Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính gắn kết igg của protein g từ chủng vi khuẩn streptococcus sp ở việt nam

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Thị Hải Hòa Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội và TS. Đỗ Biên Cương Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, hướng
dẫn cho tôi trong quá trình nghiên cứu suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn sinh viên
phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội cùng các
anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh và sinh
học phân tử - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã động
viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian nghiên
cứu và thực hiện đề tài.
Hà Nôi, ngày 24 tháng 9 năm 2015
Phạm Thế Phúc


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của tôi
được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Bùi Thị Hải Hòa trường Viện
Đại học Mở Hà Nội và TS. Đỗ Biên Cương trường Đại học Bách khoa Hà Nội, với
sự giúp đỡ của sinh viên Tạ Thị Hiền và các sinh viên làm việc tại phòng thí nghiệm
khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội cùng các bạn học viên, sinh
viên đang học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh và sinh học

phân tử, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách
khoa Hà Nội.
Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng
tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.
Hà Nội, ngày 24 tháng 9 năm 2015
Phạm Thế Phúc


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Mục lục
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về protein G ..................................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm, nguồn gốc protein G .............................................................3
1.1.2. Vai trò sinh học của protein G ................................................................3
1.1.3. Protein G và bệnh lý ...............................................................................4
1.2. Cấu tạo protein G ......................................................................................................... 5
1.3. Cơ chế gắn kết của protein G với IgG ........................................................................ 7
1.4. Nguồn thu và đặc tính gắn kết của protein G với IgG .............................................. 8
1.5. Ứng dụng của protein G trong miễn dịch học ........................................................... 9
1.6. Vi khuẩn sinh tổng hợp protein G ............................................................................ 11
1.6.1. Giới thiệu về vi khuẩn Streptococcus ...................................................11
1.6.1.1.

Đặc điểm hình thái vi khuẩn Streptococcus ...................................11

1.6.1.2.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................11

1.6.2. Đặc điểm sinh trưởng và khả năng sinh độc tố của vi khuẩn
Streptococcus .....................................................................................................13
1.6.2.1.

Đặc điểm sinh trưởng.....................................................................13

1.6.2.2.

Cấu trúc kháng nguyên ..................................................................15

1.6.2.3.

Các enzym và độc tố.......................................................................15

1.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của Streptococcus
spp…………………………………………………………………………….17
1.6.3.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................17

1.6.3.2.

Ảnh hưởng của pH .........................................................................17

1.6.3.3.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon .......................................................18

1.6.3.4.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................18


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

1.6.3.5.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống ......................................................18

1.7. Tình hình nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protein G từ Streptococcus spp .. 19
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................20
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ..................................................................... 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................20
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ...............................................................................20
2.1.2.1.

Thiết bị ...........................................................................................20

2.1.2.2.

Hoá chất trong thí nghiệm .............................................................21

2.1.3. Môi trường nuôi vi sinh vật ..................................................................21
2.1.3.1.

Môi trường phân lập ......................................................................21

2.1.3.2.

Môi trường lên men ........................................................................21

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 22
2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................22
2.2.1.1.

Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Streptococcus .....22

2.2.1.2.

Xác định đặc điểm sinh lý - sinh hóa .............................................22

2.2.1.3.

Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng

hợp protein của chủng vi khuẩn .....................................................................24
2.2.2. Phương pháp hóa sinh và sinh học phân tử ..........................................25
2.2.2.1.

Tách chiết protein G ......................................................................25

2.2.2.2.

Tinh sạch protein qua sắc ký lọc gel Sephadex G-50 ....................26

2.2.2.3.

Xác định hàm lượng protein G ......................................................27

2.2.2.4.

Điện di protein ...............................................................................27

2.2.2.5.

Đánh giá độ tinh sạch của protein bằng phần mềm Image J ........29

2.2.2.6.

Phương pháp Western blot ............................................................29

2.2.2.7.

Tách DNA tổng số ..........................................................................30

2.2.2.8.

Phương pháp điện di gel agarose ..................................................31

2.2.2.9.

Nhân dòng gen 16S rRNA ..............................................................31

2.2.2.10. ELISA gián tiếp kiểm tra khả năng gắn kết kháng thể động vật của
Protein G ……………………………………………………………………………32


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................34
3.1. Phân lập và định tên chủng vi khuẩn Streptococcus ............................................... 34
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Streptococcus .......................................34
3.1.2. Chọn chủng có khả năng sinh protein G cao ........................................40
3.1.3. Định tên chủng theo trình tự 16S rRNA ...............................................41
3.2. Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protein
của Streptococcus suis L5 ................................................................................................... 43
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy .........................................................43
3.2.2. Ảnh hưởng của pH ................................................................................45
3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ..............................................................46
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ...................................................................47
3.2.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống .............................................................48
3.2.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ........................................................49
3.3. Làm sạch protein G của Streptococcus suis L5........................................................ 50
3.4. Nghiên cứu đặc tính gắn kết với kháng thể động vật của protein G của
Streptococcus suis L5 .......................................................................................................... 53
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................55
1. Kết luận ....................................................................................................................... 55
2. Kiến nghị ..................................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHIA

: Brain Heart Infusin Agar

BSA

: Bovine Serum Albumin

CAMP

: Christie, Atkins, Munchpeterson

cAMP

: Cyclic Adenosine Monophosphate

DAG

: diacyglycerol

DNA

: Deoxylribonucleic aicd

ELISA

: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

GTP

: Guanosine triphosphate

IgG

: Immunoglobulin G

IP3

: Inositol trisphotphate

KIA

: Kligler Iron Agar

KLPT

: Khối lượng phân tử

LB

: Luria-Bertani

MR

:Methyl Red

OD

: Độ đục

PBS

: Phosphate Buffer Saline

PLC

: Phospholipase C

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophores
TSA

: Tryticase Soy Agar

V.P

: Voges-Proskauer


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Mô tả cấu trúc G-protein…………………………………………...........7
Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn Streptococcus.............................................................11
Hình 3.1: Đặc điểm hình thái và sinh hóa của một số chủng cầu khuẩn đã sàng lọc
................................................................................................................................... 39
Hình 3.2: Khả năng sinh protein G của các chủng phân lập ..................................... 41
Hình 3.3: Điện di đồ DNA tổng số của chủng L5 ..................................................... 42
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân dòng 16S rDNA của chủng L5 ...................... 42
Hình 3.5. Cây phân loại của chủng L5 theo trình tự 16S rDNA ............................... 43
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein G................................... 44
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein G ........................................... 45
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hàm lượng protein G .......................... 46
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hàm lượng protein G .............................. 48
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến hàm lượng protein G ...................... 49
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein G ................ 50
Hình 3.12: Điện di đồ protein sau sắc ký .................................................................. 51
Hình 3.13. Kết quả Western Blot .............................................................................. 53
Hình 3.14: Khả năng gắn kết của protein G từ Streptococus suis L5 với IgG của một
số loài động vật ......................................................................................................... 54


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Khả năng gắn kết kháng thể của protein G ................................................ .10
Bảng 3.1: Kết quả các cầu khuẩn gram dương phân lập được....................................34
Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên 24 chủng cầu khuẩn đã sàng lọc.......................37
Bảng 3.3: Độ sạch tương đối của protein G qua các phân đoạn..................................52

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỞ ĐẦU
Ngày nay, việc sử dụng kháng thể trong công tác điều trị và chuẩn đoán
bệnh trên người, động vật và thực vật đã trở nên phổ biến. Trong đó IgG,
chiếm 80% tổng số immunoglobulin, là lớp kháng thể chính trong máu và
dịch ngoại bào, có chức năng kiểm soát và bảo vệ cơ thể với hiện tượng
nhiễm trùng. Được cấu tạo từ bốn chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng
(H, heavy) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light) cũng giống hệt nhau,
IgG giữ vai trò chính trong việc bảo vệ cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh,
đảm nhiệm các chức năng opsonin hóa, hoạt hóa bổ thể, gây độc qua trung
gian tế bào phụ thuộc kháng thể (giúp tế bào diệt tế bào đích), trung hòa ngoại
độc tố, gây ngưng kết vi khuẩn và trung hòa virut.
Trên thế giới, đã có hàng ngàn loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học
có sử dụng IgG. Hiện ở Việt Nam, IgG cũng đã được sử dụng trong các hệ
thống chẩn đoán miễn dịch tuy nhiên do chưa có hệ thống tinh sạch IgG có
hiệu quả cao dẫn tới chưa thiết lập được hệ thống chuẩn đoán trong nước.
Một trong những nghiên cứu hiện nay được quan tâm là sử dụng phương
pháp sắc ký ái lực với protein A và protein G để tách và tinh chế IgG. Theo
các nghiên cứu, cả protein A và protein G đều có khả năng liên kết với IgG tại
các mảnh Fc của IgG. Tuy nhiên, protein G ngoài khả năng gắn với vùng Fc
của IgG ở nhiều loài động vật có vú còn có khả năng gắn kết với cả vùng Fab
của IgG. Bên cạnh đó, Protein G có thể gắn kết và làm sạch một loạt các IgG
mà protein A gắn kết yếu và liên kết ái lực của protein G với IgG của một số
loài cũng cao hơn so với ái lực của protein A [33]. Do vậy, theo các nghiên
cứu việc sử dụng protein G tinh sạch IgG đem lại hiệu quả tốt hơn so với

dùng protein A tinh sạch IgG.
Ở Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu cụ thể cho việc xác định
được một loại protein có thể tách chiết và tinh sạch kháng thể. Do đó việc thu
1


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

nhận và sản xuất protein G làm nguyên liệu tách chiết IgG từ các chủng vi
khuẩn Streptococus ở Việt Nam là một hướng mới cần nghiên cứu để sử dụng
nguồn thu và nguyên liệu sẵn có phục vụ cho công tác điều trị và chẩn đoán
bệnh trên người và động vật trong nước. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính gắn kết IgG của protein G
từ chủng vi khuẩn Streptococcus sp ở Việt Nam”.
Mục tiêu của đề tài:
Xác định được điều kiện thích hợp thu nhận protein G từ chủng vi
khuẩn thuộc chi Streptococcus phân lập ở Việt Nam và đánh giá được khả
năng gắn kết của protein G với IgG.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên phải tiến hành một số nội dung
cụ thể sau:
- Phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn thuộc chi Streptococcus có
khả năng sinh protein G
- Định tên vi khuẩn.
- Tách chiết được protein G.
- Đánh giá đặc tính gắn kết của protein G với IgG của một số động vật

2

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về protein G
1.1.1. Khái niệm, nguồn gốc protein G
Protein G là protein màng tế bào của vi khuẩn Streptococcus nhóm C
và G. Protein G được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin Rodbell năm
1971 về sự kích hoạt cAMP bởi glucagon [27]. Nhờ thí nghiệm này Martin
Rodbell đã phát hiện ra sự hiện diện của GTP là rất quan trọng trong phản
ứng này. Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide, sau này đổi tên
là N-protein, hoạt động như bộ chuyển đổi trung gian.
1.1.2. Vai trò sinh học của protein G
Protein G giữ vai trò quan trọng trong việc tiếp nhận và truyền tín hiệu
của tế bào. Với các thụ thể màng, phối tử liên kết với ngoại bào (các protein
xuyên màng). Phức protein G liên kết với nhóm phosphate và chức năng như
thiết bị chuyển mạch phân tử. Các chức năng của protein G bao gồm (nhưng
không giới hạn) điều chỉnh các enzym chuyển hóa, kiểm soát phiên mã và bài
tiết, và điều này giúp thay đổi các chức năng như: sự phát triển của phôi thai,
học tập và trí nhớ, sự cân bằng nội môi [2].
Như trong võng mạc mắt, protein G chuyển đổi tín hiệu ánh sáng để
kích hoạt lên những sợi dây thần kinh mà truyền đạt kích thích thị giác lên
não . Nhận biết về mùi cũng phụ thuộc vào protein G trong các tế bào
olfactory ( tế bào khứu giác) . Và cảm giác hương vị còn liên quan đến những
protein G khác [2].
Một số protein G kích thích hoặc ức chế sự hình thành của AMPc, vì
thế có sự chuyển hóa trong tế bào. Protein G làm thay đổi lưu lượng các

ion qua màng tế bào và thay đổi hoạt động tế bào. Protein G còn ảnh hưởng

3


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

đến quá trình phospho hóa protein do đó kiểm soát quá trình phân chia và
những quá trình khác của tế bào [2,7].
Protein G không chỉ có vai trò trung gian mang thông tin từ chất nhận
hormone đến adenylatcyclase mà còn có hoạt tính của GTPase, đó là khả năng
thuỷ phân GTP. Nhờ khả năng đó nên nó xúc tác cho quá trình chuyển phức
protein G-GTP hoạt động thành dạng protein G-GDP không hoạt động do
thuỷ phân GTP trong phức protein GTP thành GDP tạo nên phức protein GGDP. Bằng cơ chế đó protein G có vai trò quan trọng trong quá trình hoạt hoá
hay phản hoạt hoá adenylatcyclase. Khi lượng hormone giảm adenylatcyclase
trở thành dạng không hoạt động [2,7].
Ngày nay, protein G còn được biết có vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch các kháng thể đơn dòng, cách ly các phức hợp miễn dịch và làm sạch,
tách chiết IgG từ huyết thanh. Hợp chất protein G thường được sử dụng như
các chất hấp phụ ái lực trong việc làm sạch các globulin miễn dịch (kháng
thể) và phân nhóm immunoglobulin từ huyết thanh, dịch nổi tế bào, và các
chất dịch sinh học khác.
1.1.3.

Protein G và bệnh lý
Hiện nay, triệu chứng của nhiều bệnh được giải thích là do sự thay đổi

chức năng của Protein G. Ví dụ bệnh tả, một bệnh truyền nhiễm đáng lo

ngại nhất của đường tiêu hóa. Bệnh là do vi khuẩn sản xuất 1 độc tố rất độc.
Các độc tố đóng vai trò như 1 loại enzym làm thay đổi 1 trong những protein
G luôn ở trạng thái hoạt động. Điều này ngăn cản sự hấp thu nước và muối ở
ruột một cách bình thường. Kết quả sự mất nước và muối có thể dẫn đến tử
vong. Nhiễm khuẩn E.coli cũng có triệu chứng tương tự. Trong trường hợp bị
nhiễm khuẩn ho gà thì độc tố lại ngăn cản sự hoạt động của protein G. Do đó
hàng rào miễn dịch bị tổn thương [2,7].

4


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Trong một số bệnh phổ biến, số lượng protein G trong tế bào thay đổi.
Có thể có quá nhiều hoặc quá ít. Như trong bệnh tiểu đường và nghiện rượu
có một số triệu chứng là do thay đổi tín hiệu của protein G.
Người ta thấy rằng biểu hiện suy giảm protein G có thể làm ảnh hưởng
tới sự phát triển và rối loạn chuyển hóa. Ở những người đột biến và hoạt tính
quá mức của protein G có thể là nguyên nhân của một số khối u. Tăng hoạt
động của protein G còn được tìm thấy trong rối loạn nội tiết di truyền nhưng
hiếm gặp như hội chứng Mc-cune Albright (da có các đốm màu cà phê sữa và
biến dạng xương). Trong trường hợp này, một sự đột biến của protein G dẫn
đến chuyển hóa calci bị gián đoạn, dẫn đến biến dạng xương [2,7].
Gần đây, người ta khám phá ra các protein G nhỏ chỉ có một đơn vị.
Chúng có cấu trúc gần giống các sản phẩm của tiền oncogen là những protein
chức năng của tế bào như: tham gia vào các quá trình sinh trưởng , phát triển,
tình trạng bộ xương tế bào, vận chuyển bên trong tế bào, hoạt động thực bào,
bài tiết,… Ví dụ như các protein G nhỏ thuộc họ ras kiểm soát sự phát triển tế

bào, điều hòa quá trình oxy hóa thực bào trong bạch cầu. Sự đột biến protein
G khiến chúng có thể trở thành siêu hoạt động và do có vai trò chức năng
trong quá trình sinh trưởng của tế bào như trên do đó có khả năng gây ung thư
[2,7].
1.2.

Cấu tạo protein G
Protein G có cấu tạo là protein trimer dị thể với tiểu phần α (40-65kD),

β (37kD) và γ (8-10kD). Tiểu phần α đóng vai trò quan trọng trong hoạt động
đặc hiệu của protein G, còn tiểu phần β và γ có thể thay đổi. Hiệu ứng sinh
học xảy ra trong tế bào phụ thuộc vào các phối tử liên kết [23].
Tiểu phần Gα có chứa 2 domain: domain GTPase và domain dạng sợi
xoắn α. Có ít nhất 20 loại Gα khác nhau được phân thành nhiều họ Gα như:

5


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- Gαs hay Gs (stimulatory) với vai trò kích hoạt enzyme adenylate
cyclase, tăng nồng độ c.AMP.
- Gαi hay Gi (inhibitory) có vai trò ức chế hoạt động của enzyme
adenylate cyclase.
- Golf (olfactory-khứu giác) kết hợp với olfactory receptor ở niêm mạc
mũi.
- Gt (transducin) chuyển đổi các tín hiệu thị giác với chất cảm quang
rhodopsin ở lớp võng mạc.

- Gq với vai trò kích hoạt enzyme phospholipase C.
- Họ G12/13 có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa thông qua các
yếu tố guanonine nucleotide đối với bộ khung xương tế bào và các liên
kết giữa các tế bào trong sự di chuyển [23].
Các tiểu phần β và γ có tính chất liên kết chặt chẽ với các thành phần
khác dưới dạng phức hợp β-γ khi chúng tách rời tiểu phần α. Phức hợp tự do
này có thể tác động như một loại tín hiệu điều dẫn. Ví dụ như phức hợp β-γ
liên kết với histamine receptor có thể hoạt hóa phospholipase A 2 hoặc liên kết
với thụ thể muscarinic acetylcholine sẽ trực tiếp mở kênh liên kết protein G ở
phần trong (GIRKs-G).

Hình 1.1: Mô tả cấu trúc G-protein

6


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Tiểu phần α có 2 vùng chức năng quan trọng khác ngoài vùng để nối kết
với tiểu đơn vị β. Một là, tiểu đơn vị α tác động với thụ thể ở vị trí 5 amino
acid cuối của đầu C. Hai là nó mang vùng gắn kết với guanine nucleotide để
thực hiện chức năng GTPase của G-protein. Mặc khác, cả 2 tiểu đơn vị α và
βγ đều có thể tác động đến bề mặt của G-protein [23].
Tiểu phần α và γ có liên kết cộng hóa trị với neo lipid , do vậy bám
dính và cố định G-protein vào mặt trong màng tế bào. Sau khi tách ra khỏi
protein G, tiểu đơn vị α sẽ hoạt hóa enzym adenylate cyclase (AC). Adenylate
cyclase (AC) là một protein xuyên màng, vùng hướng về phía bào tương được
gọi là vùng xúc tác. Enzym AC sẽ giúp chuyển ATP thành AMPc[23].

1.3. Cơ chế gắn kết của protein G với IgG
Sự gắn kết của protein G và IgG là yếu tố quan trọng trong hệ thống
miễn dịch. Protein G được gắn kết với IgG ở cả hai vùng Fc và Fab của IgG,
tuy nhiên, để làm sáng tỏ tính đặc hiệu của protein cũng như sự tương tác với
IgG tại các vùng, người ta đã nghiên cứu về cấu trúc của protein G để xác
định được cơ chế gắn kết của protein G với IgG. Cấu trúc của protein G
Streptococcal gồm hai vùng chính là B1 và B2. Vùng B1 bao gồm 56 chuỗi,
vùng B2 gồm 13 chuỗi trước, 56 chuỗi trong vùng và kèm theo là 14 chuỗi
axit amin. Trong 56 chuỗi axit amin ở hai vùng B1 và B2, khác nhau ở 6 vị
trí: Ile6 – Val, Leu7 – Ile, Glu19 – Lys, Ala24 – Glu, Val29 – Ala và Glu42 –
Val. Nhằm mục đích tìm hiểu cặp axit amin nào là yếu tố quan trọng trong
gắn kết với IgG, người ta đã tiến hành so sánh vị trí của 6 cặp axit amin giữa
hai vùng B1, B2 và thấy Leu7 là axit amin không tham gia đến quá trình gắn.
Trong khi đó, Ile 6, Glu 19 và Ala24 là các axit amin đứng đầu chuỗi xoắn α,
tham gia vào quá trình gắn. Từ nghiên cứu cho thấy, quá trình gắn của protein
G với vùng Fc của IgG sử dụng mảnh peptid tách ra từ vùng gắn kết của IgG
với protein G, kết hợp với 11 cặp axit amin bao quanh tạo thành cấu trúc xoắn
7


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

α. Một trong những axit amin không có tính liên kết giữa vùng B1 và B2 là
Glu42 – Val có thể là nguyên nhân sự thay đổi ái lực gắn IgG giữa hai vùng
B1, B2. Ngoài ra, nghiên cứu còn cho thấy protein G gắn kết với vùng Fab
của IgG yếu hơn so với vùng Fc [9].
1.4. Nguồn thu và đặc tính gắn kết của protein G với IgG
Protein G, tế bào vi khuẩn có ái lực với immunoglobulin (IgG), đã

được phân lập từ vi khuẩn thuộc chi Streptococcus nhóm C và G. Trong một
nghiên cứu, protein G đã được phân lập từ nhóm chủng Streptococcus G148
[33]. Protein bề mặt của vi khuẩn được hòa tan bởi sự thủy phân với enzyme
papain (hoặc trypsin), protein G được phân lập bằng cách sử dụng tuần tự các
phương pháp là sắc ký trao đổi ion trên DEAE-cellulose, lọc gel trên
Sephadex G-100, sắc ký ái lực trên Sepharose 4B-coupled IgG [11,29]. Từ đó
đã thu được một protein G tinh khiết cao, có khối lượng phân tử 30kDa và có
khả năng gắn kết với các lớp IgG của thỏ, chuột, dê [33]. Theo một số nghiên
cứu, các protein G khác nhau cũng có tính chất gắn kết với IgG khác nhau.
Protein G được phân lập từ Streptococcus G148, có trọng lượng phân tử 65
kDa, 55kDa, 14kDa trong đó protein G 14kDa không có khả năng gắn kết với
IgG mà chỉ có thể gắn kết với HAS. Trong khi đó protein G 65kDa, protein G
55kDa từ G148 ngoài khả năng gắn với HAS còn gắn kết với các IgG mạnh
hơn so với protein G 60kDa và 40kDa từ Streptococcus C40[33]. Một nghiên
cứu khác từ chủng streptococcus suis, protein G có trọng lượng phân tử
60kDa khi so sánh khả năng gắn kết kháng thể các loài cho thấy có khả năng
gắn kết cao với IgG của trâu, bò, lợn nhưng yếu hơn với IgY của gà [32]. Khi
phân giải protein, những mảnh khối lượng phân tử 30kDa có khả năng gắn kết
với IgG lợn và bò trong khi đó mảnh khối lượng phân tử 16 kDa lại có khả
năng gắn kết với IgG của dê và người [32]. Như vậy cho thấy, với mỗi loại

8


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

protein G khác nhau khả năng gắn kết IgG của người và các loài động vật
cũng khác nhau.

1.5. Ứng dụng của protein G trong miễn dịch học
Hiện nay, ngoài khả năng là trung gian trong việc tiếp nhận và truyền
tín hiệu của tế bào, protein G đã được sử dụng để làm sạch kháng thể của các
loài động vật. Dựa vào tính chọn lọc cao và ổn định, protein G đã được dùng
phổ biến để tinh chế kháng thể từ một loạt các nguồn mẫu, bao gồm huyết
thanh, dịch nổi tế bào,… Protein G được phân lập từ vi khuẩn thuộc chi
Streptococcus nhóm G và C, được tìm ra là một thuốc thử mạnh mẽ trong việc
phát hiện các kháng thể, từ đó phát hiện kháng nguyên các loài. Trong các
nghiên cứu, protein G có khả năng gắn kết với với tất cả các lớp IgG của thỏ,
chuột, bò, dê… [11]. Ngoài khả năng gắn kết với kháng thể các loài động vật,
protein G còn có thể gắn kết với cả bốn lớp IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 của người
tuy nhiên không gắn kết với các lớp IgA, IgY, IgD, IgE.

9


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bảng 1.1 Khả năng gắn kết kháng thể của protein G
Ngày nay trên thế giới, việc sử dụng protein G Streptococcus tái tổ hợp
để tinh sạch kháng thể đã trở nên phổ biến. Protein G tái tổ hợp không có các
vùng liên kết với albumin, do đó protein G sẽ liên kết đặc hiệu với IgG, cho
khả năng tách chiết và tinh sạch IgG tốt hơn.

10


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.6. Vi khuẩn sinh tổng hợp protein G
1.6.1. Giới thiệu về vi khuẩn Streptococcus
1.6.1.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn Streptococcus
Streptococcus là chi vi khuẩn thuộc họ Streptococcaceae, có dạng hình
cầu hoặc hình trứng, có kích thước đường kính nhỏ hơn 2µm. Chúng được
xếp thành chuỗi như chuỗi hạt, với độ dài ngắn không đều nhau (từ 2-10 vi
khuẩn hoặc có thể dài hơn), cũng có khi chúng đứng riêng lẻ hoặc thành từng
cặp. Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus bắt màu gram dương (+), chúng không
có khả năng sinh bào tử, không có khả năng di động , một số dòng có khả
năng tạo vỏ nhày.

Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn Streptococcus
1.6.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus dễ bị tiêu diệt bởi nhiều chất sát
trùng như: phenol, iod, hypochloride, axit phenic 3-5% diệt vi khuẩn trong
vòng 3-15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút. Vi khuẩn còn bị
diệt bởi cồn 70% trong vòng 30 phút [3].

11


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu rất quan trọng để phân lập một loài vi
khuẩn cụ thể. Đặc điểm sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp chất,

khả năng tiết enzyme để thủy phân các chất có trong môi trường của vi khuẩn.
Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus khi được nuôi trong môi trường tổng hợp
hoặc bán tổng hợp sẽ sử dụng các hợp chất có sẵn để phục vụ cho nhu cầu
sinh trưởng và phát triển. Người ta đã xác định được một số đặc tính sinh hóa
của vi khuẩn thuộc chi Streptococcus như có phản ứng catalase, oxydase,
indol và H2S âm tính (-) [3,16]. Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus còn có khả
năng lên men đường glucose, ribose, trehalose, maltose, saccharose… và
không lên men đường galactose, ngoài ra trên môi trường thạch máu 5%, vi
khuẩn thuộc chi Streptococcus gây dung huyết cả ba kiểu tùy từng loài cụ thể.
Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus không thủy phân tinh bột, không bị ly giải
bởi muối mật, tức thử nghiệm optochin âm tính [3].
Để phân biệt được các loại liên cầu khuẩn khác nhau, người ta phải dựa
trên một số tính chất sinh hóa. Theo Trần Quang Cảnh (Khoa xét nghiệmHMTU) thì có một số thử nghiệm để phân biệt các loại liên cầu như CAMP
test, thử nghiệm Bile Esculin, canh thang chứa muối NaCl 6,5%. Liên cầu
nhóm B được xác định bởi thử nghiệm CAMP (viết tắt của Christie, Atkins và
Munch-peterson). Liên cầu nhóm B sản xuất một chuỗi peptide hay chất
CAMP có hoạt động phối hợp với hemolysin gây tan máu β, tạo ra hiệu quả
tan máu tăng lên rõ rệt. Sau khi nuôi cấy và ủ, kết quả tác dụng là vùng tan
máu có dạng β, tức là hình thành vòng tan máu có màu trong suốt xung quanh
khuẩn lạc.
Trong thử nghiệm Bile Esculin, với sự xuất hiện của muối mật, liên
cầu nhóm D thủy phân glycoside esculin hành 6,7-dihydroxycoumarin, chất
này sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường để tạo ra màu nâu cho đến
màu đen sau khi nuôi cấy và ủ. Nếu không xuất hiện màu tối này trên môi
12


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

trường, thì đó không phải là liên cầu khuẩn nhóm D. Một thử nghiệm khác
nữa để có thể phân biệt liên cầu nhóm D, đó là chúng có khả năng tồn tại và
phát triển trên môi trường canh thang 6,5% NaCl, trong khi đó, các cầu khuẩn
không thuộc họ đường ruột khác không có khả năng này.
1.6.2. Đặc điểm sinh trƣởng và khả năng sinh độc tố của vi khuẩn
Streptococcus
1.6.2.1. Đặc điểm sinh trưởng
Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus thuộc nhóm liên cầu hiếu khí, kị khí
tùy tiện và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như
máu, huyết thanh, đường… Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường
có thêm 5-10% CO2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 30-37oC, một số phát
triển ở 10-40oC như liên cầu đường ruột, không phát triển ở 45oC, pH của
nước vôi (pH=12) có thể ức chế và tiêu diệt vi khuẩn trong 15-30 phút [3]
Trong môi trường lỏng (canh thang), liên cầu dễ tạo thành những chuỗi
dài không bị gẫy, sau đó tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông
rồi lắng xuống đáy môi trường nuôi cấy. Do đó, sau 24 giờ nuôi cấy, môi
trường trở nên trong và có lắng cặn.
Trong môi trường đặc, liên cầu có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, khô, màu
hơi xám trong, những chủng có vỏ khuẩn lạc lầy nhầy.
Trên môi trường thạch máu, liên cầu phát triển tốt, có thể làm tan máu
dưới ba hình thức α, β và γ tùy thuộc từng nhóm liên cầu.
+ Tan máu (α): Đây là tan máu không hoàn toàn, vòng tan máu có xuất
hiện màu xanh. Liên cầu tan máu α, loài Streptococcus viridans thường là loại
không gây bệnh. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, chúng có khả năng gây
các bệnh nhiễm trùng ở người, như viêm nội tâm mạc bán cấp (subacute
endocarditis) có thể dẫn đến tổn thương van tim và suy tim nếu không điều trị

13

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

[21].
+ Tan máu (β): Đây là tan máu hoàn toàn, vòng tan máu trong suốt và
có đường kính gấp 2-4 lần đường kính khuẩn lạc. Những vi khuẩn thuộc chi
Streptococcus có khả năng gây tan máu β phần lớn có khả năng gây bệnh. Tan
máu β chủ yếu ở liên cầu nhóm A, ngoài ra có thể gặp ở nhóm B, C, D [21].
+ Tan máu (γ): Đây là kiểu tan máu không có vòng tan huyết xung
quanh khuẩn lạc. Hầu hết các vi khuẩn thuộc chi Streptococcus gây tan máu γ
không mang tính độc lực. Tan máu kiểu này đối với liên cầu nhóm D [21].
Khi kiểm tra tính chất mọc của vi khuẩn thuộc chi Streptococcus trên
môi trường, cho kết quả như sau:
+ Môi trường thạch thường: Khuẩn lạc mọc yếu, khuẩn lạc màu trắng,
trong, tròn gọn.
+ Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi tím, lồi, tròn,
gọn, mịn, dung huyết.
+ Thạch Edward: Khuẩn lạc nhỏ mịn, ướt, tròn, gọn, trong, mặt hơi lồi,
màu hơi tím.
+ Thạch Shapman: Không mọc, màu đỏ tươi.
+ Nước thịt 5% huyết thanh: Khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi đục [8].
Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus, khi nuôi trên môi trường BHIA
(Brain Heart Infusin Agar) ở 28-30oC, sau 24 giờ, thì đa số các khuẩn lạc mọc
trên đĩa thạch BHIA đều có hình tròn, rìa đều, bóng, lồi thấp, tâm hơi đậm,
đường kính 0,5-0,7mm. Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu
5%, sau 24 giờ nuôi cấy, trên đĩa thạch mọc lên khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn
rìa đều, tâm hơi đậm, khuẩn lạc tạo vòng dung huyết β hoặc γ nhỏ, trong suốt,
rìa không rõ ràng. Các liên cầu khuẩn thuộc chi Streptococcus bị ức chế nếu

sống trong môi trường có nồng độ muối NaCl 6,5% [3,4].

14


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.6.2.2. Cấu trúc kháng nguyên
+ Kháng nguyên C đặc hiệu nhóm: Năm 1930, Lancefield dựa vào
kháng nguyên C (cacborhydrat) của vách tế bào vi khuẩn xếp liên cầu khuẩn
thành các nhóm từ A, B, C,…R. Liên cầu nhóm A và D có khả năng gây bệnh
cho người. Các nhóm khác (B, C) gây bệnh cho gia súc hoặc không gây bệnh.
+ Kháng nguyên M đặc hiệu typ: Kháng nguyên M (protein M) cũng
nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên này, Lanceifeld xếp liên
cầu nhóm A thành 80 typ huyết thanh khác nhau. Protein M nằm trên bề mặt
tế bào nên dễ dàng kết hợp với kháng thể kháng protein M. Kháng nguyên M
có khả năng chống lại sự thực bào vì vậy nó liên quan trực tiếp tới độc lực của
liên cầu.
Ngoài ra, còn có những kháng nguyên khác của liên cầu như:
+ Kháng nguyên T là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá hủy bởi
nhiệt độ ở pH axit.
+ Kháng nguyên P bản chất là nucleoprotein, kháng nguyên này có
phản ứng chéo với nucleoprotein của tụ cầu.
+ Kháng nguyên R bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Có
một số typ M của liên cầu A và kháng nguyên vỏ axit hyaluronic có ở những
liên cầu có vỏ của nhóm A.
1.6.2.3. Các enzym và độc tố
a, Các enzym

Enzym streptokinase, thường có ở liên cầu nhóm A, C, G. Enzym này
là một kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể
kháng Streptokinase (ASK). Streptokinase có khả năng làm tan tơ huyết, hoạt
hóa xung quanh vùng tổn thương tạo điều kiện cho vi khuẩn lan tràn.

15


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Một loại enzym thứ hai đó là streptodornase (Deoxyribonuclease).
Streptodornase có khả năng thủy phân DNA, do đó làm lỏng mủ nhưng chỉ có
tác dụng khi có mặt của ion Mg. Enzym streptodornase có 4 loại A, B, C, D
và đều là những kháng nguyên kích thích cơ thể hình thành những kháng thể
đặc hiệu.
Ezym thứ ba đó là hyaluronidase, enzym này có tác dụng thủy phân
axit hyaluronic của tổ chức, tạo điều kiện cho vi khuẩn lan truyền sâu rộng
vào các mô. Enzym này cũng có tính kháng nguyên kích thích cơ thể sinh ra
kháng thể anti Streptohyaluronidase.
Một enzym có ở liên cầu khuẩn nhóm A, C và G khác nữa là enzym
diphospho pyridine nucleotidase, enzym này có độc tính với tế bào bạch cầu
và gây chết bạch cầu. Đây cũng là enzym có tính kháng nguyên và kích thích
cơ thể hình thành kháng thể. Ngoài ra, còn có proteinase, có tác dụng phân
hủy protein và kích thích cơ thể hình thành kháng thể.
b, Khả năng sinh độc tố của Streptococcus spp
Các liên cầu khuẩn tan máu β nhóm A có phương thức xâm nhập ngoại
bào, chúng phá vỡ các rào cản của tổ chức để phát tán các tác nhân gây bệnh
đến các vị trí khác trong cơ thể trong khi bản thân chúng vẫn tồn tại bên ngoài

tế bào vật chủ. Sau khi xâm nhập, Streptococcus spp. tiết ra các enzym phá
hủy các phân tử của tế bào vật chủ như: hyaluronidase để cắt đứt các
proteoglycan ở tổ chức gắn kết, streptokinase phá hủy các cục fibrin…
Ngoài ra, một số vi khuẩn thuộc chi Streptococcus còn có khả năng tạo
vỏ vi khuẩn, khả năng này là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất
của vi khuẩn về phương diện xâm nhập tại vị trí viêm. Vỏ vi khuẩn này giúp
chúng chống lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng như để kháng kháng sinh.
Vi khuẩn thuộc chi Streptococcus nguy hiểm có khả năng tạo vỏ đó là
Streptococcus pneumoniae.
16


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Streptococcus spp. có 2 loại dung huyết tố, đó là Streptolysin O và
Streptolysin S. Hầu hết liên cầu tan máu β đều có khả năng sinh ra enzym
này. Chúng bị mất hoạt tính bởi oxy nên trên môi trường nuôi cấy chúng gây
tan máu ở phía sâu trong thạch. Độc tố này mang tính chất của một ngoại độc
tố, có tính kháng nguyên mạnh nên kích thích cơ thể hình thành kháng thể
kháng Streptolysin O. Việc định lượng kháng thể này có giá trị trong chẩn
đoán bệnh liên cầu đặc biệt trong bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp.
Bên cạnh đó, nhiều liên cầu tiết ra Streptolysin S, gây tan máu ở bề mặt
môi trường nuôi cấy, tính kháng nguyên yếu nên không kích thích cơ thể hình
thành kháng thể, nó còn làm ảnh hưởng đến chức năng của tế bào lympho T
[14].
Ngoài ra, độc tố hồng cầu còn được gọi là độc tố sinh đỏ của vi khuẩn
thuộc chi Streptococcus cũng là căn nguyên của một số loại bệnh tật. Độc tố
này có bản chất là protein, gây phát ban trong bệnh tinh hồng nhiệt.

1.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của
Streptococcus spp
1.6.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn thuộc chi
Streptococcus. Do đó nhiệt độ cũng là yếu tố tác động lớn đến khả năng sinh
tổng hợp protein trong thành tế bào. Khoảng nhiệt độ của Streptococcus spp.
có thể phát triển được trong khoảng từ 22 - 42oC, không phát triển ở 45oC.
1.6.3.2. Ảnh hƣởng của pH
Có thể nói, pH là một trong những yếu tố có tác động rất mạnh đến
hoạt động của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Streptococcus spp nói riêng.
pH môi trường tác động đến ca của chúng, mỗi enzyme đều có một vùng pH
tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzyme là cao nhất. Có thể nói pH tối ưu cho sự
17