Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp CELLULASE từ vi khuẩn ruột mối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------

NGUYỄN THỊ HIỀN

TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. LÊ THANH HÀ

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Lê Thanh Hà Trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi
trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự chỉ bảo chuyên môn
nhiệt tình của các thầy cô giáo bộ môn Công nghệ Sinh học, cũng như sự động viên
tinh thần của tập thể cán bộ nghiên cứu tại phòng thí nghiệm bộ môn, cán bộ Trung
tâm Sinh học Thực nghiệm. Nhân dịp hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc của mình tới sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và
bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc vừaqua.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 9 năm 2016

Nguyễn Thị Hiền


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi
sự giúp đỡ trong việc thực hiện đề tài đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn
trong luận văn đã được ghi rõ nguồngốc.

Ký tên

Nguyễn Thị Hiền


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................3
MỤC LỤC ..................................................................................................................4
DANH MỤC HÌNH VẼ ............................................................................................6
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................1
DANH MỤC VIẾT TẮT ..........................................................................................2
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................3

1.1 Cellulase .................................................................................................. 3
1.1.1 Phân loại enzyme cellulase .............................................................. 3
1.1.2. Nguồn thu nhận cellulase ................................................................ 4
1.1.3 Cơ chất cellulose .............................................................................. 5
1.1.4 Cơ chế thủy phân cellulose .............................................................. 7
1.1.5Ứng dụng của enzyme cellulase........................................................ 8

1.2Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase từ ruột mối ..................................... 11
1.2.1 Cấu tạo ruột mối và hệ vi sinh vật trong ruột mối ......................... 11
1.2.2 Vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột mối ......................................... 14
1.3.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy ....................................................... 17
1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt độ enzyme ............... 20
CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................22

2.1 Vật liệu .................................................................................................. 22
2.1.1 Chủng vi khuẩn nghiên cứu ........................................................... 22
2.1.2 Hóa chất.......................................................................................... 22
2.1.3 Môi trường muôi cấy...................................................................... 22
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ..................................................... 23
2.2Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 24
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ..................................................... 24
2.2.2Phương pháp thu enzyme thô .......................................................... 24
2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase [27] .............................. 24
2.2.5 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 27
2.3 Phân tích thống kê ................................................................................. 29


3.1 Tối ưu hóa môi trường lên men sinh tổng hợp cellulase của chủng
Bacillus subtilis G4 ..................................................................................... 30
3.1.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy .................................................... 30
3.1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon .............................................................. 31
3.1.3 Ảnh hưởng nồng độ cacbon ........................................................... 32
3.1.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ ................................................................... 33
3.1.5 Ảnh hưởng nồng độ nitơ ................................................................ 34
3.2 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ............................................................... 35
3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy ......................................................... 35
3.2.2Ảnh hưởng pH ................................................................................. 36

3.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống ............................................................. 37
3.3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc ..................................................................... 38
3.3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy........................................................ 39
3.3 Nghiên cứu động thái quá trình lên men chủng Bacillus subtilis G4 ... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................43


DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật [5] ......... 6
Hình 1.2 Hệ enzyme cellulase tham gia vào quá trình thủy phân sợi cellulose
[46] .................................................................................................................... 8
Hình 1.3 Sơ đồ phân loại mối, các con số chỉ số lượng giống/loài trong từng
họ mối khác nhau [7]....................................................................................... 11
Hình 1.4 Cấu tạo ruột mối, gồm có ruột trước (foregut), ruột giữa (midgut) và
ruột sau (hindgut) [54] .................................................................................... 12
Hình 3.1 A- Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ CMCase, B - Ảnh
hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và pH chủng G4 ....................... 30
Hình 3.2 A- Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase; B - Ảnh hưởng
nguồn cacbon đến sinh trưởng và pH.............................................................. 31
Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến pH và sinh trưởng của G4.................... 33
Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ nitơ đên hoạt độ CMCase ............................... 34
Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ CMCase ........................ 35
Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ CMCase ............................................... 36
Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ CMCase ....................... 39
Hình 3.8 Hoạt độ enzyme FPU trước và sau khi tối ưu .................................. 40
Hình 3.9 Động thái lên men của chủng Bacillus subtilis G4 .......................... 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Lớp Bacilli phân lập từ ruột mối [35].............................................. 15
Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ cám gạo đến hoạt độ CMCase ........................ 32
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase ........................... 33
Bảng 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến hoạt độ CMCase............................ 37
Bảng 3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ CMCase.................................... 38

1


DANH MỤC VIẾT TẮT
CFU: Colony Forming Unit
CMCase: Carboxymethyl Cellulase
FPU: Filter Paper Units
rpm: revolutions per minute

2


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nông nghiệp với khối lượng phế phụ phẩm nông
nghiệp như rơm, rạ, bã mía ước tính mỗi năm lên đến 80 - 100 triệu tấn. Cellulose
từ các phế phụ phẩm này là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất năng
lượng tái sinh. Tuy nhiên, hiện nay nguồn sinh khối rất lớn này đang được nông dân
xử lý bằng cách đốt, gây lãng phí rất lớn nguồn sinh khối có sẵn và còn ảnh hưởng
tiêu cực đến môi trường sống [16]. Vì vậy, việc chuyển hóa chúng thành cồn hoặc
các chất có giá trị khác không những có ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ môi trường
sống mà còn góp phần giải quyết nhu cầu năng lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập
tại chỗ cho nông dân. Ưu điểm cồn sinh học thế hệ thứ hai hay thế hệ mới (được sản

xuất từ nguồn lignocellulose phế phụ phẩm nông lâm nghiệp) là bền vững, không
gây ảnh hưởng tới an ninh lương thực như cồn sinh học thế hệ thứ nhất (được sản
xuất từ việc lên men dịch đường và tinhbột).
Mối là nhóm côn trùng sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn để sinh sống và phát
triển. Sở dĩ ở nhóm côn trùng này có thể thủy phân được gỗ là nhờ hệ vi sinh vật
cộng sinh trong đường ruột của chúng, quá trình phát triển chúng sinh ra hệ enzym
cellulase để thủy phân các thành phần của gỗ như cellulose, hemicellulose thành các
loại đường và các thành phần có phân tử lượng thấp làm nguồn thức ăn. Theo
Ohkuma (2003), mối có khả năng tiêu hóa 74 - 99% cellulose và 65 - 87%
hemicellulose.Mốiđóng vai trò sinh thái quan trọng trong quá trình phân giải
cellulose từ thực vật nhờ sự hỗ trợ tích cực của nhóm vi sinh vật cộng sinh trong
ruột mối. Nhóm vi sinh vật này có khả năng tiết ra các enzym thủy phân cellulose
hiệu quả. Do đó, hệ vi sinh vật ruột mối được coi là nguồn dự trữ phong phú và đa
dạng các enzym tham gia vào phân hủy cellulose.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng phân lập từ ruột mối có khả năng
sinh cellulase cao. Tuy nhiên để thu được hoạt tính sinh học cao từ các chủng phân
lập cần phải tạo môi trường thuận lợi để vi sinh vật phát triển sinh tổng hợp
cellulase cao nhất. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase gồm
pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chấtbổ sung vào môi trường... Mỗi loài sinh trưởng và

1


phát triển ở một điều kiện khác nhau, do đó lựa chọn điều kiện tối ưu để vi khuẩn
sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao là hết sức cần thiết, trên cơ sở nghiên cứu
các thông số trong phòng thí nghiệm có thể đưa ra quy trình sản xuất cellulase từ vi
khuẩn ruột mối trên quy mô công nghiệp. Việc thực hiện đề tài “Tối ưu điều kiện
sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối” cho phép lựa chọn được các điều
kiện nuôi cấy thích hợp để sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối nhằm mục
tiêu tạo ra chế phẩm cellulase để ứng dụng trong cuộc sống.

2


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cellulase
1.1.1 Phân loại enzyme cellulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các
acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-. Cellulase là enzyme
thuộc lớp glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất polycacharide và
oligosaccharide được tìm thấy trong tự nhiên (cellulose, tinh bột, chitin, xylan,
cellobiose). Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ
cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau. Trước đây, cellulase được chia làm
hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy
phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx được
chia thành hai loại: exo β-1,4-glucanase (E.C.3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt
gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo β-1,4-glucanase
(E.C.3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết bên trong
phân tử cellulose.
Hiện nay, cellulase được chia làm ba nhóm chủ yếu sau đây:
- Endo-β-(1,4)-glucanase (hay còn gọi là endocellulase (1,4-β-Dglucanohydrolase); CMCase hoặc Cx) (E.C.3.2.1.4) thủy phân liên kết β-1,4glycoside bên trong chuỗi của cellulose và một số loại polysaccharide tương tự một
cách ngẫu nhiên. Sản phẩm thủy phân là các oligosaccharide phân tử lượng thấp,
cellodextrin. Endo-β-(1,4)-glucanase thủy phân dễ dàng cellulose vùng vô định hình
nhưng tác dụng rất yếu ở vùng cellulose kết tinh và không phân giải cellobiose.
-

Exo-β-(1,4)-glucanase

(hay

còn

gọi

là

exocellulase;

1,4-β-D-

glucancellobiohydrolase hoặc C1) (E.C.3.2.1.91) phân cắt cellulose từ đầu khử và
đầu không khử giải phóng ra các các oligosaccharide, cellobiose và glucose. C1 có
tính chất không đặc hiệu. Dưới tác dụng của C1, các loại cellulose bị hấp thụ nước,
trương lên và chuẩn bị cho sự tác động của các enzyme khác. Nếu tách riêng C1 cho
hoạt động độc lập thì tác dụng này lại không rõ ràng.

3


- β-(1,4)-glucosidase hay cellobiase (E.C.3.2.1.2) thủy phân các phân tử
cellobiose và cellooligosacharide mạch ngắn tạo thành glucose, nhưng không có tác
dụng đối với cellulose và cellulose dextrin cao phân tử [52].
Trong tự nhiên, enzym endoglucanase phổ biến hơn exoglucanase.
Endoglucanase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, thực vật và
động vật, trong khi exoglucanase chỉ xuất hiện giới hạn ở vi khuẩn, nấm và động
vật nguyên sinh. β-glucosidase cũng là một dạng enzym cellulase phổ biến. Một số
enzym đã được tìm ra có hoạt tính của cả hai loại endoglucanase và exoglucanase
[51].
Tính chất của cellulase [6]
- Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl

cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid trong cellulose, và cắt β-D-glucan của ngũ cốc.
- Cellulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4 và 5.
- Nhiệt độ tối ưu từ 40 – 50ºC, hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở
80ºC trong 10 – 15 phút
- Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30 – 110KDa

1.1.2. Nguồn thu nhận cellulase
Cellulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên,
trong đó vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật
và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật.
Quá trình phân giải cellulose bởi vi sinh vật là một trong những chu trình quan
trọng nhất của tự nhiên. Các chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp
cellulase bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men.
Vi khuẩn là một trong những đối tượng có khả năng sinh tổng hợp cellulase
khá phong phú với ưu thế chu kỳ sinh trưởng trong thời gian ngắn. Nhiều loài vi
khuẩn hiếu khí đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh

4


như Acidothemus cellulobuticus, Bacillus pumilis, Cellulomonas flavigena, C. udai,
Pseudomonas fluoressens.Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn
kỵkhí cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như Clostridium [56].
Nấm sợi là một trong những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase
mạnh nhất. Nhiều chủng nấm sợi thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng sinh tổng hợp
cellulase mạnh như: A. niger, A. flavus, A. fumigatus, A. terreus, A. oryzae, A.
awamori, T. reesei, Penicillium sp. , Penicillium persicinum, P. brasilianum,
Phanerochaete chrysosporium [26].
Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả

năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli
[62]. Năm 1955, hoạt động phân giải cellulose bởi vi sinh vật sống cộng sinh trong
dạ cỏ của các động vật nhai lại đã được chứng minh. Đến năm 1971, người ta đã
phân lập được một số loài vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose trong dạ cỏ.
Trong đó có hai chủng được nghiên cứu kĩ hơn cả là Ruminococus albus và R.
flavefaciens. Ngoài ra, cellulase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis, ở
động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối [63].

1.1.3 Cơ chất cellulose
Cellulose là một polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, được
cấu tạo từ các đơn phân β – D – glucose thông qua liên kết 1,4 – β glycoside với các
mức độ trùng hợp khác nhau, từ 2000 đến 2500 phân tử. Cellulose là hợp chất hữu
cơ phong phú nhất trong hệ sinh quyển trái đất. Nó có mặt ở khắp mọi nơi, từ thực
vật bậc thấp (tảo, nấm, nấm mốc) tới thực vật bậc cao, và cả trong động vật biển
không xương sống và vi khuẩn [38]. Ở hệ thực vật, cellulose là thành phần chính
tạo nên thành tế bào, chiếm 30 – 50% sinh khối thành tế bào thực vật, số lượng
cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy
rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông,
cellulose có thể chiếm đến 80 – 90% và 40 – 50% trong gỗ.

5


Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơnghe, người ta đã tìm ra cấu trúc
của cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi. Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có
đường kính vào khoảng 3nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là
micelle. Mỗi micelle thường có khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 1040 nm, dài 100-40000 nm. Các micelle này hợp lại thành từng bó sợi to hơn nằm
đan xen vào nhau có thể quan sát được dưới kính hiển vi quang học. Các bó sợi
cellulose liên kết với lớp polysaccharide trong thành tế bào thực vật tạo nên một
phức hệ bền vững đóng vai trò như lớp kết dính sinh học trong thành tế bào thực vật

(Hình 1.1)

Hình 1.1 Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật [5]
Dựa vào số lượng liên kết hydro giữa các đơn phân và giữa các phân tử
cellulose, cấu trúc cellulose ở thành tế bào thực vật được phân thành 2 dạng là vùng
kết tinh và vùng vô định hình [29]:
- Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ
liên kết hydro nối nhóm dehydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở
mạch cacbon của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của
điều kiện bên ngoài, enzyme cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này.
- Vùng vô định hình: có cấu trúc không chặt ch , các mạch tập hợp với nhau
nhờ lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước chúng
có thể hấp thu nước và trương phồng lên, nhờ vậy cellulase rất dễ tác động.

6


Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng
chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Trong phân tử cellulose có
nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế
bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc
este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC,
trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –
OCH2COOH.

1.1.4 Cơ chế thủy phân cellulose
Khi nghiên cứu cơ chế thủy phân cellulose, nhiều tác giả đã trình bày cơ chế
tác động của cellulase theo các cách khác nhau. Reese (1950) là người đầu tiên đề
xuất cơ chế thủy phân cellulose hòa tan bởi enzyme C1 và Cx. Theo Reese thì C1 là
yếu tố tiền thủy phân, nó chỉ có tác dụng làm trương nở cellulose tự nhiên tạo thành

cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn. Sau đó, Cx s tiếp tục phân cắt các chuỗi này
tạo thành các đường tan và cuối cùng tạo thành glucose [48]. Eriksen và Goksoyr
(1977) đã đưa ra cơ chế tác dụng phối hợp của endoglucanase; exoglucanase và βglucosidase. Đầu tiên, những vùng có mức độ kết tinh thấp trong sợi cellulose bị các
endoglucanase tấn công tạo các đầu tự do. Tiếp đó, exoglucanase s bắt đầu phân cắt từ
các đầu tự do để tạo thành các cellobiose; cellooligosaccharide và glucose. βglucosidase s thủy phân tiếp và cuối cùng tạo thành glucose [23].
Cellulose là một chất đơn giản có chứa các đơn vị lặp lại của glucose, nhưng
phức tạp về cấu trúc bởi vì sự hiện diện của liên kết β-1,4-glucozit (khó bị phá vỡ)
và tạo phức với lignin và hemicelluloses. Phân hủy cellulose bao gồm cellulase chịu
trách nhiệm về depolymer hóa cellulose thành đường. Ba loại chính của các enzym
chịu trách nhiệm cho quá trình thủy phân cellulose là Endoglucanases (EC3.2.1.4),
cellobiohydrolases hoặc Exoglucanases (EC 3.2.1.91) và beta-glucosidases
(EC3.2.1.21). Endoglucanases cắt ngẫu nhiên ở bên trong vô định hình trong
polymer cellulose và tạo oligosaccharides có độ dài khác nhau. Exoglucanase thủy
phân các đầu giảm hoặc không giảm của cellulose polymer giải phóng glucose hoặc

7


cellobiose như các sản phẩm chính. Cuối cùng, β-glucosidases thủy phân cellobiose
thành glucose, làm nguyên liệu cho quá trình lên men [57] (Hình 1.2).

Hình 1.2 Hệ enzyme cellulase tham gia vào quá trình thủy phân sợi cellulose [46]
Trong số các enzyme cellulase thủy phân polyme cellulose thì endoglucanase
tác dụng đồng thời cho các phản ứng thủy phân tiếp theo, đặc biệt endoglucanase
được nghiên cứu khá nhiều, đặc biệt là khả năng chịu nhiệt. α – amylase và
endoglucanase đều tham gia vào quá trình chuyển đổi nguyên liệu thực vật thành
đường, tuy nhiên có một sự khác biệt đó là α – amylase thủy phân tinh bột từ ngô,
ngũ cốc được sử dụng làm thực phẩm cho con người, trong khi đó endoglucanase
phá vỡ thành tế bào cellulose chủ yếu từ rơm, bã mía (phụ phẩm nông nghiệp). pH
và nhiệt độ có liên quan đến việc chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu sinh học,

trong đó phải kể đến vai trò của enzyme endoglucanases và enzyme hiệp đồng của
nó như cellobiohydrolase và β-glucosidase. Endoglucanases chịu nhiệt được coi là
đầy hứa hẹn bởi vì họ thường thể hiện đặc điểm có giá trị trong sản xuất nhiên liệu
sinh học bao gồm các chức năng tối ưu ở nhiệt độ cao hơn và khả năng chịu được
sự thay đổi pH (Rogathaman và cs, 2013). Ngoài ra endoglucanase được ứng dụng
trong việc tăng hiệu suất của các loại nước ép trái cây, quá trình lọc bia, nâng cao
chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm bánh mì và thức ăn gia súc… Với vai trò to
lớn của endoglucanase trong quá trình thủy phân cellulose, trong nghiên cứu này
chúng tôi tập trung nghiên cứu hoạt tính endoglucanase (CMCase),

8


1.1.5 Ứng dụng của enzyme cellulase
Các cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như:
công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất
dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong
công nghệ xử lý rác thải, sản xuất phân bón vi sinh, cồn sinh học.
Trong công nghiệp
Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phương hướng
tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch quả
sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất xơ có bản
chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thường
được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ
nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Glucanase kết
hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscozyme 120l được
ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tương [2]. Trong quá trình sản
xuất nước cà rốt thường sử dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra
nhiều pectin hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường,

protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử trọng lượng cao cellulose và
β-glucanase ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm. Người ta
thường sử dụng β-glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm như
Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger, β-glucanase từ Bacillus subtillis,
Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong sản xuất bia [36].
Trong nông nghiệp
Cho đến nay, các enzyme được dùng nhiều để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
và cho hiệu quả cao là các enzyme phân giải polysaccharide không phải tinh bột của
lúa mỳ, lúa mạch, yến mạch. Các chất này được xem là các chất kháng dinh dưỡng,
vì khi ở dạng hòa tan nó làm tăng độ dính trong ruột non của động vật, do đó làm
giảm mức độ và tốc độ tiêu hóa các chất dinh dưỡng. Thức ăn gia súc, gia cầm được

9


chế biến từ các loại ngũ cốc chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này
thường không được tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó
chúng đã hạn chế sự hấp thu các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của
động vật. Bổ sung β-glucanase vào thức ăn s làm tăng khả năng phân giải các hợp
chất trên, giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả
năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn [2].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp với
các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi làm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và
giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi. Omogbenigun và cộng sự (2004) cho thấy, khi bổ
sung tổ hợp chế phẩm glucanase và một số enzyme khác (amylase, invertase,
protease, phytase, xylanase) xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng
nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung
enzyme như sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 86,7-94,2%, các polysaccharide
khác tăng 10,1-17,6%, phytate tăng 59-70% [40].
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi

như: Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng
nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc.
Còn hầu hết các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về tác động của các
enzyme nhập khẩu lên sự sinh trưởng của vật nuôi [1].
Trong xử lý rác thải
Sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, công nghệ tái sử dụng phế thải,
chuyển các phế thải thành sản phẩm có ích là một hướng quan trọng trong xử lý
chống ô nhiễm môi trường. Trong nhiều năm qua trên thế giới và cả ở Việt Nam,
các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng
rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt. Nguyễn Lan Hương và Hoàng Đình Hòa
(2003) đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính
cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải

10


sinh hoạt từ 5-7 ngày [4]. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên
cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam.
Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã
được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi
bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời
gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng
chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với đối
chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung một số vi
sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong
nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và
nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.

1.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase từ ruột mối
1.2.1 Cấu tạo ruột mối và hệ vi sinh vật trong ruột mối

Mối được phân loại là bộ Cánh đều (danh pháp khoa học: Isoptera), thuộc
lớp Côn trùng (Insecta). Dựa trên chứng cứ DNA, một số nhà khoa học cho rằng
mối có quan hệ họ hàng gần gũi nhất với các loài gián ăn gỗ (chi Cryptocercus).
Đến nay, trên thế giới đã biết hơn 2700 loài mối và xếp vào 7 họ của bộ cánh đều
[3], trong đó có duy nhất một họ duy nhất Termitidae là mối bậc cao, còn lại là mối
bậc thấp(Hình 1.3).

Hình 1.3 Sơ đồ phân loại mối, các con số chỉ số lượng giống/loài trong từng họ
mối khác nhau [7]

11


Cấu tạo ruột mối
Mối là nhóm côn trùng sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn để sinh sống và phát
triển. Ở nhóm côn trùng này có thể thủy phân được gỗ là nhờ hệ vi sinh vật cộng
sinh trong đường ruột của chúng, quá trình phát triển chúng sinh ra hệ enzyme
cellulase để thủy phân các thành phần của gỗ như cellulose, hemicellulose thành các
loại đường và các thành phần có phân tử lượng thấp làm nguồn thức ăn. Mối có khả
năng tiêu hóa 74 - 99% cellulose và 65 - 87% hemicelluloses [39]. Ruột mối gồm 3
phần chính là ruột trước, ruột giữa và ruột sau (Hình 1.4). Ở phần ruột trước tuyến
nước bọt tiết glucanase và sinh enzyme tiêu hóa. Ruột giữa gồm hệ thống ống mảnh
tiết peritrophic và endoglucanase phân hủy lignocellulose. Ruột sau chứa hệ vi sinh
vật cộng sinh phân hủy cellulose và diễn ra quá trình lên men [42].

Hình 1.4 Cấu tạo ruột mối, gồm có ruột trước (foregut), ruột giữa (midgut) và
ruột sau (hindgut) [54]
Hệ vi sinh vật trong ruột mối
Năm 1856, Lespes là người đầu tiên miêu tả sự tồn tại của vi sinh vật trong
ruột mối. Tuy nhiên, việc nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa mối và vi sinh vật

chỉ được bắt đầu từ đầu thế kỷ 20. Năm 1923, một thí nghiệm nổi tiếng của
Cleveland đã chứng minh được mối không thể tồn tại trên gỗ nếu không có sự hỗ
trợ của vi sinh vật. Chất kháng sinh làm thay đổi khu hệ sinh thái của vi khuẩn trong
ruột mối, phá vỡ sự tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và vật chủ, qua đó dẫn tới
chu kỳ sống và khả năng sinh sản của mối bị giảm [50].

12


Trong mỗi tổ mối, mối thợ chịu trách nhiệm tìm kiếm thức ăn, tiêu hóa và
nuôi dưỡng cả đàn mối. Trong đường tiêu hóa của mối thợ, cellulose được chuyển
hóa thành các chất dinh dưỡng nhờ hệ enzym của ruột mối và hệ vi sinh vật cộng
sinh trong ruột mối, bao gồm động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn và cổ khuẩn.
Khoảng 106 đến 108 tế bào nhân sơ tồn tại trong mỗi ruột mối. Động vật nguyên sinh
chỉ có ở ruột mối bậc thấp, từ 103 đến 105 cá thể, 90% hoặc hơn trong số đó chủ yếu
tập trung ở ruột sau của mối. Đồng thời, động vật nguyên sinh còn là nơi sinh sống
của rất nhiều loài vi sinh vật nhân sơ, bao gồm cả cộng sinh nội bào và cộng sinh
ngoại bào [14]. Mỗi loài mối thường có một hệ động vật nguyên sinh đặc trưng và
bền vững, thuộc hai ngành Parabasalia hoặc Preaxostyla và có thể chứa tới vài trăm
loài vi khuẩn khác nhau và đặc trưng riêng cho loài mối đó. Khoảng 440 loài động
vật nguyên sinh không có ty thể, thuộc các bộ Trichomonadida, Hypermastigida và
Oxymonadida đã được tìm thấy trong ruột mối bậc thấp ăn gỗ [20].
Vi khuẩn và cổ khuẩn được tìm thấy trong cả mối bậc thấp và mối bậc cao,
trong đó phần lớn là vi khuẩn (trên 90%). Hầu hết vi khuẩn ruột mối đặc trưng cho
từng loài mối. Thành phần quần xã vi khuẩn rất giống nhau giữa các loài mối trong
cùng một chi, nhưng lại thay đổi mạnh giữa hai chi mối. Quần xã vi sinh vật trong
ruột mối có sự đa dạng rất cao. Nhiều nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong ruột mối
được thực hiện thông qua các phương pháp truyền thống dựa trên việc nuôi cấy và
phân lập vi sinh vật ở trong phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt là
Staphylococcus và Bacillus, là những vi khuẩn có mặt nhiều nhất trong cả ruột mối

bậc thấp và bậc cao [35]. Serratia marcescenes, Enterobacter aerogenes,
Enterobacter cloacae và Citrobacter farmeri đã được phân lập từ Coptotermes
formosanus trong khi đó E. aerogenes, E. cloacae và Clavibacter agropyri đã được
chứng minh là tồn tại trong ruột mối C. curvignathus[45]. Tương tự, Husseneder và
cộng sự cũng đã phân lập từ C. formosanus 25 chủng vi khuẩn, thuộc các họ
Enterobacteriaceae, bộ Bacteroidales và Lactobacillales [30]. Trùng roi là sinh vật
đơn bào đặc trưng chỉ có ở ruột mối bậc thấp. Trong khi Hodotermopsis japonica có

13


chứa tới 19 loài trùng roi khác nhau ở trong đường ruột thì chỉ có 3 loài động vật
nguyên sinh tồn tại trong ruột mối C. formosanus[32].
Vi khuẩn Cellulolytic như là Acinetobacter,Pseudomonas, Staphylococcus và
các loài khác nhau của Enterobacteriaceae và Bacillaceae, Salmonella sp.,
Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Bacillus subtilis, Cellulomonas sp., và nấm
như Aspergillus niger và Aspergillus flavus [19], được báo cáo hiện diện trong ruột
mối. Một số loài vi khuẩn Bacillus và Paenibacillus được phát hiện trong ruột mối,
trong đó chi Bacillus đang chiếm ưu thế với mật độ lên đến 107 tế bào [64]. Nghiên
cứu của Dinita Sharma và cs (2015), phân lập vi sinh vật từ ruột mối ở Nepal gồm
Bacillus sp., Cellulomonas sp., Enterobacter sp.,và Aspergillus sp. trong đó
B.subtilis S3B8 hoạt độ cellulase đạt 0,12 ± 0,01 IU/ml sau 96 giờ nuôi cấy,
Aspergillus sp. S3F3 đạt 0,07 ± 0,01IU/ml trong 168 giờ. Quá trình đường hóa và
lên men sinh khối lignocelluloses sảm xuất ethanol đã thành công thông qua nuôi
cấy chọn B.subtillis S3B8 và Aspergillus sp. S3F3, sau đó lên men với nấm men
Saccharomyces cerevisiae S2Y1 [19].
Hệ vi sinh vật ruột mối sinh tổng hợp cellulase, tiết ra lysozyme trong tuyến
nước bọt, có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn thành tế bào peptidoglycan. Điều này
đã được quan sát thấy trong ở mối Reticulitermes hesperus. Nồng độ cao của các
protease cũng được tìm thấy trong ruột non [13]. Các chủng vi khuẩn phân lập từ

ruột mối hầu hết có hoạt tính Endoglucanase và Filter Paper- cellulase.

1.2.2 Vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột mối
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả
trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19.
Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả năng sinh
nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống. Bacillus
phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên:từ trên cạn đến dưới nước, từ nước
ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương [61]. Nhiều loài vi
khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B. subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm

14


thương mại ứng dụng trong y học, trong nông nghiệp và trong công nghiệp thực
phẩm. Hệ enzyme của Bacillus rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase,
cellulase, pectinase. Trong đó, cellulase – hệ enzyme thủy phân cellulose – là một
enzyme đã được sản xuất với quy mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt, tẩy, sản xuất nhiên
liệu sinh học…Vì l đó, Bacillus đã được quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ trong
tế bào như giải mã trình tự genome, nghiên cứu cơ chế điều hòa và biểu hiện
enzyme và protein, sàng lọc các chất hoạt tính sinh học từ các sản phẩm trao đổi
chất bậc hai cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại trong phân loại vi
sinh vật ở cấp độ loài và dưới loài [15].
Trong ruột mối, Bacillus chiếm ưu thế trong ruột mối đã được các nhà
nghiên cứu khẳng định trước đó (Wenzel và cs, 2002), một số nghiên cứu về phân
lập Bacillus được thể hiện trong Bảng 1.1
Bảng 1.1 Lớp Bacilli phân lập từ ruột mối [35]
Loài
Bacillus brevis

Ruột mối
Anacanthotermes ahngerianus
Zootermopsis angusticollis

Bacillus cereus

Anacanthotermes ahngerianus
Nasutitermes nigriceps
Neotermes castaneus
Reticulitermes hesperus
Reticulitermes santonensis

B. cereus

Zootermopsis angusticollis

Bacillus circulans

Zootermopsis angusticollis

Bacillus coagulans

Mastotermes darwiniensis

Bacillus firmus

Reticulitermes santonensis

Bacillus licheniformis

Reticulitermes santonensis

15


Bacillus megaterium

Anacanthotermes ahngerianus
Mastotermes darwiniensis
Zootermopsis angusticollis

Bacillus mycoides

Anacanthotermes ahngerianus

Bacillus oleronius

Reticulitermes santonensis

Bacillus sp.

Schedorhinotermes intermedius
Coptotermes acinaciformis
Coptotermes formosanus
Heterotermes indicola

Bacillus sphaericus

Odontotermes distans

Odontotermes obesus
Reticulitermes santonensis
Zootermopsis angusticollis

Bacillus subtilis

Anacanthotermes ahngerianus
Reticulitermes santonensis

Paenibacillus macerans

Mastotermes darwiniensis

Paenibacillus sp.

Zootermopsis angusticollis

Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối đang là hướng đi của các nhà
nghiên cứu trong việc phát hiện nhiều loài vi khuẩn có khả năng ứng dụng trong
phân hủy cellulose. Nghiên cứu của Pourramezan và cộng sự (2013), phân lập được
chủng Bacillus B5B từ ruột mối Microcerotermes diversus (Silvestri), ở tỉnh
Khuzestan của Iran với hoạt tính CMCase 1,47 U/ml. Kết quả cũng cho thấy hoạt
độ CMCase của chủng Bacillus B5B ổn định trong dải pH lớn và nhiệt độ cao, có
giá trị thương mại lớn [41].
Nghiên cứu của tác giả Dinita Sharma và cs (2015), phân lập chủng Bacillus
sp. S3B8 hoạt độ CMCase 0,12 ± 0,01 U/ml sau 96 giờ lên men và được lựa chọn

16

để tiến hành lên men sinh khối lignocelluloses thành ethanol cùng với chủng
Aspergillus S3F3 [19]. Nghiên cứu khác của Sreena (2015), phân lập và xác định
đặc tính cellulase của vi khuẩn từ ruột mối Odontotermes và Heterotermes. 5 chủng
vi khuẩn được phân lập trong đó có HT1 thuộc chi Enterobacter, ODO3 thuộc chi
Staphylococcus. sp, 3 chủng HT, ODO1 và ODO2 thuộc loài Bacillus.sp chiếm đa
số [59]. Năm 2011, hai loài vi khuẩn thuộc chiBacillus sống cộng sinh trong ruột
mối C. formosanus được xác định là có khả năng sinh ra các enzyme
endoglucanase.

1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
Việc sản xuất enzyme được kiểm soát chặt ch với các dòng vi sinh vật và
các điều kiện nuôi cấy chúng. Khả năng sinh cellulase phụ thuộc vào một quan hệ
rất phức tạp liên quan đến nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, chất cảm ứng, chất phụ
thêm vào môi trường, sự khuấy, thời gian nuôi cấy,…[31]. Do đó, việc tuyển chọn
dòng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh và nghiên cứu sự ảnh
hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các
dòng vi khuẩn đó s giúp ích cho việc sản xuất enzyme cellulase tốt hơn cũng như
trong việc cải tiến các sản phẩm vi sinh. Để thiết lập một quá trình lên men thành
công thì các điều kiện môi trường và dinh dưỡng thuận lợi cho các vi sinh vật phát
triển và sinh tổng hợp enzyme.

1.3.1 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy
1.3.1.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ của dịch lên men và môi trường xung quanh có ảnh hưởng khá
mạnh đến quá trình lên men và khả năng sinh tổng hợp enzyme. Mỗi loài vi sinh vật
có thể sinh trưởng và phát triển ở một dải nhiệt độ khác nhau. Khi nhiệt độ môi
trường lên men quá cao hoặc quá thấp thì cơ thể vi sinh vật có một số thay đổi như
protein bị biến tính, các quá trình trao đổi chất trong vi sinh vật không còn hoạt
động bình thường.

17