Xác định hàm lượng β caroten, lycopen và vitamin e trong khẩu phần ăn của người trưởng thành tại các vùng sinh thái khác nhau

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................
MỤC LỤC.........................................................................................................
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG - HÌNH .................................................................
MỞ ĐẦU ...........................................................................................................
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ...........................................................................
1.1. Chế độ ăn của người trưởng thành.......................................................
1.1.1. Bữa ăn gia đình, nền tảng hạnh phúc và sức khỏe ...............................
1.1.2. Yêu cầu của một bữa ăn gia đình hợp lý...............................................
1.1.3. Chế độ ăn của người trưởng thành .......................................................
1.2. Lipit và các chất chống oxy hóa chính..................................................
1.2.1. Lipit ......................................................................................................
1.2.2. Sự oxy hóa Lipit....................................................................................
1.2.2.1. Oxy hóa gốc tự do ...........................................................................
1.2.2.2. Sản phẩm oxy hóa bậc 2 ..................................................................
1.2.3. Một số chất chống oxy hóa chính và tác dụng sinh học........................
1.2.3.1. Lycopen và tác dụng sinh học của lycopne ....................................
1.2.3.2. β-caroten và tác dụng sinh học của β-caroten ................................
1.2.3.3. Vitamin E và tác dụng sinh học của vitamin E ..............................
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến đề tài
1.2.4.1. Trong nước .....................................................................................
1.2.4.2. Trên thế giới ...................................................................................
1.3. Các phương pháp phân tích chất chống oxy hóa chính ......................
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................
1.4.1. Nguyên lý chung ...................................................................................
1.4.2. Các thành phần chính của HPLC ........................................................
1.4.2.1. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi ..........................
1.4.2.2. Hệ thống bơm .................................................................................
1.4.2.3. Hệ tiêm mẫu....................................................................................

1.4.2.4. Cột sắc ký .......................................................................................

Trang
2
3
4
7
8
10
12
12
12
12
14
14
14
14
15
15
15
16
21
24
27
27
28
30
31
31
32

32
33
33
34


1.4.2.5. Detector ..........................................................................................
1.4.2.6. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC...........................................
1.4.2.7. Phân tích định tính bằng HPLC......................................................
1.4.2.8. Phân tích định lượng bằng HPLC...................................................
1.4.2.9. Phương pháp sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC.......................
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............
2.1. Vật liệu, nguồn gốc của vật liệu ................................................................
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ....................................................................
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ....................................................................................
2.2.2. Hóa chất ...............................................................................................
2.3. Phương pháp xử lý mẫu ............................................................................
2.3.1. Cỡ mẫu ..................................................................................................
2.3.2. Cách lấy mẫu và chọn mẫu ...................................................................
2.3.3. Xử lý mẫu...............................................................................................
2.4. Phương pháp phân tích .............................................................................
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................
3.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích.........................................
3.1.1. Chọn cột tách.........................................................................................
3.1.2. Chọn detector và bước sóng phát hiện..................................................
3.1.3. Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động......................................................
3.2. Nghiên cứu đánh giá phương pháp phân tích..........................................
3.2.1. Khảo sát lập đường chuẩn ....................................................................
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) .....................................................................
3.2.3. Giới hạn định lượng (LOQ) ..................................................................

3.2.4. Khoảng tuyến tính .................................................................................
3.2.5. Độ lặp lại (SD) và hệ số biến thiên (CV%) ...........................................
3.2.6. Độ thu hồi của phương pháp.................................................................
3.3. Ứng dụng phân tích mẫu thực tê...............................................................
3.3.1. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong 120 mẫu
khẩu phần ăn của người trưởng thành tại 8 vùng sinh thái...................
3.3.2. Kết quả phân tích hàm lượng lycopen trong 120 mẫu
khẩu phần ăn của người trưởng thành tại 8 vùng sinh thái....................
3.3.3. Kết quả phân tích hàm lượng lycopen trong 120 mẫu
khẩu phần ăn của người trưởng thành tại 8 vùng sinh thái....................

34
35
37
37
38
39
39
39
39
39
41
41
41
41
41
43
43
43
44

45
47
47
50
52
52
52
55
56
57
63
70


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................

78
83


1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Chế độ ăn của người trưởng thành

1.1.1. Bữa ăn gia đình, nền tảng hạnh phúc và sức khỏe [19].
Bữa ăn gia đình là một vấn đề rất quan trọng. Trong thời buổi cơ chế thị

trường, người lớn thì tất bật với công việc bận rộn, trẻ em thì lo lắng với sách vở
học hành. Thường thì gia đình chỉ gặp mặt quây quần vào bữa cơm chiều tối và
những bữa ăn trong những ngày nghỉ cuối tuần.
Bữa ăn gia đình là thời điểm mà mọi người trong gia đình mong đợi để được
ăn những món ăn ngon truyền thống, để được chia sẻ những niềm vui, để được nhận
những lời khuyến khích an ủi. Bữa ăn gia đình cũng là nơi chị em phụ nữ thể hiện
sự khéo léo, tận tâm với chồng con và qua đó thể hiện vai trò của người mẹ đã tốn
công sức và tình cảm tạo ra những bữa ăn ngon đem lại niềm vui và sức khỏe cho
tất cả mọi mgười. Bữa ăn gia đình ngon lành, đầm ấm là thế mạnh để thu hút lôi
cuốn người đàn ông luôn nhớ tới tổ ấm của mình. Bữa ăn là chất keo gắn bó mọi
thành viên trong gia đình lại với nhau. Xây dựng và tổ chức tốt bữa ăn gia đình là
đảm bảo sức khỏe, sự an tòan và hạnh phúc của mọi thành viên.
1.1.2. Yêu cầu của một bữa ăn gia đình hợp lý [19].
Bữa ăn gia đình phải đủ dinh dưỡng và ngon miệng: Bữa ăn phải đủ chất
dinh dưỡng cần thiết và cân đối, cụ thể là phải đảm bảo đủ 4 nhóm thực phẩm gồm
nhóm lương thực (gạo hoặc mì, ngô, khoai, bún phở…); nhóm chất đạm (thịt hoặc
cá, trứng, tôm, lạc, đậu phụ…); nhóm chất béo (dầu hoặc mỡ, bơ, vừng…); nhóm
vitamin và muối khoáng (rau xanh và quả chín). Khi chế biến nên sử dụng nhiều
loại thực phẩm phối hợp để chúng bổ sung và hỗ trợ cho nhau vì thực tế không có
lọai thực ăn nào có đầy đủ các chất dinh dưỡng và ở tỉ lệ cân đối. Món ăn được chế
biến cần hợp khẩu vị , hấp dẫn, ngon lành và thường xuyên thay đổi. Khi nấu xong
nên ăn ngay như vậy vừa ngon miệng lại không bị hao hụt chất dinh dưỡng.
Bữa ăn phải an toàn: Thức ăn phải đảm bảo lành, sạch, không độc, không
phải là nguồn gây bệnh để giúp cho các chức phận của cơ thể họat động tốt. Thực
phẩm phải có giá trị phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, tăng cường sinh lực, thực
phẩm phải an tòan không bị nhiễm hóa chất độc, không bị nhiễm giun, nhiễm
khuẩn. Do vậy ngay từ khâu mua thực phẩm người nội trợ cần lựa chọn những thực
phẩm tươi, sạch không mua và sử dụng những thực phẩm có nghi ngờ không an

2

tòan. Dùng nước sạch rửa kỹ thực phẩm trước khi chế biến, hoa quả cần rửa sạch và
gọt vỏ trước khi ăn. Bữa ăn nên được tổ chức một cách tiết kiệm, kinh tế nhất:
Người nấu ăn cần biết chọn thực phẩm sạch, giàu dinh dưỡng nhưng giá cả phù hợp
với điều kiện kinh tế gia đình. Không nhất thiết các thức ăn đắt tiền mới là tốt,
nhiều thức ăn rẻ tiền nhưng biết cách lựa chọn, chế biến lại có giá trị dinh dưỡng
cao. Thí dụ cá diếc, cá dầu nhỏ giá thành chỉ bằng khỏang 1/4 giá của thịt nạc hoặc
cá chép to nhưng thành phần chất đạm cũng gần tương đương (100 gam cá diếc có
17,7 gam đạm; 100 gam cá chép có 16,0 gam đạm; 100 gam thịt lợn nạc có 19 gam
đạm) mà cá nhỏ kho nhừ ăn cả xương còn là nguồn canxi hữu cơ rất tốt giúp phòng
chống bệnh còi xương ở trẻ nhỏ và loãng xương ở người lớn.
Bữa ăn gia đình cần được tổ chức tình cảm: trong không khí đầm ấm, hạnh
phúc, quan tâm săn sóc lẫn nhau sẽ kích thích các tuyến tiêu hóa họat động gíup
mọi người ăn ngon miệng và giúp cho việc tiêu hóa, hấp thu thức ăn được tốt hơn.
Cần hết sức tránh mắng mỏ, nhiếc móc con cái trong bữa ăn, tránh những lời nói,
thái độ bực tức của người lớn thể hiện khi vào bữa ăn. “Trời đánh còn tránh bữa
ăn”là điều mà các cụ ta răn dạy từ lâu đời nay vẫn luôn là đúng xin mọi người đừng
bỏ qua.
Mọi người nên dành thời gian và có thói quen tổ chức “Bữa ăn gia đình” đủ
chất, ngon miệng và an tòan. Qua bữa ăn gia đình sẽ giảm bớt được các sức ép
(stress) do công việc căng thẳng trong ngày gây nên, đồng thời sẽ tạo điều kiện để
các thành viên trong gia đình gần gũi và quan tâm đến nhau hơn.
Hiện nay, ở các thành phố trên thị trường có nhiều lọai thức ăn chế biến sẵn
hay ăn liền bày bán trong các cửa hàng hay quán ăn trên vỉa hè rất thuận tiện cho
việc ăn nhanh và ăn cá nhân. Hầu hết các lọai thức ăn này đều chế biến hấp dẫn để
kích thích người mua và sử dụng nhưng giá trị dinh dưỡng của chúng thường đơn
điệu, nghèo nàn và có thể không đảm bảo vệ sinh. Vì vậy các gia đình nên duy trì
bữa ăn tập trung gia đình với các món ăn ngon miệng, truyền thống dân tộc. Người
phụ nữ trong gia đình cần có hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng, giá trị dinh dưỡng

của từng lọai thức ăn và biết cách tổ chức tốt bữa ăn đủ dinh dưỡng, ngon, lành, tình
cảm và tiết kiệm.
1.1.3. Chế độ ăn của người trưởng thành
1.2.

Lipit và các chất chống oxy hóa chính.

1.2.1. Lipit.


3

Lipid (chất béo) là một nhóm lớn các hợp chất tan nhiều trong dung môi hữu
cơ nhưng kém tan trong nước, có chứa các nhóm hydrocacbon là thành phần sơ cấp
của phân tử, và có mặt trong hoặc có nguồn gốc từ cơ thể sống [41]. Theo định
nghĩa này thì lipid bao gồm các acid béo, axylglicerol, este của acid béo, và các
hydrocacbon thuộc nhóm isoprenoid. Các hợp chất cũng nằm trong định nghĩa này
nhưng thường được coi là nằm trong nhóm khác như: carotenoid, sterol, các vitamin
A, E, D, và K. Chúng là thành phần chính của mô mỡ, cùng với protein và
cacbohydrat chúng tạo thành bộ khung cấu trúc của mọi tế bào sống. Các este
glycerol và acid béo chiếm tới 99% lượng lipid có nguồn gốc động vật và thực vật
(dầu, mỡ). Sự phân biệt này chủ yếu dựa trên trạng thái tồn tại của chúng ở nhiệt độ
phòng ở dạng rắn hay lỏng và hai dạng này có thể chuyển hoá lẫn nhau [36].
Lipid đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng. Chúng cung cấp năng
lượng và các acid béo cần thiết, hoà tan một số vitamin, làm tăng giá trị cảm quan
của thực phẩm, nhưng trong vài thập kỷ trở lại đây, chúng trở thành trung tâm của
các cuộc tranh luận về trách nhiệm đối với độc tính, chứng béo phì và các bệnh mãn
tính khác như : loãng xương, động mạch vành, một số bệnh ung thư do nguyên nhân
ăn uống, choáng đột qụy, đái tháo đường không phụ thuộc Insulin và xơ vữa động
mạch.

1.2.2. Sự oxy hoá lipid.
Sự oxy hoá lipid có thể được tiến hành theo hai con đường enzym và phi
enzym (tự oxy hoá) [41]. Phản ứng oxy hoá dưới tác dụng của enzym được xúc tác
bởi enzym như lipoxygenase và phản ứng tự oxy hoá xảy ra theo cơ chế tự xúc tác.
Quá trình oxy hoá lipid tạo ra các sản phẩm bậc một là hydropeoxit và các gốc tự
do. Các gốc tự do là tác nhân gây ra các bệnh nguy hiểm: ung thư, lão hoá tế bào,
đái tháo đường, xơ vữa động mạch, động mạch vành, choáng đột qụy…. Sau đó
hydropeoxit tiếp tục bị phân huỷ tạo ra các anđehit no và không no, xeton,
epoxit…[36].
Một cách tổng quát, phản ứng oxy hoá lipid xảy ra theo cơ chế sau :
1.2.2.1.

Oxy hoá gốc tự do.

¾ Khơi mào:
LH + In
¾ Phát triển mạch:

L’ + InH

(2.1)


4

L’ + O2
LOO’ + LH

LOO’
LOOH + L

’

(2.2)
(2.3)

¾ Ngắt mạch:
LOO’ + LOO
LOOL + O2
(2.4)
LOO’ + L
LOOL
(2.5)
’
L +L
LL
(2.6)
Phản ứng oxy hoá có thể khơi mào bởi các gốc có trong cơ thể sống (như
hydropeoxit H2O2 , hydroxit HO’, peoxit ROO’, acoxyl RO’, alkyl R’), hoặc bởi
nhiệt độ, ánh sáng, ion kim loại chuyển tiếp….
1.2.2.2.

Sản phẩm oxy hoá bậc hai.

Sự phân huỷ các gốc tự do tạo thành sản phẩm oxy hoá bậc hai như xeton,
anđehit, hydroxit với nhóm chức ở các vị trí khác nhau phụ thuộc vào các acid béo
không no, các epoxit, dime và oligome. Thậm chí dưới điều kiện êm dịu (25 –
40oC), các acid không no cũng bị oxy hoá tạo thành nhiều dime khác nhau qua các
liên kết peoxit, cacbon – cacbon, cacbon – etedien, và trien liên hợp. Các hợp chất
dễ bay hơi được tạo thành là kết quả của sự phân cắt beta của hydropeoxit. Đó là

anđehit mạch ngắn bão hoà và không bão hoà (cis, trans) alcol và hydrocacbon [34].
1.2.3. Một số chất chống oxy hóa trong thực phẩm và tác dụng sinh học
Trong mấy chục năm gần đây, vấn đề vai trò các chất dinh dưỡng chống oxy
hoá và các gốc tự do đã được nghiên cứu nhiều. Cách đây 30 năm (1970) Linus
Pauling, nhà hoá học hai lần được giải Noben đã viết: “ Các acid béo chưa no giữ
vai trò quan trọng trong bộ máy sinh hoá của chúng ta, trong các màng tế bào và
các mô khác. Các chất do đó oxy hoá sẽ chuyển thành peroxit có hại. Vitamin C
và vitamin E là các chất chống oxy hoá tự nhiên. Tăng cường các vitamin này sẽ
tăng cường bảo vệ tim mạch. Vitamin E có thể quan trọng hơn nhưng vitamin C
cũng quan trọng. Ăn đủ vitamin C và vitamin E có thể phòng già trước tuổi nhất
là khi chế độ ăn giàu acid béo chưa no.” [8].
Mọi người đều biết quá trình oxy hoá – khử là quá trình quan trọng và phổ
biến trong mọi cơ thể sống trước hết để giải phóng năng lượng. Cơ thể cần oxy cho
các hoạt động chuyển hoá bình thường, nhưng oxy cũng có những phản ứng bất lợi
đối với nhiều thành phần khác của tế bào. Một số phản ứng sinh học đó sản sinh ra
các gốc tự do. Trong các thành phần của tế bào bị tấn công trước hết đó là màng tế


5

bào vì ở đó có nhiều acid béo chưa no. Quá trình oxy hoá với sự có mặt của các gốc
tự do sẽ tạo nên các peroxyt của lipid, điều đó được coi là một phản ứng thoái hoá
sinh học [8].
May thay thiên nhiên đã tạo ra ở các vi sinh vật một hệ thống chống oxy hoá
gồm những enzyme chống oxy hoá ở nội bào và các chất chống oxy hoá ở ngoại
bào như: glutathion, vitamin E, vitamin C, vitamin A (β-caroten) và selenium.
Người ta cũng nhận thấy nhiều chất có nguồn gốc thực vật như các polyphenol, các
carotenoid và một số chất khác ở rau, hoa, quả có tác dụng chống oxy hoá tốt.
Một chế độ dinh dưỡng giàu các chất chống oxy hoá có vai trò dự phòng đối
với các bệnh động mạch vành do xơ vữa động mạch, ung thư, đục thuỷ tinh thể và

sự già hoá [3].
Có nhiều chất chống oxy hoá (AntH) theo nhiều cơ chế chống oxy hoá khác
nhau song các cơ chế phổ biến nhất là : bẫy gốc tự do, tác dụng với gốc tự do tạo
thành gốc bền, tạo phức vòng càng với gốc tự do. Cũng có nhiều chất có hoạt tính
chống oxy hoá một cách gián tiếp chúng ảnh hưởng đến sự tạo thành gốc tự do qua
con đường gián tiếp, như ức chế hoạt động của enzym xúc tác cho quá trình oxy hoá
(Denisov, Afanasev, 2005)
Chất ức chế gốc tự do trực tiếp ngăn chặn sự tạo thành gốc tự do qua phản ứng
với gốc tự do tạo thành gốc mới không hoạt động hoặc tạo thành phức vòng càng
với kim loại chuyển tiếp tạo thành phức chất không hoạt động
HO’ + AntH
H2O + Ant’
(2.7)
’
’
ROO + AntH
ROOH + Ant
(2.8)
1.2.3.1.

Lycopen và tác dụng sinh học của lycopen

Lycopen là thành viên của họ carotenoid, đó là một chất hóa thực vật có màu
đỏ sáng có trong một số loại rau, quả, như cà chua, dưa hấu... Thực vật và vi sinh
vật tự tổng hợp được lycopen nhưng động vật thì không tự tổng hợp được.
Bảng 1.1. Hàm lượng lycopen trong một số thực phẩm [35].
Thực phẩm

Dạng thực phẩm

Hàm lượng lycopen (mg/100g)

Nho

Tím, tươi

3,36

Ổi

Hồng, tươi

5,40

Nước ổi

Hồng, đã chế biến

3,34

Ketchup

Đã chế biến

16,60

Đu đủ

Đỏ, tươi

2,00 – 5,30


6

Sốt pizza

Lon

12,71

Sốt spaghetti

Đã chế biến

17,50

Cà chua

Đỏ, tươi

3,10 – 7,74

Cà chua

Đã chế biến

11,21

Nước cà chua

Đã chế biến

7,83

Súp cà chua

Lon, cô đặc

3,99

Cà chua dạng paste

Lon

30,07

Dưa hấu

Đỏ, tươi

4,10

Lycopen không đơn thuần chỉ là một chất màu, nó còn là một chất chống oxy
hóa nhờ khả năng làm vô hiệu các gốc tự do, đặc biệt là các oxy nguyên tử, do đó
lycopen có tác dụng bảo vệ chống lại các bệnh ung thư, xơ vữa động mạch và các
bệnh liên quan đến động mạch vành. Lycopen làm giảm sự oxy hóa LDL (low
density lipoprotein) và giúp làm giảm mức cholesterol trong máu.
Lycopen là một tecpen được tập hợp từ 8 isoprene. Công thức phân tử của
lycopen là C40H56 và có khối lượng phân tử là 536,88 dalton. Nó là một chuỗi

hydrocacbon mạch thẳng không bão hòa chứa 11 nối đôi liên hợp và 2 nối đôi
không liên hợp. Khác với các carotenoid khác hai vòng cácbon ở hai đầu mạch của
lycopen không kín. Công thức cấu trúc phân tử của lycopen được thể hiện ở hình
1.1.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của lycopen
Lycopen ở dạng đồng phân all-trans là dạng đồng phân hình học chiếm ưu
thế hơn được tìm thấy trong thực vật. Đồng phân dạng cis của lycopen cũng được


7

tìm thấy trong tự nhiên, bao gồm dạng đồng phân 5-cis, 9-cis, 13-cis và 15-cis.
Lycopen được tìm thấy trong huyết thanh người là hỗn hợp của gần 50% lycopen
dạng cis và 50% dạng all-trans. Lycopen trong các thực phẩm chế biến chủ yếu ở
dạng đồng phân cis [21].
Lycopen là một chất hòa tan trong chất béo và không hòa tan trong nước.
Lycopen được biết nhiều như là một chất chống oxy hóa, cả hai cơ chế oxy hóa và
không oxy hóa đều liên quan đến hoạt tính bảo vệ sinh học của nó. Do cấu trúc của
lycopen thiếu vòng beta-ionone nên nó không thể tạo nên vitamin A và tác dụng
sinh học của nó trong cơ thể người có cơ chế khác với vitamin A. Do vậy, khác với
beta-caroten, lycopen không có hoạt tính của vitamin A, nó không phải là tiền tố
của vitamin A.
Với công thức cấu tạo của lycopen cho phép nó khử hoạt tính của các gốc tự
do. Do các gốc tự do là các phân tử không cân bằng điện hóa học, chúng có khả
năng phản ứng cao với các thành phần tế bào và gây ra sự phá hủy thường xuyên.
Các oxy nguyên tử là dạng hoạt động nhất. Các chất hóa học không tốt này được tạo
nên trong tự nhiên như là sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa trao đổi chất của các
tế bào. Các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng lycopen có hoạt tính chống oxy
hóa cao nhất trong số các carotenoid.

Lycopen có khả năng ngăn chặn oxy nguyên tử, “bẫy” gốc tự do peroxyl, ức
chế oxy hóa DNA, ức chế peroxyt hóa lipid và trong một vài nghiên cứu cho thấy
lycopen có khả năng ức chế oxy hóa low density lipoprotein (LDL). Khả năng dập
tắt các oxy nguyên tử của lycopen cao gấp 2 lần so với beta-caroten và cao hơn gấp
10 lần so với alpha-tocopherol [31].
Bảng 1.2. Hệ số chống oxy hóa của một số carotenoid [31].
Carotenoid

Hệ số chống oxy hóa

Lycopen

31

γ-caroten

25

Astaxanthin

24

Canthaxanthin

21

α-caroten

19

β-caroten

14

Zeaxanthin

10

Lutein

8


8

Do lycopen có chuỗi nối đôi liên hợp, chúng có khả năng đặc biệt ngăn chặn
các gốc tự do, trong đó có oxy nguyên tử. Oxy nguyên tử là gốc tự do có hoạt tính
cao được tạo thành trong quá trình chuyển hóa, chúng phản ứng với các axit béo
không no, là thành phần chính của màng tế bào. Do đó, lycopen có trong màng tế
bào đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa tác hại của việc oxy hóa màng
lipid, vì vậy ảnh hưởng đến độ dày, độ bền của màng. Màng tế bào là người gác
cổng cho tế bào, nó cho phép các chất dinh dưỡng đi vào và ngăn ngừa không cho
các chất độc đi vào tế bào. Vì vậy, việc duy trì sự nguyên vẹn của màng tế bào là
yếu tố then chốt trong việc phòng ngừa bệnh tật.
Lycopen là loại carotenoid phổ biến nhất trong cơ thể người. Bảng 1.3. cho
thấy hàm lượng lycopen trong một số bộ phận của cơ thể người.
Bảng 1.3. Hàm lượng lycopen trong một số bộ phận của cơ thể người [37]
Cơ quan

Lycopen (nmol/g)

Tinh hoàn

4,34 – 21,36

Thượng thận

1,90 – 21,60

Gan

1,28 – 5,72

Tiền liệt

0,80

Vú

0,78

Tụy

0,7

Da

0,42

Đại tràng

0,31

Buồng trứng

0,30

Phổi

0,22 – 0,57

Thận

0,15 – 0,62

Dạ dày

0,2

Lycopen cũng như các carotenoid chủ yếu được các LDL mang trong huyết
thanh nên chúng có vai trò bảo vệ LDL không bị oxy hóa. Lycopen đóng vai trò
quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh tim mạch do nó ngăn chặn các gốc tự do phá
hủy LDL cholesterol. Cholesterol bị oxy hóa bởi các gốc tự do và lắng lại thành các
mảng cứng và làm hẹp động mạch. Với hoạt tính chống oxy hóa mạnh, lycopen có
thể ngăn ngừa LDL cholesterol khỏi bị oxy hóa.


9

Các nghiên cứu dịch tễ học gần đây cho thấy mối liên quan giữa việc giảm

nguy cơ bệnh tim mạch với chế độ ăn giàu lycopen. Việc giảm nguy cơ này chủ yếu
là do tính chất chống oxy hóa của lycopen. LDL chứa các axit béo không no và có
thể bị oxy hóa bởi các gốc tự do và tác nhân peroxyt hóa. Lycopen chủ yếu gắn vào
LDL trong huyết thanh, nó có thể bảo vệ chống lại chứng xơ vữa động mạch thông
qua việc ức chế peroxyt hóa lipid.
Trong các nghiên cứu dịch tễ và thực nghiệm cho thấy lycopen bảo vệ chống
lại tác hại của oxy hóa lipid và góp phần giảm nguy cơ các bệnh mạn tính. Người ta
cũng quan sát thấy có sự giảm đáng kể oxy hóa lypid máu và DNA.
Trong nghiên cứu của các tác giả Nhật bản khi bổ sung lycopen với hàm
lượng 15 và 45mg/ngày từ nước quả cà chua đã nhận thấy giảm sự peroxyt hóa lipid
[32]. Tuy nhiên, trong một nghiên cứu gần đây của Rao và cs với mức lycopen ăn
vào thấp (từ 5, 10 đến 20 mg/ngày) cũng cho thấy mức lycopen huyết thanh tăng
đáng kể từ 92% lên đến 216% và giảm peroxyt hóa lipid trung bình 10% [32].
Lycopen ức chế sự tăng sinh của nhiều dòng tế bào ung thư (như các ung thư
tuyến tiền liệt, vú, buồng trứng, cổ tử cung, thực quản, dạ dày, đại tràng...). Nhiều
nghiên cứu cho thấy mối liên quan giữa việc ăn nhiều lycopen với việc giảm nguy
cơ ung thư ở một số cơ quan đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt [26]. Lycopen là một
cấu tử không thể thiếu trong hệ thống miễn dịch. Các tế bào miễn dịch rất nhạy với
các gốc tự do. Khi có mặt của các gốc tự do, các tế bào miễn dịch sẽ tập trung lại và
nhờ lycopen ngăn chặn sự hoạt động của các gốc tự do. Lycopen cũng làm tăng
hoạt động của các tế bào giết (killer cells) của hệ thống các tế bào miễn dịch. Sự
thiếu hụt lycopen sẽ làm giảm hiệu quả của hệ thống miễn dịch và kết quả là các
bệnh nhiễm trùng sẽ phát triển.
Như vậy, lycopen là một chất chống oxy hóa tự nhiên rất cần thiết cho tế bào
sống, đảm bảo tính bền chắc của màng tế bào, ngăn cản các tác nhân oxy hóa độc
do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất, đặc biệt nó đã giúp cho cơ thể ngăn
ngừa và chữa trị các bệnh mạn tính không lây như tim mạch, ung thư, các bệnh liên
quan đến tuổi già.
1.2.3.2. β-caroten và tác dụng sinh học của β-caroten
β-caroten là thành viên của họ carotenoid. Tương tự các carotenoid khác,

beta-caroten là chất mầu tự nhiên (đặc trưng là mầu vàng của củ cà rốt) tan trong
chất béo, không tan trong nước, được tìm thấy chủ yếu trong thực vật. Beta-caroten


10

là polyisoprenoid, phân tử gồm 40 nguyên tử cácbon có công thức C40H56 và hệ
thống các nối đôi liên hợp, hai đầu của chuỗi liên hợp là một cấu trúc vòng. Khối
lượng phân tử của beta-caroten là 536,9. Beta-caroten rất bền trong quá trình nấu
nướng, nhưng nó có thể bị mất một chút hoạt tính trong quá trình cất giữ do sự phá
hủy bởi ánh sáng và không khí. Công thức cấu trúc của beta-caroten được thể hiện ở
hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của β-caroten
β-caroten được biết như là tiền chất của vitamin A, bởi vì nó là một trong
những tiền tố quan trọng nhất của vitamin A trong chế độ ăn của con người. βcaroten chính là nguồn vitamin A an toàn. Hiệu quả chuyển đổi β-caroten thành
vitamin A tùy thuộc vào mức ăn vào. Nếu ăn nhiều β-caroten hơn là mức được
chuyển đổi thành vitamin A thì nó sẽ được tích trữ ngược lại trong chất béo của cơ
thể. Vì vậy, nếu quá nhiều β-caroten thì sẽ làm cơ thể bị vàng.
β-caroten được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng all-trans β-caroten và 9-cis βcaroten. Một lượng rất nhỏ 13-cis β-caroten cũng được tìm thấy trong tự nhiên. Cà
rốt là nguồn β-caroten tự nhiên chính trong chế độ ăn. β-caroten cũng được tìm thấy
trong dưa đỏ, bông cải xanh, ...
Hàm lượng β-caroten trong một số thực phẩm tươi sống được trình bày ở bảng 1.4.
Bảng 1.4. Hàm lượng β-caroten trong một số thực phẩm tươi sống [27]
Thực phẩm

β-caroten (µg/100g)

Sữa

21

Phomat

225

Gan

100

Bơ

432

Cải bắp

300

Spinach

6000

Đậu Hà Lan

80


11

Cà rốt

1200

Cà chua

600

β-caroten sẽ là chất dinh dưỡng cần thiết khi chế độ ăn thiếu vitamin A. Vì βcaroten là tiền chất của vitamin A nên nó đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn
ngừa các bệnh do thiếu vitamin A như bệnh khô giác mạc ảnh hưởng đến thị lực và
gây mềm giác mạc, tăng mắc các bệnh nhiễm trùng đặc biệt là tiêu chảy và viêm
đường hô hấp, nó còn là nguyên nhân của sự chậm phát triển thể lực và tinh thần
của trẻ em.
Ngoài lợi ích là tiền chất của vitamin A, β-caroten cũng giống như các
carotenoid khác, là chất chống oxy hóa tự nhiên, nó có thể ngăn chặn các oxy
nguyên tử, dọn sạch các gốc peroxyl và ngăn ngừa sự peroxyt hóa lipid, làm giảm
khả năng oxy hóa LDL, ngăn ngừa bệnh tim mạch, làm tăng khả năng miễn dịch và
chống ung thư.
Chế độ ăn ít chất béo sẽ làm cho việc hấp thụ β-caroten kém. Chỉ bổ sung
lượng nhỏ chất béo trong chế độ ăn sẽ làm tăng khả năng hấp thụ β-caroten lên
50%. Nghiên cứu cho thấy hàm lượng β-caroten nên ăn vào hàng ngày từ 5 – 15mg,
lượng β-caroten này nên được lấy từ thức ăn thực vật và nó tác dụng tốt với bệnh
tim mạch khi được ăn vào cùng với các chất chống oxy hóa khác như lycopen,
vitamin E...[20].
Vitamin A và β-caroten rất cần thiết cho sự sinh sản và phát triển của tế bào.
Chúng tham gia trong sự tạo thành các tổ chức mô, khung xương, làm tăng chức
năng hoạt động của màng bảo vệ của niêm mạc và da. Vitamin A còn tham gia vào
các quá trình trao đổi chất trong cơ thể. Đặc biệt, nó còn là nhân tố rất quan trọng và
cần thiết cho hoạt động của mắt, thiếu vitamin A sẽ dẫn đến quáng gà, khô giác mạc
và nhiều trường hợp sẽ dẫn đến mù loà. Đối với trẻ em thiếu vitamin A sẽ gây ra
tình trạng suy dinh dưỡng protein [13].

Các nhà khoa học trên xứ sở của công nương Diana đã chứng minh rằng yếu
tố quyết định trong toàn bộ quy trình chống ung thư của rau quả chính là β-caroten,
tiền sinh tố A [12]. Đây chính là lí do tại sao sinh tố A trong thực phẩm nguồn gốc
động vật chỉ có hiệu lực cục bộ trên thị giác, niêm mạc, nói cách khác trong phòng
chống ung thư một miếng carot có giá trị hơn một miếng gan heo.Theo dõi một số
kết quả nghiên cứu dịch tế học và thực nghiệm các nhà khoa học đã xác định, β-


12

caroten ức chế sinh sản tế bào mới và sau đó ức chế sự hình thành ung thư [2].
Chuyên gia đại học Einstein, New York, đã áp dụng tiền sinh tố A trên súc vật thí
nghiệm bị gây ung thư và quả quyết là các chất này có khả năng ngăn chặn sự phát
triển của u bướu. Tác dụng phòng chống ung thư của tiền sinh tố A đã được chứng
minh nếu áp dụng trong thời kỳ bệnh chưa bột phát, ngay cả khi u bướu đã phát
triển, tiền sinh tố A vẫn được xem là có khả năng điều trị [12], ngoài ra tiền sinh tố
A còn hỗ trợ phương pháp trị liệu phóng xạ. Năm 1994, Mayne ST và cộng sự đã
khảo sát trên 413 đối tượng cả nam và nữ đều không hút thuốc và nhận thấy ăn
nhiều rau quả có β-caroten và vitamin E đã có tác dụng phối hợp làm giảm ung thư
phổi cho cả nam và nữ [33].Đối với bệnh tim mạch, carotenoid thường sử dụng để
giảm nguy cơ bệnh tim mạch, động mạch vành, đột quỵ. β- caroten còn bảo vệ tăng
cường hoạt động của phổi đối với người bị hen [14], chống lại sự hư hỏng phân tử
tế bào do các gốc tự do được tích luỹ theo tuổi tác.
Nhu cầu của con người về vitamin A là khác nhau tùy thuộc vào độ tuổi, và
được thể hiện ở bảng 1.5 sau
Bảng 1.5: Nhu cầu khuyến nghị về vitamin A [1].
Đối tượng

Tháng tuổi

Nhu cầu (µg/ngày)

<6

375

6-11

400

1-3

400

4-6

450

7-9

500

Nam vị thành niên (tuổi)

10-18

600

Nữ vị thành niên (tuổi)

10-18

600

Nam trưởng thành
(tuổi)

19-60

600

>60

600

Nữ trưởng thành
(tuổi)

19-60

500

>60

600

Trẻ em (tháng tuổi)

Trẻ nhỏ (năm tuổi)

Phụ nữ mang thai
Bà mẹ cho con bú
1.2.3.3.

Cấu trúc và tác dụng sinh học của vitamin E

800
850


13

Vitamin E là một vitamin hòa tan trong chất béo và tồn tại ở 8 dạng khác
nhau, 4 dạng thuộc nhóm tocopherol và 4 dạng thuộc nhóm tocotrienol, mỗi nhóm
có một cấu trúc hóa học đồng nhất của vitamin E trong thực phẩm. 4 tocopherol
được biết rõ là alpha, beta, gamma và delta-tocopherol có dạng dầu màu vàng. Mỗi
một dạng có hoạt tính sinh học riêng, trong đó D – apha – tocopherol có hoạt tính
sinh học cao nhất. Trong cơ thể, dạng vitamin E có chủ yếu là alpha-tocopherol.
Công thức hóa học của vitamin E là C29H50O2, khối lượng phân tử 430,72, có cấu
trúc vòng chromanol và chuỗi isoprenoid. Cả chuỗi isoprenoid và vòng chromanol
đều có liên quan đến chức năng chống oxy hóa của vitamin.
Công thức cấu trúc của vitamin E được trình bày ở hình 1.3.

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của vitamin E
Vitamin E chỉ được tổng hợp ở thực vật vì vậy dầu thực vật là nguồn vitamin
E chính trong chế độ ăn. Vì hòa tan trong chất béo nên vitamin E không bị mất vào
trong nước chế biến trong quá trình lọc và nói chung là ổn định. Vitamin E khá bền
với nhiệt. Tuy nhiên, vì là chất chống oxy hóa có nhiều trong dầu thực vật nên nó bị
phá hủy trong điều kiện oxy hóa như dưới tác dụng của không khí và ánh sáng, tăng
khả năng oxy hóa bởi nhiệt và sự có mặt của đồng. Vitamin E rất cần cho sự sống

14

và phát triển. Tuy nhiên, cơ thể người không tự tổng hợp được vitamin E, chúng ta
phụ thuộc chủ yếu vào chế độ ăn hoặc bổ sung cho nhu cầu vitamin E
Giống như các chất chống oxy hóa khác, vitamin E có thể ngăn ngừa và làm
chậm sự phát triển của bệnh tim mạch. Oxy hóa LDL-cholesterol sẽ thúc đẩy dầy
thành động mạch dẫn đến vữa xơ động mạch và gây ra cơn đau tim. Vitamin E giúp
ngăn ngừa hoặc làm chậm sự phát triển bệnh tim mạch bằng cách hạn chế oxy hóa
LDL-cholesterol. Vitamin E cũng giúp ngăn ngừa việc hình thành các cục máu sẽ
có thể dẫn đến cơn đau tim. Nhiều nghiên cứu cho thấy với mức vitamin E ăn vào
cao sẽ giảm bệnh tim mạch.
Bảng 1.6. Hàm lượng vitamin E trong một số loại dầu ăn [20]
Loại dầu

Vitamin E (mg/kg)

Dầu đậu nành

560-1600

Dầu ngô

530-1620

Dầu lạc

200-320

Dầu cọ

330-730

Dầu olive

50-150

Các chất chống oxy hóa cũng như vitamin E bảo vệ chống lại ảnh hưởng
không tốt của các gốc tự do như có thể gây ra sự phá hủy các tế bào và có thể góp
phần gây ra các bệnh mạn tính. Vitamin E có thể chặn đứng việc hình thành các
nitrosamine, là các chất gây ung thư được tạo ra trong dạ dày do việc tiêu thụ các
chất nitrit trong chế độ ăn. Nó có thể bảo vệ chống lại sự phát triển của các bệnh
ung thư bằng cách tăng cường chức năng miễn dịch.
Ngoài ra có nhiều nghiên cứu cho thấy vitamin E còn có tác dụng ngăn ngừa
sự già hóa và sự phát triển các bệnh của tuổi già như đục nhân mắt, Alzheimer,
Parkinson. Nhu cầu vitamin E trong cơ thể là không lớn lắm và trong cơ thể lượng
vitamin E dữ trữ đủ để đảm bảo được trong một thời gian dài tới vài tháng vì vậy ít
xảy ra hiện tượng thiếu vitamin E. Nhu cầu vitamin E khuyến nghị của con nguời
dao động từ 3-18(µg/ngày)[1] tùy theo từng đối tượng và được thể hiện ở bảng 1.7
dưới đây.
Bảng 1.7: Nhu cầu khuyến nghị về vitamin E [1]
Đối tượng

Tháng tuổi

Nhu cầu (µg/ngày)

Trẻ em (tháng tuổi)

<6

3


15

Trẻ nhỏ (năm tuổi)

Trai vị thành niên (tuổi)

Gái vị thành niên (tuổi)

6-11

4

1-3

5

4-6

6

7-9

7

10-12

10

13-15

12

16-18

13

10-12

11

13-15

12

16-18

12

Nam trưởng thành ≥ 19
tuổi
Nữ trưởng thành ≥ 19 tuổi

12
Bình thường

12

Có thai

12

Cho con bú

18

1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến đề tài.
1.2.4.1.

Trong nước

Năm 1989, bộ môn Hoá Dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã bước đầu
xác định sự có mặt của Vitamin E trong dầu hạt đậu tương bằng phương pháp sắc
ký bản mỏng so sánh với Vitamin E ở dạng tự do. Nhóm tác giả này cũng đã xác
định được một lượng nhỏ Vitamin E có trong dầu màng gấc bằng phương pháp sắc
kí lớp mỏng và sắc kí lỏng cao áp. Đầu năm 1993 Phạm Gia Huệ và cộng sự đề cập
đến sự có mặt của Vitamin E trong dầu gấc [9], [14], [6].
Lê Doãn Diên, Phan Quốc Kinh và cộng sự đã tiến hành xác định sự có mặt
của Vitamin E ở trong hạt đậu tương đã nảy mầm trong phôi ngô đặc biệt trong thịt
quả gấc [9].
Ở Việt Nam, từ hơn 30 năm nay, phương pháp HPLC đã được ứng dụng để
phân tích nhiều loại hợp chất có trong nhiều đối tượng khác nhau. Tuy nhiên, mãi
đến năm 2003, hầu như vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào nghiên cứu ứng
dụng phương pháp HPLC trong định lượng carotenoit nói chung. Nguyên nhân có
lẽ là do chúng ta chưa quan tâm đến loại hợp chất này (những hoạt tính sinh học

16

của carotenoit chỉ mới được khẳng định trong những năm gần đây). Mặt khác,
những đòi hỏi khắt khe về điều kiện thực nghiệm nhằm tránh sự phân hủy
carotenoid trong quá trình phân tích và việc không có được chất chuẩn carotenoit
cũng được xem là những trở ngại lớn đối với các nhà phân tích.
1.2.4.2.

Trên thế giới

Vào năm 1922, các nhà nghiên cứu Evans, Scott và Bishop đã ly trích và xác
định được cấu trúc của sinh tố E.
Sinh tố E còn mang tên tocopherol, có nghĩa là nữ hộ sinh, dựa vào nhận xét
về tác dụng tăng cường khả năng sinh sản của sinh tố E trong thực phẩm ngũ cốc,
trên súc vật thí nghiệm (trích “Khoẻ vì sinh tố mạnh nhờ khoáng tố, BS. Lương Lễ
Hoàng).
Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol và
4 tocotrienol. Tất cả đều có vòng choromanol, với nhóm hyđroxyl có thể cung cấp
nguyên tử hyđro để khử các gốc tự do và nhóm R (phần còn lại của phân tử) sợ
nước để cho phép thâm nhập vào các màng sinh học. Các tocopherol và tocotrienol
đều có dạng alpha, beta, gamma và delta, được xác định theo số lượng và vị trí của
các nhóm metyl trên vòng choromanol. Mỗi dạng có hoạt động sinh học hơi khác
nhau.
Lần đầu tiên, vitamin E được Evans và cộng sự phân lập từ mầm lúa mì vào
năm 1936. Một năm sau, 1937, Fernholz đã xác định được cấu trúc của nó [25].
Năm 1938 Karrer và cộng sự đã xác định cấu trúc hoá học của α-tocopherol
và tác giả tiến hành bán tổng hợp chất này băng phương pháp đơn giản. Bằng cách
ngưng tụ pseudocumohydroquinol với phytylbromid với sự có mặt của kẽm clorid.
Weber và cộng sự (năm 1955) đã điều chế d1-α-tocopherol acetat từ d1-α –

tocopherol và acetic anhydrid.
Năm 1936, Emerson và cộng sự đã điều chế và tách riêng được β- tocopherol
từ các nguồn tự nhiên và đồng thời tách được γ-tocopherol từ dầu đậu tương, phôi
ngô bằng cách chuyển các tocopherol thành dạng allophatnat kết tinh. Cũng vào
năm này, Demole và cộng sự đã điều chế dl-α-tocopherol succinat từ dl-αtocopherol và succinic anhydrid trong pyripdin [9].
ε-tocopherol lần đầu tiên được chiết xuất từ dầu đậu tương bởi Stern và cộng
sự vào năm 1947. Năm 1959, Green và cộng sự đã tiến hành tổng hợp được chất
này.


17

Năm 1956, Green và cộng sự đã chiết xuất được ζ2-tocopherol và ηtocopherol từ gạo, tới năm 1959 cũng chính tác giả đã xác định được cấu trúc của
nó. ζ2-tocopherol và η-tocopherol được tổng hợp bởi Mc Hale và cộng dự năm
1958 [9].
ε-tocopherol được chiết xuất từ cám bởi Eggit và cộng sự, năm 1953. Cấu trúc
của nó được Green và cộng sự xác định vào năm 1959. Đến năm 1963, Schudel và
cộng sự đã tổng hợp được chất này bằng con đường hoá học.
Năm 1953, Green và cộng sự đã chiết xuất được ζ1-tocopherol từ cám lúa mì.
Cũng chính tác giả cũng xác định được cấu trúc của nó vào năm 1959. Tới năm
1963, Schudel và cộng sự đã tổng hợp được chất này [9].
Nhóm nghiên cứu do tiến sĩ A. Elizabeth Hak (thuộc Viện Sức khỏe Cộng
đồng Harvard, bang Massachusett, Mỹ) chủ trì đã tiến hành theo dõi 22.071 bác sĩ
nam trong 13 năm về tác dụng của carotenoid đối với nguy cơ tim mạch. Trước
nghiên cứu, không có đối tượng nào mắc bệnh tim mạch. Đến thời hạn, người ta
nhận thấy có 297 người bị bệnh thiếu máu cơ tim – là một bệnh về tim mạch do
giảm sự lưu thông máu giới hạn ở một vùng hay lan tỏa khắp cơ tim.
Tiến sĩ Hak và cộng sự đã phân tích nồng độ các chất chống oxy hóa (gồm
carotenoid và vitamin E) trong máu của 297 bệnh nhân trên với 297 người khác
không mắc bệnh. Carotenoid là những sắc tố thiên nhiên có trong trái cây và rau

xanh (nhất là trong các loại rau quả có màu cam và đỏ). 5 loại carotenoid được khảo
sát trên những người bệnh này là: alpha và beta-caroten, beta-cryptoxantin, lutein và
lycopen. Những chất chống oxy hóa khác cũng được nghiên cứu là retinol (tiền
vitamin A), alpha và beta-tocopherol (vitamin E)
Kết quả những người có nồng độ alpha, beta-caroten và lycopen cao trong
máu thì nguy cơ bị thiếu máu giảm đi. Người ta còn nhận thấy nguy cơ này giảm
đến 40% ở những người có nồng độ các chất chống oxy hóa cao nhất. Còn các chất
beta cryptoxantin, lutein, retinol và tocopherol không có ảnh hưởng gì đối với nguy
cơ trên. Theo tiến sĩ Hak, kết quả thực nghiệm này cho thấy nồng độ carotenoid cao
trong máu có thể giúp làm giảm nguy cơ bị thiếu máu cơ tim.
1.3.

Các phương pháp phân tích chất chống oxy hóa (vitamin E, Lycopen và
β-caroten).

Hiện nay, các phương pháp phân tích carotenoid trong thực phẩm đang được
phát triển, bao gồm sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp, để thay thế hoặc bổ


18

sung cho phương pháp phân tích cổ điển (sắc ký cột mở - OCC) [37]. Để định tính
và đánh giá cấu trúc carotenoid, các phương pháp phổ biến là quang phổ UV-VIS,
phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ [28], [29], [30]. Ngoài ra, phương
pháp xác định bằng điện hóa (ECD) cũng là một công cụ rất hữu ích, thay thế cho
phương pháp HPLC (UV-VIS) thông thường, trong những trường hợp đòi hỏi độ
nhạy cao (cỡ 10-15) đối với cỡ mẫu nhỏ hoặc phân tích lượng vết. Phương pháp đo
quang phổ tử ngoại-khả kiến (UV-VIS) thường được dùng để ước lượng tổng số
carotenoids, tuy nhiên, phương pháp sắc ký lỏng cao áp (pha thường và pha ngược,
C18 và C30) được dùng phổ biến nhất để xác định từng carotenoid riêng biệt.

Nhiều công trình trên thế giới đã nghiên cứu và công bố số liệu phân tích các
thành phần chống oxy hoá như: vitamin E, β-caroten, lycopen và các phytosterol.
Vitamin E, β-caroten, lycopen trong thực phẩm được phân tích chủ yếu bằng
phương pháp sắc ký lỏng, phytosterol được phân tích chủ yếu bằng phương pháp
sắc ký khí. Các phương pháp phân tích các chất này trong một số đối tượng thực
phẩm cũng đã được tiêu chuẩn hoá trong các tài liệu của IUPAC và AOAC. Bảng
thành phần thực phẩm của nhiều nước như Mỹ, Canada, Nhật Bản và một số nước
châu Âu đã có số liệu phân tích một số chất này trong nhiều đối tượng thực phẩm
thông dụng nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về dinh dưỡng. Một số nước đã công
bố các số liệu của các thành phần nói trên trên mạng Internet như Mỹ và Canada.
Một thực phẩm thông dụng của Việt Nam là quả gấc cũng đã được nghiên cứu rất
sâu và phân tích các thành phần acid béo, beta-caroten, lycopen và các carotenoid
khác.[10]
Ngày nay, thành phần một số các chất chống oxy hoá liên quan đến chuyển
hoá lipid như: vitamin E, beta-caroten, lycopen trong thực phẩm Việt Nam được
nghiên cứu chủ yếu bằng phương pháp HPLC, bởi HPLC là phương pháp có hiệu
lực tách tốt, độ chọn lọc cao, có thể tách chất không bay hơi và dễ phân huỷ nhiệt
(trong đó có nhiều chất có hoạt tính sinh học), có độ nhạy cao, chỉ cần một lượng
mẫu nhỏ, mẫu có thể bị phân huỷ trong nhiều trường hợp, có nhiều khả năng thay
đổi cơ chế tách (phương pháp), điều kiện và kỹ thuật sắc ký để giải các bài toán về
tách khó khăn. Mặt khác thiết bị và hoá chất sử dụng trong HPLC không quá đắt,
phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam.
Tuy hiện nay chưa có một phương pháp chuẩn để xác định tất cả các
carotenoid trong thực phẩm nhưng phương pháp của Hart và Scott [31], trên thiết bị


19

sắc ký lỏng cao áp được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu thành phần các
carotenoid cũng như trong một số thử nghiệm liên phòng [23].

1.4.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.1. Nguyên tắc chung
Sắc ký lỏng được phát triển mạnh từ năm 1969 với việc sử dụng áp suất cao,
chất nhồi cột kích thước nhỏ đã làm tăng hiệu quả của quá trình sắc ký. Hầu hết các
chất có trọng lượng phân tử lớn, tất cả các chất vô cơ được ion hóa, và các sản
phẩm hữu cơ đều có thể được xác định bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng
cao.
Sắc ký lỏng là quá trình tách một hỗn hợp các chất phân tích trong cột tách
sắc ký ở trạng thái lỏng. Các chất phân tích phải hoà tan trong một chất lỏng nào đó
(dung môi lỏng) thường là pha động của quá trình sắc ký. Hệ thống sắc ký lỏng
được thể hiện ở sơ đồ sau :


20

1- Nguồn Heli
2- Bình dung môi
3-Đầu phun 4-Đầu lọc.
5- Bơm
6- Van kiểm tra
7- khử xung
8- Đầu thải.
9- Van xả
10-Mồi bơm
11- Lọc dung môi
12-Điều hoà áp suất ngược
13- Transducer áp suất

14- Van tiêm mẫu
15-Cột
16- nối tới detectơ
Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo của HPLC
1.4.2. Các thành phần chính của HPLC
1.4.2.1.

Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh. Trước khi sử dụng cần lọc để
loại hết vẩn trong dung môi và đuổi khí hòa tan trong dung môi, thường dùng các
đầu lọc bằng thép không rỉ cỡ lỗ 0.2µm nhúng vào bình dung môi, có thể đặt màng
lọc trên đường ống dẫn
Khí hòa tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường
nền làm xuất hiện các pic lạ.... Có thể đuổi khí dung môi bằng nhiều cách: chạy siêu
âm, đun nóng và khuấy, sục khí trơ như heli hoặc đơn giản là dùng chân không
Trong phương pháp rửa giải thường hay rửa giải đẳng dòng ( isocratic
gradient) chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp rửa giải gradient thường
dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp
của các loại dung môi trên được trộn với nhau theo tỷ lệ xác định hoặc có tỉ lệ biến
đổi theo chương trình đã định ( rửa giải gradient)
Đường ống dẫn dung môi thường làm bằng Teflon và có đường kính ngoài
khoảng 1/8 inch
1.4.2.2.

Hệ thống bơm

Bơm dùng trong sắc ký lỏng cần phải đáp ứng một số yêu cầu khá cao:
thường phải tạo được áp suất cao ( 3000-6000 psi hay khoảng 250-500at), lưu lượng
của bơm khoảng 0.1 đến 10 mL/ph và không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi

khác nhau
Trong phân tích hay dùng loại bơm có tốc độ dòng hẳng định (constant flow)
đó là hai loại bơm cơ. Bơm kiểu này tiêm sẽ đẩy dung môi lien tục, khi hết dung
môi trong ống bơm(khoảng 250mL) thì dừng lại để nạp. Bơm kiểu pit tong thì đẩy
hút luân phiên, với loại này thường dùng hai đầu luân phiên nhau hút và đẩy để
giảm sự thăng giáng áp suất. Loại sau được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm.


21

Bơm khí lực(dùng áp suất khí nén để đấy dung môi) là loại bơm áp suất hằng định,
thường cho áp suất thấp và không được dùng trong sắc ký rửa giải gradient.
Ống dẫn dung môi từ bơm ra thường làm bằng thép không rỉ đường kính
ngoài khoảng 1/16inch
1.4.2.3.

Hệ tiêm mẫu

Có thể dùng bơm tiêm mẫu qua một tấm đệm đàn hồi (độ lặp lại kém và chỉ
dùng ở áp suất thấp dưới 1500psi hay khoảng 110at). Trong phương pháp tiêm dừng
dòng (stop flow) người ta dùng bơm tiêm để tiêm mẫu vào đầu cột khi mở một cái
khóa
Phương pháp phổ biến là dùng một van tiêm mẫu có vòng chứa mẫu (sample
loop) với dung tích xác định và chính xác, có thể thay đổi các vòng mẫu dung tích
khác nhau. Tiêm bằng can tiêm có độ chính xác cao. Vòng chứa mẫu là một đoạn
ống thép không rỉ có dung tích rất chính xác
Ngày nay, với các máy HPLC hiện đại có phần mềm điều khiển, có thể sử
dụng bộ phận bơm mẫu tự động. Theo chương trình đã lập trước, hàng chục mẫu
thử đặt trên khay đựng mẫu sẽ được máy tự động lần lượt lấy mẫu và tiêm vào máy.
1.4.2.4.

Cột sắc ký

Cột HPLC có thể làm bằng thủy tinh, hầu hết là cột thép không rỉ. Cột bằng
thủy tinh chỉ dùng ở áp suất thấp dưới 50at và chủ yếu dùng trong việc phân tích khi
chấtp han tích có phản ứng với các thành phần kim loại trong thép không rỉ. Cột
bằng thủy tinh thường đặt trong một vỏ thép không rỉ để bảo vệ cột.
Ngày nay người ta thường dùng cột thép không gỉ. Thường cột dài 10-30cm
và có đường kính trong 4-10mm, hạt chất nhồi cỡ 5-10µm. Với chất nhồi cõ 3-5µm
và nhỏ hơn có thể dùng cho cột có chiều dài ngắn
Chất nhồi cột thường là Silicagen hoặc có bọc một lớp mỏng chất hữu cơ.
Bên cạnh Silicagen người ta còn dùng những hạt khác như: nhôm oxyt, polymer
xốp, chất trao đổi ion
1.4.2.5.

Detector

Detector là bộ phận quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp
phân tích. Tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà chúng ta lựa chọn
detector phân tích:


22

• Detector quang phổ hấp thụ phân tử vùng tử ngoại, khả kiến (UV-VIS),
detector photodiot-aray (PDA) áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh
sáng trong vùng tử ngoại hoặc vùng khả kiến.
• Detetor huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát
huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn
xuất hóa chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc

chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng
phát huỳnh quang
• Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa như các ion kim
loại chuyển tiếp
Ngày nay các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như: diot-aray, MS,
nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kỹ thuật
tin học phát triển, người ta có thể thực hiện theo chương trình định sẵn, có thể
thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích
1.4.2.6.

Một số đại lượng đặc trưng của HPLC

• Thời gian lưu:
Khi được bơm vào cột sắc ký các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong
một khoảng thời gian nhất định, đó chính là thời gian lưu của chất phân tích tính
từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải khỏi cột ở điểm
có nồng độ cực đại:
tRi = to + t’Ri
Trong đó: to là thời gian chết (thời gian chất phân tích nằm trong pha động)
t’Ri là thời gian lưu giữ thực của chất phân tích trên cột tách
• Số đĩa lý thuyết
Hiệu lựu của cột tách được đo bằng số đĩa lý thuyết N của cột
16.(tRi- to)
tR 2
3.14.(h.tR)2
N=
= 5,54.
= 2.
Wi2
W1/22

A2
Trong đó:
tRi là thời gian lưu của chất phân tích I trên cột tách
to là thời gian không lưu trữ
Wi là chiều rộng đáy chân pic
W1/2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic
h là chiều cao pic
A là diện tích pic