.4.3.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp .................................
60
3.4.3.2. Đánh giá khả năng tổng hợp PDC và ADH II trong môi trường lên men 62
chứa đường glucose và xylose
Kết luận và kiến nghị ..............................................................................................
65
Tài liệu tham khảo ...................................................................................................
66
vi
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
BẢNG THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
STT
Ký hiệu
Tên đầy đủ
1
DNA
Deoxyribonucleic acid
2
Amp
Ampiclin
3
bp
4
dNTP
Deoxynucleotide
5
EDTA
Ethylen Diamine Tetra acetic Acid
6
EtBr
7
Da
Dalton
8
LB
Môi trường Luria Broth
9
OD
Optical Density (mật độ quang học)
10
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng
Base pair (cặp bazơ nitơ)
Ethidium Bromide
chuỗi trùng hợp)
11
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
12
TAE
Tris- Acetate-EDTA
13
TE
Tris-EDTA
14
v/ph
Vòng/phút
15
PDC (pdc)
Pyruvate decacboxylase
16
ADH II; ADH2;
Alcohol dehydrogenase 2
adhB
17
PDCf/ PDCr
Cặp mồi xuôi/ ngược của PDC
18
ADHf/ADHr
Cặp mồi xuôi/ ngược của ADH.
vii
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG
SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng 1.1. Sự đa dạng các thành phần đường đơn trong quá trình thủy phân
6
cellulose từ nguyên liệu gỗ.
Bảng 1.2. Những đặc điểm quan trọng đối với vi sinh vật được lựa chọn trong
9
sản xuất ethanol sinh học
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng ........................................................
26
Bảng 3.1. Hai trình tự mồi đặc hiệu gen pdc và adhB …………………….
40
Bảng 3.2. Kết quả blast trình tự đoạn gen pdc được tách dòng …………...
50
Bảng 3.3. Kết quả blast trình tự đoạn gen adhB được tách dòng …………
53
viii
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình 1.1. Hướng tiếp cận tạo sinh vật tái tổ hợp chuyển hóa lignocellulose 11
thành ethanol
Hình 1.2. Con đường chuyển hóa pentose, arabinose, glucose thành ethanol…. 12
Hình 1.3. Các con đường chuyển hóa xylose ………………………………….. 14
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử cofactor NAD+ và NADH…………………………. 18
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc không gian của tetramer ADH2 …………………..
20
Hình 1.6. Trung tâm hoạt động của ADH2 …………………………………….
21
Hình 1.7. Mô hình cấu trúc không gian của enzyme PDC …………………….. 22
Hình 1.8. Cấu trúc trung tâm hoạt động của PDC ……………………………... 23
Hình 1.9. Con đường chuyển hóa đường C5 và C6 thành ethanol …………….. 24
Hình 3.1. Phổ điện di DNA tổng số của vi khuẩn Zymomonas mobilis .............. 38
Hình 3.2. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen rDNA 16S ………. 39
Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm PCR của gen PDC và ADH II .........................
41
Hình 3.4. Sơ đồ nối ghép gen đích vào vector để tạo vector tái tổ hợp ………..
43
Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra vector pTAC-MAT bằng các enzyme giới hạn
44
Hình 3.6. Kết quả cắt và kiểm tra sản phẩm PCR gen pyruvate decarboxylase
45
và gen alcohol dehydrogenase II bằng các enzyme giới hạn.
Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH10b …..
46
Hình 3.8. Phổ điện di plasmid tách từ 10 khuẩn lạc được biến nạp vector tái tổ
47
hợp mang gen mã hóa PDC.
Hình 3.9. Điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
48
PstI
Hình 3.10. Phổ điện di plasmid tách từ 10 khuẩn lạc được biến nạp vector tái
51
tổ hợp mang gen mã hóa ADH II .
Hình 3.11. Điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
52
Pst I.
Hình 3.12. Kết quả biến nạp sản phẩm lai ghép hai gen pdc và adh II với 54
ix
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
vector vào E. coli DH10b
Hình 3.13. Phổ điện di plasmid tách từ 13 dòng khác nhau …………………… 55
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra dòng tái tổ hợp bằng PCR ……………………….. 56
Hình 3.15. Kết quả cắt kiểm tra dòng 13 (C13) bằng enzyme giới hạn ……….. 57
Hình 3.16. Biến nạp vector tái tổ hợp pHBB1807 vào E. coli ATCC11303 ......
58
Hình 3.17. Phổ điện di plasmid tách từ các dòng E. coli ATCC11303 sau khi
58
được biến nạp pHBB1807
Hình 3.18. Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng plasmid làm khuôn và cặp mồi
59
với mồi xuôi là PDCf và mồi ngược là ADHr
Hình 3.19. Phổ điện di cắt enzyme giới hạn kiểm tra ………………………….
60
Hình 3.20. Động học sinh trưởng của chủng E. coli ATCC 11303 ....................
61
Hình 3.21. Khả năng sinh ethanol của chủng E. coli tái tổ hợp ..........................
63
x
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
MỞ ĐẦU
Theo dự đoán, sản lượng dầu mỏ trên toàn thế giới sẽ sụt giảm vào năm 2025
và cạn kiệt hoàn toàn vào năm 2050. Với những báo động trên, thế giới đang đứng
trước nguy cơ rơi vào khủng hoảng năng lượng nếu không nhanh chóng tìm kiếm được
những nguồn nhiên liệu mới thay thế nguồn nhiên liệu từ dầu mỏ. Vì thế, tìm kiếm
nguồn năng lượng thay thế đang được các nước đặt lên hàng đầu.
Trong tiến trình tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế, ethanol nhiên liệu nổi
lên như một ứng cử viên sáng giá nhất, đáp ứng được các tiêu chuẩn như dễ sản xuất,
giá rẻ và “thân thiện” với môi trường. Việc sản xuất ethanol được xem là mục tiêu
chiến lược cho việc sản xuất nguồn nhiên liệu sạch, có khả năng tái tạo do ethanol có
rất nhiều ưu điểm như: góp phần ổn định an ninh năng lượng, giảm thiểu phát thải khí
thải gây hiệu ứng nhà kính đến 60-80%, khai thác nguồn nguyên liệu từ phụ phẩm
nông nghiệp và sinh khối thực vật, góp phần nâng cao thu nhập cho người nông dân
trong quá trình trồng cây lương thực.
Hiện tại, 98% ethanol nhiên liệu được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu liên
quan đến lương thực. Đây là nguyên liệu đắt nên sẽ đẩy giá thành sản phẩm lên rất
cao, làm cho hiệu quả kinh tế thấp. Trong khi đó sản xuất nông nghiệp hàng năm sản
sinh ra một khối lượng khổng lồ nguyên liệu sinh khối như rơm rạ, bã mía, vỏ thân
cây, … với các thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose. Nguyên liệu này sau
khi được thủy phân sẽ giải phóng một loạt các đường đơn như glucose, mannose,
galactose, xylose, arabinose,... Khi sử dụng dịch đường này cho lên men sẽ hạ được
giá thành sản phẩm.
Như vậy, sản phẩm thủy phân nguồn nguyên liệu lignocellulose là một hỗn hợp
các loại đường gồm đường C5 và đường C6. Tuy nhiên, không có chủng vi sinh vật tự
nhiên nào có khả năng lên men ethanol từ hỗn hợp các loại đường này. Xuất phát từ
những yêu cầu đặt ra và tiến tới nhằm hiện thực hóa việc sản xuất bioethanol thế hệ
thứ hai, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen
1
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
mã hóa PDC và ADH II từ Zymomonas mobilis lên men ethanol từ đường C5 và C6”.
Đề tài tập trung vào các vấn đề sau:
1. Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzyme pyruvate decarboxylase (PDC)
và alcohol dehydrogenase II (ADH II) từ Zymomonas mobilis
2. Nghiên cứu tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen mã hóa PDC và ADHII
Các kết quả trong luận văn này cũng mới chỉ là một phần của các bước đi đầu
tiên trên con đường phát triển nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật. Còn rất nhiều
các nghiên cứu tiếp tục để có thể áp dụng được chủng vi khuẩn tái tổ hợp này vào quá
trình lên men ethanol ở quy mô lớn hơn. Tuy nhiên, kết quả của đề tài cũng là một
bước quan trọng làm hiện thực hóa mục tiêu phát triển nhiên liệu sinh học trong
chương trình năng lượng quốc gia.
2
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới
Năm 1908, Henry T. Ford, cha đẻ của ngành công nghiệp ô tô hiện nay đã vận
hành chiếc xe hơi đầu tiên của ông, chiếc Quadricycle bằng nhiên liệu cồn. Theo Ford
thì cồn là “nhiên liệu của tương lai” và là loại nhiên liệu tái tạo khả thi nhất cho ngành
công nghiệp ôtô vừa mới ra đời lúc bấy giờ. Nhưng vào đầu thế kỷ 20, ngành công
nghiệp lọc dầu phát triển nhanh chóng, đưa xăng chiếm vị trí hàng đầu của cồn. Nhờ
giá rẻ, khối lượng cung cấp lớn và nhiều tiện lợi khác, xăng đã dần dần đẩy cồn ra khỏi
thị trường nhiên liệu ôtô. Hiện nay, do giá dầu cao nên ở nhiều nước vị trí của cồn
đang được phục hồi, và nhiên liệu này được xem là một hướng ưu tiên trong chính
sách phát triển nhiên liệu tái tạo. Công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu cũng đang phát
triển mạnh mẽ ở các nước châu Âu. Với mục tiêu giảm phụ thuộc vào nhiên liệu hóa
thạch, EU đặt mục tiêu đến năm 2010 các loại nhiên liệu sinh học sẽ chiếm 5,7 % tổng
mức tiêu thụ nhiên liệu trong giao thông vận tải [32], [49], [52], [85].
Ở Mỹ, trong tháng 6/2006, Bill Ford, cháu của Henry Ford, cùng các ông chủ
của các hãng xe khổng lồ của Mỹ như General Motors, Chrysler đã cùng với Tổng
thống Bush thảo luận tìm giải pháp để cồn được dùng nhiều hơn trong ngành vận tải,
cụ thể là yêu cầu chính phủ cung cấp tài chính để xây dựng hệ thống phân phối cồn
nhiên liệu trên toàn Liên bang. Từ năm 1990 đến nay, do giá dầu tăng liên tục nên cồn
được đưa vào chương trình an ninh năng lượng Mỹ.
Ở châu Mỹ, Braxin sau gần 30 năm nghiên cứu và ứng dụng cồn làm nhiên liệu
thay thế xăng dầu, đã trở thành quốc gia sản xuất cồn lớn nhất thế giới và là nước nắm
vững nhất kỹ thuật sản xuất cồn nhiên liệu. Hiện nay Braxin là nước xuất khẩu cồn lớn
nhất thế giới, chiếm tới 39,8% thương mại của thế giới.
Ở châu Á, do đặc điểm khí hậu, với nguồn nguyên liệu sinh khối giàu có, tốc độ
tăng trưởng cồn nhiên liệu rất ấn tượng: Năm 1984, tổng sản lượng cồn nhiên liệu là
1,5 triệu tấn. Năm 1990, tăng lên 3 triệu tấn, năm 2004 là 6 triệu tấn. Theo dự đoán,
3
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
tổng sản lượng cồn nhiên liệu trong khu vực đạt tới 15 triệu tấn vào năm 2010. Các
nước trong khu vực như Thái Lan, Philippines, Indonesia, Campuchia đều xây dựng
cho mình chương trình nghiên cứu và phát triển năng lượng cồn nhiên liệu cho mục
tiêu tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Thái Lan đã có chính sách sản xuất cồn nhiên liệu
từ 10 năm nay.
Trung Quốc bắt đầu sản xuất cồn nhiên liệu từ 1990 thông qua sử dụng phế liệu
ngũ cốc. Trong kế hoạch 2006-2010 Chính phủ đặt mục tiêu sản xuất 6 triệu tấn cồn,
phục vụ cho vận tải trong các thành phố lớn. Chính phủ đang tăng cường hỗ trợ cho
năng lượng sinh khối và hoạt động sản xuất cồn. Trong kế hoạch xã hội-kinh tế 5 năm
lần thứ 11 (2006-2010) đã xác định rõ nhiệm vụ sản xuất nhiên liệu này cần tăng mạnh
trong những năm tới.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu khởi đầu cho phát triển công nghệ
ethanol từ biomass đã và đang được triển khai. Một nghiên cứu đã được thực hiện tại
Đại học Bách khoa Tp HCM và phát triển thành dự án xây dựng mô hình ”Thị trấn
Biomasse” trong đó ethanol sau khi được tạo ra từ dịch thủy phân của phế thải nông
nghiệp sẽ phục vụ trở lại nhu cầu năng lượng của địa phương. Một nghiên cứu khác đã
được thực hiện tại Viện Công nghiệp thực phẩm về việc nghiên cứu phát triển và thử
nghiệm công nghệ và dây truyền thiết bị cho sản xuất ethanol khan sử dụng nguồn
đường thu được từ dịch thủy phân phế thải nông nghiệp như bã mía, rơm lúa. Các
nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội thử nghiệm sử dụng enzyme thương
mại để thủy phân cỏ voi, sử dụng chế phẩm enzyme tái tổ hợp tạo ra để thủy phân bã
mía nhằm chuyển hóa các nguồn nguyên liệu này thành ethanol.
Thực hiện Đề án chiến lược phát triển nhiên liệu sinh học, năm 2009 chính thức
đánh dấu sự ra đời của ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học tại Việt Nam, với sự
tăng tốc nhanh chóng của các dự án đầu tư sản xuất ethanol nhiên liệu nhờ nguồn
nhiên liệu thế hệ I là sắn, mía. Theo kế hoạch, đến 2011, sẽ đưa vào vận hành 5 cơ sở
sản xuất ethanol nhiên liệu với tổng công suất thiết kế 380.000 tấn/năm đủ để pha 7,6
4
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
triệu tấn xăng E5, vượt mục tiêu của “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học” đề ra về số
lượng và thời gian (Bộ Công thương, 2010).
1.2. Các vấn đề gặp phải khi sản xuất bioethanol.
1.2.1. Sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu thế hệ I.
Nguồn nguyên liệu dùng để lên men sản xuất ethanol là các loại đường, các loại
tinh bột hay từ sinh khối cellulose. Hiện nay, 98% bioethanol được sản xuất từ ngũ cốc
như bột ngô (Mỹ), bột lúa mỳ hay củ cải đường (Châu Âu), đường mía (Châu Mỹ với
sự phát triển mạnh mẽ ở Brazil), hay tinh bột sắn (Châu Á), trong đó chi phí nguyên
liệu chiếm tới 50 – 70% giá thành. Như vậy, tính kinh tế của cồn làm từ ngũ cốc không
khả thi do giá thành để mua nguyên liệu từ ngũ cốc chiếm tới 60% chi phí sản xuất ra
cồn và chi phí này được tính theo giá trị của lương thực chứ không tính theo giá trị về
năng lượng. Hiện nay, các nhà máy sản xuất bioethanol từ ngũ cốc không thể tồn tại
được nếu không có chính sách trợ giá của chính phủ từ các quốc gia (8.5 cent/lit ở
Canada; 54 cent US/ gallon ở Mỹ).
Việc sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu thực phẩm hoặc từ ngành công
nghiệp thực phẩm đã gây lên sự cạnh tranh với sự cung ứng thực phẩm, đe dọa vấn đề
an ninh lương thực toàn cầu. Điều này được đặc biệt nhận thức rõ trong thời điểm hiện
tại khi vào tháng 5/2008, giá lương thực tăng cao 180% so với 3 năm trước đây. Tổ
chức Nông lương thế giới cho rằng một lý do quan trọng gây nên sự bất ổn định lương
thực hiện nay là sự tăng cao tỷ trọng ethanol sản xuất từ ngô của Mỹ trong vòng 3 năm
vừa qua. Ngoài ra việc sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu thực phẩm này sẽ dẫn đến
giá thành sản phẩm rất cao, làm cho hiệu quả kinh tế thấp.
Nhìn nhận một cách tổng quát, cồn nhiên liệu đang được chú ý phát triển và
đưa vào chương trình an ninh năng lượng của rất nhiều quốc gia trên toàn thế giới
trong đó có cả Việt Nam.
1.2.2. Sản xuất ethanol đi từ nguồn nguyên liệu thế hệ II.
Sản xuất nông nghiệp và công nghiệp hàng năm sản sinh một khối lượng khổng
lồ nguyên liệu sinh khối trong đó có sinh khối cellulose. Nếu lượng sinh khối này được
5
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
chuyển thành các dạng nguyên liệu có thể lên men được, chúng sẽ trở thành nguồn
nguyên liệu rất hấp dẫn cho ngành công nghiệp sản xuất cồn. Khi đó chi phí nguyên
liệu trong sản xuất cồn chỉ còn 35 – 40% so với ethanol sản xuất từ tinh bột. Với mục
tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có khả năng tái sử dụng cho quá trình
sản xuất cồn sinh học, sinh khối lignocellulose với các thành phần chủ yếu là các
polyme: cellulose (45% trong gỗ), hemicellulose (31% trọng lượng khô tổng số của
sinh khối) và lignin khá dồi dào từ phụ phẩm nông – lâm nghiệp như: rơm, chấu, thân
cây, gỗ,… chất thải có bản chất thực vật từ các khu dân cư… đang trở thành đối tượng
được chú trọng nghiên cứu tại nhiều quốc gia khác nhau hiện nay.
Bảng 1.1. Sự đa dạng các thành phần đường đơn trong quá trình thủy phân
cellulose từ nguyên liệu gỗ. (tính theo % khối lượng) [17]
Tên đường
Gỗ mềm
Gỗ mềm đã
Gỗ cứng
bóc vỏ
Gỗ cứng đã
bóc vỏ
Glucose
61 – 65
57 - 63
55 – 73
53 - 65
Xylose
9 – 13
11 – 15
20 – 39
18 – 36
Mannose
7 – 16
6 -16
0.4 – 4
0.3 – 3
Galactose
6 – 17
1 -5
1–4
1–6
Arabinose
< 3.5
4 – 11
<1
2–8
Rhamnose
<1
<1
<1
<1
Uronic acids
4 -7
---
4 -7
----
Dựa vào bảng số liệu về thành phần của các loại đường đơn thu được trong quá
trình thủy phân cellulose ta thấy: Xylose là loại đường có tỷ lệ chiếm vị trí thứ hai sau
glucose, sau đó là mannose và galactose. Như vậy, để sử dụng nguồn lignocellulose
làm nguồn cơ chất trong quá trình thủy phân sản xuất bioethanol thì một thách thức đặt
ra là ngoài đường 6 cacbon, cần phải tìm kiếm giải pháp chuyển hóa được cả đường 5
cacbon (xylose, arabinose) tạo thành ethanol. Một trong những giải phát được đưa ra
đó là tìm kiếm, lựa chọn và tạo chủng vi sinh vật có khả năng lên men ethanol từ hỗn
hợp các loại đường là sản phẩm của quá trình thủy phân từ sinh khối cellulose.
6
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
1.3. Tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng nguồn cacbon đa dạng có
khả năng lên men tạo thành ethanol.
Vi sinh vật là nhân tố đóng vai trò then chốt trong quá trình lên men sản xuất
ethanol, dù quá trình sản xuất đi từ bất cứ nguồn nguyên liệu ban đầu nào. Những
phương pháp lên men với đường 6 cacbon đã được biết đến trước đây ít nhất 6000 năm
khi người Xume, người Babylon, người Ai cập bắt đầu hoàn chỉnh và miêu tả quá trình
sản xuất bia từ ngũ cốc (tinh bột). Đến cuối thế kỉ 19, sau khi quá trình thủy phân
lignocellulose từ cây trồng tạo thành đường 6 cacbon được tiến hành dễ dàng thì sự
chuyển hóa đường 5 cacbon trở thành vấn đề được quan tâm nhất. Đường 5 cacbon
chiếm tỷ lệ phần trăm cao trong các loại đường đơn thu nhận được từ quá trình thủy
phân lignocellulose, khả năng đồng hóa và chuyển chúng thành ethanol là rất quan
trọng khi xét về năng suất và tính kinh tế của quá trình. Chỉ đến những năm 1980
những nghiên cứu về sự lên men xylose mới được bắt đầu với đồ uống có cồn lên men
từ hoa quả, khi một số loại men bia hoang dã đã được xác định rằng có thể chuyển đổi
xylose thành ethanol. Trong quá trình tìm kiếm chủng vi sinh vật có hoạt lực cao, có
khả năng lên men được đường 5 cacbon thành ethanol, vi khuẩn đã thu hút được sự
chú ý đặc biệt nhờ tốc độ lên men nhanh trong quá trình lên men. Tất cả những chủng
vi sinh vật tự nhiên được tuyển chọn hiện nay đều có những hạn chế: hoặc là không có
khả năng lên men đối với cả hai loại đường 5 và 6 cacbon, hiệu suất tạo ethanol thấp
hoặc sự tạo ra sinh khối tế bào dễ bị kìm hãm bởi nồng độ ethanol.
Cho đến thời điểm hiện nay, trong sản xuất ethanol trên quy mô công nghiệp,
chủng được sử dụng phổ biến nhất là Saccharomyces cerevisiae nhờ có nhiều ưu điểm
nổi trội [83]. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của nấm men này là chịu nồng độ
ethanol kém, tối đa là 60g/l, và cơ chế xúc tác cơ chất khá chậm làm kéo dài thời gian
lên men. Một số công trình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Zymomonas mobilis thay thế
nấm men nhờ có những ưu điểm vượt trội về: tốc độ phát triển nhanh hơn, dễ điều
chỉnh con đường chuyển hóa bậc cao cũng như khả năng chịu nồng độ ethanol tốt hơn,
hiệu suất tạo ethanol cao gấp 2.5 lần nấm men [19]. Nhưng nhược điểm của vi khuẩn
này là chỉ lên men được các loại đường 6 cacbon như glucose, fructose, hay saccarose
7
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
mà không có khả năng lên men được các loại đường 5 cacbon như xylose,
arabinose,… [19], [36]. Tuy nhiên, hiện nay bằng con đường biến đổi gen Zymomonas
mobilis tái tổ hợp đã có khả năng sử dụng đường 5 cacbon như xylose, arabinose tạo
ethanol [55], [87]. Hướng tiếp cận dùng công nghệ gen để tạo chủng tái tổ hợp cũng đã
được áp dụng thành công trên Saccharomyces cerevisiae [81], tuy nhiên các chủng tái
tổ hợp không được sử dụng trong công nghiệp vì lí do tính di truyền không ổn định
dẫn tới việc chuyển hóa cũng như hiệu suất tạo ethanol thấp. Ngoài ra, các loại vi
khuẩn khác như Clostridium thermocellum [16], Clostridium acetobutylicum [37] nhờ
khả năng tự nhiên lên men cellulose, hemicellulose, tinh bột thành ethanol cũng đã
được tiến hành nghiên cứu song không đạt hiệu quả bằng Saccharomyces cerevisiae
hay Zymomonas mobilis.
Các nhà khoa học thuộc viện nghiên cứu khoa học quốc gia Mỹ (NAS) đã tạo ra
được một chủng vi khuẩn theo phương pháp di truyền học, có thể giúp giảm giá thành
sản xuất bioethanol từ hợp chất cellulose. Theo ông Lee Lynd, tác giả của nghiên cứu
khoa học trên, các chủng vi khuẩn được sinh ra tự nhiên cũng có thể giúp lên men
cellulose nhưng với điều kiện chỉ xảy ra ở nhiệt độ thấp và cần phải sử dụng một loại
enzym rất đắt là cellulase. Loại vi khuẩn mới này, được tạo ra từ loại vi khuẩn yếm khí
ưa nhiệt Thermoanaerobacterium saccharolyticum đã được loại các gen liên quan đến
quá trình tạo ra các axit hữu cơ, được gọi là ALK2, có thể giúp lên men tất cả các loại
đường ở nhiệt độ 500C, trong khi các loại vi khuẩn thông thường khác không thể làm
được điều này khi nhiệt độ vượt quá 370C. Mặt khác, trong khi quá trình lên men
thông thường hiện nay tạo ra các loại axit hữu cơ cùng với cồn ethanol, thì với phương
pháp sử dụng vi khuẩn mới ALK2 sẽ cho sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là
ethanol. Với vi khuẩn ALK2, phương pháp sản xuất cồn từ cellulose – trữ lượng sinh
khối lớn nhất trên thế giới, đã mở ra một hướng đi mới trong việc sản xuất nhiên liệu
sạch vừa góp phần chống lại sự biến đổi khí hậu, vừa không ảnh hưởng đến sản lượng
lương thực.
Sự thủy phân các polyme cao phân tử như cellulose và hemicellulose sẽ giải
phóng ra một hỗn hợp các đường đơn như đã chỉ ra trong bảng. Tuy nhiên, trong tự
8
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
nhiên không có một sinh vật nào có khả năng chuyển hóa nhanh và hiệu quả hỗn hợp
đường khác nhau này thành ethanol. Điều đó là do sự thiếu hụt một hoặc một số
enzyme quan trọng tham gia vào con đường chuyển hóa đường tạo thành ethanol. Do
đó, một hướng nghiên cứu đã và đang được tiến hành đó là dùng công nghệ gen để tạo
ra các chủng vi sinh vật có khả năng lên men được hỗn hợp các loại đường thu được từ
dịch thủy phân sinh khôi thực vật và phế thải nông nghiệp với hiệu xuất cao.
1.4. Phát triển những chủng vi sinh vật có khả năng lên men đồng thời cả hai loại
đường C5 và C6
Trong suốt hai thập kỉ qua, nhiều chủng vi sinh vật đã được nghiên cứu, cải
biến để có thể ứng dụng trong sản xuất ethanol sinh học. Sinh khối lignocellulose có
chứa hợp chất cacbonhydrates phức tạp đòi hỏi phải có những chủng vi sinh vật có khả
năng lên men được các loại đường mà nấm men thông thường không thể lên men
được. E. coli và K. oxytoca là những vi sinh vật tự nhiên có thể sử dụng một phổ rộng
các loại đường nhưng không có khả năng lên men thành ethanol. Đối với Zymomonas
mobilis mặc dù có khả năng men ethanol đạt hiệu suất cao nhưng chỉ có khả năng lên
men được đường glucose và fructose.
Những đặc tính quan trọng đối với một chủng vi sinh vật được chọn lựa cho sự
lên men ethanol:
Bảng 1.2. Những đặc điểm quan trọng đối với vi sinh vật được lựa chọn trong sản
xuất ethanol sinh học. [19]
Đặc điểm
Yêu cầu đặt ra
Hiệu suất tạo cồn
> 90 % theo lý thuyết
Khả năng chịu cồn
> 40 g/l
Khả năng sinh ethanol
> 1 g/l/h
Các yếu tố dinh dưỡng
Rẻ tiền
Khả năng sinh trưởng trong dịch thủy Ít bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế
phân không pha loãng
trong dịch thủy phân
9
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
Do đó một số nghiên cứu cải biến gen đã được thực hiện trên những vi sinh vật
này để có thể tạo ra chủng tái tổ hợp có thể lên men tạo thành ethanol từ nhiều loại
đường khác nhau. Các loại vi sinh vật đã được cải biến gen như: vi khuẩn Gram âm
(Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Zymobacter palmae) [34],
vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis), nấm men (Saccharomyces cerevisiae).
Việc cải biến gen để tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng lên men ethanol từ
hỗn hợp đường từ dịch thủy phân sinh khối có thể được thực hiện theo hai hướng tiếp
cận:
-
Đưa các gen mã hóa các enzyme tham gia thủy phân lignocellulose từ các
chủng tự nhiên vào các chủng vi sinh vật có khả năng lên men cồn nhưng
lại thiếu hụt những enzyme thủy phân này.
-
Đưa các gen quan trọng của con đường chuyển hóa tạo ethanol từ các
chủng có khả năng lên men cồn vào các chủng vi sinh vật có khả năng sử
dụng được hỗn hợp các loại đường.
10
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
Hình 1.1. Hướng tiếp cận tạo sinh vật tái tổ hợp chuyển hóa lignocellulose thành
ethanol
1.4.1. Vi khuẩn Zymomonas mobilis tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol
Zymomonas mobilis là một vi khuẩn Gram âm mang nhiều đặc tính quý báu, có
vai trò xúc tác sinh học cho quá trình sản xuất ethanol. Z. mobilis lên men đồng hình
và khả năng chịu ethanol lên đến 120g/l. Quá trình lên men cho năng suất tạo ethanol
cao (5 – 10% ethanol / quá trình lên men glucose) và có năng suất tạo ethanol đặc biệt
cao hơn nhiều (gấp 5 lần) so với nấm men Saccharomyces [66]. Hơn nữa Z. mobilis
được coi là an toàn (generally regarded as safe (GRAS)) và là lựa chọn thích hợp cho
việc sản xuất ethanol trong những năm 1970 - 1980. Một số ý kiến cho rằng có thể sử
dụng chủng vi khuẩn này thay thế nấm men trong quá trình sản xuất ethanol. Tuy
11
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
nhiên S. cerevisiae vẫn được ưu tiên sử dụng trong quy mô công nghiệp bởi vì khả
năng chịu đựng tốt môi trường lên men khắc nghiệt. Mặc dù lợi thế của Z. mobilis như
là một ethanologen (vi sinh vật được lựa chọn để lên men sản xuất ethanol nhiên liệu)
nhưng chúng lại không thích hợp cho việc sản xuất ethanol nhiên liệu bởi vì chúng chỉ
có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose and sucrose. Để khắc phục
hạn chế này các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra những chủng tái tổ
hợp có khả năng lên men xylose bằng việc đưa vào các gen mã hóa cho enzyme chìa
khóa tham gia vào con đường chuyển hóa xylose như xylose isomerase, xylulokinase,
transaldolase, transketolase [87].
Hình 1.2. Con đường chuyển hóa pentose, arabinose, glucose thành ethanol
Tuy nhiên, hiệu suất lên men tạo ethanol của chủng Z. mobilis tái tổ hợp hiện
nay không cao do khả năng chịu axit axetic trong môi trường lên men xylose của biến
chủng Z. mobilis là rất kém. Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn này trên môi trường
có nguồn cacbon xylose là tương đối thấp và thấp hơn nhiều khi phát triển trên môi
trường glucose [40]. Do vậy, việc tạo ra được những chủng Z. mobilis tái tổ hợp mà có
12
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
khả năng lên men được hỗn hợp cả hai loại đường trên hay phổ rộng các loại đường
tồn tại trong hỗn hợp thủy phân lignocellulose vẫn còn là một vấn đề thách thức đối
với các nhà khoa học trong tương lai.
1.4.2. Vi khuẩn Klebsiella oxytoca tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol.
K. oxytoca là một loại vi khuẩn đường ruột được tìm thấy có khả năng sống và
phát triển trong môi trường giấy và bột giấy cũng như xung quanh các nguồn nguyên
liệu khác từ gỗ. Vi sinh vật này có khả năng phát triển ở điều kiện pH thấp (pH = 5.0)
và nhiệt độ 350C. K. oxytoca sẽ phát triển trên nhiều loại đường trong đó có hexose,
pentose cũng như là trên cellobiose và cellotriose. Đặc tính này làm cho chủng đặc biệt
được quan tâm trong quá trình nghiên cứu lên men cellulose. Ingram và cộng sự đã
biến đổi gen đối với các vi khuẩn Gram âm K. oxytoca với việc đưa vào operon PET.
Tuy nhiên những chủng này tạo ra ethanol với hiệu suất thấp hơn so với E. coli.
1.4.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol.
Nấm men là chủng vi sinh vật rất quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong
quá trình lên men sản xuất ethanol do có nhiều ưu điểm nổi bật:
• Không tích tụ và tạo ra độc tố trong quá trình lên men. Có độ an toàn sinh học
cao.
• Được sử dụng phổ biến trong công nghiệp và đã được nghiên cứu ứng dụng
trong một thời gian dài, hiện nay có nhiều chế phẩm nấm men cho hiệu suất tạo
cồn cao.
• Lên men được nhiều loại đường, dễ dàng đạt được điều kiện lên men tối ưu.
Tốc độ phát triển nhanh.
Tuy nhiên, nấm men không có khả năng lên men đường 5 cacbon do trong bộ
gen của nấm men thiếu một số enzym quan trọng phục vụ cho quá trình chuyển hóa
đường 5 cacbon thành pyruvate. Chính vì vậy, nếu sản xuất ethanol đi từ nguồn
nguyên liệu thế hệ 2 với đại diện tiêu biểu là cellulose và sản phẩm của quá trình thủy
phân lignocellulose cho thấy đường 5 cacbon (xylose) chiếm vị trí quan trọng thứ 2
sau glucose thì chế phẩm nấm men thông thường không đảm bảo được yêu cầu đặt ra.
Do đó, trước nhu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả năng lên men
13
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
được đường C5 và C6, các nhà khoa học cũng đã bắt tay vào nghiên cứu và tìm cách
tạo ra chủng nấm men tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme phục vụ cho quá trình
chuyển hóa đường 5 cacbon thành ethanol.
Có hai con đường khác nhau có thể sử dụng để tạo ra chủng nấm men tái tổ hợp
có khả năng lên men đường C5:
• Con đường gắn hai enzyme: xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase
(XDH) lấy từ nấm men Pichia stipitis (Con đường XR - XDH)
• Con đường gắn enzyme: xylose isomerase (XI) lấy từ nấm men Pichia stipitis
(Con đường XI)
Hình 1.3. Các con đường chuyển hóa xylose.
A. con đường XR-XDH, B. con đường XI, xylose reductase (XR); xylitol
dehydrogenase (XDH); xylulokinase (XK); xylose isomerase (XI) [38].
Có nhiều nghiên cứu khác cũng được tiến hành theo cả hai con đường lên men
để so sánh khả năng lên men theo hai cách này. Như nghiên cứu của Tomonori Ito và
cộng sự thuộc trường đại học Kobe, Nhật Bản; Anuj Kumar Chandel và cộng sự thuộc
trường đại học Osmania University, Malaysia, công bố 2/2007; A. S. Ahmed và cộng
sự thuộc trường đại học Sarawak, Malaysia công bố ngày 13/03/2010;… Kết quả đều
14
Vũ Thị Thu Hà
Luận văn thạc sĩ
cho thấy lên men theo con đường XI, sản phẩm của quá trình lên men hầu như chỉ có
ethanol, hiệu suất đạt được không cao so với con đường XR – XDH , rất ít sản phẩm
phụ được tạo thành. Lên men theo con đường XR – XDH, sản phẩm của quá trình lên
men ngoài ethanol còn có rất nhiều sản phẩm phụ khác, đặc biệt là xylitol và glycerol.
Hiệu suất tạo ethanol cao hơn con đường lên men thứ nhất (con đường XI).
Như vậy, dựa vào yêu cầu sản xuất và dây chuyền sản xuất mà có lựa chọn phù
hợp trong việc tạo chủng nấm men tái tổ hợp có khả năng lên men xylose tạo ethanol.
Tuy nhiên, cho đến nay việc lên men hỗn hợp đường C5 và C6 từ nấm men tạo thành
ethanol không đạt hiệu suất cao bằng các chủng vi khuẩn tái tổ hợp như E. coli tái tổ
hợp. Vì vậy, xu thế hiện nay trên thế giới là phát triển các chủng vi khuẩn như E. coli;
Z. mobilis…trong vấn đề sản xuất ethanol nhiên liệu và Mỹ đang là quốc gia đi tiên
phong trong lĩnh vực này
1.4.4. Vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol.
Escherichia coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được ưa chuộng nhất trong
tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen mong muốn. Một trong những lý do là vì hệ
gen của E. coli đã được giải mã đầy đủ. Những thao tác kỹ thuật với E. coli khá dễ
dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm. E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh và
tương đối đơn giản về mặt di truyền. Đặc biệt chúng rất dễ tiếp nhận các tác nhân
ngoại lai như plasmid, phagemide,… Các phân tử DNA ngoại lai được nhân lên và tồn
tại một cách độc lập trong tế bào với số lượng bản sao lớn.
Vi khuẩn E. coli còn có một số những ưu điểm lớn mang nhiều hoạt tính sinh
học có lợi cho quá trình sản xuất ethanol, bao gồm những ưu điểm chính như môi
trường để nuôi E. coli là khoảng pH trung tính (pH = 6.0 – 8.0), môi trường tăng sinh
E. coli đơn giản hơn so với nấm men, không yêu cầu môi trường phát triển phức tạp.
Một trong những đặc điểm rất quan trọng nữa đó là chủng vi khuẩn này có thể
sử dụng được hỗn hợp các loại đường có nguồn carbon đa dạng để sinh trưởng. Như
vậy, với những ưu điểm vượt trội của mình, vi khuẩn E. coli là một trong những vật
15
Vũ Thị Thu Hà
