Phân lập và tuyển chọn chủng sinh vật tổng hợp enzyme endocellulase ứng dụng trong khâu nghiền bột giấy

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô đã tận tình
giảng dạy tôi trong khóa học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Tô
Kim Anh và TS Phạm Tuấn Anh là hai thầy cô đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều
kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm
Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi trong quá trình nghiên
cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Hoàng Nam, ThS Lê Tuân, KS
Nguyễn Khoa Đăng đã luôn giúp đỡ ủng hộ tôi trong thời gian nghiên cứu tại phòng
thí nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân trong gia đình đã luôn
là điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã cộng
tác giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn thạc sỹ.
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2013
Học viên

Phạm Khánh Dung

i
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả số liệu nghiên cứu đề tài là hoàn toàn trung thực. Các
thí nghiệm đƣợc tiến hành một cách nghiêm túc trong quá trình nghiên cứu, không
có sự sao chép từ bất kỳ tài liệu khoa học nào.
Học viên

Phạm Khánh Dung

ii
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................x
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................... xi
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ xiii
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................1
1.1.

Công nghệ sản xuất giấy................................................................................1

1.1.1.

Sơ lƣợc về ngành công ngiệp giấy ..........................................................1

1.1.2.

Nguyên liệu sản xuất giấy.......................................................................1

1.1.2.1.

Cellulose...........................................................................................3

1.1.2.2.

Hemicellulose...................................................................................5

1.1.2.3.

Lignin ...............................................................................................7

1.1.3.

Quy trình sản xuất bột giấy .....................................................................9

1.1.4.

Quy trình nghiền bột giấy .....................................................................11

1.2.

Hệ enzyme ứng dụng trong nghiền giấy[9] .................................................12

1.2.1.

Hệ enzyme thủy phân cellulose ............................................................13

1.2.2.

Hệ enzyme phân hủy hemicelluloses ....................................................15

1.3.

Enzyme Endo-β-1,4-glucanases ..................................................................18

1.3.1.

Nguồn gốc .............................................................................................18

1.3.2.

Cấu tạo ..................................................................................................19

1.3.3.

Tính chất hóa lý ....................................................................................20

1.3.3.1.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ .................................................................20

1.3.3.2.

Ảnh hƣởng của pH .........................................................................20

1.3.3.3.

Ảnh hƣởng của ion kim loại...........................................................20

1.3.3.4.

Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ...................................................21

1.3.4.

Cơ chế xúc tác của Endo-β-1,4-glucanases ..........................................21

iii
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

1.3.5. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp endoβ-1,4-glucanase...................................................................................................22

1.4.

1.3.5.1.

Nguồn carbon .................................................................................22

1.3.5.2.

Nguồn nitrogen ..............................................................................23

1.3.5.3.

Nhiệt độ nuôi cấy ...........................................................................23

1.3.5.4.

pH môi trƣờng nuôi cấy .................................................................23

Ứng dụng của enzyme trong sản xuất nghiền .............................................23

1.4.1.

Giảm năng lƣợng cần thiết cho quá trình nghiền..................................24

1.4.2.

Giảm thời gian nghiền ..........................................................................24

1.4.3.

Làm thay đổi một số thuộc tính của xơ sợi, bột giấy và giấy ...............24

1.5.

Nâng cao khả năng tổng hợp enzym nhờ đột biến ......................................25

1.5.1.

Tác động của tia tử ngoại ......................................................................26

1.5.2.

Các tác nhân gây đột biến hóa chất ......................................................28

1.6.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .................................................29

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .....................................................31
2.1.

Vật liệu-hóa chất ..........................................................................................31

2.1.1.

Nguyên vật liệu .....................................................................................31

2.1.2.

Dụng cụ và hóa chất..............................................................................31

2.2.

2.1.2.1.

Dụng cụ ..........................................................................................31

2.1.2.2.

Hóa chất và môi trƣờng..................................................................32

Phƣơng pháp ................................................................................................35

2.2.1.

Phƣơng pháp phân lập ..........................................................................35

2.2.1.1.

Nguyên tắc .....................................................................................35

2.2.1.2.

Môi trƣờng .....................................................................................35

2.2.1.3.

Cách tiến hành ................................................................................35

2.2.2.

Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu ........35

2.2.3. Phƣơng pháp định tính hoạt tính enzyme thông qua xác định vòng thủy
phân [3]36

2.2.3.1.

Nguyên tắc .....................................................................................36

2.2.3.2.

Cách tiến hành ................................................................................37
iv

Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

2.2.4.

Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng thuốc thử DNS [36]
37

2.2.4.1.

Nguyên tắc .....................................................................................37

2.2.4.2.

Xây dựng đƣờng chuẩn ..................................................................37

2.2.4.3.

Xác định hoạt độ enzyme endoglucanase ......................................38

a. Nguyên tắc: ...........................................................................................39
b. Tiến hành ..............................................................................................39
2.2.5.

Định tên vi sinh vật ...............................................................................40

2.2.5.1.

Định tên hình thái ...........................................................................40

2.2.5.2.

Định tên sinh học phân tử. .............................................................40

2.2.6. Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme endo-glucanase...............................................................................42
2.2.6.1.

Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất ......................................42

2.2.6.2.

Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................42

2.2.6.3.

Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ...................................43

2.2.6.4.

Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ .......................................43

a. Ảnh hƣởng của nitơ hữu cơ ..................................................................43
b. Ảnh hƣởng của nitơ vô cơ ....................................................................43
2.2.7.

Phƣơng pháp đột biến chủng nấm mốc ................................................44

2.2.7.1.

Nguyên tắc .....................................................................................44

2.2.7.2.

Tiến hành........................................................................................44

2.2.8.

Tuyển chọn chủng đột biến thu đƣợc ...................................................45

2.2.8.1.

Nguyên tắc .....................................................................................45

2.2.8.2.

Phƣơng pháp ..................................................................................45

a. Tuyển chọn sơ bộ dựa vào vòng thủy phân với thuốc thử lugol ..........45
b. Tuyển chọn dựa vào hoạt độ enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ các
chủng đột biến .............................................................................................45
2.2.9.
biến

Khảo sát đặc tính của enzyme thu đƣợc từ chủng tự nhiên và chủng đột
46

2.2.9.1.

Khảo sát độ bền nhiệt độ và bền pH của enzyme endo-glucanase 46

v
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

2.2.9.2.

Khảo sát nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu của enzyme endo-glucanase
46
Tủa cồn 70 độ ....................................................................................47

2.2.10.

2.2.10.1. Nguyên tắc .....................................................................................47
2.2.10.2. Tiến hành........................................................................................47
2.2.11.

Tủa muối amoni sulfate (NH4)2SO4 ..................................................47

2.2.11.1. Nguyên tắc .....................................................................................47
2.2.11.2. Tiến hành........................................................................................48
2.2.12.

Lọc dòng ngang (Cross-Flow Filtration) ...........................................48

2.2.12.1. Nguyên tắc .....................................................................................48
2.2.12.2. Tiến hành........................................................................................49
Sấy đông khô .....................................................................................49

2.2.13.

2.2.13.1. Nguyên tắc .....................................................................................49
2.2.13.2. Tiến hành........................................................................................50
2.2.14.

Bảo quản lỏng ...................................................................................51

2.2.15.

Điện đi protein trên gel polyacrylamide ............................................51

2.2.15.1. Điện di biến tính ( SDS-PAGE) .....................................................51
a. Nguyên tắc ............................................................................................51

b. Chuẩn bị ................................................................................................52
a. Tiến hành ..............................................................................................53
2.2.15.2. Điện di không biến tính ( Zymogram) ...........................................54
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................57
3.1.

Kết quả phân lập ..........................................................................................57

3.2.

Kết quả tuyển chọn ......................................................................................58

3.2.1.

Kết quả tuyển thông qua xác định vòng thủy phân ..............................58

3.2.2. Kết quả tuyển chọn thong qua xác định hoạt độ enzyme endoglucanase bằng phƣơng pháp DNS ....................................................................60
3.2.3.

Định tên chủng ......................................................................................61

3.2.3.1.

Định tên hình thái ...........................................................................61

3.2.3.2.

Định tên bằng sinh học phân tử .....................................................62
vi

Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của
chủng R22-20 .........................................................................................................63
3.3.1.

Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất ...........................................................63

3.3.2.

Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng .............................................................64

3.3.3.

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ........................................................65

3.4.

Nâng cao khả năng tổng hợp enzyme của chủng tự nhiên nhờ đột biến .....65

3.5.

Tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng đột biến UV13 ........................................67

3.5.1.

Ảnh hƣởng nồng độ nitơ hữu cơ ...........................................................67

3.5.2.

Ảnh hƣởng nồng độ nitơ vô cơ .............................................................68

3.5.3.
nuôi

Hoạt độ enzyme endo-glucanase của chủng đột biến UV13 theo ngày
69

3.6.

Đặc tính của enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ chủng đột biến .............70

3.6.1.

Nhiệt độ tối ƣu ......................................................................................70

3.6.2.

pH tối ƣu ...............................................................................................71

3.6.3.

Bền nhiệt độ ..........................................................................................72

3.6.4.

Bền pH ..................................................................................................74

3.7.

Điện di .........................................................................................................75

3.8.

Thu enzyme kỹ thuật ...................................................................................75

3.9.

Bảo quản enzyme.........................................................................................77
KẾT LUẬN ..............................................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................79

vii
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1: Thành phần cấu trúc lignocellulose

2

2

Hình 1.2: Công thức hóa học của cellulose

4

3

Hình 1.3: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập

4

4

Hình 1.4: Công thức hóa học của hemicellulose

6

5

Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin

7

6

Hình 1.6: Các liên kết giữa lignin và polysaccarid

9

7

Hình 1.7: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose

14

8

Hình 1.8: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân

16

giải xylan. Ac: nhóm acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-OMe-GlcA: α-4-O-methylglucuronic acid. (B) Thủy phân các
xylooligosaccharide bởi enzyme β-xylosidase
9

Hình 1.9: Cấu trúc không gian của endoglucanase

19

10

Hình 1.10: Cơ chế xúc tác của enzyme endo-glucanase

22

11

Hình 1.11: Ảnh hƣởng của tia UV

27

12

Hình 3.1 : Hình ảnh một số chủng phân lập từ rơm

58

13

Hình 3.2 : Hình ảnh kết quả tuyển chọn bằng nhỏ lugol

59

14

Hình 3.3: Khuẩn lạc của: Aspergillus fumigatus Fresenius

62

viii

Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

15

Hình 3.4: Đầu sinh bào tử trần của Aspergillus fumigatus

62

Fresenius (X1000)
16

Hình 3.5: Hình ảnh lựa chọn sơ bộ trên môi trƣờng CMC và tỷ

66

lệ vòng thủy phân

ix
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG

STT

Tên bảng

1

Bảng 1.1 Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocelluloses

3

2

Bảng 1.2: Các enzyme phân hủy cellulose

13

3

Bảng 3.1 : Số chủng phân lập từ rơm

57

4

Bảng 3.2: Tổng hợp tỷ lệ vòng thủy phân của các chủng đột biến 65

Trang

so với chủng gốc

x
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

STT

Tên

Trang

1

Biểu đồ 3.1 :Biểu đồ kết quả đo vòng thủy phân

59

2

Biểu đồ 3.2: Hoạt độ enzyme endo-glucanase của các chủng

60

nấm
3

Biểu đồ 3.3 : Biểu đồ khảo sát nồng độ CMC

63

4

Biểu đồ 3.4: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng

64

5

Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy

65

6

Biểu đồ 3.6: % Hoạt độ enzyme của chủng đột biến so với

67

chủng R22-20
6

Biểu đồ 3.7: Ảnh hƣởng của Nitơ hữu cơ

68

7

Biểu đồ 3.8: Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ vô cơ

69

8

Biểu đồ 3.9: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ

70

enzyme endo-glucanase của chủng đột biến UV13
9

Biểu đồ 3.10: Nhiệt độ tối ƣu của endo-glucanase từ chủng

71

UV13
10

Biểu đồ 3.11: pH tối ƣu của endo-glucanase từ chủng UV13

72

11

Biểu đồ 3.12: Khả năng bền trong các nhiệt độ khác nhau của

73

endo-glucanase từ chủng UV13
12

Biểu đồ 3.13: Khả năng bền trong các pH khác nhau của endo-

74

xi
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

glucanase từ chủng UV13
13

Biểu đồ 3.14: Độ bền pH của 2 enzyme endo-glucanase từ 2

75

chủng UV13 và R22-20 (tại thời điểm sau 5h ủ)
14

Biểu đồ 3.15: Hiệu suất thu hồi enzyme bằng các phƣơng pháp

76

khác nhau
15

Biểu đồ 3.16: Hiệu suất sấy đông khô enzyme với chất mang

77

Magnesi Stearat

xii
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

ĐẶT VẤN ĐỀ
Giấy đóng vai trò rất quan trọng và góp phần thúc đẩy các nền kinh tế khác
phát triển. Trong công nghiệp bột giấy và giấy, chi phí năng lƣợng chiếm tới
25% tổng chi phí sản xuất loại bột giấy trong đó năng lƣợng sử dụng cho quá
trình nghiền bột giấy chiếm khoảng 15-18% tổng năng lƣợng cần thiết. Việc sử
dụng enzyme nhƣ một phƣơng thức để thay đổi thuộc tính của xơ sợi nhằm cải
thiện khả năng nghiền của bột giấy đã đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và đi
sâu nghiên cứu. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tiền hành nghiên cứu về
enzyme endo-glucanase với đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng sinh vật
tổng hợp enzyme endocellulase ứng dụng trong khâu nghiền bột giấy”.

Nội dung nghiên cứu:
-

Phân lập chủng vi sinh vật từ các mẫu rơm.

-

Tuyển chọn chủng vi sinh vật cho hoạt độ enzyme endo-glucanase cao nhất.

-

Định tên chủng.

-

Nâng cao khả năng sinh enzyme endo-glucanase của chủng tự nhiên bằng
phƣơng pháp đột biến tia UV.

-

Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp enzyme của chủng đột biến.

-

Khảo sát đăc tính enzyme của chủng đột biến: bền nhiệt độ, bền pH và nhiệt
độ và pH phản ứng tối ƣu.

-

Thu chế phẩm enzyme kỹ thuật.

-

Bảo quản enzyme.

xiii
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

CHƢƠNG 1:
1.1.

TỔNG QUAN

Công nghệ sản xuất giấy

1.1.1. Sơ lược về ngành công ngiệp giấy
Ngành giấy là một trong những ngành đƣợc hình thành từ rất sớm tại việt
nam, khoảng năm 284. Từ giai đoạn này đến đầu thế kỷ 20, giấy đƣợc làm bằng
phƣơng pháp thủ công để phục vụ cho việc ghi chép, làm tranh dân gian vàng mã…
Năm 1912, nhà máy sản xuất bột giấy đầu tiên bằng phƣơng pháp công nghiệp đi
vào hoạt động với công 4.000 tấn/năm tại Việt Trì. Trong thập niên 1960, nhiều nhà
máy giấy đƣợc đầu tƣ xậy dựng nhƣng hầu hết đều có công suất nhỏ (dƣới 20.000
tấn/năm) nhƣ nhà máy giấy Việt Trì, nhà máy bột giấy Văn Điển, nhà máy giấy
Đồng Nai, nhà máy giấy Tân Mai vv… Năm 1975, tổng công xuất thiết kế của
ngành giấy Việt Nam là 72.000 tấn/năm nhƣng do ảnh hƣởng của chiến tranh và

mất cân đối giữa sản lƣợng bột giấy và giấy nên sản lƣợng thực tế chỉ đạt 28.000
tấn/năm.
Năm 1982, nhà máy giấy Bãi Bằng do Chính Phủ Thụy Điển tài trợ đã đi vào
sản xuất với công suất thiết kế là 53.000 tấn bột giấy/năm và 55.000 tấn giấy/năm,
dây truyền sản xuât khép kín, sử dụng công nghệ cơ-lý và tự động hóa. Nhà máy
cũng xây dựng đƣợc vùng nguyên liệu.cơ sở hạ tầng, cơ sở phụ trợ nghƣ điện, hóa
chất và trƣờng đào tạo nghề phục vụ cho hoạt động sản xuất.
Ngành giấy có những bƣớc phát triển vƣợt bậc, sản lƣợng giấy tăng rtung
bình 11%/năm trong giai đoạn 2000-2006; tuy nhiên, nguồn nguồn cung nhƣ vậy
chỉ đáp ứng đƣợc gần 64% nhu cầu tiêu dung (năm 2008) phần còn lại vẫn phải
nhập khẩu. Mặc dù đã có sự tăng trƣởng đáng kể tuy nhiên tới nay đóng góp của
ngành về tổng giá trị sản xuất quốc gia vẫn rất nhỏ [52].
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất giấy
Nguyên liệu sản xuất bột giấy chủ yếu từ thực vật nhƣ: gỗ lá rộng, gỗ lá kim,
họ thân thảo, họ tre nứa… hay còn gọi là vật liệu lignocellulose.

1
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin
(Hình 1.1). Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đƣờng
khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng đƣợc tổng hợp từ tiền
phenylpropanoid. Các tế nào gỗ đƣợc cấu thành từ các lớp khác nhau, các lớp này
khác nhau từ cấu trúc và thành phần hóa học. Cellulose cơ bản hình thành nên bộ
khung xƣơng mà đƣợc bao quanh bởi các cơ chất tạo thành mạng lƣới và hình thành

lớp vỏ lignin. Dƣới đây là thành phần nguyên liệu lignocelluloses trong tự nhiên.

Hình 1.1: Thành phần cấu trúc lignocellulose
Thành phần cấu tạo và phần trăm của cellulose, hemicelluloses và lignin là
khác nhau giữa các loài, trong cùng một cây hay các cây khác nhau dựa vào độ
tuổi, giai đoạn sinh trƣởng, phát triển của cây và các điều kiện khác.

2
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Bảng 1.1 Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocelluloses [49]
Nguồn lignocelluloses

Cellulose (%)

Hemicellulose (%)

Lignin (%)

Thân gỗ cứng

40-55

24-40

18-25

Thân gỗ mềm

45-50

25-35

25-35

Giấy

85-99

0

0-15

Lá cây

15-20

80-85

0

Giấy báo

40-55

25-40

18-30

Giấy thải từ bột giấy hóa học

60-70

10-20

5-10

1.1.2.1.

Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, là một
polysaccharide gồm một chuỗi tuyến tính gồm từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân
D – glucose nối với nhau bởi liên kết 1,4 β - glucoside (Hình 1.2).
Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển [33, 36], hàng
năm thực vật tổng hợp đƣợc khoảng 1.5x1011 tấn cellulose [11]. Khoảng 33% khối
lƣợng khô của thực vật là cellulose (sợi bông là 90%, gỗ là 40 -50%) [17, 53, 55].

3
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Hình 1.2: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van
Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong
vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn
công bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất. Ngƣợc lại, trong vùng vô định hình, cellulose
liên kết kém chặt chẽ hơn, có thể thấp thụ nƣớc và trƣơng lên tạo điều kiện thuận lợi
cho cellulase tấn công [22]. Tuy vậy, việc thủy phân cắt ngắn chuỗi chỉ có thể đạt
đƣợc khi cellulose đƣợc tách khỏi các thành phần cùng cấu thành nên
lignocelluloses. Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã đƣợc đƣa ra nhằm mô tả
vùng tinh thể và vô định hình nhƣ hình 1.4 [41] .

Hình 1.3: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập

4
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose đƣợc kéo thẳng và định
hƣớng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô
định hình.
Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi
đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b nhƣ trên
hình vẽ. Các đơn vị đó đƣợc sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ,
các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định
hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên

kết β - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn
gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định
hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc
liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết,
đồng thời vị trí này không tạo đƣợc liên kết hydro [7].
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Ngƣời và động vật không
có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa đƣợc cellulose, vì vậy
cellulose không có giá trị dinh dƣỡng.Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy
cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong
dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối
sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy
chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [33, 53].
1.1.2.2.

Hemicellulose

Hemicellulose là hợp chất polysaccharid chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau
cellulose.Lƣợng hemicellulose đƣợc tạo thành trên thế giới đƣợc đánh giá là 3.900
triệu tấn/năm. Ngƣợc lại với cellulose, hemicellulose là một loại polymer phân
nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 có cấu trúc phức tạp hơn đơn phân.
Hemicellulose chứa cả đƣờng 6 carbon gồm glucose, mannose và galactose và
đƣờng 5 carbon gồm xylose và arabinose.Trong đó xylose, mannose là những thành

5
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

phần chính. Khác với Cellulose, Hemicellulose bao gồm những chuỗi mắt xích ngắn
( khoảng 200 đơn vị đƣờng) [53].

Hình 1.4: Công thức hóa học của hemicellulose
Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch kiềm
và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính. Cùng
với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực vật.Về
cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, D-mannose,
D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong liên kết
glycoside. Hemicellulose còn chứa cả axit 4-O-methylglucuronic, axit Dgalacturonic và axit glucuronic [42]. Trong đó, đƣờng D-xylose, L-arabinose, Dglucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc. Tuy nhiên, khác
với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lƣợng lớn các
dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một
loài cũng nhƣ phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó.
Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào
mà nó sẽ có những tên tƣơng ứng nhƣ mannan (chứa mannose), xylan (chứa xylose)
hoặc galactan (chứa galactose). Các monose trong hemicellulose liên kết với nhau
thông qua các liên kết beta-1,3, -1,6 và -1,4 glycozid, thƣờng bị acetyl hóa, tạo
6
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

thành “keo dính” các phân tử cellulose và lignin. Do vậy chuyển hóa thủy phân các
thành phần hemixellulose bằng các chế phẩm hemicellulase (xylanase, mannanase)
cũng là một con đƣờng để tác động lên các thành phần xơ sợi cellulose và loại bỏ
lignin ra khỏi bột gỗ một cách có hiệu quả.

1.1.2.3.

Lignin

Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến đƣợc tìm thấy trong gỗ và trong
hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin là
một trong các polymer hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất [54]. Lignin có cấu trúc
không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ.
Lignin không phải là carbohydrate nhƣng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo
nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nƣớc
trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị
đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nƣớc), giúp cây phát triển và chống lại sự
tấn công của côn trùng và mầm bệnh. Lignin là polymer, đƣợc cấu thành từ các đơn
vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl
alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-pcourmary alcohol (Hình 1.7) [54].

Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin
Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc
của nó trong gỗ. Ngoài việc đƣợc phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ,

7
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

lignin có thể đƣợc phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl
lignin.

Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Các nghiên
cứu đã chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trƣơng nở của xơ sợi và vì vậy loại
nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin [41].
Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhƣng
không nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên
kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đƣờng tham gia liên kết [7]. Carbon
alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất
với khối hemicellulose. Ngƣợc lại, các đƣờng nằm ở mạch nhánh nhƣ arabinose,
galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thƣờng liên kết với lignin.
Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-Dglucuronic), hay glycoside (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm
OH phenolic của lignin).
Sự có mặt của lignin trong gỗ là nguyên nhân gây sẫm mầu của giấy thành
phẩm và giảm chất lƣợng của giấy, cản trở sự tiếp xúc của cellulase với các xơ sợi
cellulose trong quá trình phân tơ chổi hóa. Do vậy việc sử các enzym hemicellulase
để gỡ bỏ lignin ra khỏi mạng lƣới hemicellulose cũng là một giải pháp đƣợc nhiều
nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.

8
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Hình 1.6: Các liên kết giữa lignin và polysaccarid
1.1.3. Quy trình sản xuất bột giấy
Các phƣơng pháp chính sản xuất bột giấy gồm: phƣơng pháp hóa học
(sulfat,sulfit…), bán hóa học, nhiệt cơ.
- Phƣơng pháp hóa học:

Sơ chế nguyên liệu -> nấu bột -> bể chứa -> sàng, rửa -> tẩy -> bột giấy
thành phẩm.
- Phƣơng pháp bán hóa học:
Gỗ nguyên liệu -> ngâm tẩm trong điều kiện hóa chất/nấu -> bột giấy thành
phẩm
- Phƣơng pháp nhiệt cơ : hiệu suất bột loại này thƣờng cao (85-90%) nhƣng sử dụng
nhiều năng lƣợng. Bột giấy có độ bền không cao, dễ bị ố vàng…
Gỗ nguyên liệu -> cắt mảnh -> nghiền bột -> sàng chọn -> bột giấy thành
phẩm
9
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Trên thực tế thƣờng kết hợp các phƣơng pháp nêu trên để sản xuất các loại
bột giấy theo yêu cầu tiêu thụ.
Nguyên liệu dùng làm giấy phải có tính chất sợi, có khả năng đan kết và ép
thành tấm đồng nhất. Một số nguyên liệu có sợi rất dài nhƣng lại khó liên kết nếu
không qua xử lý cơ học làm phát triển sự liên kết giữa các sợi thì cũng khó đƣợc
dùng làm giấy. Nhƣ vậy giấy có thể đƣợc làm từ tất cả các loại cây có chứa xơ sợi
cellulose nhƣ gỗ và phi gỗ. Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi chỉ dề cập tới
nguyên liệu bột giấy đi từ gỗ.
Nguyên liệu gỗ đƣợc chia làm 2 loại: gỗ lá kim (gỗ mềm) nhƣ các loại thông,
thông rụng lá, vân sam, linh sam… và gỗ lá rộng (gỗ cứng) nhƣ bạch đàn, sồi,
dƣơng, keo các loại..., chúng khác nhau về cấu tạo và hàm lƣợng các hợp phần tạo
nên chúng.
Gỗ mềm: galactoglucomannan là thành phần hemicellulose chủ yếu, chiếm

tới 20% so với gỗ khô tuyệt đối.

Bên cạnh cấu tử chính còn có

arabinoglucuronoxylan, chiếm khoảng 5-10% khối lƣợng gỗ khô. Lignin gỗ lá kim
gồm các đơn vị mắt xích guaiacylpropan (4-hydroxy-3-metoxy phenylpropan).
Gỗ cứng: glucuronoxylan là hemicellulose chủ yếu, dao động từ 15-25% so
với gỗ khô tuyệt đối. Bên cạnh đó gỗ cứng còn chứa 2-5% glucomannan. Lignin
chiếm

16-25%,

ngoài

guaiacylpropan

còn

chứa

3,5-dimetoxy-hydroxy

phenylpropan.
Sản xuất bột giấy là giai đoạn gia công để tách thành phần sơ sợi từ nguyên
liệu gỗ hay một số thực vật bằng các phƣơng pháp hóa học hay cơ học tƣơng ứng ta
sẽ thu đƣơc bột hóa hay bột cơ. Tùy theo yêu cầu sử dụng mà bột có thể có hoặc
không đƣợc tẩy trắng hoặc đƣợc tẩy trắng với mức độ khác nhau (loại lignin).
Bột cơ: là bột giấy đƣợc sản xuất bằng cách mài hoặc nghiền lóng gỗ hoặc
dăm gỗ để tách các bó sợi. Mài gỗ cho bột có độ che phủ rất cao, nhƣng tính chất
cơ, lý lại kém. Nghiền dăm gỗ cho bột có tính chất cơ lý cao hơn nhƣng tính quang

học lại kém hơn. Sản xuất bột cơ cần gỗ chất lƣợng cao và tốn năng lƣợng. Khả
10
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

năng tạo liên kết của bột cơ kém hơn bột hoá và do vậy tính chất cơ, lý của bột cơ
thấp hơn. Bột cơ thƣờng chứa tạp chất, không thể tẩy trắng bột cơ tới mức nhƣ bột
hoá và độ hồi màu của bột cơ khá cao.
Bột hóa: tuỳ theo hoá chất sử dụng ta có các loại bột khác nhau nhƣ bột soda
(dịch nấu gỗ là dung dịch NaOH), bột sunphat còn gọi là bột Kraft (hóa chất nấu là
NaOH và Na2S), Bột sunphit ( dịch nấu gồm H2SO3+M(HSO3) ), có thể có bột
sunphit acid, bột sunphit trung tính hay bột sunphit kiềm...
Bột hóa cơ: là bột giấy đƣợc sản xuất trên phƣơng pháp kết hợp giai đoạn xử
lý hóa chất với xử lý cơ học để phân tách xơ sợi ra một cách hoàn toàn. Hiệu suất
với phƣơng pháp này đạt từ 80-95%. Vị trí xử lý hóa chất: công đoạn xử lý hóa chất
có thể đƣợc bố trí ở các vị trí khác nhau trong dây chuyền sản xuất, tƣơng ứng sẽ
cho ra những loại bột hóa cơ khác nhau.
1.1.4. Quy trình nghiền bột giấy
Nhƣ đã nói ở trên, công đoạn nghiền bột đóng vai trò quan trọng và quyết
định lớn đến chất lƣợng sản phẩm giấy. Tùy theo yêu cầu sản phẩm và loại nguyên
liệu mà công nghệ sản xuất sẽ thay đổi khác nhau, nhƣng về nguyên tắc chung có
hai bƣớc chính sau:
Bước 1, đánh tơi bột: thƣờng bột đƣa vào sản xuất là dạng kiện, dạng tấm
không ở dạng xơ sợi do đó cần phải đánh tơi đƣa bột về dạng xơ sợi phân tán trong
nƣớc ở dạng huyền phù.
Bước 2,nghiền bột: bột sau khi đánh tơi, các xơ sợi ở dạng huyền phù, tuy

nhiên chúng vừa không đều vừa không đan dệt đƣợc với nhau nên nếu đem sản xuất
ngay thì giấy thu đƣợc sẽ rất thô, cứng và độ bền thấp. Do vậy bột giấy phải đƣợc
qua bƣớc nghiền. Dƣới các tác động cơ học (nhƣ lực cắt, lực xé, lực va đập của các
lƣỡi dao lên xơ sợi, lực ma sát giữa các xơ sợi với nhau và với thành thiết bị) và các
tác động thủy động học (lực nén ép thủy động) các xơ sợi bị cắt ngắn, trƣơng nở,
hydrat hóa và bị phân tơ chổi hóa. Sự phân tơ chổi hóa là hiện tƣợng các xơ sợi bị
tách dọc tạo thành những bó xơ sợi nhỏ hơn và thƣờng xảy ra ở vị trí các vết cắt.
11
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Khi xơ sợi bị phân tơ chổi hóa, lớp vỏ bên ngoài (lignin) bị dập nát và bong ra, làm
tăng khả năng thâm nhập của nƣớc vào phân tử cellulose và tạo thành lớp vỏ solvat
bao quanh bề mặt các phân tử cellulose. Do những biến động này mà xơ sợi trở nên
trơn, nhớt, mềm dẻo hơn, mịn hơn, độ linh động cao hơn. Diện tích tiếp xúc bề mặt
tăng lên, tạo nên những tính chất đặc biệt cho tờ giấy sau này.
Tác động của quá trình nghiền lên đặc tính xơ sợi
Quá trình nghiền nhằm mục đích tạo kích thƣớc thích hợp ( chiều dài và độ
dày) của xơ sợi theo yêu cầu của cấu trúc giấy; làm cho xơ sợi có độ thủy hóa nhất
định để tạo lực kết dính giữa các xơ sợi.
Trong quá trình nghiền đồng thời xảy ra quá trình cơ học thuần túy làm thay
đổi kích thƣớc và hình dạng xơ sợi, và quá trình hóa keo – thủy hóa xơ sợi. Tác
động cơ học làm sợi bị cắt ngắn và bị phân tơ theo chiều dọc. Thủy hóa ở đây đƣợc
hiểu là hiện tƣợng hó keo bắt đầu bằng việc trƣơng nở xơ sợi thực vật ƣa nƣớc làm
cho các xơ sợi có khả năng liên kết với nhau tạo thành cấu trúc chặt chẽ của tờ giấy.
Mục đích quan trọng của nghiền là phân tơ để tăng diện tích bề mặt xơ sợi. Sự hấp

phụ nƣớc lên bề mặt này sẽ làm sợi trƣơng nở, tăng độ mềm mại và tạo điều kiện
thuận lợi để các xơ sợi liên kết lại hình thành độ bền cơ lý, độ thấm hút và thấu khí
của giấy. Kết quả sau khi nghiền xơ sợi bị chà phẳng và mền dẻo hơn, liên kết bề
mặt tăng lên.
1.2.

Hệ enzyme ứng dụng trong nghiền giấy[9]
Với các loại bột hóa, sau khi nấu phần lớn lignin đã bị loại bỏ ở lớp ngoài

cùng của xơ sợi cellulose, tuy nhiên vẫn còn một lƣợng nhỏ ở lớp sát xơ sợi. Vì vậy
bột sau khi nấu phải trải qua công đoạn nghiền để thu đƣợc xơ sợi có những thuộc
tính mong muốn nhƣ vừa nói ở trên. Để giảm thời gian nghiền và tiết kiệm chi phí
về năng lƣợng, giải pháp công nghệ đƣợc đƣa ra ở đây là xử lí bột giấy trƣớc khi
nghiền với các enzym cellulase và hemicellulase (xylannase, mannanase) nhằm cắt
ngắn sợi cellulose hoặc thủy phân một phần hemicellulose (mannan, xylan) giải
phóng lignin, tăng tốc độ trƣơng nở và quá trình phân tơ chổi hóa xơ sợi.
12
Học viên: Phạm Khánh Dung

Lớp: CH.CNSH2011B