Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic sử dụng trong chế biến rau quả lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI
KHUẨN LACTIC SỬ DỤNG TRONG CHẾ
BIẾN RAU QUẢ LÊN MEN
NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÃ SỐ: 003687C79

ĐẶNG THỊ HƯỜNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ THANH MAI

HÀ NỘI 2009


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………..

1

PHẦN I. TỔNG QUAN…………………………………………………………..

3

1.1. Vi khuẩn Lactic và ứng dụng………………………………………………..

3

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Lactic…………………………….………..

3

1.1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic……………………………………………….. 4
1.1.3. Đặc điểm của vi khuẩn lactic. ………………………………………………

5

1.1.3.1.Hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic……………………………

5

1.1.3.2.Phân loại vi khuẩn lactic…………………………………………………...

6

1.1.3.3.Hoạt động chuyển hoá của vi khuẩn lactic………………………………… 6
1.1.3.4.Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ……………………………….. 10
1.2. Rau quả lên men và ứng dụng chế phẩm VKL trong rau quả muối chua.. 13
1.2.1. Tổng quan về rau quả lên men……………………………………………..... 13
1.2.2. Quy trình công nghệ sản xuất dưa cải bẹ muối chua truyền thống ở Việt
Nam………………………………………………………………………………… 14
1.2.3. Cơ chế của quá trình muối chua rau quả…………………………………….

15

1.2.4. Vi khuẩn lactic trong lên men rau quả………………………………………. 16
1.2.4.1.Các chủng vi khuẩn lactic khởi đầu cho quá trình lên men rau quả……….. 16

1.2.4.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men lactic trong rau quả muối
chua………………………………………………………………………………… 17
1.3. Quá trình tạo chế phẩm Lactic……………………………………………… 18
1.3.1. Quá trình tạo sinh khối. ……………………………………………………..

18

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic………. 19
1.3.2.1.Nhu cầu dinh dưỡng………………………………………………………..

19

1.3.2.2.Điều kiện nuôi cấy…………………………………………………………. 21
1.3.3. Các phương pháp sấy………………………………………………………... 22
1.3.3.1.Sấy đông khô.………………………………………………………………

22

1.3.3.2.Sấy chân không.……………………………………………………………. 23


1.3.3.3.Sấy phun.…………………………………………………………………...

23

1.4.2. Chất độn cho chế phẩm……………………………………………………… 28
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………….. 30
2.1. Vật liệu.……………………………………………………………………….. 30
2.1.1. Chủng giống.………………………………………………………………… 30
2.1.2. Nguyên liệu muối dưa………………………………………………………

30

2.1.3. Hoá chất và môi trường.…………………………………………………….. 30
2.1.3.1.Hoá chất.…………………………………………………………………… 30
2.1.3.2.Môi trường.………………………………………………………………… 30
2.1.4. Thiết bị. ……………………………………………………………………... 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.…………………………………………………… 33
2.2.1. Phương pháp vi sinh.………………………………………………………... 33
2.2.1.1.Hoạt hoá, làm sạch và giữ giống ………………………………………….

33

2.2.1.2.Phương pháp đếm khuẩn lạc

34

2.2.1.3.Quá trình nuôi cấy tạo sinh khối…………………………………………… 35
2.2.2. Phương pháp xác định đặc tính của chủng Lactobacillus plantarum b33…...

35

2.2.2.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc ………………………………………………. 35
2.2.2.2.Quan sát hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram ……………….

35

2.2.2.3.Kiểm tra khả năng sinh khí………………………………………………… 36
2.2.3. Phương pháp hoá học.……………………………………………………….

36

2.2.3.1.Xác đinh hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov.................. 36
2.2.3.2.Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp chuẩn độ……………

36

2.2.4. Phương pháp hoá lý………………………………………………………..

37

2.2.4.1.Xác định pH bằng máy đo pH.......................................................................

37

2.2.4.2.Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo
OD (Optical Density) ……………………………………………………………… 37
2.2.4.3.Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng ly tâm và cân……………... 37
2.2.4.4.Phương pháp thu hồi chế phẩm…………………………………………….

38

2.2.4.5.Xác định độ ẩm của chế phẩm……………………………………………... 40


2.2.4.6.Xác định tỷ lệ tế bào sống sót……………………………………………… 40
2.2.5. Kiểm tra khả năng kháng E. coli và St. aureus của chủng Lactobacillus
plantarum b33..…………………………………………………………………….. 40
2.2.5.1.Phương pháp nuôi đồng thời trong môi trường MRS lỏng……………….... 40
2.2.5.2.Trong sản phẩm dưa cải bẹ muối chua…………………………………….. 42

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….. 44
3.1. Kiểm tra các đặc tính của chủng Lactobacillus plantarum b33……………

44

3.1.1. Đặc diểm hình thái…………………………………………………………..

44

3.1.2. Kiểm tra khả năng sinh khí………………………………………………….

44

3.1.2. Khảo sát khả năng phát triển của chủng ở các nhiệt độ khác nhau…………

45

3.2. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus plantarum
b33………………………………………………………………………………….

46

3.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng……………………………………………… 46
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng tạo sinh khối ………………

47

3.2.3. Ảnh hưởng của chế độ đảo trộn, thông khí đến khả năng tạo sinh khối của
chủng ở nhiệt độ 300C……………………………………………………………...

47

3.3. Nghiên cứu chọn chế độ thích hợp cho quá trình sấy phun đối với chủng
Lactobacillus plantarum b33……………………………………………………… 49
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào tới đặc tính của chế phẩm………………... 49
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất mang maltodextrin…………………………… 50
3.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tỷ lệ tế bào sống trong quá trình tạo
chế phẩm Lactobacillus plantarum b33 trên phương pháp sấy phun………….. 52
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy…………………………………………… 52
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào……………………………………………… 53
3.5. Ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Lactobacillus plantarum b33 trong muối
chua dưa cải bẹ……………………………………………………………………. 54
3.5.1. Đánh giá chất lượng chủng Lb.plantarum b33 trong chế phẩm…………….. 54
3.5.2. Khả năng ức chế một số vi sinh vật gây độc hại của chủng b33……………… 56
3.5.2.1.Nghiên cứu trên môi trường MRS lỏng……………………………………. 56


3.5.2.2.Nghiên cứu trong dưa cải bẹ muối chua…………………………………… 60
3.5.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm dưa cải bẹ…………………………………..

64

3.5.3.1.Đánh giá chất lượng cảm quan…………………………………………….

64

3.5.3.2.So sánh hiệu quả sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic……………………….

64

3.5.4. Quy trình công nghệ ứng dụng chế phẩm VKL trong quá trình muối chua
dưa cải bẹ…………………………………………………………………………... 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………... 69
TÓM TẮT NỘI DUNG…………………………………………………………... 73


1

MỞ ĐẦU
Nghiên cứu và ứng dụng quá trình lên men trong các sản phẩm lên men đã
được các nhà khoa học thực hiện thành công vào những năm cuối thế kỷ 19.
Quá trình lên men lactic là do rất nhiều loại vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic
không chỉ tham gia vào việc lên men lactic mà còn có khả năng sinh ra một số chất
có tác dụng bảo quản thực phẩm như diaxetyl, axeton, peroxit,..đồng thời làm tăng
hương vị của sản phẩm, ngoài ra một số loài còn sinh ra các chất kháng sinh như
bacteriocin có tác dụng ức chế và tiêu diệt một số vi khuẩn không có lợi, nấm men,
nấm mốc gây hư hỏng và mang mầm bệnh ở thực phẩm.
Hiện nay có rất nhiều lại sản phẩm thực phẩm trên thế giới nói chung ứng
dụng vi khuẩn lactic thành công cho đặc tính riêng (phomat, sữa chua,..). Còn ở
Châu Á, đặc biệt Việt Nam đẵ sử dụng vi khuẩn lactic từ thời xa xưa trong rau quả
muối chua (cà muối, dưa chuột muối, dưa cải bẹ muối,...). Dưa cải bẹ muối chua là
món ăn mang tính truyền thống khá phổ biến, tạo thành do quá trình lên men tự
nhiên của hệ vi khuẩn lactic sẵn có trong nguyên liệu. Tuy nhiên, cho đến hiện nay,
phương pháp muối chua rau cải bẹ vẫn chỉ được thực hiện 1 cách thủ công, nghĩa là
quá trình lên men lactic là hoàn toàn tự nhiên. Điều này dẫn đến chất lượng sản
phẩm không ổn định, và sản phẩm có nguy cơ nhiễm một số vi sinh vật gây bệnh.
Người ta cũng đã tìm cách đẩy nhanh quá trình lên men trong phương pháp muối
chua rau cải bẹ bằng việc bổ sung thêm nước dưa cũ. Việc bổ sung này cũng giúp
quá trình lên men xảy ra nhanh hơn nhờ hệ vi khuẩn lactic hỗn hợp có trong nước

dưa, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào khẳng định nước dưa cũ làm giảm nguy cơ
nhiễm tạp và tăng tính ổn định cho sản phẩm dưa cải muối chua. Mặt khác, trong
sản phẩm dưa cải bẹ muối chua, hệ vi sinh vật có lợi chiếm ưu thế chính là vi khuẩn
lactic. Chúng không những lên men đường có trong nguyên liệu thành axit lactic,
làm giảm pH của sản phẩm, mà còn có khả năng sinh ra các hợp chất có tính kháng
khuẩn, vì thế làm giảm nguy cơ nhiễm các vi sinh vật lạ gây hỏng sản phẩm. Tuy
nhiên, để nâng cao chất lượng sản phẩm, rút ngắn thời gian lên men, và giảm nguy


2

cơ nhiễm tạp trong sản phẩm rau cải bẹ muối chua, chúng ta cần bổ sung thêm vào
sản phẩm chủng vi khuẩn lactic thuần khiết (chế phẩm vi khuẩn lactic thuần khiết)
và có khả năng kháng khuẩn tốt. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
với tên: “Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic sử dụng trong chế
biến rau quả lên men”.
Thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến các nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu điều kiện nhiệt độ nuôi cấy thích hợp để thu hồi nhiều sinh khối
chủng Lb.plantarum b33 khỏe giúp sau sấy được chế phẩm tỷ lệ sống sót cao..
- Nghiên cứu chế độ sấy phun thích hợp cho chủng nhằm nâng cao tỷ lệ sống
sót cho chế phẩm.
- Nghiên cứu nồng độ chất mang maltodextrin và nồng độ vi khuẩn trong 1 g
chất mang khô tuyệt đối (CFU/g CM) để nâng cao tỷ lệ thu hồi và tỷ lệ sống sót
cũng như số tế bào vi khuẩn sống trong 1 g chế phẩm (CFU/g CF) cho chế phẩm
- Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh trong chế biến dưa cải bẹ
muối chua.


3

PHẦN I. TỔNG QUAN.
1.1. Vi khuẩn Lactic và ứng dụng.
Từ thời xa xưa, con người đã biết sử dụng phương pháp lên men trong bảo
quản và chế biến thực phẩm. Sự lên men thực phẩm nhờ vi khuẩn Lactic mang lại
nhiều lợi ích:
-

Kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm.

-

An toàn về mặt vi sinh cho thực phẩm.

-

Tạo ra thực phẩm dễ tiêu hoá với đặc tính riêng.

-

Phân huỷ các hợp chất độc và không có lợi cho thực phẩm,..

Với khả năng chuyển hoá đặc hiệu, vi khuẩn Laclic đã có mặt trong rất nhiều
quá trình lên men sữa (có mặt ở sản phẩm sữa chua, bơ, phomat,..), lên men thịt
(nem chua,…), lên men các loại ngũ cốc và rau quả (đặc biệt là rau qủa muối chua)
ở nhiều nước trên thế giới, đem lại lợi ích cho người tiêu dùng và người sản xuất.
Ngày nay, việc nghiên cứu các vi khuẩn có lợi nói chung và vi khuẩn Lactic
nói riêng càng được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm ứng dụng vào
một số sản phẩm thực phẩm.
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Lactic.
Năm 1857, Pasteur chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động

của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [12]. Năm 1873, lần đầu
tiên J.Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên Bacterium lactis (hiện nay
gọi là Streptococcus lactic),.. Năm 1998, Axelsson đã xem xét lại vi khuẩn lactic.
Ông cho rằng: Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, hô hấp yếm khí, dạng
không bào tử, hình cầu hoặc que, chúng tạo ra axit lactic khi lên men hợp chất
cacbonhydrat. Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong các quá trình
lên men yếm khí thực phẩm, đang dùng lên men bột mì nhão ẩm, bia cỏ, các loại
sữa lên men, tinh bột sắn (để chế biến gari và fufu) và nhiều rau quả lên men (muối
chua,..).


4

Những đặc tính sinh hoá, sinh lý, sinh thái, cách phân loại, ứng dụng của vi
khuẩn lactic đã được nghiên cứu kỹ và viết trên cuốn sách tên: Lactic Acid
Bacteria-Microbiological and Functional Aspects [11]
Cho tới nay, đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn lactic. Nhờ
khoa học kỹ thuật hiện đại, con người đã miêu tả một cách đầy đủ hơn về hình
dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic. Trong đó, công nghệ
di truyền trở thành một công cụ phân loại xác định hàm lượng phần trăm mol C+G
chứa trong DNA hay sử dụng phương pháp điện di để xác định các gen.
1.1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic.
Việc sử dụng vi khuẩn lactic trong các sản phẩm thực phẩm lên men ngày càng
trở nên rộng rãi. Các dạng sản phẩm lên men quen thuộc có nguồn gốc từ nguyên
liệu ban đầu là sữa, thịt, tinh bột, dưa chuột, bắp cải và cải bẹ,..
Bảng 1.1. Một số sản phẩm lên men [12]
Sản phẩm
Bia
Phomat
Kefir

Sữa chua
Rượu cọ
Bánh mì
Gari
Puto
Chicha
Xúc xích
Nam
I-sushi
Mahewu
Dưa chuột
muối chua
Sauerkraut

Thành phần
chính

Vi sinh vật

Vùng địa lý

Lúa mạch
Sữa
Sữa
Sữa
Nhựa cây cọ
Bột mì
Bột sắn
Gạo
Ngô

Thịt
Thịt
Cá
Ngô
Dưa chuột

Nấm men, VKL
VKL
VKL, nấm men
VKL
Nấm men
Nấm men
VKL
Nấm nem
Nấm men
VKL
VKL
VKL
VKL
VKL

Toàn thế giới
Toàn thế giới
Đông châu âu
Toàn thế giới
Toàn thế giới
Toàn thế giới
Nigeria
Philipphin
Nam Mỹ

Toàn thế giới
Thái lan
Nhật bản
Nam Châu phi
Châu âu, Bắc mỹ

Cải bắp

VKL

Châu âu, Bắc mỹ


5

Kimchi
Oliu
Nước tương, miso
Tempeh

Các loại rau
Oliu xanh
Đậu tương
Đậu tương

VKL
VKL
Nấm men, VKL
Nấm mốc, VKL

Toàn thế giới
Địa trung hải
Đông nam châu á
Indonesia

Các sản phẩm trên hầu như sử dụng hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu,
cho nên, ngoài những ưu điểm nổi trội vẫn có một số các hạn chế như quá trình lên
men kéo dài và gây ra sự nhiễm tạp trong quá trình lên men. Vì thế nhờ sự tiến bộ
của các ngành khoa học kỹ thuật đã nghiên cứu và sản xuất ra các loại chế phẩm bổ
sung vào trong các quá trình lên men nhằm rút ngắn thời gian lên men, hạn chế các
sự nhiễm của loài vi sinh vật có hại.
Ngày nay, axit lactic là sản phẩm số một được sản xuất nhờ ứng dụng vi khuẩn
lactic; axit lactic là nguyên liệu cần thiết cho ngành công nghệ thực phẩm, công
nghệ tổng hợp chất dẻo, công nghệ sản xuất thức ăn gia súc, công nghệ thuộc da,
dệt [14].
Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn tổng hợp ra chất có tác dụng bảo quản thực phẩm
(bacteriocins), các loại kháng sinh dùng trong y học [11].
1.1.3. Đặc điểm của vi khuẩn lactic [11].
1.1.3.1.Hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic.
Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae. Chúng không
đồng nhất về mặt hình thái, các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích
thước khác nhau. Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ
thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào. Tuy
nhiên về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất. Chúng đều là các vi khuẩn
Gram(+), không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải
hydratcacbon và tiết ra axit lactic. Chúng không chứa các riboxom và enzym
catalaza nên không phân giải trực tiếp peroxit thành nước và oxy.
Một đặc điểm quan trọng:là từng loại vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh
dưỡng rất phức tạp và khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ. Mặc dù
đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn, lactic vẫn

6

đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như phôtphat, lưu huỳnh, vitamin, muối vô cơ,
axit amin, lipit, những chất này phải có trong môi trường lên men.
1.1.3.2.Phân loại vi khuẩn lactic.
Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic. Dựa vào những tính chất cơ bản
của chúng mà người ta có thể phân loại theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng
phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm…
Năm 1919, Orla – Jensen là người tiên phong trong việc nghiên cứu, phân loại có hệ
thống các vi khuẩn lactic. Về hình dáng, Ông phân chúng thành bốn giống:
Lactobacillus; Leuconostocs; Pediococcus; Streptococcus và Lactococcus. Ngày
nay người ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi.
- Lactobacillus: Trực khuẩn, có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ. Nhiệt độ
tối ưu là 300C - 450C. Lên men được galactoza, glucoza, sacaroza, fructoza...
-Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng. Lên men đường
dextran, trioza, sản phẩm tạo thành là axit D- lactic, etanol, CO2.
-Pediococcus: Cầu khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn. Lên
men đường glucoza theo con đường EMP, axit lactic tạo thành có dạng DL, D(-)
hay D(+).
-Streptococcus và Lactococus: Dạng cầu khuẩn, xếp đôi hoặc chuỗi. Có khả
năng lên men đường hexoza thành axit lactic và các loại đường khác.
-Bifidobacterium: Lên men dị hình, có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình
ovan, có lúc lại hình que. Có khả năng lên men lactoza sản phẩm tạo thành là axit
lactic và axit axetic. Ví dụ như các chủng B.bifidum, B.longgum, B. infantis.
Ngoài ra, theo nhiệt độ, người ta cũng có thể phân ra 3 loại: ưa lạnh, ấm, ưa
nhiệt
1.1.3.3.Hoạt động chuyển hoá của vi khuẩn lactic.
Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều nguồn đường, thường có khả năng

phân giải protein và lipit yếu, đòi hỏi nguồn axit amin sẵn có để sinh trưởng.
a. Chuyển hoá đường.


7

* Một số đường như: mantose, galactose, và fructose, được lên men bởi nhiều
loài vi khuẩn. Các loại đường này sau khi đồng phân hoá hoặc phosphoril hoá,
chúng đi theo con đường chuyển hoá chính ở hai dạng glucose-6-phosphate hoặc
fructose-6-phosphate.
* Đường hexoza (glucoza)
Tất cả các vi khuẩn lactic đều sản sinh ra axit lactic từ hexoza và chúng thiếu
chức năng để liên kết với electron vận chuyển của mạch và chu trình Krebs, nên
chúng thu năng lượng thông qua cơ chất ở dạng photphoryl hóa. Axit lactic được
sinh ra có thể ở dạng L (+), ít khi ở dạng D(-), hoặc có thể ở dạng hỗn hợp.
Con đường hexoza chuyển hóa đã phân chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm: lên
men đồng hình và lên men dị hình. Ta thấy các dạng lên men đồng hình như
Pediococus, Streptococus và một số Lactobacillus,.. sinh axit lactic là thành phẩm
chính và duy nhất của việc lên men glucoza. Tuy nhiên đưới điều kiện sinh trưởng
thay đổi và khi cơ chất ban đầu là pentoza thì có thể thay đổi. Các chủng lên men
đồng hình sử dụng con đường Embden-Meyergof-Parnas để sinh ra 2 mol lactate
trên 1 mol glucoza và nhận được xấp xỉ gấp 2 lần năng lượng trên một mol glucoza
so với các chủng lên men dị hình. Các chủng lên men dị hình như Leuconostocs,
nhóm III lactobacilli, oenococci và weissellas thông qua đồ hình 6phosphogluconate/phosphoketolase (6-PG/PK) sinh ra một lượng cân bằng giữa
lactate, CO2, và etanol từ 1 mol glucoza theo con đường monophotphat hoặc
pentoza [11]. (Hình 1.1)


8

Hình 1.1. Sơ đồ quá trình lên men glucoza của vi khuẩn lactic:
(Hình 1.1A) lên men lactic đồng hình (thuỷ phân gluco, đồ hình EmbdenMeyerhof-Parnas);
(Hình

1.1B)

lên

men

lactic

dị

hình

(đồ

hình

6-

phosphogluconate/phosphoketolase). Các enzym đã dùng được đánh số như sau: 1.


9

Glucokinase; 2. fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3. glyceradehyde-3-phosphate
dehydrogenase; 4. pyruvate kinase; 5. lactate dehydrogenase; 6. glucose-6phosphate

dehydrogenase;

7.

6-phosphogluconate

dehydrogenase;

8.

phosphoketolase; 9. acetaldehyde dehydrogenase; 10. alcohol dehydrogenase.
* Sự chuyển hoá disacarit lactoza là một bước quan trọng đầu tiên đối với các
vi khuẩn lactic sử dụng trong sản xuất sữa lên men. Lactoza có thể đi vào bên trong
tế bào nhờ chất mang lactoza, và các lacto-pecmeaza phân cắt lactoza thành glucoza
và galactoza, hoặc theo con đường photphoenolpyruvat photphotransferaza (PTS),
lactoza phân cắt thành glucoza và galactoza-6-photphat.
* Sự lên men đường saccarose bắt đầu bởi quá trình thuỷ phân saccarose
thành đường đơn glucose và fructose. Những đường đơn này đi theo con đường
chuyển hoá chính. Đối với lactococci, đường saccarose bị chuyển hoá theo con
đường PTS và saccarose-6-phosphate phân tách thành glucose – 6 – phosphate và
fructose [21]. Đường saccarose cũng có thể đóng vai trò như đường
monosaccharide ở dạng exopolysaccharide. [22]
b. Chuyển hoá xitrat. [16 – 20]
Xitrat vận chuyển được vào tế bào vi khuẩn là nhờ chất dễ thấm thành tế bào
xitrat và khi bị phân chia bởi enzym xitrat lyase để tạo ra oxaloacetat và acetat.
Dưới sự xúc tác của enzym oxaloacetat decacbonoxylase, oxaloacetat bị decacboxyl
thành pyruvat và CO2. Trong công nghiệp chế biến sữa, một số loài như: Lc.lactic
subsp. lactis, Ln. cremoris hoặc Ln.citrovorum được sử dụng với mục đích tạo ra
diacetyl. Nhìn chung, sự hình thành diacetyl hoặc acetoin khi nồng độ đường thấp
và pH thấp.

Pyruvat dưới tác dụng của enzym 2 sẽ chuyển thành α – axetolactat, α –
axetolactat bị oxi hoá thành diaxetyl (là chất có tác dụng tạo hương và giúp bảo
quản thực phẩm). Ngoài ra, pyruvat còn tạo được một số axit hữu cơ khác như axit
lactic, acetic, propionic (là những axit có tác dụng kháng khuẩn) [11]
Qua nhiều tranh cãi, các nhà nghiên cứu đã đưa ra đồ hình sau:


10

Hình 1.2. Các đường hướng chuyển hoá từ pyruvate [11]
Mũi tên biểu thị phản ứng không enzym. Các chuyển hoá quan trọng và sản
phẩm cuối được để trong khung. Các phản ứng dưới xúc tác bởi enzym được đánh
số: 1. diacetyl synthase; 2. acetolactate synthase; 3. pyruvate-formate lyase; 4.
pyruvate dehydrogenase; 5. pyruvate oxidase; 6. acetate kinase.
c. Chuyển hoá protein.
Vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn về các loại axit amin để phát triển, chúng
không thể tổng hợp các nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ mà phải lấy trực tiếp từ môi
trường. Hoạt động thuỷ phân protein được nhắc đến khi trong môi trường không đủ
axit amin cung cấp cho sự sinh trưởng và phát triển [11].
1.1.3.4.Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic [11].


11

Cơ chế kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic: Quá trình lên men nhờ vi khuẩn
lactic làm giảm một lượng cacbonhydrat sẵn trong nguyên liệu, và kết quả là sinh ra
một dãy các phân tử hữu cơ có khối lượng phân tử nhỏ, có hoạt tính kháng khuẩn,
trong đó phổ biến nhất là axit lactic, axit axetic và axit propionic. Ngoài những sản
phẩm trao đổi chất có tính kìm hãm vi sinh vật này, còn nhiều những cấu tử kháng
vi sinh vật được tạo ra từ những vi khuẩn lactic khác nhau. Thông thường các chất

có tính kháng khuẩn tạo ra từ vi khuẩn lactic bao gồm: axit hữu cơ, H2O2, CO2,
diaxetyl, các chất kháng vi sinh vật có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin.
a). Axit hữu cơ
Theo các nghiên cứu thu được, axit yếu có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn
axit trung bình ở cùng pH thấp. Hai axit sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi
khuẩn lactic, axit acetic có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn và phổ kháng khuẩn
rộng hơn, bao gồm cả nấm men, nấm mốc và vi khuẩn; trong khi axit propionic
cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh, nhưng chỉ là nấm men, nấm mốc. Đó là
do chúng có pKa cao hơn axit lactic (4.87, 4.75 và 3.08). Ví dụ, ở pH= 4 chỉ 11%
axit lactic không phân ly, trong khi đó axit axetic là 85%, và axit propionic là 92%.
Khi có 1 hỗn hợp các axit này, axit lactic góp phần chủ yếu làm giảm pH, trong khi
axit axetic và axit propionic chủ yếu không bị phân ly, mới đóng vai trò chính là
tác nhân kháng vi sinh vật. Thật vậy, hỗn hợp axit lactic và axit axetic làm giảm tỉ lệ
sinh trưởng của Samonella enterica typhimurrium hơn là từng loại axit đứng riêng
rẽ, và đó là hoạt tính hợp lực. Tuy nhiên, ngoài việc làm giảm pH, axit lactic còn có
chức năng như 1 màng thấm, do đó giúp tăng cường hoạt tính của các chất kháng vi
sinh vật khác. Người ta cho rằng, những phân tử không hòa tan của 1 axit yếu có
tính độc, mặc dù những phân tử hòa tan có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của vi
sinh vật. Người ta giả thiết rằng dạng không hòa tan của axit hữu cơ sẽ khuyếch tán
qua màng tế bào bởi vì chúng là những dịch lỏng [27].
b). H2O2


12

Với sự có mặt của O2, vi khuẩn lactic có thể sinh ra H2O2 thông qua hoạt động
của các enzym flavoprotein oxidaza và NADH oxidaza. Vi khuẩn lactic không có
khả năng sinh enzym catalaza để loại bỏ H2O2. Vì thế, H2O2 ngày càng được tích
lũy. Tuy nhiên, Fortain và các cộng sự [27] lại kết luận rằng H2O2 không được tích
lũy đủ trong tế bào, bởi vì nó bị phá hủy bới các enzym peroxidaza, flavoprotein và

pseudocatalaza. Người ta dự đoán rằng H2O2 sinh ra có vai trò đặc biệt quan trọng
cho sự xâm nhập vào đường tiết niệu của vi khuẩn lactic. Trong điều kiện tự nhiên,
hiệu ứng kháng vi sinh vật của H2O2 có thể được tăng cường bởi sự có mặt của
enzym lactoperoxidaza và thiocyanat SCN-. Enzym glycoprotein lactocperoxidaza
được tìm thấy trong nước bọt, trà, sữa…:

SCN- + H2O2 Î OSCN- + H2O

Sự thay đổi và phá hủy cấu trúc của màng tế bào vi sinh vật là do sự giải
phóng ra OSCN-.
c). CO2.
Vi khuẩn lactic lên men dị hình từ đường hexoza tạo ra CO2 là sản phẩm
chính. Và nhiều phương thức trao đổi chất khác giải phóng ra CO2 trong quá trình
lên men. CO2 có tính kháng vi sinh vật lưỡng tính. Cách thức là tạo ra 1 môi trường
yếm khí, và tự bản thân CO2 cũng có tính kháng vi sinh vật. Cơ chế của hoạt tính
kháng khuẩn này chưa tìm ra, nhưng được dự đoán là do sự tích lũy CO2 gây ra sự
hoạt động bất thường tính thấm của màng tế bào. Bởi tính kháng vi sinh vật này,
CO2 được sử dụng như 1 cấu tử chính trong công nghệ đóng gói với môi trường khí
thay đổi.
Theo nghiên cứu, vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với CO2 trong môi trường khí
thay đổi hơn vi khuẩn Gram dương [9].
d). Diacetyl.
Diacetyl được tìm ra bởi Niel và các đồng nghiệp [11] như 1 cấu tử tạo hương
và mùi trong bơ. Năm 1927 Lemoige đã tìm ra hoạt tính kháng vi sinh vật Bacillus
sp của nó. Diacetyl được sinh ra bởi các loài và chủng thuộc giống Lactobacillus,
Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus cũng như các loài vi sinh vật khác. Khi


13

đường hexoza được chuyển hóa, sự tạo thành diacetyl bị ngăn chặn. Tuy nhiên,
diacetyl sẽ được sinh ra với 1 lượng rất lớn nếu citrate được chuyển hóa. Citrate
được chuyển hóa thành pyruvat, rồi thành diacetyl. Jay tìm ra rằng lượng diacetyl
được tăng lên dần dần khi pH <7. Hoạt tính kháng khuẩn của diacetyl bị phản tác
dụng khi có mặt glucoza, acetate và tween 80. Diacetyl thể hiện tính kháng với vi
khuẩn gram âm, nấm men, và nấm mốc tốt hơn là với vi khuẩn gram dương; và vi
khuẩn lactic là kém nhạy cảm nhất với hoạt tính kháng khuẩn của diacetyl.
e). Các chất kháng vi sinh vật có trọng lượng phân tử thấp.
Gồm: reuterin, reutericyclin, 2-pyrrolidone-5-carboxylic Acid,…
Vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra các hợp chất kháng vi sinh vật với trọng
lượng phân tử thấp. Đặc điểm của các hợp chất này: khối lượng phân tử thấp, có các
đặc tính hoạt động ở pH thấp, bền nhiệt, phổ kháng rộng, tan trong aceton.
k). Bacteriocin [11]
Bacteriocin là một peptid, sinh ra bởi một số vi khuẩn để kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn khác. Bacteriocin có thể được coi như những chất kháng sinh, tuy
nhiên chúng lại khác với chất kháng sinh ở một vài điểm mấu chốt: Bacteriocin là
một riboxom tổng hợp; các tế bào chủ miễn dịch với bacteriocin; cách thức hoạt
động của bacteriocin khác với các chất kháng sinh; bacteriocin có phổ kháng khuẩn
hẹp, do đó chỉ có thể kháng những chủng có liên quan mật thiết với chủng sinh ra
bacteriocin đó.

1.2. Rau quả lên men và ứng dụng chế phẩm VKL trong rau quả muối chua
1.2.1. Tổng quan về rau quả lên men
Các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở qui mô gia đình
trong điều kiện thủ công. Hiện nay một số nước đã đưa việc sản xuất các sản phẩm
trên qui mô công nghiệp, đi đầu là Nhật Bản, Hàn Quốc, Philipine và Thái Lan. Còn
ở châu Âu, công nghệ lên men lactic được ứng dụng trên nguyên liệu rau quả như


14

bắp cải, dưa chuột, ôliu, cà rốt, cà chua, tảo biển... Ở Việt Nam, dưa muối có thể
được coi là sản phẩm truyền thống của dân tộc. Từ giữa thế kỷ 18 đến giữa thế kỷ
19, nhân dân ta đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa làm ra dưa muối từ các loại
rau, củ, quả. Có hai loại dưa: dưa muối xổi thường dùng các loại rau cải non, các
loại củ, quả cắt nhỏ, ngâm trong dấm, có thể ăn ngay sau khi muối một thời gian
ngắn; còn loại thứ hai là dưa muối để lâu dùng các loại cải bẹ, cà, hành, dưa chuột,
xơ mít,…[7], [1], [3].
1.2.2. Quy trình công nghệ sản xuất dưa cải bẹ muối chua truyền thống ở Việt Nam

* Thuyết minh quy trình :
-Chọn nguyên liệu: Cây dưa cải bẹ với khối lượng trung bình 2 – 3 kg/cây, loại
mới chớm ra hoa (vì thời điểm này dưa chứa hàm lượng đường cao).
-Cắt-rửa: Loai bỏ cuống già ở sát gốc và những lá sâu, vàng,… tạp chất , một
phần vi sinh vật có trên lá dưa.. Chú ý tránh dập, nát lá dưa khi rửa.
-Muối dưa: Thường thực hiện trong các vải sành, sứ. Tỷ lệ muối ăn trắng sạch
6 – 9 % so với khối lượng dưa pha với nước. Tỷ lệ nước sự dụng là 20% khối lượng
dưa. Trước khi muối có thể cho thêm 5% hành tươi để tạo vi cho sản phẩm, có tác
dụng ức chế các vi sinh vật có hạơ và bổ xung thêm đường cho dưa.


15

-Lên men: Ở chế độ nhiệt độ thích hợp 20-250C, trong thời gian 15-16 ngày
nhằm đạt sản phẩm có hàm lượng axit lactic đạt 2,5 - 3,6 g/l. Để qúa trình lên men
ổn định có thể pha thêm nước dưa cũ với nước dưa mới muối.
Sản phẩm dưa cải bẹ muối chua được đánh giá là đạt chất lượng khi ăn thấy
thơm của hành và cải, vị chua tự nhiên của axit lactic hơi the của cải, màu vàng
sáng đặc trưng. Trạng thái miếng dưa không được nhũn, khi ăn giòn.
Thực tế cho thấy: phần lớn quy trình sản xuất dưa cải bẹ muối chua mang tính

thủ công, dựa vào kinh nghiệm sản xuất là chính nên chất lượng sản phẩm không ổn
định. Hơn nữa, thời gian bảo quản và sử dụng ngắn nên hiện nay chưa có một tiêu
chuẩn nhất định để quản lý chất lượng sản phẩm. Do đó, cần phải cải tiến các quy
trình sản xuất đồng thời bổ sung các hóa chất (gia vị), các chế phẩm vi khuẩn lactic
có khả năng sinh axit tốt và khả năng kháng khuẩn cao vào quá trình lên men ổn
định và nâng cao chất lượng sản phẩm dưa cải bẹ muối chua, lại có thể rút ngắn thời
gian lên.
1.2.3. Cơ chế của quá trình muối chua rau quả.
Rau quả muối chua thuộc nhóm sản phẩm lên men lactic. Trong quá trình lên
men này, chất đường (có sẵn trong nguyên liệu hoặc do đưa vào) được chuyển hoá
thành acid lactic nhờ hệ vi sinh vật lactic. Acid lactic và các sản phẩm khác tạo
thành trong quá trình lên men làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng. Bên cạnh
đó, acid lactic còn có tác dụng làm giảm pH sản phẩm, ức chế hoạt động của nhiều
loại vi sinh vật gây hư hỏng [11].
Quá trình muối chua rau quả gồm có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: muối ăn tạo áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh
dưỡng khác có trong nguyên liệu khuyếch tán vào nước, tạo môi trường thuận lợi
cho các vi sinh vật lactic và một số vi sinh vật khác hoạt động. Trên bề mặt nước
muối xuất hiện những bọt khí, đó là do hoạt động của vi khuẩn E.coli và một số vi
sinh vật có khả năng sinh khí khác. Chủng vi sinh vật lactic phát triển chủ yếu trong
thời kỳ này là Leuconostoc mesentercroides. Đó là loại cầu khuẩn có khả năng sinh
khí và acid lactic. pH môi trường nhanh chóng giảm xuống, các vi sinh vật có hại sẽ


16

bị ức chế. Khi CO2 sinh ra làm tăng điều kiện yếm khí, góp phần ức chế vi sinh vật
“lạ”, đồng thời ngăn cản được sự oxi hoá vitamin C và giữ được màu sắc tự nhiên
của rau cải. Ngoài ra, sự phát triển của chủng này sẽ làm môi trường biến đổi, tạo
điều kiện thuận lợi cho các chủng vi sinh vật lên men ở giai đoạn sau phát triển. Khi

nồng độ acid (chủ yếu là acid lactic) đạt 0,25 – 0,3%, nó sẽ phát triển chậm dần và
chết đi, trong khi đó các enzyme mà nó tiết ra vẫn tiếp tục chuyển hoá đường thành
acid lactic.
- Giai đoạn 2: các vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ và acid lactic tích tụ
được nhiều. pH của môi trường giảm tới 3 – 3,5 và ức chế hoạt động của các vi
khuẩn gây thối. Chủng vi sinh vật lactic phát triển chủ yếu trong thời kỳ này là
Lactobacillus cucumeris, Lactobacillus plantarum, B.brassicae fermentati và một
số chủng khác. Đây là thời kỳ quan trọng của quá trình lên men. Trong giai đoạn
này, sản phẩm sẽ tích tụ được lượng acid lactic cao và có hương vị đặc trưng. Khi
nồng độ acid đạt 1,5 – 2%, cùng với nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp, các chủng
này sẽ bị giảm hoạt tính.
- Giai đoạn 3: một số chủng vi sinh vật lactic khác (như: L.pentoacetius,..) sẽ
tiếp tục quá trình lên men và đưa nồng độ acid lên 2 – 2,5 %. Lượng acid lactic tích
luỹ cao quay lại ức chế hoạt động của chính các vi sinh vật này. Lúc này, một số
nấm men và nấm mốc có khả năng phân huỷ acid lactic sẽ phát triển, làm giảm chất
lượng sản phẩm. Do vậy, trong thời kỳ này, để ngăn ngừa hiện tượng trên, ta có thể
bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp (2 - 40C) hoặc bảo quản ở điều kiện yếm khí hay
bảo quản bằng acid sorbic, natri benzoat,… [1], [3], [7].
1.2.4. Vi khuẩn lactic trong lên men rau quả [44].
1.2.4.1.Các chủng vi khuẩn lactic khởi đầu cho quá trình lên men rau quả.
Các loại rau quả lên men có thể sử dụng rộng rãi bao gồm sauerkraut, dưa
chuột và oliu muối chua. Thông thường bắp cải, cải bẹ, dưa chuột, và oliu được lên
men bởi Lb. plantarum. P. cerevisiae, P. pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides,
or Lb. brevis


17

cũng có thể được dùng. Dịch muối NaCl được thêm vào, trong suốt quá trình chuẩn
bị sản phẩm này. Hỗn hợp NaCl và axit lactic làm cho rau quả lên men ổn định

trong suốt thời gian dài ở nhiệt độ phòng. Nồng độ muối cũng hạn chế độ tăng
trưởng của vi khuẩn lactic, do đó ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm.
1.2.4.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men lactic trong rau quả muối chua.
Bao gồm: nồng độ muối ăn, hàm lượng đường trong sản phẩm (đường có sẵn
trong nguyên liệu và đường bổ sung thêm vào), độ pH của sản phẩm, hệ vi sinh vật
trong sản phẩm và nhiệt độ môi trường [11].
Dung dịch muối ăn với nồng độ tương đối cao sẽ ức chế sự phát triển của các
vi sinh vật lạ và cả vi khuẩn lactic. Khi tiến hành muối chua rau quả cần tạo điều
kiện cho các vi khuẩn lactic phát triển và ức chế các vi sinh vật lạ. Do vậy cần sử
dụng nồng độ muối không quá cao: thường sử dụng muối ăn với nồng độ 4 - 6%.
Đường trong quá trình muối chua rau quả là nguồn tạo axit lactic. Trong trường hợp
đường ở nguyên liệu không đủ thì hàm lượng axit lactic tích tụ trong sản phẩm cũng
không đạt mức yêu cầu, khi đó sản phẩm có hương vị kém và dễ bị hư hỏng khi bảo
quản. Vì vậy: muối chua cần chọn loại nguyên liệu có hàm lượng đường đạt mức
yêu cầu và khi cần thì phải bổ sung thêm đường. Độ axit trong sản phẩm cũng ảnh
hưởng lớn tới quá trình muối chua vì các vi sinh vật rất nhạy cảm đối với pH môi
trường (pH tối ưu của vi khuẩn lactic là 5,5- 6,5). Trong quá trình lên men của rau
quả muối chua axit lactic tích tụ với hàm lượng 0,5% cũng đã ức chế hoạt động của
nhiều vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men. Khi tích tụ axit lactic
với hàm lượng cao (1 - 2%) thì ngay cả các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế và do đó
quá trình lên men lactic bị kìm hãm. Nồng độ axit lactic giới hạn đạt được trong quá
trình lên men lactic phụ thuộc vào lượng đường có sẵn trong nguyên liệu, nồng độ
muối, nhiệt độ lên men và loại vi khuẩn lactic. Tuy nhiên axit lactic không ức chế
hoạt động của một số nấm men, nấm mốc. Nhiệt độ lên men ảnh hưởng trực tiếp
đến quá trình lên men và tới chất lượng sản phẩm. Ở nhiệt độ 0 - 40C thì sự lên men
lactic không bị đình chỉ mà chỉ diễn ra chậm. Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại vi
khuẩn lactic là 35 - 420C, nhưng nhiệt độ này cũng kích thích sự phát triển của


18

nhiều vi sinh vật lạ. Sự lên men lactic cần tiến hành trong điều kiện yếm khí. Phần
lớn các vi khuẩn lactic hoạt động trong điều kiện yếm khí tùy tiện, tức là phát triển
không nhất thiết phải có mặt của oxy không khí. [7],[1],[3].
1.3. Quá trình tạo chế phẩm Lactic.
1.3.1. Quá trình tạo sinh khối.
Trong quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn, người ta chia quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn thành 4 pha chính:
-Pha tiềm phát: được tính từ khi bắt đầu cấy đến khi tốc độ sinh trưởng của vi
khuẩn tăng mạnh. Thời gian này vi khuẩn làm quen và thích nghi với môi trường
mới.
-Pha phát triển logarit: là pha tăng trưởng mạnh nhất. Tế bào sinh sản với tốc
độ lớn nhất, sự tạo thành sinh khối được mô tả theo hàm số mũ; lượng cơ chất giảm
rõ rệt và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra. Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có
hoạt tính sinh học cao. Kích thước tế bào cũng lớn lên. Số lượng tế bào tăng theo
phương trình: N= No.2n . Trong đó:
-No : Số tế bào ban đầu.
-N : Tổng số tế bào.
-n : Số lần tế bào phân chia.
Tốc độ sinh sản đạt mức cưc đại và không thay đổi trong suốt thời gian của
giai đoạn phát triển logarit. Việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần
dần
-Pha cân bằng: quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào
mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả số tế bào và cả sinh khối không tăng
cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho
nên, khi giảm nồng độ cơ chất thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm.
Nguyên nhân tồn tại của pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm của quá trình
trao đổi chất (các loại rượu, axit hữu cơ,..) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng.
Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản

19

lượng phụ thuộc vào tính chất và số lượng các chất dinh dưỡng sử dụng và vào điều
kiện nuôi cấy.
-Pha suy vong: là pha, mà quá trình sinh sản bị đình chỉ hoàn toàn, số lượng tế
bào có khả năng sống giảm theo luỹ thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể
không giảm). Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzim của bản thân. Các tế bào
chết đi, sự cân bằng bị phá vỡ, ngoài sự biến đổi về số lượng tế bào còn có sự thay
đổi về kích thước.
Thông qua đánh giá các pha sinh trưởng của vi khuẩn, người ta có thể vẽ được
đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. Nhìn vào đường cong sinh trưởng, ta có thể
thấy rõ thời gian vi khuẩn phát triển ở từng pha và khi nào vi khuẩn phát triển mạnh
nhất để thu được lượng sinh khối lớn nhất.
Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ở mỗi pha phụ thuộc vào từng
loại vi khuẩn, đặc điểm, tính chất, thành phần của môi trường và các điều kiện bên
ngoài như nhiệt độ, điều kiện thông khí,..
Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng, lúc này xuất hiện khá nhiều tế bào già
và chết; vì vậy khả năng chịu đựng của vi khuẩn đối với các phương pháp xử lý sẽ
kém (phương pháp sấy,…). Do vậy: Để có được chế phẩm hoạt lực cao, ta cần chọn
thời điểm thu hồi sinh khối ra khỏi canh trường nuôi cấy vì nó ảnh hưởng đến số
lượng tế bào sống sót trong quá trình sấy và bảo quản sau này. Theo một số nghiên
cứu về vi khuẩn lactic đã chứng minh: nếu sinh khối được lấy ra tại thời điểm vi
khuẩn phát triển đạt đến đầu pha cân bằng là tốt nhất.
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic.
1.3.2.1.Nhu cầu dinh dưỡng [11].
a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon.
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza
(glucoza, fructoza, manoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza)
cho đến các polysacarit (tinh bột, dextrin). Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho

vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để
cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit


20

malic, pyruvic, fumaric, axetic… Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon,
vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin
làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó xảy ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2.
Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau
b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ.
Một số lớn các vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu
cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển, chúng phải sử dụng
nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả
năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Đôi khi trong một số
trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic, như Lactobacillus
helyeticus, có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường.
Do vậy, để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn
hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa
nitơ như các sản phẩm thuỷ phân protein từ thịt, lactabumin, casein, peptone, peptit,
nấm men thuỷ phân…
c. Nhu cầu vitamin
Các vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào.
Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin.
d. Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic
Một số chất hữu cơ ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển
của axit lactic. Các bazơ nitơ: Adenin, Hypoxantin, Guanin, Uraxin, Thimin,
Thimidin. Axit hữu cơ : axit axetic và nhiều axit hữu cơ không bay hơi khác. Axit
amin: L-asparagin, L-glutamin.,..
Một loại axit hữu cơ quan trọng ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết

các loài vi khuẩn lactic là axit oleic (có thể thay thế bằng axit linoleic và axit
linolenic). Đó chính là nguyên nhân tại sao người ta lại sử dụng Tween 800 - một
dẫn xuất của axit oleic (Polyoxyethlene sorbiton monooleate), trong thành phần môi
trường phân lập, nuôi cấy vi khuẩn lactic.
e. Nhu cầu các muối vô cơ.