NGHIÊN cứu, PHÂN TÍCH sự BIỂU HIỆN PROTEIN được cảm ỨNG bởi KHÁNG SINH của CHỦNG MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI


PHẠM NGỌC THẠCH

NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN
ĐƢỢC CẢM ỨNG BỞI THUỐC KHÁNG SINH CỦA
CHỦNG MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. TRƢƠNG QUỐC PHONG

Hà Nội - 12/ 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu
và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả
khác công bố.
Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2013

Phạm Ngọc Thạch

i


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.

Trƣơng Quốc Phong, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng
Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy, cô công tác tại Viện
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội
đã tận tình giúp đỡ và dạy bảo tôi trong quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại trƣờng.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Đỗ Thị Thu Hà – kỹ thuật viên phòng Công
nghệ Proteomics – Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học – Viện
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà
Nội, NCS. Nguyễn Việt Phƣơng và các học viện, sinh viên làm việc tai phòng
Proteomics đã động viên, giúp đỡ và chỉ bảo ân tình để tôi có thể hoàn thành luận
văn này.
Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời biết ơn tới tất cả các cán bộ và các học viên tại
Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học
và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã động viên,
hƣớng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ và tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà nôi, ngày 30 tháng 12 năm 2013
Học viên

Phạm Ngọc Thạch
ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮT......................................................... vi
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................ viii
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
I. BỆNH LAO VÀ TÁC NHÂN GÂY BỆNH............................................................. 3
I.1. Bệnh lao ............................................................................................................. 3
I.1.1. Lịch sử bệnh lao. ........................................................................................... 3
I.1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới .................................................................... 4
I.1.3. Tình hình bệnh lao ở Việ Nam...................................................................... 6
I.1.4. Các dạng bệnh lao ......................................................................................... 8
I. 2. Tác nhân gây bệnh lao ....................................................................................... 9
I.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao Mycobacterium Tuberculosis ............................ 9
I.2.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................. 9
I.2.1.2. Đặc điểm hóa sinh ................................................................................ 10
I.2.2. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh của vi khuẩn lao Mycobacterium
Tuberculosis .................................................................................................................. 11
II. VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN . 12
II.1. Các dạng vi khuẩn lao kháng thuốc................................................................. 12
II.2.Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao ............................................................... 13
II.3. Các phƣơng pháp xác định vi khuẩn lao kháng thuốc..................................... 16
II.3.1. Phƣơng pháp kiểu hình .............................................................................. 16
II.3.1.1. Các phương pháp nuôi cấy truyền thống ............................................ 16
iii


II.3.1.2. Các phương pháp nuôi cấy cải tiến .................................................... 17
II.3.1.3. Một số phương pháp kiểu hình mới .................................................... 17
II.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc .......... 19

II.3.2.1. Kỹ thuật giải trình tự DNA .................................................................. 19
II.3.2.2. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR ................................................. 19
II.4. Ứng dụng công cụ proteomic trong nghiên cứu hệ protein của vi khuẩn lao. 21
II.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein ngoại bào vi khuẩn lao .................... 23

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 25
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .................................. 25
2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao ................................................................................. 25
2.1.2. Mẫu dịch nuôi nổi ......................................................................................... 25
2.1.3. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: ....................................................... 25
2.1.4. Các thiết bị chủ yếu....................................................................................... 25
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 26
2.2.1. Tách chiết protein ......................................................................................... 26
2.2.1.1. Quy trình tách chiết protein từ sinh khối tế bào .................................... 26
2.2.1.2. Quy trình thu hồi protein ngoại bào từ dịch nuôi .................................. 28
2.2.2. Định lƣợng protein trong dung dịch bằng phƣơng pháp Bradford ............. 32
2.2.3. Phân tách protein bằng các kỹ thuật điện di ................................................. 33
2.2.3.1. Phân tách protein bằng kỹ thuật điện di biến tính trên gel
polyacryamide(SDS-PAGE) ................................................................................ 33
2.2.3.2. Phân tách protein bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) .................... 34
2.2.3.3. Điện di hai chiều (2DE – MS) kết hợp với khối phổ ............................. 36

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 38
3.1 TÁCH CHIẾT CÁC HỆ PROTEIN ..................................................................... 38
3.1.1. Tách chiết hệ protein từ sinh khối vi khuẩn lao ............................................ 38
3.1.1. Tách chiết hệ protein từ dịch nuôi. ............................................................... 39
3.1.1.1. Kết tủa hệ protein dịch nuôi bằng aceton .............................................. 39

iv

3.1.1.2. Kết tủa và phân đoạn protein từ dịch nuôi tế bào bằng muối
(NH4)2SO4 bão hòa kết hợp với cut-off. ............................................................... 40
3.1.1.3. Tách chiết hệ protein dịch nuôi bằng hỗn hợp dịch axít
tricloacetic/ethanol (TCA/EtOH) ........................................................................ 42
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) ............................... 44
3.2.1. Khảo sát dải pH khác nhau của strip............................................................. 44
3.2.2. Khảo sát chiều dài khác nhau của strip với cùng dải pH. ............................. 46
3.3. KHẢO SÁT DẢI PI CỦA HỆ PROTEIN DỊCH NUÔI. .................................... 47
3.4. PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH CÁC HỆ PROTEIN ............................................. 48
3.4.1. Với hệ protein sinh khối tế bào lao nhạy và lao kháng thuốc bằng điện di
hai chiều đánh dấu huỳnh quang. .................................................................................. 48
3.4.2. Với hệ protein ngoại bào vi khuẩn kháng thuốc có kháng sinh và không
có kháng sinh................................................................................................................. 52

KẾT LUẬN ........................................................................................................ 54
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 56

v


DANH MỤC CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮT
1-DE

One-dimensional electrophoresis

Điện di một chiều

2-DE

Two-dimensional electrophoresis

Điện di hai chiều

APS

Ammonium persulfate

Ammonium persulfate
ai
chiều
Một
chất tẩy rửa lƣỡng tính để
hòa tan protein

DTT

3-[(3Cholamidopropyl)dimethylammoni
o]-1-propanesulfonate
Dithiothreitol

IAA

Iodoacetamide

Iodoacetamide

IEF

Isoelectric focusing

Điện di đẳng điện

IPG

immobilized pH gradient

Gradien pH cố định

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

MALDI

Matrix-asststed laser deorption
ionization

Ion hóa do tác động của laze với
sự hỗ trợ của chất nền

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

MS/MS

Tandem mass spectrometry

Khối phổ liên tục

pI

Isoelectric point

Điểm đẳng điện

SDSPAGE

Sodium dodecyl sulphate
polyacrylamide gel electrophoresis

Điện di biến tính trên gel
polyacrylamide

TEMED

Tetramethylethylenediamine

Tetramethylethylenediamine

TCA

Acid trichloacetic

A xít tricloacetic

w/v

Weight/volumn

Khối lƣợng/thể tích

CHAPS

vi

Dithiothreitol


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tỷ lệ mắc lao ở các khu vực năm 2007 ........................................................... 5
Bảng 1.2. Ƣớc tính bệnh Lao kháng đa thuốc trên toàn thế giới ..................................... 6
Bảng 1.3. Tỷ lệ mắc lao và tỷ lệ tử vong do lao ở Việt Nam qua các năm ..................... 7
Bảng 1.4. Tỷ lệ mắc lao kháng thuốc ở Việt Nam năm 2006 .......................................... 8
Bảng 1.5. Bảng tóm tắt cơ chế kháng thuốc lao mức độ phân tử .................................. 15
Bảng 2.1. Thành phần gel trong điện di SDS-PAGE ..................................................... 33
Bảng 3.1. Nồng độ protein sinh khối vi khuẩn lao xác định bằng Bradford ................. 39
Bảng 3.2. Nồng độ protein dịch nuôi vi khuẩn lao xác định bằng Bradford ................ 44
Bảng 3.3. Các protein sai khác giữa chủng lao nhạy và kháng ...................................... 50

vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Hình thái tế bào M. tuberculosis dƣới kính hiển vi điện tử ........................... 10
Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc của M. tuberculosis trên môi trƣờng thạch .................... 10
Hình 1.3. Sơ đồ truyền bệnh lao từ ngƣời lớn sang trẻ em bằng đƣờng hô hấp ........... 12
Hình 1.4. Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao [195] ............................... 13
Hình 2.1. Quy trình điện di 2-DE đánh dấu huỳnh quang ............................................. 35
Hình 2.2. Mô hình điện di hai chiều kết hợp khối phổ .................................................. 36
Hình 3.1. Điện di SDS – PAGE kết quả tách chiết hệ protein từ sinh khối vi khuẩn lao ..... 38
Hình 3.2. Kết quả điện di kết tủa hệ protein dịch nuôi bằng ethanol ............................. 40
Hình 3.3. Kết tủa phân đoạn protein từ dịch nuôi vi khuẩn laobằng (NH4)2SO4bão
hòa kết hợp màng cut-off ............................................................................................... 41
Hình 3.4. Kết quả loại albumin và tủa các các protein khác từ dịch nuôi .................... 43
Hình 3.5. Kết quả loại albumin và tủa các protein khác trong các dịch nuôi bằng
15%TCA/EtOH .............................................................................................................. 44
Hình 3.6. Điện di 2-DE protein tách chiết từ vi khuẩn lao với pH của strip là 3-10 (A) ...... 45
Hình 3.7. Ảnh hƣởng chiều dài thanh strip đến sự phân tách protein trên gel điện di
2-DE với chiều dài strip là 11cm (A) và 18cm (B) ........................................................ 46
Hình 3.8. Hệ protein dịch nuôi vi khuẩn lao ở các dải pI khác nhau ............................. 47
Hình 3.9. Kết quả điện di 2-DE đánh dấu huỳnh quanng với chủng lao nhạy (A), lao
kháng (B), và mẫu hỗn hợp(C)....................................................................................... 49
Hình 3.10. Sự sai khác của các protein spots giữa chủng vi khuẩn lao nhạy và kháng . 51
Hình 3 .11. Các protein spots sai khác giữa hai môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lao
kháng thuốc không có kháng sinh (A) và có kháng sinh (B) Isoniazid ......................... 53

viii


MỞ ĐẦU
Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ tử vong cao và có tính chất dễ lây lan
trong cộng đồng. Bệnh lao là một bệnh có lịch sử lâu đời, xuất hiện từ thời trƣớc
Công Nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nƣớc vùng Trung Á. Nhƣng ngƣời

ta không hiểu hết về bệnh lao và bệnh lao còn bị nhầm lẫn với 1 số bệnh khác đặc
biệt là các bệnh ở phổi, ngƣời ta vẫn quan niệm rằng bệnh lao là bệnh di truyền và
không chữa đƣợc.
Từ năm 1819 đến năm 1865 nhiều tác giả đã đi sâu vào nghiên cứu bệnh lao.
Nhƣng mãi đến năm 1882 Robert Koch tìm ra nguyên nhân gây bệnh lao là do vi
khuẩn lao gọi là Bacillus Koch-BK. Từ đó đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn
đoán, phòng và điều trị bệnh lao [5].
Việc áp dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh nhân lao đã cứu chữa cho
hàng triệu bệnh nhân lao khỏi căn bệnh nguy hiểm này. Tuy nhiên, việc áp dụng
rộng rãi các chất kháng sinh trong chế độ hóa trị liệu đã cung cấp một áp lực chọn
lọc cho sự hình thành và phát triển của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc. Vi
khuẩn lao kháng đa thuốc hiện nay đang là mối đe dọa cho chƣơng trình kiểm soát
bệnh lao. Sự gia tăng tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao có nguyên nhân từ sự lạm
dụng các thuốc kháng sinh và sƣ thiếu các thuốc kháng sinh mới có hiệu quả.
Việt Nam hiện đang đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh lao
cao nhất thế giới. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế gới (WHO) năm 2008, tỷ lệ
bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc (kháng ít nhất với rifampicin và isoniazid) ở
nƣớc ta năm 2007 chiếm tỷ lệ 2,7% trong số bệnh nhân lao mới và 19,3% trong số
bệnh nhân lao đã điều trị trƣớc đó [28].
Bệnh lao đa kháng thuốc hiện nay là mối đe dọa nghiêm trọng trong kiểm soát
bệnh lao toàn cầu. Sự phát hiện kháng thuốc muộn dẫn đến làm chậm trong quá
trình điều trị hiệu quả là một trong những yếu tố chính góp phần vào sự bùng phát
bệnh lao đa kháng thuốc. Nghiên cứu toàn bộ hệ protein của chủng lao kháng và
nhạy cảm với thuốc cũng nhƣ sự biểu hiện ở mức độ protein của chúng trong môi
trƣờng có kháng sinh bằng phƣơng pháp phân tích protein có thể giúp đỡ trong việc
1


làm sáng tỏ hơn về cơ chế kháng thuốc và xác định đƣợc các chỉ dấu sinh học
(Biomarker) liên quan đến tính đa kháng thuốc. Các kết quả thu đƣợc sẽ vô cùng bổ

ích trong việc hỗ trợ để phát triển các loại thuốc mới và các công cụ chẩn đoán
nhanh cho lao đa kháng thuốc.
Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu,
phân tích sự biểu hiện protein cảm ứng bởi kháng sinh của chủng
Mycobacterium tuberculosis”
Mục tiêu của của đề tài:
- Thiết lập quy trình điện di hai chiều ứng dụng cho phân tách protein vi khuẩn lao
- Nghiên cứu so sánh hệ protein vi khuẩn lao nhạy và kháng thuốc; hệ protein
trước và sau cảm ứng thuốc kháng sinh

2


PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. BỆNH LAO VÀ TÁC NHÂN GÂY BỆNH
I.1. Bệnh lao
I.1.1. Lịch sử bệnh lao.
Bệnh lao phổi đƣợc quan sát thấy ở ngƣời cách đây 7000 năm. Di tích các bộ
xƣơng ngƣời cổ đại cho thấy những tổn thƣơng đặc trƣng của bệnh lao, cho thấy
bệnh này đã ảnh hƣởng lên con ngƣời khoảng 4000 năm trƣớc công nguyên và là
bệnh thuờng gặp ở Ai Cập khoảng 1000 năm trƣớc công [22].
Từ thời Hippocrates (460 – 377 trƣớc công nguyên) cho đến thế kỷ thứ XIX con
ngƣời chƣa biết nhiều về nguyên nhân gây bệnh và cho rằng bệnh lao là một căn
bệnh di truyền. Vì thế vào thời đó phƣơng pháp điều trị bệnh lao là dùng chế độ ăn
thích hợp, phƣơng pháp này do Hippocrates và Galen (130 – 200 trƣớc công
nguyên) đƣa ra là phƣơng pháp điều trị bệnh lao duy nhất thời đó cho đến thời kỳ
phục hƣng. Mãi đến thế kỷ XVII việc điều trị bệnh lao có một số thay đổi, đó là tập
thể dục và sử dụng một số chất nhƣ ký ninh, cà phê, trà và thậm chí thuốc lá là
những phƣơng pháp điều trị bệnh lao. Sự hiểu biết không đầy đủ về bệnh lao đã giải
thích vì sao bệnh lao thời đó là nỗi kinh hoàng của nhân loại. Đầu thế kỷ XIX khi

học thuyết của Braussais phát triển thì ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp trích máu để
điều trị bệnh lao và các thầy thuốc đã dùng đĩa hút máu nhƣ là một phuong pháp
điều trị bệnh lao[2].
Cho đến nửa sau của thế kỷ XIX nhờ kết quả nghiên cứu của Villemin (1865) và
đặc biệt là nghiên cứu của Robert Koch (1843 – 1910) con ngƣời mới biết đƣợc
nguyên nhân gây bệnh lao là vi khuẩn lao và từ đó đã mở ra kỷ nguyên điều trị
bệnh lao sau này[2].
Việc điều trị bệnh lao thay đổi rất nhiều khi đƣa kháng sinh vào điều trị bệnh.
Năm 1943, Streptomycin- một loại thuốc chống lao đầu tiên đƣợc đƣợc phát hiện và
sau đó là một loạt các thuốc chống lao khác ra đời đã mở ra một kỷ nguyên mới cho
chế độ điều trị bệnh lao, kỷ nguyên của thuốc kháng sinh. Việc áp dụng thuốc
3


kháng sinh trong điều trị bệnh nhân lao đã cứu chữa cho hàng triệu bệnh nhân lao
khỏi căn bệnh nguy hiểm này. Tuy nhiên, việc áp dụng rộng rãi các chất kháng sinh
trong chế độ hóa trị liệu đã cung cấp một áp lực chọn lọc cho sự hình thành và phát
triển của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc. Cùng với sự phát triển của đại dịch
HIV/AIDS, dịch tễ lao toàn cầu đã bƣớc sang một hƣớng phát triển mới gây ra
những thách thức vô cùng to lớn cho cuộc chiến chống lao toàn cầu đó là sự tƣơng
tác giữa dịch lao và đại dịch HIV/AIDS, sự phát triển của các chủng vi khuẩn lao
kháng thuốc (drug resistant tuberculosis), đa kháng thuốc (multidrug resistant
tuberculosis) và hiện nay là sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc
phổ rộng (extensive resistant tuberculosis) [20].
I.1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Bệnh lao là một trong những căn bệnh truyền nhiễm hàng đầu dẫn đến tử vong
và gây ra những hậu quả rất nặng nề cho xã hội. Theo báo cáo của trung tâm phòng
chống lao - Bộ y tế (2006), trên thế giới không có một quốc gia nào, một khu vực
nào, một dân tộc nào mà không có ngƣời mắc bệnh lao và chết do lao. Do sự phát
minh các loại thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản và hiệu quả

hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của giới y học đã làm lãng quên căn
bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch
HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên chủ yếu dẫn tới bệnh lao và tử
vong chủ yếu, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển.
Theo ƣớc tính hiện nay có khoảng 1/3 dân số thế giới hiện đạng nhiễm lao,
tƣơng đƣơng với khoảng 2,2 tỷ ngƣời đang nhiễm lao thuộc tất cả các dạng. Có tới
75% số ngƣời mắc lao nằm trong độ tuổi lao động (15 đến 54 tuổi). Mặc dù là một
dịch bệnh toàn cầu, nhƣng trong đó có 95% số trƣờng hợp mắc lao và 99% số ca tử
vong do lao xảy ra ở các nƣớc đang phát triển[11], [13], [27]. Theo thông báo của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2007, riêng trong năm 2005, trên thế giới đã có
khoảng 8,8 triệu trƣờng hợp nhiễm lao mới. Tỷ lệ ngƣời mắc lao hiện đang chiếm
2,5% số ngƣời mắc bệnh truyền nhiễm toàn cầu và là nguyên nhân phổ biến nhất
gây ra tử vong ở những ngƣời phụ nữ trẻ (số phụ nữ trẻ bị chết do lao lớn hơn cả tỷ

4


lệ tử vong của các bà mẹ do tất cả các nguyên nhân cộng lại). Hiện nay, bệnh lao
đang đƣợc xếp ở vị trí thứ 7 trong số những nguyên nhân gây tử vong toàn cầu. Nếu
không có những nỗ lực đƣợc tạo ra, vị trí này sẽ không thay đổi cho đến tận năm
2020 [12], [13], [20].
Tỷ lệ mắc bệnh lao có sự khác nhau giữa các khu vực. Châu Á (bao gồm Đông –
Nam Châu Á và Tây Thái Bình Dƣơng) chiếm 55%, khu vực Châu Phi chiếm 31%
số ca mắc lao toàn cầu. Trong số 15 quốc gia đứng đầu về tỷ lệ mắc lao mới có tới
13 quốc gia thuộc khu vực Châu Phi[29].
Bảng 1.1. Tỷ lệ mắc lao ở các khu vực năm 2007[29]
Tỷ lệ mắc lao mới

Tỷ lệ tử vong do lao

Dƣơng tính với trực
Tất cả các dạng

khuẩn lao bằng soi

Khu
vực

HIV âm tính

HIV dƣơng tính

kính
Số
lƣợng
(x1000)

Số
lƣợng/

Số lƣợng

100.000

(x1000)

dân.năm

Số lƣợng/
100.000

Số lƣợng
(x1000)

dân.năm

Số lƣợng/

Số

100.000

lƣợng

dân.năm

(x1000)

Số
lƣợng/

Lao
nhiễm
HIV (%)

100.000
dân.năm

AFR

2879

363

1188

150

375

45

378

48

38

AMR

295

32

157

17

33

3,6

7,9

0,9

11

EMR

583

105

259

47

97

17

7,7

1,4

3,5

EUR

432

49

190

21

56

6,3

8,1

0,9

9,8

SEAR

3165

181

1410

81

497

28

40

2,3

4,6

WPR

1919

108

859

48

276

16

15

0,8

2,7

9273

139

4062

61

1316

20

456

6,8

15

Toàn
cầu

Ghi chú:
AFR : Khu vực Châu Phi

AMR: Khu vực Câu Mỹ

EMR : Khu vực Đông Địa Trung Hải

EUR : Khu vực Châu Âu

SEAR : Khu vực Đông – Nam Châu Á

WPR : Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng

Vi khuẩn lao kháng đa thuốc và đặc biệt lao kết hợp với HIV đang ngày càng là
một trở ngại lớn đối với công tác phòng chống lao toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ
chức Y tế Thế giới năm 2011, trên thế giới có khoảng 650.000 các trƣờng hợp bệnh

5


lao kháng đa thuốc. TCYTTG cũng đã ƣớc tính số lƣợng bệnh nhân sẽ chết vì lao
kháng thuốc hàng năm khoảng 150.000 trƣờng hợp.
Bảng 1.2. Ƣớc tính bệnh Lao kháng đa thuốc trên toàn thế giới

Lao các thể

Lao và HIV
Lao kháng đa thuốc

Số trƣờng hợp ƣớc tính

Ƣớc tính tử vong

8,8 triệu

1,45 triệu

(8,5 – 9,2 triệu)

(1,2 – 1,6 triệu)

1,1 triệu

350.000

(1,0 – 1,2 triệu)

(320.000 – 390.000)

650.000
(460.000 – 870.000 )

150.000

Nếu nhƣ so sánh với các báo cáo kháng thuốc trƣớc đây, bệnh lao kháng thuốc
nói chung và bệnh lao kháng đa thuốc nói riêng đã gia tăng trên bình diện toàn cầu.
Báo cáo ƣớc tính bệnh lao kháng đa thuốc năm 2004 là 424.203 trƣờng hợp và gia
tăng đến năm 2007 là 511.000 và đến năm 2011 trên toàn thế giới có khoảng
650.000 bệnh nhân lao kháng đa thuốc.
Theo báo cáo của TCYTTG, số lƣợng bệnh Lao kháng đa thuốc cao nhất là khu
vực Tây Thái Bình Dƣơng chiếm tỷ lệ 1/3 trên toàn cầu (năm 2004). Khu vực cao
kế tiếp là Đông Nam Á và sau đó là khu vực Đông Âu và Châu Phi[2].
I.1.3. Tình hình bệnh lao ở Việ Nam
Bệnh lao ở nƣớc ta còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao với vị trí thứ 13
trong 22 nƣớc có số bệnh lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004). Trong khu vực
Tây Thái Bình Dƣơng , Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippin về số
lƣợng bệnh nhân lao lƣu hành cũng nhƣ số lƣợng bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng
năm [1].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế gới năm 2007, Việt Nam có tổng số
192.000 trƣờng hợp mắc lao ở tất cả các dạng chiếm tỷ lệ 220 trƣờng hợp/100.000
dân, trong đó bệnh nhân lao mới chiếm tỷ lệ 171 trƣờng hợp/100.000 dân. Số bệnh

nhân mắc lao mới với AFB theo phƣơng pháp soi kính trực tiếp là 66.000 trƣờng
6


hợp chiếm tỷ lệ 76 trƣờng hợp/100.000 dân. Tỷ lệ tử vong do lao năm 2007 là
24/100.000 dân [29].
Hiện trạng mắc lao đồng thời với nhiễm HIV đang là một trở ngại lớn ở nƣớc ta,
một quốc gia có số ngƣời nhiễm HIV đang tăng. Theo công bố của WHO, số trƣờng
hợp mắc lao dƣơng tính với HIV ở nƣớc ta năm 2007 chiếm tỷ lệ 8,1% trong đó có
15.000 trƣờng hợp là lao mới, tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân mắc lao đồng thời
nhiễm HIV chiếm 3,5% tổng số ca tử vong do lao[29]. Tỷ lệ mắc lao dƣơng tính với
HIV và tỷ lệ tử vong do lao trong các năm 2005, 2006 và 2007 ở nƣớc ta đƣợc thể
hiện trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Tỷ lệ mắc lao và tỷ lệ tử vong do lao ở Việt Nam qua các năm
Năm

2005 [30]

2006 [31]

2007[29]

Tỷ lệ mắc lao mới (số lƣợng/100.000 dân)

175

173

171

Tỷ lệ mắc lao dƣơng tính với HIV (%)

3,0

5,0

8,0

Tỷ lệ tử vong do lao (số lƣợng/100.000

23

23

24

2,3

2,7

2,7

dân)
Tỷ lệ mắc lao mới đa kháng thuốc (%)

Từ năm 1994 – 1997, TCYTTG phối hợp với Hiệp hội Lao và Bệnh phổi Quốc
tế tiến hành nghiên cứu có quy mô rất lớn về kháng thuốc lao trên tòa thế giới,
nghiên cứu thực hiện ở 35 nƣớc đại diện cho 216 quốc gia trên toàn thế giới trong
đó có Việt Nam và kết quả cho thấy tình hình kháng thuốc lao tại Việt Nam có
chiều hƣớng gia tăng, tỷ lệ lao đa kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi mới năm 1997

là 2,3% và gia tăng đến 3,8% năm 2000 [2].
Theo báo cáo lần thứ nhất của TCYTTG năm 1997, tỷ lệ bệnh nhân mắc lao
kháng thuốc ở nƣớc ta khá cao so với 35 nƣớc và khu vực đƣợc nghiên cứu. Tỷ lệ
bệnh nhân mắc lao kháng thuốc là 32,5%, chỉ đứng sau Thái Lan (36,6%), Latvia
(34%) và Cộng hòa Diminica (40,6%). Tỷ lệ mắc lao đa kháng thuốc là 2,3%[25].
Theo công bố của WHO năm 2008, trong tổng số 1619 bệnh nhân lao mới đƣợc
phát hiện năm 2006, tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong một số bệnh nhân lao mới và

7


bệnh nhân lao đã điều trị lần lƣợt là 19,3% và 2,7% [28]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc lao
kháng thuốc ở Việt nam năm 2006 đƣợc trình bày trong bảng 1.4 dƣới đây.
Bảng 1.4. Tỷ lệ mắc lao kháng thuốc ở Việt Nam năm 2006 [28]
Loại kháng thuốc

Bệnh nhân mới

Bệnh nhân lao đã điều trị

Số lƣợng

Tỷ lệ %

Số lƣợng

Tỷ lệ %

497

30,7

122

58,9

Kháng INH

310

19,1

90

43,5

Kháng RIF

53

3,3

44

21,3

Kháng EMB

42

2,6

30

14,5

Kháng SM

375

23,2

105

50,7

Kháng đơn thuốc

291

18,0

38

18,4

Kháng đơn INH

114

7,0

8

3,9

Kháng đơn RIF

5

0,3

2

1,0

Kháng đơn EMP

3

0,2

2

1,0

Kháng đơn SM

169

10,4

26

12,6

Kháng nhiều thuốc

162

10,0

44

21,3

Kháng đa thuốc

44

2,7

40

19,3

Kháng bất kỳ

I.1.4. Các dạng bệnh lao
Bệnh lao là một căn bệnh có tính chất lây lan truyền nhiễm, nhƣng rất khó để

trực khuẩn lao xâm chiếm toàn bộ cơ thể và tạo nên dạng bệnh hoạt động. Sự nhiễm
trùng ban đầu của trực khuẩn lao là sự khởi đầu của tất cả các dạng bệnh lao. Sau sự
nhiễm trùng ban đầu, vi khuẩn lao có thể bị tiêu diệt hoặc tiếp tục tiến triển hình
thành dạng bệnh tiềm tàng, dạng tiến triển, dạng hoạt động hoặc tái phát lặp lại phụ
thuộc vào mối tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh, cơ thể chủ và môi trƣờng. Trong
phần lớn những ngƣời bị nhiễm lao, giữa cơ thể chủ và vi khuẩn gây bệnh có một sự
tồn tại ở trạng thái cân bằng. Nếu tính kháng tự nhiên của cơ thể chủ cao, độc lực
của vi khuẩn lao thấp, số lƣợng đơn vị nhiễm là nhỏ và các điều kiện môi trƣờng
không thuận lợi, bệnh lao không tiến triển thành dạng hoạt động. Ngƣợc lại, nếu
8


trực khuẩn lao nhân lên nhanh chóng, bệnh sẽ phát triển. Sức đề kháng của cơ thể
chủ là hàng rào bảo vệ hữu hiệu nhất giúp cơ thể chống lại sự nhiễm trùng lao.
Bệnh lao có thể đƣợc phân loại theo các cách khác nhau. Dựa vào biểu hiện của
bệnh, có thể chia bệnh lao thành 2 dạng chính là dạng bệnh tiềm ẩn và dạng bệnh
hoạt động [20].
• Bệnh lao dạng tiềm ẩn (latent tuberculosis hay latent tuberculosis infection) là
dạng một bệnh nhân bị nhiễm Mycobacterium tuberculosis nhƣng không có sự biểu
hiện của bệnh. Các bệnh nhân bị bệnh lao dạng nhiễm trùng tiềm ẩn không có khả
năng lây nhiễm sang ngƣời khác. Theo ƣớc tính, khoảng 10% số bệnh nhân nhiễm
lao dạng tiềm ẩn sẽ tiếp tục phát triển trở thành dạng bệnh hoạt động vì vậy việc
chẩn đoán đúng và điều trị những bệnh nhân này là một phần quan trọng của việc
kiểm soát bệnh lao.
• Bệnh lao dạng hoạt động (active tuberculosis) là dạng bệnh lao đã biểu hiện
thành các triệu chứng bệnh lý và lâm sàng. Các triệu chứng lâm sàng có thể gặp ở
bệnh nhân lao dạng hoạt động bao gồm mệt mỏi hoặc sức khoẻ yếu, giảm cân, chán
ăn, xuất hiện cảm giác ớn lạnh, sốt, đổ mồ hôi về đêm,… Những bệnh nhân lao
dạng hoạt động rất dễ lây lan nguồn bệnh cho ngƣời khác.
Dựa vào bộ phận của cơ thể bị nhiễm lao, bệnh lao có thể đƣợc chia thành

những dạng lao phổi và lao ngoài phổi. Lao phổi là dạng bệnh phổ biến nhất, chiếm
khoảng 80-85% các dạng bệnh lao. Lao ngoài phổi bao gồm lao xƣơng, lao màng
não, lao ruột... [34].
I. 2. Tác nhân gây bệnh lao
I.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao Mycobacterium Tuberculosis
I.2.1.1. Đặc điểm hình thái
Dƣới kính hiển vi quang học, các trực khuẩn lao có hình thái là các trực khuẩn
thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài trung bình từ 1-10 µm (thƣờng là 3-5 µm), rộng
từ 0,2-0,6 µm. Tuỳ theo điều kiện sinh trƣởng, trực khuẩn có thể thay đổi về kích
thƣớc và hình dạng từ cầu trực khuẩn (coccobacilli) tới các trực khuẩn dài. M.

9


tuberculosis đƣợc xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dƣơng. Tuy nhiên khi tiến hành
nhuộm Gram chúng bắt màu thuốc nhuộm rất yếu hoặc không giữ đƣợc màu thuốc
nhuộm do có chứa hàm lƣợng lipid và axit mycolic cao trong thành tế bào [20].

Hình 1.1. Hình thái tế bào M. tuberculosis dƣới kính hiển vi điện tử
Khuẩn lạc của của vi khuẩn lao trên môi trƣờng thạch có dạng không đều, bề
mặt có dạng nhƣ sáp và có mầu da bò không đều. Trong khuẩn lạc, các vi khuẩn lao
chồng chất lên nhau tạo nên các khối cục hoặc có dạng dãy nhấp nhô [20].

Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc của M. tuberculosis trên môi trƣờng thạch
I.2.1.2. Đặc điểm hóa sinh
M. tuberculosis đƣợc coi là một loài vi khuẩn rất hiếu khí.Tuy nhiên, trong cơ
thể, trực khuẩn lao cũng có thể tiến hành trao đổi chất kị khí bằng sự biến đổi
10

enzyme. Trong điều kiện thiếu oxy nhƣ trong các nốt vôi hoá, cục xơ hoá, các cục
bã đậu rắn chắc trực khuẩn lao tồn tại ở trạng thái không hoạt động (trạng thái ngủ)
rất nhiều năm. Vi khuẩn lao có khả năng kháng lại các chất gây khô và hầu hết các
chất tẩy trùng ngoại trừ formaldehyde và glutaraldehyde. Chúng cũng kháng mạnh
với các axít hữu cơ phân cực và các dung môi kiềm .
M. tuberculosis là các loài mẫn cảm với nhiệt độ và tia UV, chúng bị chết nếu bị
phơi nắng 2 giờ. Tuy nhiên, trong các mẫu đờm chúng có thể tồn tại đƣợc 20 đến 30
giờ phơi nắng .
Vi khuẩn lao thƣờng đƣợc nuôi cấy từ các vật liệu lâm sàng bằng cách nuôi ủ
trên môi trƣờng thạch giàu dinh dƣỡng chứa albumin huyết thanh bò, môi trƣờng
dinh dƣỡng hỗn hợp nhƣ môi trƣờng Lowenstein-Jensen hay Middebrook, chúng
cũng có thể sinh trƣởng trên môi trƣờng hoá học xác định có chứa asparagines,
glycerol và các chất khoáng vi lƣợng.
Điều kiện tối ƣu cho sự sinh trƣởng là 370C , pH 6.0-7.6, pO2 là 100 mmHg và
pCO2 là 40 mmHg trong các tổ chức mô .
M. tuberculosis có tốc độ sinh trƣởng rất chậm, thời gian của một thế hệ là
khoảng 18 giờ, trên môi trƣờng thạch Lowenstein-Jensen, có thể quan sát đƣợc
khuẩn lạc sau 3 đến 8 tuần nuôi cấy [20] .
I.2.2. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh của vi khuẩn lao Mycobacterium Tuberculosis
Vi khuẩn lao Mycobacterium Tuberculosis vào cơ thể qua đƣờng hô hấp là phổ
biến nhất. Bệnh nhân lao phổi ho (hoặc hắt hơi) bắn ra các hạt rất nhỏ lơ lửng trong
không khí . Vi khuẩn lao tồn tại trong các hạt khí dung ngoài không khí. Khi đƣợc
hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi đến phế nang. Tại đây,vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị
ức chế tùy thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2 – 10
tuần, các đại thực bào đƣợc hoạt hóa,bao quanh vi khuẩn tạo lên lớp vỏ cứng giúp
kìm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của
cơ thể không thể kiểm soát đƣợc vi khuẩn,vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có
thể theo đƣờng máu và đƣờng bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhƣ phổi,
thận, não, xƣơng …(giai đoạn lao bệnh).

11


Trong lao màng não, trực khuẩn lao theo đƣờng máu đến màng não. Sau giai
đoạn tiềm tàng, yên lặng trong nhiều tuần, nhiều tháng hoặc nhiều năm, trực khuẩn
lao phát triển thành các hạt lao, củ lao. Khi có kích thích nhƣ kích thích do chấn
thƣơng, tình trạng miễn dịch thay đổi, trực khuẩn lao và các kháng nguyên chứa
trong các củ lao đƣợc giải phóng vào các khoang màng não gây bệnh[35].

Hình 1.3. Sơ đồ truyền bệnh lao từ ngƣời lớn sang trẻ em bằng đƣờng hô hấp
II. VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT
HIỆN
II.1. Các dạng vi khuẩn lao kháng thuốc [25], [26]
Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đƣợc định nghĩa là sự giảm mức độ mẫn cảm
của M.tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự khác biệt với các chủng dại
chƣa bao giờ tiếp xúc với thuốc chống lao . Dựa vào số lƣợng thuốc mà chủng vi
khuẩn lao kháng, tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đƣợc chia thành:
+ Kháng đơn thuốc (monoresistance) đƣợc sử dụng khi một chủng vi khuẩn lao
kháng lại chỉ 1 trong các thuốc chống lao .
+ Kháng nhiều thuốc (polyresistance) đƣợc sử dụng để nói đến một chủng kháng
lại nhiều hơn một thuốc chống lao .

12


+ Kháng đa thuốc (multidrug – resistance: MDR): đƣợc định nghĩa là sự kháng
lại đồng thời ít nhất với isoniazid và rifampicin, hai loại thuốc đƣợc sử dụng phổ
biến nhất trong hóa trị liệu bệnh lao .
+ Kháng thuốc phổ rộng (extensively drug – resistance: XDR): đƣợc định nghĩa
là kháng đồng thời hai loại thuốc chống lao hàng một là isoniazid và rifampicin và

kháng với bất kỳ một loại thuốc nào thuộc họ quinolone và ít nhất với một trong các
thuốc kháng sinh thế hệ 2 là kanamycin, capreomycin hoặc amikacin dạng tiêm .
II.2.Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là một sự khuếch đại nhân tạo của một hiện
tƣợng tự nhiên liên quan đến sự phát sinh các đột biến một cách ngẫu nhiên ở các
gen nằm trong vùng nhân của tế bào vi khuẩn.

Hình 1.4. Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao
Trong quá trình nhân lên của vi khuẩn lao đã xuất hiện đột biến gen ngẫu nhiên
của vi khuẩn, những gen này mã cho cho việc tổng hợp protein ( hoặc enzym) giúp
cho hoạt động chuyển hóa bình thƣờng của vi khuẩn. Các protein hoặc enzym này
là mục tiêu tấn công của các thuốc chống lao. Khi có hiện tƣợng đột biến gen này

13


xảy ra thì chúng không đƣợc tổng hợp nữa hoặc bị biến thể nên các thuốc chống lao
không còn tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn. Trong môi trƣờng không
có kháng sinh, các vi khuẩn lao kháng thuốc bị lấn át bởi các vi khuẩn lao nhạy
cảm. Nhƣng khi điều trị đơn trị hoặc không đúng phác đồ chỉ những vi khuẩn nhạy
cảm bị tiêu diệt, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc phát triển và trơ thành chủ
yếu, chiếm đa số và gây ra đột biến kháng thuốc mắc phải. Hiện tƣợng đột biến
kháng thuốc lao xảy ra ngẫu nhiên với tần suất nhất định: Với RMP là 10-10 , với
INH xấp xỉ 10-7 - 10-9 . Trong hang lao có đƣờng kính lớn hơn 2cm quần thể vi
khuẩn thƣờng lớn hơn 107, nhƣ vậy sẽ có khả năng một hoặc một số cá thể đột biến
đề kháng với một thuốc này hoặc một thuốc khác. Kháng đa thuốc ngẫu nhiên gần
nhƣ không thể vì không có gen đa hiệu, nghĩa là một gen quy định kháng đa thuốc
và đột biến các tuốc khác nhau là những đột biến độc lập. Kháng INH và kháng
RMP là kết quả của hai đột biến độc lập nên sẽ có tần số là tích của hai đột biến đơn
độc nên có tỷ lệ rất thấp. Trên thực tế trong quần thể vi khuẩn kháng INH có thể

xảy ra đột biến kháng RMP khi điều trị bằng INH+RMP sẽ chọn lọc ra các cá thể
kháng cả hai thuốc này. Quá trình tƣơng tự cũng có thể xảy ra với sự phối hợp các
thuốc khác và có thể dẫn đến kháng tất cả các thuốc chống lao [3].

14


Bảng 1.5. Bảng tóm tắt cơ chế kháng thuốc lao mức độ phân tử
Thuốc

Gen đột

Chức năng gen

Cơ chế hoạt động

TSĐB

biến
Isoniazid (1952)

Rifampicin (1966)

(%)

katG

Catalase-peroxidase

inhA

Enoyl ACP reductase

rpoB

β subunit of RNA polymerase

Ức chế tổng hợp axit
mocolic
Ức chế tổng hợp RNA

50–95
8–43
95

Pyrazinamide (1952) pncA

Nicotinamidase/pyrazinamidase Phá vỡ liên kết của ATP

72-97

Ethambutol (1961)

Chuyến hóa Arabinosyl

47-65

embB

Ức chế sự tổng hợp

arabinogalactan (thành tb)

Streptomycin (1944) rpsL

S12 ribosomal protein

Ức chế tổng hợp protein

52-59

rrs

16S rRNA

8-21

gidB

rRNA methyltransferas

?

(G527 in 530 loop)
Amikacin/kanamycin rrs

16S rRNA

(1957)

16S rRNA

Capreomycin (1960) tlyA

2’-O-methyltransferase

Quinolones (1963)

gyrA

DNA gyrase A

gyrB

DNA gyrase B

Ức chế tổng hợp protein

76

Ức chế DNA gyrase

75-94

Ethionamide (1956)

etaA/ethA Flavin monooxygenase

Ức tổng hợp axit mycolic

37

PAS (1946)

inhA

Ức chuyển hóa axit folic

56

thyA

Tổng hợp Thymiylate

15

và iron?

36


II.3. Các phƣơng pháp xác định vi khuẩn lao kháng thuốc.
II.3.1. Phương pháp kiểu hình
II.3.1.1. Các phương pháp nuôi cấy truyền thống
Trong các phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống, vi khuẩn lao đƣợc nuôi cấy trên môi
trƣờng thạch chứa thuốc chống lao. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn đƣợc đánh giá
thông qua số khuẩn lạc sinh trƣởng trên môi trƣờng nuôi cấy.
 Phương pháp tỷ lệ (Proportion method)
Trong phƣơng pháp này, chủng vi khuẩn lao đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa
thuốc chống lao và môi trƣờng đối chứng không chứa thuốc chống lao với nồng độ nhƣ
nhau. Sau 28 ngày nuôi ở 370C, tiến hành kiểm tra kết quả lần đầu. Nếu tỉ lệ giữa số

khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng chứa chất chống lao so với những khuẩn lạc phát
triển trên môi trƣờng kiểm chứng lớn hơn 1% (đối với isoniazid, rifampicin và axit pra
– aminosalycilic) hoặc hơn 10% (đối với các thuốc chống lao khác) thì chủng đó đƣợc
kết luận là kháng thuốc, sau 42 ngày nuôi cấy đếm lại số khuẩn lạc để đánh giá các
chủng mẫn cảm thuốc chống lao [15], [20], [25]. .
 Phương pháp tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu (resistance ratio method)
Để tiến hành kiểm tra tính kháng thuốc, hai hệ thống môi trƣờng nuôi cấy đƣợc
chuẩn bị với hàm lƣợng thuốc chống lao cách nhau hai lần. Hệ thống thứ nhất đƣợc bổ
sung chủng vi khuẩn lao cần kiểm tra và hệ thống môi trƣờng thứ hai đƣợc bổ sung
chủng M.tuberculosis H37Rv với lƣợng nuôi cấy tƣơng đƣơng. Nồng độ ức chế tối
thiểu của thuốc chống lao (MIC) đƣợc xác định sau 4 tuần nuôi ủ ở 370C. MIC của
thuốc là nồng độ thuốc chống lao thấp nhất trong môi trƣờng mà số khuẩn lạc vi khuẩn
lao phát triển thấp hơn 20. Nếu tỷ lệ giữa MIC của chủng đƣợc kiểm tra so với MIC
của chủng chuẩn M.tuberculosis H37Rv nhỏ hơn 2 thì kết luận là chủng mẫn cảm, nếu
lớn hơn hoặc bằng 8 thì kết luận là chủng kháng thuốc[15], [20], [25].
 Phương pháp nồng độ tới hạn (absolute concentration method)
16