Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện vi sinh vật và công nghệ sinh học đại học quốc gia hà nội

LỜI CAM ĐOAN
Tôi- TUẤN HOÀNG VIỆT xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề
tài: “Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện Vi sinh
vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội” là công trình nghiên cứu
và sáng tạo do chính tôi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. DƢƠNG VĂN
HƠP. Số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa công
bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác.

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi Tuấn Hoàng Việt xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS.
DƢƠNG VĂN HỢP –Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học–Đại học Quốc gia
Hà Nội đã hƣớng dẫn chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu
và hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm- Đại học Bách Khoa Hà Nội- đã chỉ dạy tận tình trong suốt quá
trình tôi theo học.
Bên cạnh đó ngƣời thân và bạn bè luôn là động lực, là nguồn động viên tôi đặc
biệt là gia đình đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn này.
Chân thành!
TUẤN HOÀNG VIỆT

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................................ii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ..............................................................................................................3
1.1. Vi sinh vật probiotic ........................................................................................3
1.1.1. Lịch sử probiotic .......................................................................................3
1.1.2. Định nghĩa probiotic .................................................................................4
1.1.3. Lựa chọn các chủng probiotic ..................................................................4
1.1.4. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic...............................5
1.1.5. Công thức chế phẩm probiotic .................................................................6
1.2. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic .......................................................6
1.2.1. Vai trò của probiotic .................................................................................6
1.2.2. Cơ chế tác động ........................................................................................7
1.3. Các phƣơng pháp lên men vi sinh vật ..............................................................9
1.3.1. Phân loại dựa vào tính chất canh trƣờng ..................................................9
1.3.1.1. Lên men chìm ............................................................................................... 9
1.3.1.2. Lên men bề mặt........................................................................................... 10
1.3.1.3. Lên men xốp ............................................................................................... 11

1.3.2. Phân loại dựa vào cách nạp liệu và thu hồi bán thành phẩm ..................12
1.3.2.1. Lên men theo mẻ......................................................................................... 12
1.3.2.2. Lên men bán liên tục ................................................................................... 12
1.3.2.3. Lên men liên tục ......................................................................................... 13

1.4. Môi trƣờng và thông số lên men vi sinh vật chủ yếu ....................................13
1.4.1 Môi trƣờng lên men vi sinh vật ...............................................................13
1.4.2. Các thông số lên men vi sinh vật chủ yếu ..............................................15
1.5. Chất mang và phát triển sinh khối vi sinh vật dạng bột ................................16
1.5.1. Chất mang ...............................................................................................16
1.5.1.1. Polysaccarit ................................................................................................. 16
1.5.1.2. Đƣờng và các dẫn xuất của đƣờng .............................................................. 17
1.5.1.3. Sữa gầy ....................................................................................................... 18

1.5.2. Chất bổ trợ ..............................................................................................18
1.5.2.1. Glutamat natri ............................................................................................. 18
1.5.2.2. Các chất chống oxy hóa .............................................................................. 18
1.5.2.3. Sữa đậu nành len men ................................................................................. 19
1.5.2.4. Glyxerol ...................................................................................................... 19

1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam ..........19
1.6.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên
thế giới ..............................................................................................................19
1.6.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt
nam ...................................................................................................................20
1.7. Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đại học Quốc Gia Hà Nội .............21
iii


Chƣơng 2: VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......23
1.1. Nguồn vi sinh vật ...........................................................................................23
1.2. Hóa chất và trang thiết bị sử dụng .................................................................23
1.2.1 Hóa chất ...................................................................................................23
1.2.2. Máy móc và dụng cụ ..............................................................................24
1.3. Môi trƣờng nghiên cứu ..................................................................................24
1.3.1. Môi trƣờng MRS (g/l): ...........................................................................24
1.3.2. Môi trƣờng LB (g/l): ...............................................................................25
2.1. Lựa chọn một số thông số lên men chủ yếu ..................................................26
2.1.1. Kiểm tra pH thích hợp cho sự sinh trƣởng .............................................26
2.1.2. Kiểm tra nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng .....................................26
2.1.3. Lựa chọn tỷ lệ chủng giống ....................................................................26
2.1.4. Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp ...........................................................27
2.1.5. Lựa chọn tốc độ sục khí thích hợp .........................................................27

2.1.6. Lựa chọn thời gian lên men ....................................................................27
2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn OD và mật độ ..........................................................27
2.3. Nghiên cứu xây dựng các thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75l ................28
2.4. Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis ..........................................30
2.5. Nghiên cứu thiết lập các chất mang thích hợp cho từng chủng vi sinh vật ...31
2.5.1. Xây dựng công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis ................31
2.5.1 Xây dựng công thức chất mang cho chủng Lactobacillus acidophilus ...32
2.6. Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm tối ƣu ...........................................33
2.7. Nghiên cứu công thức phối trộn sản phẩm đa chủng ....................................33
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................................34
3.1. Lựa chọn một vài thông số lên men ...............................................................34
3.1.1. Chủng Bacillus subtilis ..........................................................................34
3.1.1.1. Dải pH thích hợp cho sự sinh trƣởng .......................................................... 34
3.1.1.2. Dải nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng .................................................. 35
3.1.1.3 Thời gian lên men thích hợp ........................................................................ 36
3.1.1.4 Tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis ................................... 36
3.1.1.5. Tốc độ sục khí ............................................................................................. 37
3.1.1.6. Tỷ lệ chủng giống ....................................................................................... 37

3.1.2. Chủng Lactobacillus acidopilus .............................................................38
3.1.2.1. Dải pH thích hợp cho sự sinh trƣởng của chủng L.acidophilus.................. 38
3.1.2.2. Dải nhiệt độ thích hợp cho chủng Lactobacillus acidophilus..................... 39
3.1.2.3. Thời gian lên men thích hợp của chủng Lactobacillus acidophilus ........... 39
3.1.2.4. Tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Lactobacillus acidophilus .................. 40
3.1.2.5 Tỷ lệ chủng giống ........................................................................................ 40

3.2. Xây dựng các thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít ..............................41
3.2.1. Thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít của chủng Bacillus subtilis ..41
3.2.2 Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis....................................42
3.2.3 Thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít của chủng Lactobacillus

acidophilus........................................................................................................43

iv


3.3 Lựa chọn các công thức chất mang thích hợp cho từng chủng vi sinh vật .....44
3.3.1 Công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis ..................................44
3.3.1.1 Công thức 1 .................................................................................................. 44
3.3.1.2 Công thức 2 .................................................................................................. 45
3.3.1.3 Công thức đối chứng 1 ................................................................................. 46
3.3.1.4 Công thức đối chứng 2 ................................................................................. 47
3.3.1.5 Công thức đối chứng 3 ................................................................................. 48
3.3.1.5 Sản phẩm của Việt Nam .............................................................................. 49

3.3.2. Công thức chất mang cho chủng Lactobacillus acidophilus ..................50
3.3.2.1. Công thức 1 ................................................................................................. 51
3.3.2.2 Công thức 2 .................................................................................................. 52
3.3.2.3. Công thức đối chứng 1 ................................................................................ 54
3.3.2.4. Công thức đối chứng ................................................................................... 55
3.3.2.5. Công thức đối chứng 3 ................................................................................ 56
3.3.2.6. Sản phẩm của Đan Mạch ............................................................................ 57
3.3.2.7. Sản phẩm của Việt Nam ............................................................................. 58
3.3.2.8 So sánh tính ổn định giữa sản phẩm của luận văn và sản phẩm thƣơng mại
lƣu hành trên thị trƣờng ........................................................................................... 59

3.4 Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm tối ƣu ............................................60
3.5 Công thức phối trộn sản phẩm đa chủng ........................................................63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................................67
PHỤ LỤC...........................................................................................................................................70

v


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1. Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic .......................................................................8
Hình 2: Quy trình nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít....................................................................28
Hình 3: Các bƣớc pha loãng dung dịch huyền phù vi sinh vật ...............................................30
Hình 4: Sơ đồ mô tả phƣơng pháp lên men bán liên tục (Fed-batch cultivation) (A) và
liên tục (Continuous cultivation) (B).............................................................................................31
Hình 5: Thời gian lên men chủng Bacillus subtilis .....................................................................36
Hình 6: Kết quả thử nghiệm tốc độ khuấy cho chủng Bacillus subtilis.................................36
Hình 7 : Kết quả thử nghiệm tốc độ sục khí của chủng Bacillus subtilis ..............................37
Hình 8: Tỷ lệ chủng giốngcho chủng Bacillus subtilis ...............................................................37
Hình 9: Thời gian lên men của chủng Lactobacillus acidophilus............................................40
Hình 10: Kết quả thử nghiệm tốc độ khuấy cho chủng Lactobacillus acidophilus .............40
Hình 11: Tỷ lệ chủng giốngcho chủng Lactobacillus acidophilus ...........................................41
Hình 12: Kết quả lên men chủng Bacillus subtilis trong nồi lên men 75 lít ..........................42
Hình 13: Thử nghiệm lên men bán liên tục.................................................................................43
Hình 14: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng Lactobacillus acidophilus trên nồi lên
men 75 lít ............................................................................................................................................43
Hình 15: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức 1 .................................45
Hình 16: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức 2 .................................46
Hình 17: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức ĐC 1..........................47
Hình 18: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức ĐC 2..........................48
Hình 19: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức ĐC 3..........................48
Hình 20: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis sản phẩm của VN so với sản phẩm
trong luận văn....................................................................................................................................50
Hình 21 Kết quả kiểm tra mật độ chủng L. acidophilus công thức 1 lần 1...........................51
Hình 22: Kết quả kiểm tra mật độ L. acidophilus công thức 1 lần 2......................................52

Hình 23: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 2 lần 1 .................53
Hình 24: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 2 lần 2 ...............53
Hình 25: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus.................................................54

vi


công thức đối chứng 1 lần 1 ...........................................................................................................54
Hình 26: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức..............................55
đối chứng lần 2 .................................................................................................................................55
Hình 27: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus.................................................56
công thức đối chứng 2 ......................................................................................................................56
Hình 28: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus.................................................56
công thức đối chứng 3 ......................................................................................................................56
Hình 29: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Đan
Mạch....................................................................................................................................................57
Hình 30: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Việt
Nam .....................................................................................................................................................59
Hình 31: So sánh tính ổn định giữa sản phẩm của luận văn và sản phẩm...........................60
thƣơng mại .........................................................................................................................................60
Hình 32: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tƣơng
ứng ở điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 °C)....................................................................................61
Hình 33: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tƣơng
ứng ở điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( 4 - 8 ° C) ..............................................................................62
Hình 34: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tƣơng
ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng......................................................................................................63

vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ ..................6
Bảng 2: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị
trƣờng..................................................................................................................................................21
Bảng 3: Hóa chất sử dụng...............................................................................................................23
Bảng 4: Trang thiết bị và dụng cụ.................................................................................................24
Bảng 5: Môi trƣờng nhân chủng, nuôi cấy và cấy đếm (môi trƣờng MRS) ........................25
Bảng 6: Môi trƣờng nhân chủng, nuôi cấy và cấy đếm (môi trƣờng LB) ............................25
Bảng 7: Các công thức cơ chất cho chủng Bacillus subtilis......................................................32
Bảng 8: Các công thức cơ chất cho chủng Lactobacillus acidophilus ....................................33
Bảng 9: Kết quả thử nghiệm nuôi Bacillus subtilis trong bình tam giác............................34
Bảng 10: Kết quả thử nghiệm nuôi Bacillus subtilis ở các nhiệt độ khác nhau ...................35
Bảng 11: Kết quả thử nghiệm nuôi Lactobacillus acidophilus trong bình .........................38
tam giác ở các pH môi trƣờng khác nhau ...................................................................................38
Bảng 12: Kết quả thử nghiệm nuôi Lactobacillus acidophilus ở các nhiệt độ ......................39
Bảng 13: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức 1.............................................44
Bảng 14: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức 2.............................................45
Bảng 15: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC 1 .....................................46
Bảng 16: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC 2 .....................................47
Bảng 17: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC 3 .....................................48
Bảng 18: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis sản phẩm của VN.................................49
Bảng 19: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 1 ..........................51
Bảng20: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 2 ...........................52
Bảng 21: Kết quả kiểm tra mật độ L. acidophilus công thức đối chứng 1 ...........................54
Bảng 22: Kết quả kiểm tra mật độ L. acidophilus công thức đối chứng 2 ...........................55
Bảng 23: Kết quả kiểm tra mật độ L.acidophilus công thức đối chứng 3 ............................56
Bảng 24: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Đan
Mạch....................................................................................................................................................57
Bảng 25: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Việt

viii


Nam .....................................................................................................................................................58
Bảng 26: Kết quả kiểm tra mật độ L.acidophilus trong sản phẩm của luận văn và sản
phẩm thƣơng mại .............................................................................................................................59
Bảng 27: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tƣơng
ứng ở điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 ° C)...................................................................................60
Bảng 28: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tƣơng
ứng ở điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( 4 - 8 ° C) ..............................................................................61
Bảng 29: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tƣơng
ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng......................................................................................................62
Bảng 30: Bảng tổng hợp kết quả kiểm nghiệm đa chủng ........................................................64

ix


MỞ ĐẦU
Trong dinh dƣỡng động vật, việc tăng cƣờng sức khỏe hệ thống tiêu hóa của
vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh sinh đƣờng ruột đƣợc coi là một
giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột của vật nuôi rất phong phú về
chủng loại và số lƣợng, chính điều này là một trong những nguyên nhân chủ yếu
dẫn đến những rối loạn trong chuyển hóa và hấp thu. Bởi vậy, viêc sử dụng các biện
pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dƣỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối
ƣu giữa các loài vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi cho vật chủ đã và đang là
hƣớng nghiên cứu đƣợc các nhà nghiên cứu trong và ngoài nƣớc quan tâm. Có
nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có
hại trong đƣờng tiêu hóa của gia súc, gia cầm. Biện pháp cổ điển đƣợc ứng dụng
rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trƣớc là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy
nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuoi ngày càng bị hạn chế( kể từ

ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nƣớc thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng
sinh trong thức ăn chăn nuôi- Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải
pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở nên cấp bách. Một trong những giải pháp
hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic. Probiotic- theo Fuller (1992) [21]- là chất bổ
sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh
vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi cho vật chủ.
Nhu cầu sinh khối vi sinh vật probiotic trong nƣớc không chỉ dùng trong sản
xuất thức ăn chăn nuôi lợn, gà, nuôi trồng thủy hải sản mà còn đƣợc dùng trong sản
xuất thực phẩm chức năng dƣới dạng men tiêu hóa. Cho dù chƣa có con số thống kê
chính xác giá trị thực tế này nhƣng nếu ƣớc tính giá trị 1% của thức ăn chăn nuôi
thì con số có thể đến hàng chục triệu USD. Thực tế hiện nay phần lớn các sản phẩm
probiotic đƣợc nhập từ các nƣớc trong khu vực ( Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc,
Ấn độ) và các nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Anh, Pháp, Bỉ.
Các nghiên cứu trong nƣớc đã đƣợc thực hiện tại các trƣờng Viện thông qua
các đề tài khoa học đã đƣa ra đƣợc kết quả lựa chọn chủng giống vi sinh vật, xây
dựng quy trình lên men thí nghiệm và bƣớc đầu thử nghiệm đánh giá hiệu quả sử

1


dụng sản phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm với những kết quả thành công ban
đầu. Một trong những khâu quan trọng trong nghiên cứu sản xuất sinh khối
probiotic là quá trình lên men đảm bảo vô trùng và đạt hiệu suất cao, sau đó là bƣớc
phát triển sản phẩm đảm bảo độ sống sót cao theo thời gian bảo quản. Nhƣ vậy sản
phẩm cuối cùng sẽ có chất lƣợng phụ thuộc vào tất cả các thông số lên men và quá
trình phát triển sản phẩm. Cho đến nay các nghiên cứu trong nƣớc theo hƣớng phát
triển đến sản phẩm cuối cùng đạt chất lƣợng cao và ổn định vẫn còn hạn chế đặc
biệt ở quy mô thử nghiệm cũng nhƣ bán sản xuất.
Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện Vi

sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội”. với mục tiêu xác
định các thông số quan trọng trong công nghệ lên men và phát triển sản phẩm
probiotic từ đó đƣa ra quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm probiotic đơn chủng
cũng nhƣ đa chủng đạt chất lƣợng cao và ổn định, do đó có tính cạnh tranh cao với
các sản phẩm ngoại nhập.
Đề tài này đƣợc thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất
các sản phẩm sinh học chất lƣợng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của
ngành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo
hƣớng công nghiệp ở nƣớc ta, hạn chế nhập khẩu

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi sinh vật probiotic
1.1.1. Lịch sử probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ ngƣời Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ
mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ
khỏe mạnh.
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - ngƣời Nga, đạt giải Nobel – đã chứng
minh đƣợc rằng sự có mặt Lactobacillus trong đƣờng tiêu hóa sẽ hạn chế các nội
độc tố của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Ông giải thích đƣợc điều bí ẩn về sức khỏe của
những ngƣời Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới
115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa
lên men, điều này đƣợc ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The
Prolongation of life (1908).
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là ngƣời đầu tiên đƣa ra những đề xuất
mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về
probiotic [20].

Năm 1930, nhà khoa học ngƣời Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn
lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [21]. Cùng năm đó, các nhà nghiên
cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm
bệnh táo bón thƣờng xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi
khuẩn đƣờng ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu
hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dƣỡng khác nhau mà cơ thể
vật chủ không tự sản xuất ra đƣợc [20]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên
men – đặt tên là “Yakult” từ sữa đƣợc cho là hỗ trợ sức khỏe đƣờng ruột (intestinal
health) đƣợc sản xuất. Khái niệm chung probiotics đƣợc chấp nhận ở Châu Á trong
nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên đƣợc giới thiệu ở
Châu Âu những năm của thập niên 80 [21].
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

3


đƣợc tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới nhƣ những nguồn thực phẩm
chính giúp tăng cƣờng sức khỏe cho con ngƣời cũng nhƣ vật nuôi.
1.1.2. Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ
probiotic đƣợc Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi
sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [20]. Kể từ khi xuất hiện,
khái niệm probiotic vẫn chƣa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai
định nghĩa đƣợc cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và đƣợc sử dụng
nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989) [20], probiotic là “chất bổ
sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng
tiêu hóa theo hƣớng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2001) [17], probiotic là “các vi sinh vật sống khi đƣa vào cơ thể theo đƣờng tiêu hoá
với một số lƣợng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.
1.1.3. Lựa chọn các chủng probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn
cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và bám dính trong đƣờng
tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này đƣợc hợp lý hóa thông qua các thí
nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn đƣợc các chủng có tiềm năng nhƣ là nguồn
probiotic .
Các chủng vi sinh vật probiotic đƣợc lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu
sau:
 Tính bám dính trên bề mặt đƣờng tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các
chủng probiotic phải bám dính đƣợc vào thành ruột non, khu trú tốt trong
đƣờng tiêu hoá và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính đƣợc xem là một yêu
cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô
và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng
cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác.
 Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn đƣợc các
chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất
4


trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi
khuẩn gây bệnh nhƣ E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt tính
kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau nhƣ:
+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.
+ Tạo ra H2O2.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dƣỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
 Khả năng tồn tại trong môi trƣờng axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của vật
chủ là nơi có môi trƣờng axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza,
proteaza, lysozym…). Các chủng vi sinh vật đƣợc coi nhƣ là nguồn probiotic

phải tồn tại đƣợc trong điều kiện này. Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng
vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi
khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
 Khả năng chịu muối mật: Thông thƣờng, muối mật trong dịch tiêu hoá của động
vật dao động 1-3% . Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả
năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng
probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu
hoá nhƣ: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng
khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dƣỡng của vật chủ.
1.1.4. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic


Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và

Bifidobacterium.
Các loài thuộc chi Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L. casei,
L. casei subsp. rhamnosus (Lactobacillus GG), L. caucasicus, L. crispatus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus), L. fermentum (L. fermenti), L.
gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. lactis, L. leichmannii, L. paracasei, L.
plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus
5


Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B.
infantis, B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum


Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và

Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii,

Saccharomyces cerevisiae.
1.1.5. Công thức chế phẩm probiotic
Nhƣ đã trình bày ở phần trên có 3 đối tƣợng chủ yếu cho nghiên cứu phát
triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men. Vai trò cũng nhƣ
cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau, cụ thể có trong bảng sau:
Bảng 1: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ
Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn Bacillus

Nấm men

- Sinh bacteriocin

- Sinh enzym phân - Sinh axit hữu cơ, kích

- Cạnh tranh vị trí bám.

giải các cơ chất nhƣ thích tiêu hoá

- Sinh các peptit, kích thích hệ tinh bột, xenluloza; - Hấp thu chất độc và
thống miễn dịch của vật chủ.

kích thích tiêu hoá.

cạnh tranh dinh dƣỡng,

- Cạnh tranh dinh dƣỡng và vị trí

vị trí bám trên biểu mô

bám vào biểu mô.

với vi sinh vật gây

- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu

bệnh.

quả hấp thu chất dinh dƣỡng.
Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau.
1.2. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic
1.2.1. Vai trò của probiotic
Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng nhƣ chất kích thích sinh trƣởng trong thức
ăn chăn nuôi ở một số nƣớc thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển
vào năm 1986) thì probiotic đƣợc coi là một trong những nguồn thay thế có triển
vọng nhất vì có nhiều đặc tính ƣu việt. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều
tác giả, Patterson (2003) [22] đã tổng kết các ảnh hƣởng có lợi của probiotic đối với
đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:
- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đƣờng ruột theo chiều hƣớng có lợi
cho vật chủ.
6


- Tăng cƣờng khả năng miễn dịch.
- Giảm phản ứng viêm.
- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.
- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi.
- Tăng cƣờng quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.
- Tăng hấp thu chất khoáng.

- Làm giảm cholesterol huyết thanh.
- Làm tăng năng suất vật nuôi.
- Giảm hàm lƣợng amoniac và urê trong chất thải.
Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trƣờng.
Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra
các chất tồn dƣ trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
1.2.2. Cơ chế tác động
Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhƣng phần lớn
các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối
kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006)[23]. Minh họa cơ chế
hoạt động của probiotic thông qua hình 1.
Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh
vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thƣờng thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị
trí bám dính. Các vi sinh vật probiotic cƣ ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các
vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác nhƣ E. coli,
Salmonella... Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii)
không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn
có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose
và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002)
[15]. Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dƣỡng là phƣơng thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì
sự sinh sôi với số lƣợng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm
trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển.

7


Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các
chất kìm hãm vi khuẩn nhƣ lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng nhƣ một
số axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu
là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1994) [14].

Phản ứng miễn dịch Cạnh tranh chất dinh Cạnh tranh loại trừ: các
đƣợc kích thích và hoạt dƣỡng:các

sinh

vật sinh vật probiotic khóa

tính kháng thể của vật probiotic cạnh tranh với chặt các vị trí thụ cảm do
chủ tăng lên

các vi sinh vật gây bệnh đó loại trừ đƣợc các vi
các chấtdinh dƣỡng quan sinh vật gây bệnh
trọng.

Màng chắn: nơi các Gây bệnh: các vi sinh Các vi sinh vật probiotic
sinh

vật

probiotic vật gây bệnh và chất độc cƣ ngụ và nhân lên trong

chiếm giữ các thụ cảm của chúng bám vào niêm ruột, ngăn cản sự bám
trên bề mặt ruột, độc mạc và các thụ cảm trên dính và phát triển của các
tố đƣợc loại trừ

ruột và phá hủy chúng

vi sinh vật gây bệnh

Hình 1. Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic

8


Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột
và hệ thống miễn dịch có mối tƣơng tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và
miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đƣờng ruột bị ảnh hƣởng rất lớn bởi sự cân
bằng của hệ vi sinh vật ruột. Thông qua tƣơng tác với hệ thống miễn dịch ruột, các
probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai. Tác
động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống hoặc
các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999) [16]. Tuy nhiên, cơ chế tác động
của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chƣa đƣợc hiểu
biết đầy đủ.
1.3. Các phƣơng pháp lên men vi sinh vật
Có nhiều cách để phân loại các phƣơng pháp lên men
 Dựa vào thành phần đồng nhất hay không đồng nhất của canh trƣờng ngƣời ta
chia ra lên men bề mặt, lên men bề sâu, và bán rắn.
 Dựa vào cách nạp liệu và thu hồi bán thành phẩm sau khi lên men ngƣời ta
chia ra lên men gián đoạn, liên tục và bán liên tục.
1.3.1. Phân loại dựa vào tính chất canh trường
1.3.1.1. Lên men chìm
Lên men chìm hay lên men bề sâu dùng môi trƣờng dịch thể. Chủng vi sinh
vật cấy vào môi trƣờng đƣợc phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào
đƣợc tiếp xúc với dịch dinh dƣỡng. Phƣơng pháp này dùng cho cả vi sinh vật kị khí
và hiếu khí. Đối với nuôi vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí
chỉ thỉnh thoảng đảo trộn còn với vi sinh vật hiếu khí chỉ sử dụng đƣợc oxygen hòa
tan trong môi trƣờng nên phải sục khí liên tục. Đây là phƣơng pháp hiện đại đã
đƣợc dùng trong khoảng nửa cuối thế kỉ XX và cho kết quả rất to lớn đối với công
nghệ vi sinh.
Ngày nay phƣơng pháp nuôi cấy chìm đƣợc dùng phổ biến trong công nghệ

vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm phân
bùn, thuốc trừ sâu, các enzyme, các acid amin, vitamin, các chất kháng sinh, các
chất kích thích sinh học v.v...
9


Không thể có môi trƣờng nuôi cấy chung cho tất cả các chủng vi sinh vật, vì
vậy cần phải chọn thành phần môi trƣờng, tỷ lệ các chất dinh dƣỡng sao cho thích
hợp với từng chủng.
Phƣơng pháp lên men chìm có một số ƣu điểm:
 Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
 Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp.
 Dễ tổ chức đƣợc xí nghiệp có sản lƣợng lớn.
 Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá.
 Sử dụng hợp lý các chất dinh dƣỡng của môi trƣờng, tránh sự lãng phí chất
dinh dƣỡng nằm lại trong khối môi trƣờng chất rắn mà vi sinh vật không sử
dụng đƣợc.
Song phƣơng pháp lên men chìm cũng có một số nhƣợc điểm sau:
 Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy, những thiết bị
lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín
và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối (trong nuôi cấy bề mặt có thể loại
bỏ phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn còn dùng đƣợc).
 Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử
dụng đƣợc ôxy hoà tan trong môi trƣờng. Khí đƣợc nén qua một hệ thống lọc
sạch tạp trùng, hệ thống này tƣơng đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi
trƣờng nuôi cấy.
1.3.1.2. Lên men bề mặt
Trong lên men bề mặt, vi sinh vật mọc trên bề mặt môi trƣờng rắn hoặc lỏng.
Các môi trƣờng rắn trƣớc khi nuôi cấy vi sinh vật cần đƣợc làm ẩm. Vi sinh vật phát
triển sẽ lấy những chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng và sử dụng oxygen phân tử của

không khí để hô hấp. Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc đều trên bề mặt môi trƣờng
và sử dụng đƣợc nhiều chất dinh dƣỡng sinh ra enzyme, những lớp môi trƣờng rắn
cần phải mỏng (chỉ dày khoảng 2-5 cm). Điều này dẫn đến một nhƣợc điểm cơ bản
của phƣơng pháp này cần phải có mặt bằng sản xuất lớn và chi phí lao động chân
tay nhiều.
10


Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phƣơng pháp bề mặt để sản xuất
enzyme thƣờng dùng môi trƣờng rắn, một số trƣờng hợp có thể dùng môi trƣờng
lỏng. Môi trƣờng rắn thƣờng là các nguyên liệu tự nhiên nhƣ cám, đôi khi dùng gạo
tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đƣờng, khoai tây, lõi ngô… hoặc hỗn hợp những nguyên
liệu này. Môi trƣờng lỏng thƣờng là rỉ đƣờng, dịch thủy phân từ thóc mầm, nƣớc bã
rƣợu… có pha thêm muối khoáng.
Để đảm bảo đủ các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng ngƣời ta có thể bổ
sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trƣởng (nƣớc khoai tây, cao ngô,…)
Trong phƣơng pháp nuôi bề mặt hay nuôi nổi các cơ thể tồn tại ở bề mặt môi
trƣờng, do đó mà các tế bào hƣớng về khoảng không khí đƣợc cung cấp đầy đủ ôxy.
Ở các váng nấm, chất dinh dƣỡng của môi trƣờng chỉ đƣợc hấp thu nhờ các tế bào
chìm và đƣợc chuyển vào sợi nấm. Sự tạo váng trong phƣơng pháp nuôi bề mặt dẫn
tới một trạng thái sinh lí có ý nghĩa quan trọng đối với việc sản xuất các chất trao
đổi nhất định của nấm, ví dụ nhƣ sản xuất acid citric hay các enzyme. Tuy nhiên
ngƣời ta vẫn cố gắng đạt đến trạng thái sinh lí tƣơng ứng với nuôi cấy chìm.
1.3.1.3. Lên men xốp
Phƣơng pháp lên men này thƣờng thích hợp cho một số nấm mốc và xạ
khuẩn. Việc lên men thƣờng đƣợc tiến hành trên các khay phẳng xếp chồng lên
nhau và ủ trong các buồng chứa vô trùng đóng kín, giống đƣợc cấy vào bằng cách
thổi bào tử vào bên trong buồng chứa. Một hình thức khác là nuôi hệ sợi nấm trên
các cơ chất rắn nhƣ lúa mì, cám hoặc lúa nƣớc trong các thùng quay chậm. Phƣơng
pháp này đƣợc dùng để sản xuất một số enzyme.

Theo phƣơng pháp này, giống vi sinh vật hiếu khí sau khi cấy sẽ phát triển
trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dƣới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành
phần môi trƣờng. Vi sinh vật sử dụng ôxy của không khí để hô hấp đồng thời thải
CO2 ra môi trƣờng xung quanh và toả nhiệt. Phƣơng pháp này thƣờng thích hợp
cho các quá trình nuôi cấy nấm mốc, một số xạ khuẩn và vi khuẩn cũng có thể sản
xuất theo phƣơng pháp này.

11


Nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trƣờng rắn hoặc bán rắn có cơ chất dinh
dƣỡng là cám có trộn các loại bột ngũ cốc, đậu tƣơng và một số thành phần dinh
dƣỡng khác. Nguồn carbon cho môi trƣờng dinh dƣỡng là các loại hạt nhƣ ngô, gạo,
mì, đại mạch, đậu tƣơng... đƣợc nghiền vỡ thành mảnh kích thƣớc khoảng 1 - 3 mm.
Độ ẩm của môi trƣờng khoảng 55 - 60%. Khi vi sinh vật phát triển sẽ thải CO2 gây
hiện tƣợng toả nhiệt làm nóng và khô môi trƣờng. Cần phải thông gió, phun mù
hoặc làm ẩm trực tiếp để giữ cho độ ẩm tƣơng đối của không khí khoảng 90%.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp:
 Tốn nhiều diện tích mặt bằng, khó cơ khí hoá và tự động hoá.
 Chi phí nhân công, điện nƣớc... cho một đơn vị sản phẩm cao.
1.3.2. Phân loại dựa vào cách nạp liệu và thu hồi bán thành phẩm
1.3.2.1. Lên men theo mẻ
Trong phƣơng pháp nuôi không liên tục (batch - cultivation) hay còn gọi là
nuôi gián đoạn, thông thƣờng vi sinh vật sinh trƣởng đến khi nào một thành phần
chủ yếu của môi trƣờng dinh dƣỡng bị giới hạn. Khi đó culture chuyển từ pha luỹ
thừa sang pha cân bằng. Sinh trƣởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của điều kiện
nuôi, sự giảm chất dinh dƣỡng và sự tăng khối lƣợng tế bào. Trong quá trình đó
trạng thái sinh lí của tế bào cũng thay đổi. Thông thƣờng việc tạo thành sản phẩm
mong muốn liên quan với một trạng thái sinh lí nhất định trong pha sinh trƣởng.
Không thể duy trì đƣợc trạng thái này trong một thời gian dài.

Trong suốt thời gian lên men mẻ, sản lƣợng nhiệt, sự sản xuất kiềm hoặc
acid, và sự tiêu thụ oxygen sẽ biến thiên từ các tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới các
tốc độ rất cao trong suốt pha log muộn. Vì vậy, điều chỉnh môi trƣờng của một hệ
thống nhƣ thế khó hơn nhiều so với quá trình liên tục mà ở trạng thái ổn định các
tốc độ sản xuất và tiêu thụ là hằng số. Lên men gián đoạn thực hiện theo từng mẻ
nên thƣờng có năng suất thấp và chu kỳ sản xuất bị kéo dài.
1.3.2.2. Lên men bán liên tục
Lên men bán liên tục ( fed- batch cultivation) đƣợc xem là hệ thống trung
gian giữa quá trình nuôi cấy mẻ và nuôi cấy liên tục. Thuật ngữ lên men gián đoạn
12


bổ sung đƣợc dùng để mô tả các nuôi cấy mẻ đƣợc cung cấp dinh dƣỡng liên tục
(hoặc nối tiếp nhau) bằng môi trƣờng mới mà không bỏ dịch cũ nuôi cấy. Nhƣ vậy,
thể tích của loại nuôi cấy này tăng lên theo thời gian.
1.3.2.3. Lên men liên tục
Trong quá trình lên men liên tục (Continuous cultivation), nguồn dinh dƣỡng
đầu vào đƣợc bổ sung liên tục va dịch lên men (gồm các tế bào va sản phẩm tạo ra )
đƣợc lấy bớt ra liên tục và nhƣ vậy tạo đƣợc cân bằng hợp lí. Phƣơng thức cung cấp
dinh dƣỡng này làm cho các điều kiện trong bioreactor (buồng lên men) luôn ở
trạng thái ổn định, do đó sản phẩm tạo ra tốt hơn. Môi trƣờng đi ra có thể lắng tế
bào rồi lấy bổ sung nó cho bioreactor.
1.4. Môi trƣờng và thông số lên men vi sinh vật chủ yếu
1.4.1 Môi trường lên men vi sinh vật
Nuôi cấy vi sinh vật ở bất cứ quy mô nào (phòng thí nghiệm, nhân giống cấp
1, 2, 3 hay trong nồi lên men) đều phải đảm bảo đầy đủ các nguyên tố dinh dƣỡng
cho vi sinh vật hoạt động nhân sinh khối tạo sản phẩm.
Nguyên tố dinh dƣỡng của vi sinh vật để là: các nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng
và các vitamin... Tuy vậy trong lên men công nghiệp cũng có chỗ khác biệt đáng
lƣu ý. Ngƣời ta không bổ sung nguyên tố vi lƣợng ở dạng dung dịch tinh khiết vào

môi trƣờng lên men, mà có sự bổ sung cùng lúc với các nguyên tố đa lƣợng. Các
nguyên tố đa lƣợng đƣợc bổ sung dƣới dạng hợp chất (rỉ đƣờng, cao ngô, gạo..).
Thông thƣờng các tạp chất này chứa một lƣợng các nguyên tố vi lƣợng cần thiết và
đủ để dùng cho vi sinh vật.
 Các hợp chất cung cấp nguồn Cacbon: Cacbon chiếm một phần rất lớn trong
tế bào vi sinh vật, chính vì vậy những hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng
đầu trong sự sống của vi sinh vật. Nguồn thức ăn chủ yếu của vi sinh vật là
hydratecacbon. Các hợp chất có phân tử thấp nhƣ một số đƣờng thì vi sinh
vật có thể đồng hóa trực tiếp. Còn các hợp chất cao phân tử (tinh bột,
cellulose,…) sẽ đƣợc phân hủy nhờ các enzyme do vi sinh vật tiết ra.
 Dầu thực vật: Các loại dầu (dầu dừa, dầu lạc, dầu đậu tƣơng, dầu hƣớng
13


dƣơng...) đƣợc dùng trong nuôi cấy vi sinh vật với vai trò là nguồn dinh
dƣỡng carbon, ngoài ra còn là chất phá bọt trong quá trình lên men. Khi nuôi
cấy vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme lipase, sẽ phân hủy các chất dầu
này thành glycerin và các acid béo. Lƣợng chất béo bổ sung vào môi trƣờng
phải rất phù hợp với hoạt động sống của vi sinh vật, nếu bổ sung quá nhiều
sẽ làm chậm quá trình đồng hóa nguồn carbohydrate của vi sinh vật.
 Các hợp chất cung cấp nguồn Nitrogen: Nitơ tham gia vào tất cả các cấu trúc
trong tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện mọi chức năng của hoạt động
sống. Nguồn nitơ là nguồn dinh dƣỡng quan trọng không kém nguồn carbon.
 Các nguyên tố khoáng: Trong công nghệ lên men, ngƣời ta nhận thấy vai trò
của dinh dƣỡng khoáng rất lớn, nó ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng của quá
trình lên men. Trong số dinh dƣỡng khoáng, ngƣời ta đặc biệt chú ý đến vai
trò của phospho (P). Khi lên men công nghiệp, ngƣời ta thƣờng bổ sung P
dƣới dạng bột đậu, bột bắp, bã rƣợu, hay ở dạng phosphate vô cơ. Với các
chất khoáng khác nhƣ: Mg, Na, Fe... vi sinh vật sẽ nhận từ môi trƣờng dinh
dƣỡng ở dạng muối vô cơ hoặc có khi ngay cả trong nƣớc pha môi trƣờng

dinh dƣỡng. Vì vậy khi pha môi trƣờng ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc máy mà
không dùng nƣớc cất. Các nguyên tố vi lƣợng nhƣ: Mn, Mo, Co... thƣờng có
mặt trong các nguyên liệu tự nhiên ban đầu khi đƣa vào môi trƣờng lên men
nhƣ dịch trái cây, nƣớc chiết các loại hạt.
 Tùy vai trò của các nguyên tố khoáng rất quan trọng, nhƣng trong quá trình
lên men cũng chứ cần một lƣợng thích hợp, nếu vƣợt quá giới hạn sẽ giảm
hiệu quả của quá trình lên men. Vì vậy khi thiết kế nồi lên men, ngƣời ta chế
tạo từ thép carbon, bên trong nồi còn quét lớp keo bảo vệ
 Nƣớc: Nƣớc là thành phần chính của tế bào và thể hiện nhiều vai trò khác
nhau. Chất lƣợng nƣớc rất quan trọng trong sản xuất các sản phẩm từ vi sinh
vật. Trong sản xuất vaccine, nguồn nƣớc phải qua nhiều công đoạn làm tinh
sạch, chƣng cất rồi mới đƣợc sử dụng để nuôi các chủng vi sinh vật. Lên men
trong môi trƣờng nƣớc có ƣu điểm là độ đồng nhất cao, dễ dàng theo dõi pH
14


và nhiệt độ, nhƣợc điểm là khi chiết suất sản phẩm thì tỉ lệ nƣớc cao gây tốn
kém năng lƣợng và thời gian.
1.4.2. Các thông số lên men vi sinh vật chủ yếu
 Lƣợng giống cấp: Nếu lƣợng giống cấy quá ít thì điều kiện lên men sẽ kéo
dài. Ngoài ra, trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, các vi sinh vật
nhiễm trong môi trƣờng dễ phát triển và có thể làm ảnh hƣởng xấu đến năng
suất và chất lƣợng sản phẩm. Ngƣợc lại, nếu lƣợng giống cấy quá nhiều thì
sẽ làm tăng chi phí cho quá trình nhân giống. Trong công nghệ lên men thực
phẩm, lƣợng giống cấy quá nhiều sẽ làm thay đổi tỉ lệ sản phẩm phụ tạo
thành trong canh trƣờng lên men, từ đó giá trị cảm quan của thực phẩm lên
men sẽ bị thay đổi. Các nhà sản xuất cần xác định lƣợng giống cấy thích hợp
bằng phƣơng pháp thực nghiệm.
 Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, hoạt tính trao đổi chất của
vi sinh vật và chất lƣợng của thực phẩm lên men. Các nhà sản xuất cần chọn

nhiệt độ lên men thích hợp để tăng năng suất và chất lƣợng sàn phẩm cao
nhất, đồng thời tiết kiệm đƣợc chi phí sản xuất.
 Sự cung cấp oxy: Nhu cầu trao đổi oxygen của một sinh vật phụ thuộc vào
đặc điểm của tế bào và điều kiện môi trƣờng nuôi. Việc cung cấp oxy cho
quá trình lên men hiếu khí là bắt buộc vì nó ảnh hƣởng quyết định đến năng
suất và chất lƣợng sản phẩm cần thu nhận. Đối với môi trƣờng rắn, ngƣời ta
thổi không khí vô trùng đi qua lớp canh trƣờng trong thiết bị nuôi cấy. Còn
đối với môi trƣờng lỏng, ngƣời ta sục không khí vào canh trƣờng, kết hợp
với sự khuấy trộn.
 Yếu tố pH: Trong quá trình lên men, pH thay đổi do sự vận chuyển các chất
qua màng tế bào, từ đó làm thay đổi nồng độ ion H+ trong canh trƣờng (môi
trƣờng chỉ chiếm một phần thể tích trong bình lên men) và một số vi sinh vật
sinh tổng hợp acid hữu cơ rồi tiết ra bên ngoài tế bào. Khi đó, một số phân tử
protein hoà tan trong canh trƣờng có thể bị đông tụ.

 Tốc độ khuấy: cánh khuấy giúp oxy hòa tan, các thành phần trong thiết bị lên
15


men đƣợc phối trộn đều với nhau, tạo điều kiện cho chất dinh dƣỡng và khí
oxy thấm vào trong tế bào, cho phép trao đổi nhiệt tốt hơn. Do đó lựa chọn
tốc độ khuấy đối với từng chủng vi sinh vật là một yếu tố hết sức quan trọng.
 Thời gian lên men: Phụ thuộc vào giống vi sinh vật, dạng sản phẩm cần thu
nhận và nhiều yếu tố khác. Khi thu nhận các sản phẩm trao đổi chất nhƣ acid
amin, acid hữu cơ, dung môi hữu cơ, enzyme….thời gian lên men thƣờng
kéo dài từ 1 đến 3 ngày. Ngƣợc lại, đối với nhóm thực phẩm lên men, thời
gian lên men và tàng trữ có thể kéo dài hàng tuần, hàng tháng và thậm chí
hàng năm. Các nhà sản xuất sẽ định thời gian lên men và tàng trữ bằng thực
nghiệm.
1.5. Chất mang và phát triển sinh khối vi sinh vật dạng bột

1.5.1. Chất mang
1.5.1.1. Polysaccarit
Đƣợc coi là chất bảo vệ tế bào,tránh sự tấn công của thực khuẩn thể, chống
lại quá trình làm khô, bảo vệ khỏi các chất độc. Có khả năng kháng khuẩn và tránh
đƣợc áp suất thấp. Những polysaccarit điển hình là tinh bột hay các dextran.
Mặc dù không thấm qua thành tế bào. Nhƣng chúng đƣợc hấp thụ lên bề mặt
tế bào VK làm thành 1 lớp dính nhằm ức chế sự phát triển của tinh thể đá ở bên
ngoài và giữ cấu trúc vô định hình của đá chỉ đƣợc nằm ngoài tế bào.
Với chế phẩm pro dùng cho ngƣời và vật nuôi thƣờng sử dụng là tinh bột
ngũ cốc. Ƣu điểm của tinh bột ngũ cốc:
 Là nguồn thức ăn thông thƣơng của ngƣời, gia súc, gia cầm nên khi dùng
làm chất mang chỉ là bổ sung thêm nguồn VSV vào thức ăn.
 Chứa một nguồn dinh dƣỡng ồn định cho VSV: C, N…
 Thời gian bảo quản lâu dài.
 Thông dụng và rẻ tiền.
 Ngoài việc sủ dụng một loại tinh bột, ngƣời ta có thể phối hợp 2 hay nhiều
loại tinh bột khác nhau để đạt hiệu quả tối đa.

16