Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen 4CL1 vào cây xoan ta (melia azedarach l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------

NGUYỄN NHƯ NGỌC

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR VÀ
CHUYỂN GEN 4CL1 VÀO CÂY XOAN TA ( Melia azedarach L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ QUANG HÒA

HÀ NỘI – 2010


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, những nội dung được trình bày trong luận văn này là do
sự tìm tòi, nghiên cứu của chính bản thân. Các kết quả nghiên cứu là trung thực
và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào của các tác giả khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm về những nội dung cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010
Tác giả
Nguyễn Như Ngọc


LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

tới TS. Lê Quang Hòa, người thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức,
kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Hồ Văn Giảng, Giám đốc trung
tâm Giống và Công nghệ Sinh học- trường Đại học Lâm Nghiệp, chủ nhiệm đề tài
“Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) có sức sinh trưởng nhanh,
chất lượng gỗ tốt” đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành
luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè cùng gia đình đã quan
tâm động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với tất cả mọi người
đã giúp đỡ và ủng hộ tôi!

Hà Nội, Tháng 10-2010
Tác giả:
Nguyễn Như Ngọc


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Stt

Ký hiệu

Tên gọi

1

FAO

Food and Agriculture Organization

2

GMC

Genetic Modified Crops

3

CNSH

Công nghệ sinh học

4

EIQ

5

Bt

6

GHE

7

ISAAA

8

RB

Right boder

9

LB

Left boder

10

Kan

Kanamycin

11

MCS

Multiple Cloning Site

12

kb

13

E.coli

14

A.tumefaciens

Environmental Impact Quotient
Bacillus thurigenesis
Greenhouse Effect
International Service for the Acquisition of Agri-biotech
Applications

Kilobase
Escheria coli
Agrobacterium tumefaciens


DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1. Một số loài cây rừng đã và đang được nghiên cứu
chuyển gen ở Trung Quốc

8

2

Bảng 1.2. Đặc điểm của một số gen 4CL1 ở các đối tượng khác nhau

18

3

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất lai southern blot

35

4

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt các vector chuyển gen pBI 121 và
vector tách dòng PCR 2.1- 4CL1 bằng cặp enzym giới hạn.

36

5

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ghép nối vector pBI121 với gen 4CL1 để
tạo vector tái tổ hợp.

36

6

Bảng 2.4. Cắt plasmid pBI121-4CL1 bằng cặp enzym BamHI/SacI

39

7

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR nhân gen 4CL1

44


DANH MỤC CÁC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1. Biểu đồ diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu

5

2

6

3

Hình1.2. Biểu đồ diện tích một số loại cây trồng CNSH trên toàn cầu từ
1996 – 2008 (Clive James, 2009)
Hình 1.3. Cấu tạo hóa học các đơn phân của lignin

14

4

Hình 1.4. Mô hình gắn kết giữa các sợi polysaccharide bởi lignin

15

5

Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp lignin

17

6

Hình 1.6. Hình thái cây trưởng thành, Hoa và Quả của cây Xoan ta

22

7

Hình 1.7. Cấu trúc T – ADN và T – plasmid

25

8

Hình 1.8. Sơ đồ cấu trúc vùng T – ADN của vector pBI121

32

9

Hình 1.9. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121

32

10

Hình 3.1. Kết quả cắt pBI121, pCR2.1-4CL1 bằng BamHI/SacI.

49

11

Hình 3.2. Kết quả thôi gel thu nhận gen 4CL1 và vector pBI121

50

12

Hình 3.3. Vi khuẩn E.coli mang vector pBI121-4CL1 trên môi trường Kan

51

13

Hình 3.4. Plasmid tách chiết từ các dòng tế bào được biến nạp pBI121-4CL1

52

14

Hình 3.5. Kết quả PCR nhân gen 4CL1

53

15

Hình 3.6. Kết quả cắt kiểm tra pBI121-4CL1 bằng enzym giới hạn

53

16

54

18

Hình 3.7. Các khuẩn lạc của vi khuẩn A.tumefaciens chủng LBA 4404
sau khi biến nạp mọc trên môi trường chọn lọc.
Hình 3.8. Kết quả colony PCR từ các khuẩn lạc của vi khuẩn A.
tumefaciens chủng
Hình 3.9. Plasmid tách từ các dòng A. tumefaciens LB1và LB2

19

Hình 3.10. Kết quả cắt plasmid dòng LB1 và LB2 bằng enzym giới hạn

56

20

Hình 3.11. Kết quả PCR nhân gen 4CL1 từ các dòng LB1 và LB2 .

57

21

Hình 3.12. Cây mầm Xoan ta in vitro tái sinh từ hạt

58

22

Hình 3.13. Thân mầm Xoan ta cộng sinh với vi khuẩn A. tumefaciens
mang vector pBI121 – 4CL1

59

17

55
56

24

Hình 3.14. Các giai đoạn phát triển của vật liệu nhận gen trên môi trường
chọn lọc
Hình 3.15. Cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1

62

25

Hình 3.16. Cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 ở điều kiện tự nhiên sau 1 tháng

63

26

Hình 3.17. Ảnh điện di ADN tổng số từ 9 dòng Xoan ta chuyển gen

64

27

Hình 3.18. Kết quả PCR nhân gen 4CL1 từ 16 dòng Xoan ta chuyển gen

65

28

Hình 3.19. Kết quả southern blot từ ADN cây Xoan ta chuyển gen, dòng T5

66

23

60


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
lời cảm ơn
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………………...1
Chương 1 ..............................................................................................................................4
TỔNG QUAN.......................................................................................................................4
1. 1. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam ...............................4
1.1.1. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới ............................................................4
1.1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam..............................................................6
1.2. Tình hình nghiên cứu về cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới và
Việt Nam ..........................................................................................................................7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới ...............................7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu cây lâm nghiệp biến đổi gen ở Việt Nam..................................9
1.2.3. Các gen thường được chuyển vào cây lâm nghiệp ....................................................10
1.3. Gen điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .....................................13
1.3.1. Giới thiệu về lignin và vai trò của lignin trong thực vật ..........................................13
1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp lignin trong thực vật ...............................................................16
1.3.3. Gen 4CL1 – điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật..............................17

1.3.4. Tình hình nghiên cứu gen 4CL1 trên thế giới...........................................................18
1.4. Tổng quan về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) ..................................................20
1.4.1. Giới thiệu về cây Xoan ta...........................................................................................20
1.4.2. Tình hình nghiên cứu phát triển giống Xoan ta.........................................................22
1.5. Chuyển gen thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.......................23
1.5.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens…………………………………………….24
1.5.2. Cấu trúc của T-plasmid và T- AND……………………………………………….24
1.5.3. Cơ chế và quá trình chuyển T - AND vào tế bào thực vật………………………..25
1.5.4. Tương tác giữa T-ADN và genome tế bào thực vật……………………………….27
1.6. Hệ vector sử dụng trong nghiên cứu........................................................................29
1.6.1. Giới thiệu về vector chuyển gen pBI121…………………………………………..29
1.6.2. Các thành phần cấu trúc của vector pBI121……………………………………...29
Chương 2 ............................................................................................................................33
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................33
2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu ............................................................................33
2.1.1. Vật liệu.......................................................................................................................33
2.1.2. Hoá chất và thiết bị....................................................................................................33
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................35
2.2.1. Thiết kế vector chuyển gen 4CL1.............................................................................35
2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp chứa gen 4CL1 ............37
2.2.3. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen .................38
2.3. Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta ..............................................................................39
2.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector mang gen 4CL1 ..............................41


2.3.2. Tạo các đoạn thân mầm để cảm ứng phục vụ cho chuyển gen .......................................42
2.3.3. Đồng nuôi cấy vi khuẩn với các đoạn thân mầm.......................................................42
2.3.4. Chọn lọc vật liệu nhận gen ........................................................................................42
2.3.5. Tái sinh chồi từ vật liệu nhận gen..............................................................................43
2.3.6. Tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh.................................................................................43

2.4. Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây Xoan chuyển gen.....................43
2.4.1.Nhân gen mục tiêu bằng phương pháp PCR ..............................................................43
2.4.2.Phương pháp lai Southern blot...................................................................................45
Chương 3 ............................................................................................................................49
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................................................49
3.1. Thiết kế vector chuyển gen tái tổ hợp pBI12-4CL1.............................................49
3.1.1. Cắt vector chuyển gen pBI121 và pCR2.1-4CL1 bằng cặp enzym BamHI/SacI và thôi gel để
thu nhận sản phẩm cắt.............................................................................................................49
3.1.2. Ghép nối tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào vi khuẩn E.coli và sàng lọc các dòng vi
khuẩn E.coli mang vector tái tổ hợp....................................................................................51
3.1.3. Kiểm tra bằng kỹ thuật PCR .....................................................................................52
3.1.4. Kiểm tra bằng enzym giới hạn ..................................................................................53
3.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp pBI121-4CL1.......54
3.2.1. Biến nạp vector chuyển gen mang gen 4CL1 vào vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA
4404 .....................................................................................................................................54
3.2.2.Tuyển chọn các dòng vi khuẩn mang vector chuyển gen............................................55
3.3. Chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta .......................................................................58
3.3.1. Tạo các cây mầm in vitro để tạo vật liệu phục vụ cho chuyển gen................................58
3.3.2. Đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen.......................58
3.3.3. Chọn lọc vật liệu nhận gen .......................................................................................59
3.3.4. Tạo cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 ....................................................................61
3.4. Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây chuyển gen....................................63
3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của cây con Xoan ta chuyển gen............................63
3.4.2. Kết quả nhân gen 4CL1 .............................................................................................64
3.4.3. Kết quả Southern blot ................................................................................................65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................69


MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu gỗ đang gia tăng mạnh mẽ cả cho tiêu dùng
nội địa và xuất khẩu. Nước ta đã xuất khẩu sản phẩm gỗ sang 120 quốc gia và vùng
lãnh thổ trên thế giới, tập trung vào các thị trường trọng điểm là Mỹ (chiếm
43,35%); Nhật Bản (chiếm 13,68% ); tiếp đến là Trung Quốc (với 7,62%). Dự kiến
kim ngạch xuất khẩu đồ gỗ và lâm sản của Việt Nam năm 2010 là 2,95 tỷ USD,
tăng 5,3% so với năm 2009, trong đó gỗ và các sản phẩm gỗ đạt 2,735 tỷ USD.
Do đó, Chính phủ đã xếp sản phẩm gỗ vào nhóm 10 mặt hàng xuất khẩu
chiến lược. Nhưng khó khăn hiện nay của Việt Nam là hàng năm phải nhập khẩu
80% nguyên liệu cho việc sản xuất các sản phẩm từ gỗ. Không những thế, trong
tương lai gần việc nhập khẩu gỗ ngày càng trở nên khó khăn hơn vì nhiều nước
nhiệt đới sẽ cấm xuất khẩu gỗ.
Một trong các loài cây lấy gỗ đáp ứng nhu cầu và thị hiếu người tiêu dùng
hiện nay là cây Xoan ta, với đặc điểm là cây gỗ lớn, thời gian thu hoạch ngắn, năng
suất gỗ cao, gỗ có tính thẩm mỹ, không bị mọt, thích nghi với nhiều điều kiện gây
trồng. Gỗ Xoan được ưa chuộng dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng, trang trí
nội thất và điêu khắc…
Do đó, Xoan ta đã được chọn là loài cây gỗ lớn quan trọng được xếp vị trí thứ
nhất và thứ hai trong danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất ở 6/9
vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm.
Mặc dù vậy, các giống Xoan ta đang trồng hiện nay vẫn chưa đáp ứng được
những yêu cầu của người trồng rừng sản xuất và người sử dụng bởi gỗ Xoan sau khi
thu hoạch thường phải ngâm trong nước từ 5 đến 6 tháng thì gỗ mới bền, không bị
mối, ít bị biến dạng khi sử dụng. Chính vì vậy, thực tiễn luôn đòi hỏi tạo ra giống
Xoan ta có sức sinh trưởng nhanh hơn, chất lượng gỗ tốt hơn nữa để đáp ứng nhu
cầu gỗ cho con người.
Công tác nghiên cứu nhằm cải tạo các giống cây trồng, vật nuôi truyền thống
đã được các nhà khoa học tiến hành từ rất sớm và đến nay đã đạt được những thành
quả nhất định. Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế, đặc biệt đối với các

1

loài cây lâm nghiệp có chu kỳ sinh trưởng dài. Việc áp dụng các kỹ thuật tiên tiến
trong công nghệ sinh học để cải thiện giống cây trồng, vật nuôi là vô cùng quan
trọng, trong đó kỹ thuật chuyển gen thực vật được xem là một giải pháp phù hợp,
cho phép các nhà khoa học nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng mới mang các
tính trạng đáp ứng mục tiêu của con người. Đến nay, trong lĩnh vực nông nghiệp đã
có hàng loạt các giống cây trồng biến đổi gen được tạo ra và gây trồng thương mại
như: Đậu tương, Ngô, Lúa, Bông, Cà chua, Khoai tây, Cải dầu,…góp phần quan
trọng vào việc đảm bảo an ninh lương thực trên phạm vi toàn cầu. Trong lĩnh vực
tạo giống cây trồng lâm nghiệp biến đổi gen đã có một số đối tượng cây trồng được
quan tâm nghiên cứu như: Cây Dương, Bạch đàn, Thông…
Hướng nghiên cứu cải thiệt chất lượng gỗ cây lâm nghiệp bằng kỹ thuật
chuyển gen thường tập trung vào các gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ sinh, đặc biệt là lignin ở thực vật, như gen
PAL, COMT, CCR, CAD, C4H, C3H, 4CL,… Trong đó gen 4CL1 mã hóa cho 4coumarate:coenzym A ligase được xem là enzym chìa khóa có vai trò quan trọng
trong việc điều hoà sinh tổng hợp lignin ở thực vật. Ở thực vật có mạch, lignin là một
thành phần quan trọng tham gia vào cấu trúc thành tế bào, đặc biệt là các tế bào của
mạch xylem. Lignin có tác dụng gắn kết các sợi polysaccharide thông qua các kiểu
liên kết hoá học khác nhau, từ đó giữ cho tế bào vững chắc, có khả năng chịu lực cơ
học và bảo vệ các sợi xellulose không bị phân huỷ bởi các nhân tố hoá- sinh học. Do
đó, chúng tôi chọn gen 4CL1 làm gen mục tiêu để chuyển vào đối tượng Xoan ta,
nhằm tạo ra giống Xoan ta biến đổi gen có chất lượng gỗ tốt, góp phần nâng cao giá
trị kinh tế và giá trị sử dụng gỗ Xoan ta. Để góp phần thực hiện mục tiêu đó, chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen
4CL1 vào cây Xoan ta (Melia azedarach L.)” đây là một trong những nội dung
quan trọng của đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) biến đổi
gen có khả năng sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt” thuộc Chương trình trọng
điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát
triển nông thôn đến năm 2020.

2


Mục tiêu của đề tài:
Mục tiêu chung: Nhằm góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật chuyển gen vào cây
Xoan ta. Làm cơ sở cho công tác tạo giống cây trồng biến đổi gen ở loài Xoan ta
cũng như các loài cây lâm nghiệp khác.
Mục tiêu cụ thể:
1. Thiết kế được cấu trúc vector chuyển gen và tạo được chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens phù hợp cho biến nạp gen 4CL1 vào đối tượng
Xoan ta.
2. Tạo được một số dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 trong phạm vi phòng thí
nghiệm.
Nội dung của đề tài:
- Xây dựng cấu trúc vector để biểu hiện gen 4CL1 trong cây Xoan ta chuyển
gen.
- Tạo chủng vi khuẩn A. Tumefaciens mang vector biểu hiện gen 4CL1 trong
cây Xoan ta.
- Chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta.
- Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây Xoan ta chuyển gen.

3


Chương 1
TỔNG QUAN
1. 1. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới
Theo bản báo cáo tổng kết số 34 năm 2005 của tổ chức ISAAA

(International Service for the Acquisition of the Agribiotech Applications), tính đến
năm 2005 tổng diện tích đất trồng cây biến đổi gen đạt 75 triệu hecta, tăng trên 205
lần trong khoảng thời gian 10 năm (từ 1996 đến 2005), liên quan tới khoảng 8,5
triệu nông dân canh tác trên khắp thế giới, 90% trong số họ là nông dân ở các nước
đang phát triển và nghèo tài nguyên thiên nhiên. Số nước trồng cây biến đổi gen đã
tăng lên gấp 3 lần trong vòng 9 năm, từ 6 nước năm 1996 lên 9 nước năm 1998, lên
12 nước (1999) và lên 21 nước (2005). Hiện nay, cây trồng biến đổi gen chủ yếu
được trồng ở các nước phát triển (chiếm 62%), còn lại ở các nước đang phát triển và
một tỷ lệ nhỏ ở các nước kém phát triển. Trong những năm gần đây thị phần cây
trồng biến đổi gen tại các nước đang phát triển liên tục tăng nhanh hàng năm với
mức tăng cao tại các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Philippin), cũng như
châu Mỹ Latinh (Achentina, Braxin, Mexico, Uruguay và Paraguay) hay ở Nam Phi
[12,35].
Diện tích cây trồng chuyển gen tính đến năm 2007 đã tăng lên 114,3 triệu ha.
Khoảng 670 sản phẩm cây trồng biến đổi gen đã được phép có mặt tại thị trường
của 53 quốc gia. Nông dân nhiều nước đã trồng các cây chuyển gen mang nhiều đặc
tính tốt. Việc trồng cây biến đổi gen trên thế giới đã giúp nông dân tăng năng suất
từ 5 – 50%. Đã có tới 12 triệu nông dân trên thế giới tham gia vào việc trồng cây
biến đổi gen [13].
Năm 2008, diện tích đất trồng cây CNSH tiếp tục tăng mạnh, đạt 125 triệu ha,
tăng so với con số 114,3 triệu ha năm 2007.
Các con số này vẫn được tăng lên hàng năm, tính đến nay đã có 25 nước tham
gia trồng cây trồng chuyển gen, trong đó có thêm các nước: Australia, Bulgaria,

4


Pháp, Đức, Rumani, Tây Ban Nha, Philipin, Colombia, Chile, Honduras, Séc,
Slovakia, Bồ Đào Nha, Ba Lan, Paraguay, Uruguay…

Hình1.1: Biểu đồ diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu
Tổng doanh thu mà cây trồng biến đổi gen mang lại kể từ khi được đưa vào
thương mại (1996) đến nay khoảng 30 tỷ USD. Như vậy, trên bình diện toàn cầu
chúng ta có thể lạc quan tin rằng diện tích và số người trồng cây biến đổi gen trên
thế giới, đặc biệt là các quốc gia đang phát triển, sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những
năm tới [12,37].
Một số loại cây trồng biến đổi gen phổ biến được trồng thương mại với diện
tích lớn, mang lại hiệu quả kinh tế rõ rệt cho các nước trên thế giới, đặc biệt là các
cây đậu tương, ngô, bông và cây cải dầu [29,45].

5


Hình 1.2: Biểu đồ diện tích một số loại cây trồng CNSH trên toàn cầu từ 1996 –
2008 (Clive James, 2009)
1.1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam
Ở Việt Nam, vấn đề chuyển gen vào thực vật vẫn còn là lĩnh vực mới mẻ,
đang đi vào giai đoạn nghiên cứu và ứng dụng bước đầu, tuy nhiên trong lĩnh vực
này, các nhà khoa học cũng đã thu được những kết quả đáng kể.
Các nghiên cứu liên quan đến cây trồng biến đổi gen được tập trung triển
khai tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các viện nghiên cứu, trường đại
học thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
Tại Viện Công nghệ sinh học, hướng nghiên cứu tạo các giống cây trồng biến
đổi gen đã được đẩy mạnh ngay từ cuối những năm 90. Các cán bộ của Viện đã tiến
hành thu nhập và phân lập được nhiều nguồn gen quý có giá trị nông sinh như: gen
chịu hạn, chịu lạnh ở lúa; gen cry, gen mã hóa protein bất hoạt ribosome (RIP) ở
cây mướp đắng và gen mã hoá α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn

6

trùng, gen kháng bọ hà khoai lang của vi khuẩn Bt, gen mã hoá protein vỏ của virus
gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ… [10,11,13,14].
Ngoài ra, trong khuôn khổ các đề án hợp tác trong nước và quốc tế, những
vấn đề nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa bằng công nghệ
biến đổi gen, chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ, chuyển gen cry và
gen chịu hạn vào cây bông… đã và đang được triển khai hiệu quả với một số loài
cây biến đổi gen trồng thử nghiệm ở nhà kính [56].
Việc đưa một số giống cây trồng biến đổi gen vào sản xuất cũng đang được
triển khai. Ngày 12/01/2006, Thủ tướng Chính phủ đã ký Quyết định số
11/2006/QĐ-TTg về việc phê duyệt "Chương trình trọng điểm phát triển và ứng
dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến
năm 2020" với tầm nhìn đến năm 2020 đưa diện tích trồng trọt các giống cây trồng
mới tạo ra bằng kỹ thuật CNSH chiếm trên 70%, trong đó diện tích trồng trọt các
giống cây trồng biến đổi gen chiếm 30 – 50%. Cho đến nay, đã có 3 cây trồng biến
đổi gen hiện diện trên đồng ruộng là lúa, ngô và bông, dự tính đến cuối năm 2011
cây trồng chuyển gen sẽ được trồng trên một diện tích lớn ở nước ta [1,2,56].
1.2. Tình hình nghiên cứu về cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới và
Việt Nam
1.2.1. Tình hình nghiên cứu cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới
Nhìn chung, lĩnh vực nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen
thường phát triển chậm hơn so với cây nông nghiệp, tuy nhiên những nghiên cứu
chuyển gen vào cây rừng đã được thực hiện ở một số nước trên thế giới như
Singapo, Trung Quốc, Đài Loan, Australia, Braxin, Ấn Độ,…(Wang, 2006). Nếu
như vào năm 1996 cây nông nghiệp biến đổi gen chính thức được trồng thương mại
hoá, thì đến năm 2002, Trung Quốc là nước duy nhất đã có 2 loài cây lâm nghiệp
biến đổi gen được trồng thương mại hoá. Đó là cây Bạch dương (Populus nigra)
chuyển gen Bt kháng côn trùng ăn lá được trồng khảo nghiệm trên 80 hecta vào năm
1999 và trồng thương mại 200-300 hecta vào năm 2002; cây Bạch dương lai 741(P.
alba X [P. davidiana + P. simonii] X P. tomentosa) chuyển gen cry1A(c) và API

7


kháng côn trùng ăn lá được trồng khảo nghiệm năm 2001 và trồng thương mại năm
2003 [20,26,38].
Theo báo cáo tổng kết của FAO (2004), trong khoảng 10 năm gần đây các
nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen chỉ chiếm 19%, trong khi đó
những nghiên cứu không có liên quan đến biến đổi gen chiếm tới 81% (vi nhân
giống 34%, đa dạng di truyền 26%, phân tích hệ gen và lập bản đồ di truyền 21%).
Điều đó có nghĩa là lĩnh vực nghiên cứu về tạo cây lâm nghiệp biến đổi gen còn rất
mới mẻ. Đến năm 2004 các nghiên cứu về cây lâm nghiệp biến đổi gen chủ yếu tập
trung vào 6 loài cây chính là: Thông, Dương, Bạch đàn, Sồi, Vân sam và Keo
[26,38].
Năm 2004 trên toàn thế giới đã có 16 nước trồng khảo nghiệm cây lâm
nghiệp biến đổi gen, nhưng phần lớn tập trung ở Mỹ. Trong số đó chỉ có 4 cây trồng
biến đổi gen được trồng khảo nghiệm chủ yếu, đó là: Populus chiếm 51%, Pinus
chiếm 23 %, Liquidambar chiếm 11 % và Eucalyptus chiếm 7 % [23,47].
Bảng 1.1. Một số loài cây rừng đã và đang được nghiên cứu chuyển gen
ở Trung Quốc
TT
1

Loài cây

Gen
chuyển
Bt

Mục tiêu

Kháng sâu ăn lá

Populus nigra

Tài liệu
Ghi chú
tham khảo
Hu et al. Thương mai hoá
2001, Li et năm 2002
al. 2000a, b

2

Populus simonii

Chịn mặn

Bet A

2001

x P. Nigra
3

Chống chịu bệnh

Populus

x

Lin et al.,
2000, 2001

Kháng sâu ăn lá

Populus
deltoides

NP-1

và stress

tomentosa
4

Yang et al.,

AalT

Wu et al.,
2000

P.

Simonii
5

Populus

Kháng côn trùng

Bt

Chen et al.,
1995

deltoides

8


6

Populus

hybrid

Kháng sâu ăn lá

BtCry1 và

741
7

Populus

x

Chịu mặn

Zheng et al. Thương mai hoá

API

2000

mtlD

Lie et al., Được phê chuẩn
2000

xiaozhuanica

năm 2001
a,b; và đăng ký bản

2002
8

Giảm hàm lượng

Eucalyptus

lignin

camadulensis
9

C4H

Eucalyptus

Kháng bệnh gây ra

urophylla

bởi Pseudomonas

quyền năm 2003

Chen et al.,
2001

CecropinD

Shao et al.,
2002

solanaceanum
10

Kháng côn trùng

Betula

Gen
peptide trừ

platyphylla

Zhan et al.,
2001

nhện
11

Kháng sâu ăn lá

Populus
deltoides

×

mtlD/gutD

P.

Fan et al.
2002

cathayana

1.2.2. Tình hình nghiên cứu cây lâm nghiệp biến đổi gen ở Việt Nam
Ở nước ta, các nghiên cứu ứng dụng CNSH vào cải tiến giống cây lâm
nghiệp đang còn nhiều hạn chế. Phần lớn mới chỉ dừng lại ở kỹ thuật vi nhân giống
một số loài cây lâm nghiệp. Do giá thành cây con in vitro còn cao nên các cây được
đưa vào nhân in vitro chủ yếu là các loài khó nhân bằng phương pháp truyền thống.
Trong đó, bạch đàn, keo lai được nhân ở hầu hết các trung tâm nghiên cứu giống
cây lâm nghiệp, qui trình đã được tối ưu hoá và sản xuất cây con phục vụ trồng rừng
nguyên liệu cho nhiều tỉnh thành trong cả nước. Một số loài cây khác cũng đã và

đang được nghiên cứu vi nhân giống như Tếch, Vù hương, Thông, Keo, Bách xanh,
Dổi, Dó trầm,… Hoàn thiện quy trình vi nhân giống các loài cây này rất có ý nghĩa
trong việc sản xuất cây giống chất lượng cao và làm cơ sở khoa học cho công tác
chuyển các gen có giá trị vào các cây này trong tương lai [14,55].

9


Hưởng ứng Chương trình phát triển trọng điểm công nghệ sinh học đến năm
2020, trong lĩnh vực giống cây lâm nghiệp với mục tiêu “Nghiên cứu ứng dụng, tạo
được một số giống cây lâm nghiệp mới bằng công nghệ gen với đặc tính lâm, sinh
học ưu việt như: có năng suất, chất lượng tốt; sức kháng sâu hại thân, hại lá và sức
chống chịu cao trước các điều kiện bất lợi của môi trường, các nhà khoa học đang
nghiên cứu chuyển một số gen vào cây lâm nghiệp và chọn giống cây lâm nghiệp
dựa vào việc đánh giá đa dạng di truyền...[1,2,56].
Lĩnh vực chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam còn là vấn đề rất mới
mẻ, đang ở giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm bước đầu.
1.2.3. Các gen thường được chuyển vào cây lâm nghiệp
Hiện nay, một số gen tiêu biểu thường được chuyển vào cây lâm nghiệp như sau:
1.2.3.1. Gen kháng côn trùng
Từ lâu người ta đã phát hiện ra các protein kết tinh được tạo ra từ các vi
khuẩn B. thurigiensis có khả năng tiêu diệt côn trùng. Các gen mã hoá cho protein
độc tố này được gọi là Cry (crystal).
Người ta phân nhóm gen này thành 6 nhóm chính ký hiệu là Cry I-VI. Các
gen này được tách ra, xác định trình tự, tiến hành tổng hợp và thiết kế vào vector
sau đó chuyển vào cây trồng như các cây Popular hybrid 741, Populus deltosis;
Populus nigra,..., hoặc gen peptide từ nhện được chuyển vào cây Beltula
platyphylla,... [26,38,48].
1.2.3.2. Gen kháng thuốc diệt cỏ
Gen kháng thuốc diệt cỏ là gen mã hoá cho enzym enolpyruvat sikimat

phosphat synthetase (EPSPS). Enzym EPSPS có chức năng chuyển hoá sản phẩm
quang hợp thành axit mang mạch vòng có tên là axit sikimic.
Axit sikimic không được hình thành sẽ làm rối loạn toàn bộ quá trình trao
đổi chất của cỏ và làm cho cỏ chết. Chuyển gen này vào thực vật sẽ tạo ra thực vật
kháng thuốc diệt cỏ [26].
1.2.3.3. Gen kháng bệnh

10


Ở cây lâm nghiệp có nhiều loại vi nấm, vi khuẩn, virus kí sinh và gây nên
những loại bệnh làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây.
Để hạn chế hiện tượng này một cách hiệu quả nhất người ta đã thiết kế vector
chuyển gen mang gen kháng bệnh rồi chuyển vào thực vật để tạo ra các cây lâm
nghiệp có khả năng chống chịu bệnh tật cao.
Ví dụ như gen CecropinD được chuyển vào cây Eucalyptus urophylla để tạo
ra cây có khả năng kháng bệnh gây ra bởi Pseudomonas solanaceanum [10,11].
1.2.3.4. Gen chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường
Các cây lâm nghiệp được trồng nhiều ở những vùng có điều kiện khắc nghiệt
như hạn hán, mặn, lạnh. Để nâng cao khả năng chống chịu của cây, người ta đã
chuyển các gen có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường
như gen chịu mặn Bet-A, mtlD được chuyển vào cây Populus xiaozhuanica,
Populus simonii x P. nigra, gen NP-1 chống chịu bệnh và các điều kiện bất lợi được
chuyển vào cây Populus tomentosa.. Hiện nay, người ta nghiên cứu thiết kế vector
chuyển gen mang nhiều gen để chuyển đa gen vào thực vật, đây có thể là triển vọng
cho việc chuyển các gen có khả năng giúp cây trồng chống chịu với điều kiện hạn
hán [29,38].
1.2.3.5. Gen làm thay đổi hàm lượng cellulose và lignin
Thành tế bào được cấu tạo từ cellulose liên kết với pectin hay hemicellulose.
Trong vách tế bào có các khoảng trống, khoảng trống này có thể chứa pectin, lignin,

suberin,… Cellulose là hợp chất quan trọng để sản xuất giấy. Bột gỗ của loài cây
nào có hàm lượng cellulose càng cao thì loài cây đó có giá trị càng cao trong sản
xuất bột giấy. Lignin là hợp chất phenol thơm có đặc tính là cứng. Tuy nhiên, lignin
lại là hợp chất không có lợi trong sản xuất giấy, nên người ta thường phải loại bỏ
lignin khi nấu bột giấy. Vì vậy, để phục vụ cho công nghiệp sản xuất bột giấy người
ta đã và đang tiến hành phân lập gen làm tăng tổng hợp cellulose, thiết kế vector và
chuyển gen này vào cây lâm nghiệp. Hoặc cũng với mục đích này người ta còn
chuyển các gen làm giảm hàm lượng lignin để tăng chất lượng bột giấy. Theo
hướng này Chen và cộng sự, 2001 đã thiết kế thành công vector mang gen C4H

11


(cinnamate 4-hydroxylase) được phân lập từ cây Bạch Dương để chuyển vào cây
Eucalyptus camaldulensis. Với mục đích tăng chất lượng gỗ phục vụ cho các mục
đích: thiết kế đồ nội thất, đồ gia dụng, gỗ trang trí hoặc gỗ xây dựng thì người ta
tiến hành chuyển gen làm tăng hàm lượng lignin (gen 4CL) [7,31,33,40,41].
1.2.3.6. Gen tăng khả năng cố định nitơ
Nitrogenase là enzym thực hiện quá trình biến đổi nitơ phân tử thành dạng
nitơ mà thực vật có thể sử dụng được. Gen tổng hợp nitrogenase gọi tắt là gen Nif
tồn tại ở một số loài vi khuẩn lam sống cộng sinh trong bèo hoa dâu, các vi khuẩn
sống cộng sinh trong các vi khuẩn nốt sần cây họ đậu (Leguminoseae) như
Rhizobium, hai nhóm vi sinh vật tự do là Azotobacterium và Clostridium,…(Lê
Trần Bình et al., 1997). Nhờ kỹ thuật gen người ta có thể tách gen Nif từ các cơ thể
cố định đạm và chuyển vào cây lâm nghiệp không có khả năng này để tạo ra các
giống cây trồng cố định đạm, có khả năng sinh trưởng tốt trên các điều kiện lập địa
cằn cỗi, nghèo chất dinh dưỡng khoáng, nitơ và cải tạo đất trống đồi núi trọc
[27,38].
1.2.3.7. Gen tăng khả năng sinh trưởng cho cây
Khả năng sinh trưởng của cây do hoạt động của các hormone kích thích sinh

trưởng tạo ra. Để tăng khả năng sinh trưởng của cây người ta tiến hành tách gen mã
hoá tổng hợp hormone như auxin, cytokinin, gibberilin (họ gen GA), rồi chuyển
vào thực vật. Người ta còn giữ lại vùng gen gây khối u của T-ADN để thiết kế
vector mang gen kích thích sinh trưởng, rồi chuyển các gen này vào thực vật
[28,38]...
Đối với các loài cây lâm nghiệp trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh trưởng và
chất lượng gỗ là những tính trạng được quan tâm hàng đầu. Nhằm nâng cao giá trị
kinh tế trên một đơn vị diện tích trồng rừng. Trong những năm gần đây phần lớn
các nghiên cứu về tạo giống cây lâm nhiệp là nhằm tạo ra những giống biến đổi gen
có tốc độ sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt. Theo báo cáo của FAO (2004) các
nghiên cứu về cải thiện chất lượng gỗ liên quan đến thành phần lignin chiếm 57%,
còn các nghiên cứu về tăng tốc độ sinh trưởng chỉ chiếm 6% [36,49].

12


Các nghiên cứu về cải thiện chất lượng gỗ thường được tiến hành theo một
trong hai hướng: giảm hàm lượng lignin (cho mục tiêu lấy gỗ làm nguyên liệu giấy)
hoặc tăng hàm lượng lignin (cho mục tiêu lấy gỗ làm đồ mộc, nội thất, thủ công mỹ
nghệ, xây dựng,...). Cả hai hướng này đều tập trung tác động vào cơ chế điều hoà sự
tổng hợp enzym chìa khoá có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin trong cơ
thể thực vật [22,40,52].
1.3. Gen điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật
1.3.1. Giới thiệu về lignin và vai trò của lignin trong thực vật
1.3.1.1. Giới thiệu về lignin
Trong cơ thể thực vật, lignin là một hợp chất polymer thơm của các đơn
phân phenylpropan. Lignin là hợp chất chiếm tỷ lệ lớn trong tự nhiên, đứng thứ hai
chỉ sau cellulose, chiếm từ 18 – 36% khối lượng khô của cây gỗ. Tham gia vào cấu
trúc thành tế bào, đặc biệt là các tế bào của mạch xylem, Lignin có tác dụng gắn kết
các sợi polysaccharide thông qua các kiểu liên kết hoá học khác nhau, từ đó giữ cho

tế bào vững chắc, có khả năng chịu lực cơ học và bảo vệ các sợi cellulose không bị
phân huỷ bởi các nhân tố hoá- sinh học [15,24].
Lignin thực vật có thể được chia thành ba lớp là: lignin ở cây gỗ mềm (cây
hạt trần), lignin ở cây gỗ cứng (cây hạt kín), và lignin ở cây thân cỏ. Ba lớp lignin
này khác nhau bởi các đơn phân cấu tạo nên lignin trong mỗi lớp [44,46,53].
Guaicyl lignin tìm thấy phần lớn trong cây gỗ mềm, được cấu tạo chủ yếu
bởi các đơn phân Conyferyl alcohol, Guaicyl, Syringyl lignin có mặt nhiều trong
cây gỗ cứng với các đơn phân cấu thành là coniferyl và synapyl alcohol. Trong khi
lignin ở cây thân cỏ lại được cấu tạo nên chủ yếu bởi các đơn phân p – coumaryl
alcohol [ 23,24,46].

13


Hình 1.3: Cấu tạo hóa học các đơn phân của lignin
1.3.1.2. Vai trò của lignin trong thực vật
Cấu tạo hóa học và cơ học của gỗ là những nhân tố chủ yếu quyết định đến
tính chất của gỗ.
Trong cấu tạo gỗ, vách tế bào chủ yếu do cellulose và lignin tạo nên.
Cellulose có vai trò như những khung (sườn) cốt sắt vững chắc, còn lignin có vai trò
như “xi măng” điền đầy khoảng trống và bám quanh sườn sắt ấy.[15,46].
Khung cellulose do nhiều phân tử cellulose liên kết lại, tạo nên chuỗi
cellulose. Nhiều chuỗi cellulose liên kết thành các mixen cellulose. Khi đó, nhiều
mixen cellulose liên kết lại tạo thành bó và điều quan trọng là vô số bó mixen
cellulose sẽ được liên kết bởi lignin để tạo nên cấu trúc vững chắc của vách tế bào
gỗ [15].
Với cấu tạo của gỗ bên trong vách tế bào thì cũng được cấu tạo bởi đại bộ
phận các mixen xếp song song với trục dọc thân cây. Khi gỗ chịu lực ép dọc thớ,
lực đặt trên đầu các mixen và lúc này các mixen sẽ sản sinh nội lực chống lại. Khi
gỗ chịu lực ép ngang thớ, gỗ sẽ có biến dạng đàn hồi. Sức hút và sức đẩy tương hỗ

giữa các mixen cân bằng nhau (tạo bởi lignin) làm cho khối gỗ vững chắc theo
chiều ngang.

14


Do đó, khả năng liên kết các mixen bởi lignin làm cho các mixen ổn định
vững chắc khi chịu lực.
Cũng chính sức hút tương hỗ giữa các thành phần cấu tạo nên gỗ (do lignin)
tạo cho gỗ trở thành một khối vững chắc và tạo ra ứng lực của gỗ.
Như vậy, trong cấu tạo của gỗ, lignin là nhân tố chính tạo nên độ rắn của gỗ.
Mặt khác, bởi lignin là chất keo vô định hình nên còn làm nên tính chất đàn hồi, dẻo
dai của gỗ. Chính vì vậy, loại gỗ nào, gỗ ở vị trí nào trong cây nếu hàm lượng lignin
càng cao thì ở đấy gỗ vừa cứng vừa dẻo dai. Còn ngược lại, ở gỗ nào có hàm lượng
lignin càng thấp thì cấu tạo gỗ càng mềm, càng xốp và nội lực của gỗ càng
thấp.[15,44].
Khi nghiên cứu về vai trò của lignin, một số tác giả cũng đã khẳng định rằng:
lignin có vai trò gắn kết các sợi polysaccharide với nhau thông qua 7 loại liên kết
chủ yếu:
+ Direct ester linkage
+ Direct ether linkage
+ Hydroxycinnamic acid ester
+ Hydroxycinnamic acid ether
+ Ferulic acid bridge
+ Dehydrodiferulic acid diester bridge
+ dehydrodiferulic acid diester-ether bridge

Hình 1.4: Mô hình gắn kết giữa các sợi
polysacharide bởi lignin

15


Kết quả làm cho gỗ có kết cấu vững chắc hơn, có khả năng chịu lực cơ học
và bảo vệ các sợi polysaccharide không bị phân hủy bởi các tác nhân hóa, lý và sinh
học [34,44].
1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp lignin trong thực vật
Quá trình sinh tổng hợp lignin đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên
cứu trong suốt hơn 30 năm qua, họ đã đưa ra kết luận chung: quá trình sinh tổng
hợp lignin là một quá trình rất phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn chuyển hóa các
chất, với sự tham gia xúc tác của hàng loạt enzym trong cơ thể thực vật.[22,23,53].
Trong quá trình sinh tổng hợp lignin, hợp chất ban đầu là phenylalanin,
dưới tác dụng của các enzym đặc hiệu, trải qua hàng loạt các biến đổi để tạo
thành vô số các đơn phân tử hay còn gọi là các monolignol. Các monolignol này,
sau khi hình thành được trải qua quá trình polyme hóa để tạo nên đại phân tử
lignin, cụ thể như sau:
Phenylalanin được đeamin hóa dưới tác dụng của enzym PAL để tạo thành
Cinnamate. Cinamate bị thủy phân để tạo p – Coumarate dưới tác dụng của enzym
C4H. P – Coumarate có thể chuyển dạng liên hợp thành dạng hoạt động là p –
coumaryl –CoA dưới sự xúc tác của enzym 4CL. P-coumaryl - CoA là một tiền chất
cho quá trình tạo thành monolignol thứ nhất p- coumaryl alcohol.
Tiếp theo, p – coumarate và p – coumaryl – CoA có thể bị thủy phân để tạo
nên hai chất là axit caffeic và caffeoyl – CoA dưới sự xúc tác của các enzym C3H
và CcoA – 3H. Trong khi đó, axit Caffeic và Caffeoyl – CoA lại được chuyển hóa
dưới tác dụng của enzym OMT và CcoA – OMT để tạo nên axit Ferulic và feruloyl
– CoA. Đồng thời, axit caffeic và ferulic cũng có thể được hoạt hóa thành dạng hoạt
động là caffeoyl – CoA và feruloyl – CoA dưới tác dụng của enzym 4CL. Trong đó,
hợp chất feruloyl – CoA đóng vai trò là tiền chất cho quá trình tạo thành monolignol
thứ hai là Coniferyl alcohol [22,42,46,53]
Tiếp tục quá trình này, axit Ferulic bị thủy phân dưới tác dụng của enzym

F5H thành axit 5 – hydroxyferulic. Axit 5 – hydroxyferulic lại được metyl hóa dưới
tác dụng của enzym OMT tạo thành axit Sinapic. Sau đó axit Sinapic được chuyển

16