Lựa chọn và cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch để phát hiện kháng nguyên vi rút gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------

PHẠM VĂN CHUNG
ĐỀ TÀI:

LỰA CHỌN VÀ CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ CHO CẢM BIẾN
MIỄN DỊCH ĐỂ PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT
GÂY BỆNH
LUẬN VĂN THẠC SỸ
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PHAN THỊ NGÀ

HÀ NỘI – 2010


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả của đề tài: “ Lựa chọn và cố định kháng thể cho cảm biến miễn
dịch để phát hiện vi rút gây bệnh” xin cam đoan rằng đây là đề tài do chính
tác giả đề xuất và thực hiện, không trùng lặp hay sao chép với bất ký công
trình nghiên cứu khác nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Các kết quả thu
nhận được trong nghiên cứu này hoàn toàn trung thực. Tác giả xin hoàn toàn
chịu trách nhiệm với nội dung cuốn luận văn này!
Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010
Tác giả

Phạm Văn Chung

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Phó giáo sư, tiến sĩ Phan Thị
Ngà, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người hướng dẫn tôi làm luận văn và tạo
mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như trang thiết bị trong quá trình tôi thực hiện
đề tài nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS. NCS. Trần Quang Huy người đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, tôi làm luận văn, đã gợi mở cho tôi những ý tưởng nghiên
cứu và tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như trang thiết bị trong quá trình tôi
thực hiện nghiên cứu ở phòng thí nghiệm để hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các nghiên cứu viên của phòng thí nghiệm hiển vi điện
tử: ThS. Nguyễn Thanh Thủy; TS. Đỗ Thị Thoa; CN. Nguyễn Thi Minh Liên, CN.
Trần Minh Hiền, nghiên cứu viên phòng thí nghiệm Hóa sinh và miễn dịch. Ths.
Trần Thị Nguyệt Lan, Các nghiên cứu viên phòng sản xuất sinh phẩm chẩn đoán, đã
tạo điều kiện cũng như chia sẻ những kinh nghiệm để tôi hoàn thiện luận văn này.
Để có kết quả này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban giám hiệu, Viện Đào tạo sau Đại
học, khoa Công nghệ Sinh học, lớp cao học K810 – Trường Đại học Bách khoa Hà
Nội; Ban giám đốc và tập thể cán bộ Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học vật
(ITIMS) - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và
thực hiện luận văn này.
Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình, bè bạn luôn khích
lệ, san sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian học tập, hoàn thành đề tài và
trong cuộc sống.
Đề tài này được sự hỗ trợ một phần kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa học và Công
nghệ Quốc gia (NAFOSTED), đề tài mã số: 106. 161. 181. 09
Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010
Tác giả
Phạm Văn Chung

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................ 4
1.1. Lịch sử hình thành phát triển cảm biến sinh học. .................................... 4
1.2. Cảm biến sinh học.................................................................................... 6
1.2.1. Khái niệm cảm biến sinh học .......................................................... 6
1.2.2. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học.................................. 9
1.2.3. Phân loại cảm biến sinh học. ........................................................... 10
1.3. Tổng quan về kháng thể, kháng nguyên, vi rút viêm não Nhật Bản........ 15
1.3.1. Kháng thể......................................................................................... 15
1.3.2. Kháng nguyên.................................................................................. 26
1.3.3. Vi rút viêm não Nhật bản (VNNB). ................................................ 28
1.4. Các phương pháp cố định kháng thể lên bề mặt điện cực. ...................... 31
1.4.1. Phương pháp cộng hoá trị................................................................ 32
1.4.2. Phương pháp liên kết chéo (cross linking) ...................................... 32
1.4.3. Phương pháp tự gắn kết (SAM - Self Assembled
Monolayers hoặc Multilayer) ......................................................... 33
1.4.4. Phương pháp hấp phụ ...................................................................... 34
1.4.5. Phương pháp điện hoá ..................................................................... 34


CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM .................................... 36
2.1. Tách chiết và tinh sạch kháng thể ............................................................ 36

2.1.1. Vật liệu ............................................................................................ 36
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm .............................................................. 37
2.2.2.1. Sơ chế và cô đặc IgG bằng amonium sulfate bão hòa ............ 38
2.2.2.2. Tinh sạch IgG bằng sắc kỹ ái lực sử dụng phức hợp gắn
protein G – sepharrose. .......................................................... 39
2.1.2.3. Xác định hàm lượng protein trong từ phân đoạn ................... 41
2.1.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch của IgG ................................................ 42
2.2. Cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch ............................................. 43
2.2.1. Vật liệu ............................................................................................ 43
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm............................................................... 45
2.2.2.1. Xử lý bề mặt điện cực trước khi cố định kháng thể................ 45
2.2.2.2. Silan hóa lớp oxit trước khi cố đinh........................................ 47
2.2.2.3. Các phương pháp cố định. ...................................................... 48
2.2.2.4. Các phép đo đạc ...................................................................... 52
2.3. Đánh giá độ nhạy của cảm biến. .............................................................. 55
2.3.1. Bộ khuếch đại Lock – in SR830...................................................... 55
2.3.2. Bố trí hệ đo ...................................................................................... 56
2.3.3. Phương pháp đo ............................................................................... 56
2.3.4. Thực hiện phép đo ........................................................................... 57
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 59
3.1. Tách chiết và tinh sạch kháng thể ............................................................ 59
3.2. Cố định kháng thể IgG kháng vi rút VNNB ............................................ 64
3.2.1. Hiển vi điện tử quét ......................................................................... 65
3.2.2. Hiển vi lực nguyên tử (AFM).......................................................... 67
3.2.3. Phổ hồng ngoại (FITR).................................................................... 69
3.2.4. Hiển vi huỳnh quang ....................................................................... 70
3.3. Đánh giá độ nhạy của cảm biến được cố định theo các phương pháp


khác nhau................................................................................................... 73

3.3.1. Phương pháp APTES – Kháng thể (APTES-Ab)............................ 74
3.3.2. Phương pháp APTES - G.A – Kháng thể (APTES – G.A – Ab) .... 77
3.3.3. Phương pháp APTES – G.A – Protein A – Kháng thể
(APTES – GA - PrA – Ab)............................................................ 79
KẾT LUẬN .................................................................................................... 84
KIẾN NGHỊ................................................................................................... 85
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ....... 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 87


Ab

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Antibody (Kháng thể)

AFM

Atomic force microscope (Kính hiển vi lực nguyên tử)

APTES

3-aminopropyl-triethoxy-silance (Một loại polyme)

FITC

Fluorescein isothiocyanate (chất phát huỳnh quang)

Arbo

Arthropod – borne – viruses

BOD

Biochemical oxygen Demand (nhu cầu oxy sinh hoá)

BSA

Bovin Serum Albumin (Huyết thanh bò)

DNA

Deoxyribonucleic acid (Axít đêoxyribônuclêic – ADN)

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn
enzym)

FTIR

Fourier transform infrared spectroscopy
( Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier)

GA

Glutaraldehyde

HIV

Human immunodeficiency virus (vi rút gây suy giảm miễn dịch)

HPV

Human papillomaviruses (vi rút gây ung thư cổ tử cung))

HSV

Herpes simplex virus

Ig

Immunoglobulin (Kháng thể)

ITIMS

International Training Institute for Materials Science
(Viện đào tạo quốc tế về khoa học vật liệu)

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Hóa
học và ứng dụng Quốc tế)

PCR

Polymerase Chain Reaction

PPy

Polypyrrole (Một loại polyme)

PrA

Protein A

RNA

Ribonucleic acid (Axít Ribônuclêic – ARN)

VNNB

Viên não Nhật Bản

WHO

World Hearlth Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

WNV

West Nile virus


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Một số kết quả của cảm biến miễn dịch trong phát hiện vi rút

12

gây bệnh
Bảng 1.2

Các loại enzym thường dùng

14

Bảng 1.3

Ký hiệu các phân lớp kháng thể

17

Bảng 2.1

Hóa chất dùng cho quá trính tách chiết IgG

36

Bảng 2.2

Thiết bị dùng cho quá trình tách chiết IgG

37

Bảng 2.3

Thứ tự thành phần dung dịch, hóa chất của bản gel phân tích

42

Bảng 2.4

Hóa chất sử dụng cho quá trình cố định kháng thể

43

Bảng 2.5

Thiết bị dùng cho quá trình cố định và đo đạc

44

Bảng 2.6

Thực hiện các phép đo theo nồng độ và thời gian

58

Bảng 3.1

Kết quả sơ chế IgG bằng amonium sulfate bão hòa.

60

Bảng 3.2

Kết quả tách chiết kháng thể IgG bằng cột sắc ký gắn prteinG

61

– sepharrose.
Bảng 3.3

Hiệu suất sơ chế và tinh sạch IgG qua hai giai đoạn

63

Bảng 3.4

Tín hiệu dò tìm theo sự thay đổi của nồng độ kháng nguyên

74

và thời gian (phương pháp APTES – Ab)
Bảng 3.5

Tín hiệu dò tìm theo sự thay đổi của nồng độ kháng nguyên

77

và thời gian (phương pháp APTES – GA - Ab)
Bảng 3.6

Tín hiệu dò tìm theo sự thay đổi của nồng độ kháng nguyên

79

và thời gian (phương pháp APTES – GA – PrA - Ab)
Bảng 3.7

Kết quả đánh giá độ nhạy của cảm biến qua ba phương pháp
cố định với nồng độ dò tìm kháng nguyên 20µg/ml

81


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang
Hình 1.1

Sự phát triển cảm biến sinh học, phân bố theo đối tượng vi

6

rút gây bệnh được phát hiện trong 10 năm gần đây (năm
2000 đến 7/2010)
Hình 1.2

Cấu tạo chung của cảm biến sinh học

7

Hình 1.3

Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học

9

Hình 1.4

Sự phát triển cảm biến miễn dịch để phát hiện virus gây

13

bệnh trong 10 năm gần đây (nguồn dữ liệu ISI Web of
Science từ năm 2000 đến 7/2010)
Hình 1.5

Cấu tạo chung của kháng thể

16

Hình 1.6

Cấu tạo của IgG

18

Hình 1.7

Cấu tạo của IgM

19

Hình 1.8

Cấu tạo của IgA

20

Hình 1.9

Cấu tạo của IgD

21

Hình 1.10

Cấu tạo của IgE

21

Hình 1.11

Hình thái vi rút VNNB

29

Hình 1.12

Phương pháp liên kết chéo (cross-linking)

32

Hình 1.13

Quá trình tự gắn kết của các phân tử sinh học lên bề

33

mặt cảm biến.
Hình 1.14

Phương pháp hấp phụ

34

Hình 1.15

Cấu trúc phân tử polypyrole

35

Hình 2.1

Bộ sinh phẩm tách chiết IgG (Mab Trap Kit)

37

Hình 2.2

Quy trình tinh chế sơ bộ IgG

38

Hình 2.3

Quy trình tinh sạch IgG

40

Hình 2.4

Vi cảm biến có có cấu hình 20 µm X 20µm

44

Hình 2.5

Quy trình là sạch bề mặt điện cực

46

Hình 2.6

Tạo nhóm OH lên bề mặt cảm biến

47


Hình 2.7

Quá trình xử lý nhiệt bề mặt cảm biến

47

Hình 2.8

Phản ứng silan hóa

48

Hình 2.9

Phản ứng liên kết kháng thể trên nền APTES

49

Hình 2.10

Quy trình cố định kháng thể theo hướng APTES - Ab

49

Hình 2.11

Phản ứng liên kết kháng thể trên nền APTES có bổ sung

50

thêm GA
Hình 2.12.

Quy trình cố định kháng thể theo hướng APTES – G.A – Ab

50

Hình 2.13.

Phản ứng liên kết kháng thể trên nền APTES có bổ sung

51

thêm GA và PrA
Hình 2.14

Quy trình cố định kháng thể theo hướng APTES – GA -

51

PrA – Ab
Hình 2.15

Kính hiển vi điện tử quét (S4800 – Hitachi)

52

Hình 2.16

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi lực nguyên tử (

53

Multimode, Veeco)
Hình 2.17

Máy phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier

54

(FTIR Thermo Nicolet 6700)
Hình 2.18

Kính hiển vi huỳnh quang (Elipse 90i Nikon)

55

Hình 2.19

Bộ khuếch đại (Lock-in SR830, Research system)

56

Hình 2.20

Hệ đo vi sai sử dụng máy khuyếch đại (Lock-in SR830)

56

Hình 3.1

Nồng độ IgG ở các phân đoạn

62

Hình 3.2

Kết quả xác định độ tinh sạch của IgG thỏ tinh chế

64

Hình 3.3

Hình thái bề mặt cảm biến được quan sát bằng kính hiển vi

65

điện tử quét phân giải cao FESEM (S4800 – Hitachi)
Hình 3.4

Hình thái điện cực quan sat dưới kính hiển vi lực nguyên tử

68

(Multimode)
Hình 3.5

Phổ hấp thụ hồng ngoại (FITR)

69

Hình 3.7.A

Hình ảnh phát quang của kháng thể IgG kháng vi rút

70

VNNB trên điện cực, sử dụng phương pháp APTES - Ab

Hình 3.7.B

Hình ảnh phát quang của kháng thể IgG kháng vi rút VNNB

71


trên điện cực, sử dụng phương pháp APTES – GA – Ab.
Hình 3.7.C

Hình ảnh phát quang của kháng thể IgG kháng vi rút

72

VNNB trên điện cực, sử dụng phương pháp APTES– GA –
PrA - Ab
Hình 3.8

Tín hiệu dò tìm theo sự thay đổi của nồng độ kháng nguyên

75

và thời gian (phương pháp APTES – Ab)
Hình 3.9

Tín hiệu dò tìm theo sự thay đổi của nồng độ kháng nguyên

78

và thời gian (phương pháp APTES – GA - Ab)

Hình 3.10

Tín hiệu dò tìm theo sự thay đổi của nồng độ kháng nguyên

80

và thời gian (phương pháp APTES – GA – PrA - Ab)
Hình 3.11

Tín hiệu dò tìm của ba loại cảm biến ở cùng nồng độ kháng
nguyên 20 (µg/ml)

82


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

M U
Ngy nay, cựng vi s phỏt trin v kinh t, gia tng dõn s, hi nhp ton cu l s
phỏt sinh cỏc dch bnh nguy him e da n sc khe cng ng. Phỏt hin,
khng ch v ngn chn kp thi cỏc tỏc nhõn gõy bnh truyn nhim l yờu cu cp
thit nhm gim thiu nguy c tỏc hi n sc khe v nhng thit hi v mt kinh
t, xó hi. Chớnh vỡ vy, phỏt hin nhanh, nhy v sng lc mm bnh truyn nhim
l mu cht ngn chn quỏ trỡnh lõy lan ca tỏc nhõn gõy bnh bng bin phỏp
cỏch ly hay iu tr kp thi [71].
Hin nay, cú rt nhiu phng phỏp v thit b chn oỏn xỏc nh tỏc nhõn gõy
bnh nh: phõn lp vi rỳt, huyt thanh hc, ELISA, PCR,... Tuy nhiờn, cỏc phng
phỏp truyn thng ny thng mt hng gi ti hng tun bit c kt qu [6],

[16]. Do ú, phỏt trin nhng thit b cú kh nng chn oỏn nhanh, chớnh xỏc tỏc
nhõn gõy bnh truyn nhim luụn l yờu cu cp thit i vi cỏc nh khoa hc
trong nc cng nh trờn th gii.
Cm bin sinh hc hin nay ang thu hỳt c s quan tõm ca nhiu nh khoa hc
trờn th gii, do thit b ny cú nhy, c hiu cao, d s dngTrong lnh
vc chn oỏn bnh, ba loi cm bin c quan tõm nghiờn cu ch to nht l:
cm bin min dch, cm bin ADN, cm bin enzym. Trong ú, cm bin min
dch bc l nhng u im vt tri do nguyờn lý ca cm bin da trờn phn ng
c hiu khỏng nguyờn khỏng th nờn d ch to v s dng, c bit l kh nng
phỏt hin mu trc tip m khụng cn x lý mu trc [52].
Tuy nhiờn, vn khú khn nht thng gp l kh nng c nh s lng ln
khỏng th trờn b mt in cc, s nh hng khỏng th tt m bo cho s bt cp
ti u vi khỏng nguyờn. Do ú, gúp phn phỏt trin cỏc cm bin min dch
Vit Nam nhm phỏt hin nhanh, trc tip vi rỳt gõy bnh, tỏc gi nhn thy vic
thc hin ti: La chn v c nh khỏng th cho cm bin min dch
phỏt hin khỏng nguyờn vi rỳt gõy bnh l rt cn thit vi hai mc tiờu sau :
K810 Khoa Công nghệ sinh học

1

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

- La chn c loi khỏng th phự hp cho cm bin min dch in húa phỏt
hin vi rỳt gõy bnh.
- Ti u húa quỏ trỡnh c nh khỏng th trờn b mt in cc ca cm bin.

i tng nghiờn cu
- Khỏng th IgG khỏng vi rỳt viờm nóo Nht Bn (VNNB)
- Cm bin min dch in húa.
Ni dung nghiờn cu bao gm
- Th nghim, ti u húa quy trỡnh tỏch chit v tinh sch khỏng th IgG khỏng vi
rỳt VNNB.
- Phõn tớch, ỏnh giỏ kh nng s dng khỏng th IgG cm bin min dch phỏt
hin vi rỳt gõy bnh.
- Th nghim mt s phng phỏp c nh khỏng th lờn b mt in cc ca cm
bin, tỡm ra phng phỏp thớch hp nht.
- o c v phõn tớch kt qu phng phỏp c nh khỏng th IgG cho cm bin
min dch.
- Th nghim o c kh nng phỏt hin vi rỳt ca cm bin min dch vi cỏc
phng phỏp c nh khỏng th khỏc nhau.
Trờn c s ni dung nghiờn cu trờn, lun vn ny c trỡnh by thnh ba chng :
Chng 1. Tng quan ti liu
Chng 1 trỡnh by tng quan v lch s phỏt trin, khỏi nim cng nh nguyờn lý
v phõn loi cm bin sinh hc. Bờn cnh ú tỏc gi trỡnh by nhng kin thc v
khỏng nguyờn, khỏng th v cỏc phng phỏp tinh sch khỏng th, khỏi nim c bn
v vi rỳt VNNB, tỏc gi c bit quan tõm gii thiu mt s phng phỏp c nh
khỏng th trờn cm bin ó c nghiờn cu v th nghim.

K810 Khoa Công nghệ sinh học

2

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

Chng 2. Phng phỏp thc nghim
Trong chng 2 ny tỏc gi mụ t cỏc phng phỏp thc nghim thc hin cỏc
ni dung nghiờn cu ó ra. Bt u t vic la chn vt liu, húa cht cng nh
trang thit b cho n cỏc bc thc hin tỏch chit tinh sch khỏng th v cỏc
phng phỏp c nh khỏng th lờn b mt cm bin. Cỏc phng phỏp o c v
th nghim nhy ca cm bin cng c mụ t chi tit.
Chng 3. Kt qu v Tho lun
Trờn c s cỏc phng phỏp thc nghim thc hin ni dung nghiờn cu ca
ti, ton b kt qu nghiờn cu c tỏc gi trỡnh by trong chng ny. a vo
nhng thụng tin khoa hc ca cỏc nghiờn cu liờn quan ó cụng b trc õy, tỏc
gi tp trung tho lun, so sỏnh vi kt qu thc nghim ti u húa vn . Trờn
c s ú a ra nhng kt lun theo tng ni dung nghiờn cu.

K810 Khoa Công nghệ sinh học

3

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

CHNG 1. TNG QUAN
1.1. Lch s hỡnh thnh v phỏt trin cm bin sinh hc
Ngi u tiờn t nn múng cho cm bin sinh hc l giỏo s Lenand Clark Jnr,

nm 1956 ụng l ngi u tiờn phỏt minh ra in cc oxy húa [22]. Ti hi tho
khoa hc Hn lõm Khoa hc New York nm 1962 ụng ó a ra mt hng nghiờn
cu mi ú l: nghiờn cu v ch to ra cm bin thụng minh hn cm bin pH,
phõn th, dn bng cỏch s dng enzym glucose oxides xỳc tỏc cho qua trỡnh
chuyn húa ng glucose thnh axớt gluconic, gim nng oxy o c t l
vi nng glucose. Cng trong nm 1962 ụng v Lyon ó a ra khỏi niờm in
cc enzyme [21]. Tip sau ú Updike v Hick ó tin hnh thc nghim chng
minh s cn thit ca in cc enzym vi chc nng o nng glucose [65]. Nm
1969, Guilbault v Montalvo cụng b chi tit v in cc enzym bng phng phỏp
o in th. Nm 1975, ý tng ca Clark ó c thc hin khi cụng ty thit b
Yellow Springs (Ohio, M) gii thiu thit b o nng glucose ln th hai (ln
u vo nm 1973). Cooney ó xut hng nghiờn cu cm bin sinh hc s
dng b chuyn i nhit vo nm 1974 v cỏc thit b ny c t tờn u dũ
enzym nhit v enzym cp nhit [24], [ 45].
Nm 1975, Divis xut hng nghiờn cu mi ú l cỏc in cc vi sinh vt vi
yu t nhn bit l cỏc vi sinh vt o nng cn [28]. Cụng trỡnh ca Divis ó
to tin cho vic nghiờn cu ng dng cỏc loi cm bin sinh hc trong cụng
ngh sinh hc cng nh kim soỏt mụi trng Nht Bn.
Bng thc nghim, nm 1976 Clemens v ng nghip ó thnh cụng trong vic
tớch hp cm bin sinh hc glucose in húa vo trong tuyn ty nhõn to [23],
ngay sau ú thit b ny c Miles tung ra th trng vi thng hiu Biostator
cựng thi im vi thit b Lactat LA640 s dng enzym dehydrogenase lm cht
chuyn in t t lactat n in cc. Nm 1982, Shichiri v ng nghip ln u
tiờn mụ t in cc kiu hỡnh kim t di da [56], ó cú nhiu cụng ty theo ui
K810 Khoa Công nghệ sinh học

4

Đại học Bách khoa Hà Nội

Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

phỏt trin thit b ny. Trong khi ú, ý tng to ra cm bin min dch bng cỏch
c nh khỏng th lờn b mt in cc ó c nghiờn cu t nhng nm 1970 [41],
cỏc nh khoa hc ó mụ t s cng hng plasmon b mt c ng dng kim
soỏt phn ng ỏi lc xy ra. Nm 1990, BIA core ó cho ra mt cm bin da trờn
cụng ngh ny, Nm 1984, cú rt nhiu cụng trỡnh cụng b s dng ferrocene v
dn xut lm cht trung gian c nh cỏc phn t dũ lờn b mt in cc [19]. Cụng
ty MediSense ó ỏp dng phỏt trin theo hng cụng ngh ny ó t doanh thu 175
triu USD nm 1996. Hin nay cỏc tp chớ chuyờn ngnh ó ng ti s lng ln
cỏc cụng trỡnh nghiờn cu v thit b khai thỏc cỏc c tớnh ca enzym, ADN, ARN,
vi rỳt, vi khun, th th t bo, khỏng th, khỏng nguyờn[42], [18], [43], [33].
Mi loi thit b cú th c s dng cho cỏc mc ớch khỏc nhau nh: y t, thc
phm, mụi trng, an ninh quc phũng, khng b sinh hc[12] ,[ 27], [38].
Trong 20 nm tr li õy, trờn th gii ó cú rt nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v cm
bin sinh hc ó c cụng b trờn cỏc tp chớ khoa hc. T trang d liu ca Vin
thụng tin khoa hc (ISI Web of Science), chỳng tụi ó thng kờ c hn 13.600
bi bỏo liờn quan n lnh vc cm bin sinh hc ó c cụng b t nm 1990 n
2010, cú 10.700 bi bỏo cụng b t nm 2000 n nm 2010. Mc dự s phỏt trin
nhanh chúng v thnh cụng ca cm bin sinh hc trong hn mt thp k qua ó
c ghi nhn thụng qua s lng ln cỏc cụng trỡnh liờn quan ó cụng b ISI. Tuy
nhiờn, nhng ng dng cm bin sinh hc phỏt hin vi rỳt gõy bnh vn cha
nhiu, lnh vc ny mi thc s phỏt trin nhanh trong vi nm gn õy. Theo thng
kờ t trang thụng tin ISI Web of Science cú khong 151 bi bỏo trong ú cú liờn
quan n phỏt trin cm bin sinh hc dũ tỡm vi rỳt gõy bnh, trong ú cú 86
cụng trỡnh v cm bin ADN v 65 v cm bin min dch [ 2]. Cỏc i tng vi rỳt
c quan tõm nghiờn cu trong 151 cụng trỡnh phõn b theo hỡnh 1.1.

K810 Khoa Công nghệ sinh học

5

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

Viờm gan
cỳm A
Dengue

20%
31%

HIV
HPV

3%
3%
3,5%
3,5%

Hanta
WNV
13%

5%
8%

SARS-CoV
HSV

10%

Vi rỳt khỏc

Hỡnh 1.1. S phỏt trin cm bin sinh hc, phõn b theo i tng vi rỳt gõy bnh
c phỏt hin trong 10 nm gn õy (nm 2000 n 7/2010)
Trong nhng nm gn õy, cm bin sinh hc ang l lnh vc c s quan tõm
ca rt nhiu nh khoa hc cng nh cỏc hóng sn xut thuc lnh vc in t y
sinh. Vit Nam khỏi nim cm bin sinh hc cng ch mi c bit n trong
khong 10 nm tr li õy. Tuy vn cũn rt mi m v ang trong quỏ trỡnh phỏt
trin nhng bc u tiờn, song ó t c mt s thnh tu nh: cm bin phỏt
hin s bin i gen u tng, phỏt hin d lng thuc tr sõu v mi õy l
cm bin phỏt hin vi rỳt, vi khun, ADN,... ang ngy cng c nghiờn cu v s
dng rng rói.[3], [4],[ 5],[34], [7].
1.2. Cm bin sinh hc
1.2.1. Khỏi nim cm bin sinh hc
Hip hi quc t v hoỏ hc ng dng - IUPAC nm 1999 ó nh ngha: cm bin
sinh hc l mt thit b tớch hp c lp, nh gn, cú kh nng cung cp nhng
thụng tin phõn tớch nh lng hoc bỏn nh lng, s dng mt yu t nhn bit
sinh hc (th th sinh húa) duy trỡ s tip xỳc khụng gian trc tip vi mt phn t
chuyn i [25].

K810 Khoa Công nghệ sinh học

6

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

Cm bin sinh hc l mt loi cm bin hot ng da trờn c s ca cỏc loi cm
bin vt lý hoc húa hc c s dng phỏt hin s bin i húa sinh ca cỏc
cht da trờn cỏc phn ng sinh hc.

Hỡnh 1.2. Cu to chung ca cm bin sinh hc
Theo cu to chung ca cm bin sinh hc ta thy nú c cu to t cỏc b phn
chớnh sau: Phn t nhn bit sinh hc; b chuyn i tớn hiu; b khuch i tớn
hiu, b x lý tớn hiu, biu hin kt qu [10],[ 62].
Phn t nhn bit sinh hc: L mt loi vt liu cú bn cht sinh hc cú th liờn
kt, bt cp, xỳc tỏc hoc phn ng vi c cht (cht cn phõn tớch) to ra cỏc thay
i sinh hoỏ trong quỏ trỡnh phõn tớch. Trong cm bin sinh hc, phn t sinh hc
úng vai trũ ht sc quan trng, nú nh hng trc tip n nhy v c hiu
ca cm bin. Hin nay, phn t sinh hc c s dng ch yu l cỏc loi enzym,
chui ADN, ARN, cỏc khỏng nguyờn/khỏng th, t bo, mụ, vi sinh vt v cỏc vt
liu sinh hc khỏcTrong y hc phỏt hin nhanh cỏc vi sinh vt gõy bnh cú th
s dng cỏc cm bin cú s dng cỏc th th l khỏng nguyờn/ khỏng th hoc
ADN/ARN c hiu. Trong thc t tựy theo c tớnh riờng ca cỏc cht cn phõn
tớch m cú nhng la chn th th khỏc nhau.

K810 Khoa Công nghệ sinh học

7

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

B chuyn i: Trong ton b cụng ngh ch to cm bin chia ra lm bn phng
phỏp chuyn i tớn hiu bao gm: in húa, nhit, quang v khi. Chớnh s khỏc
bit ca tớnh cht b mt cm bin, kh nng o lng, thi gian o, kh nng tỏi s
dng cm bin ph thuc vo tng phng phỏp chuyn i tớn hiu. c im c
bn ca 4 loi chuyn i c mụ t di õy.
+ Chuyn i in húa (electrochemical transducer)
Gm sỏu loi: o th, o dũng, o bỏn dn, o cụng sut, o tr khỏng v o
trng thỏi oxy húa. Trong cm bin sinh hc hin nay thỡ phng phỏp o in th
(o s thay i pH mụi trng) v phng phỏp o dũng in c s dng rng
rói nht.
+ Chuyn i nhit (thermal transducer)
Trong tt c cỏc phn ng trong c th sng u do enzym hoc vi sinh vt xỳc tỏc,
cỏc phn ng ny u gii phúng nhit nờn b chuyn i nhit c ng dng
theo dừi s thay i nhit . Loi thit b ny c ng dng rng rói trong ngnh
cụng nghip thc phm.
+ Chuyn i quang (optical transducer)
Trong mt s ỏp ng sinh hc to ra cỏc c tớnh quang cú th o c nh: hunh
quang, lng ỏnh sỏng b hp th, ch s khỳc x, s nhiu x hay s phõn cc.
Thit b ny cú th chia thnh hai phn: bờn ngoi v bờn trong. Phn bờn trong ỏnh
sỏng cú th xuyờn qua mu v phn ng trc tip vi mu. Phn bờn ngoi, súng

ỏnh sỏng khụng trc tip qua khi mu m truyn theo mt b phn hng sỏng v
ch tng tỏc vi mu ti b mt v nhanh chúng bin mt.
+ Chuyn i khi (mass transducer)
Loi chuyn i ny rt nhy vi s thay i n hi, t trng hay tớnh bỏn dn
ca b mt khi cú súng õm xuyờn qua. H thng ỏp in nht thit phi cõn bng v
K810 Khoa Công nghệ sinh học

8

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

da trờn tớnh cht ca cỏc tinh th thch anh. Nhng tinh th ny s b bin dng c
hc khi cho qua mt in th.
B phn khuch i tớn hiu: l b phn khụng th thiu trong cm bin sinh hc.
Thng s dng vi cỏc trng hp tớn hiu in hoc n gin ch l thu cỏc tớn
hiu gc a vo b x lý tớn hiu.
B x lý tớn hiu: X lý tớn hiu a ra kt qu, thụng qua vic so sỏnh vi cỏc
mc chun hoc cụng thc toỏn hc.
1.2.2. Nguyờn lý hot ng ca cm bin sinh hc
Cm bin sinh hc hot ng trờn c s thu nhn, chuyn i v khuch i tớn
hiu t cỏc tng tỏc gia phn t nhn bit vi phn t ớch. Nguyờn lý hot ng
ca cm bin sinh hc c mụ t hỡnh 1.3

Hỡnh 1.3. Nguyờn lý hot ng cm bin sinh hc
Trong cm bin sinh hc, mi phõn t nhn bit ch cú th nhn bit c mt hay

mt nhúm i tng phõn tớch nht nh. Khi cho cm bin sinh hc tip xỳc vi
mu, nu cú s tng tỏc gia u dũ vi phn t ớch thỡ phn ng sinh húa s xy
ra, ng thi to ra cỏc tớn hiu: in húa, nhit, nng ion, kớch thớch hunh
quang, hp th ỏnh sỏng, thay i khi lng Tựy theo tng loi tớn hiu m ta s

K810 Khoa Công nghệ sinh học

9

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

dng cỏc loi chuyn i tớn hiu khỏc nhau. Nu phn t dũ khụng tng tỏc vi
phn t ớch thỡ s khụng phỏt ra tớn hiu hoc phỏt ra rt yu.
1.2.3. Phõn loi cm bin sinh hc
Tựy theo phn t nhn bit sinh hc v b chuyn i m ta cú th phõn loi cm
bin sinh hc thnh cỏc loi khỏc nhau. Trong chn oỏn bnh, ngi ta da vo
yu t nhn bit sinh hc phõn loi cm bin v phõn thnh cỏc loi sau.
Cm bin min dch (immunosensors)
Cm bin min dch l ch ngy cng thu hỳt s quan tõm ca cỏc nh nghiờn cu
do thit b ny cú tim nng ng dng thay th cỏc k thut min dch trong chn
oỏn bnh v kim soỏt mụi trng. K thut ELISA, PCR l nhng phng phỏp
cú nhy v c hiu cao, tuy nhiờn mu phõn tớch cn phi x lý trc khi phõn
tớch, do ú quỏ trỡnh phõn tớch s tn nhiu thi gian, sinh phm v húa cht. Cm
bin min dch l thit b phõn tớch khụng cn x lý mu trc v cú kh nng phõn
tớch mu cú cha nhiu tp cht nh: mỏu, huyt thanh, nc tiu cha cỏc c cht

nh protein, axớt amin, ng, hooc mụn c bit, cm bin min dch cú u im
vt tri hn hn so vi phng phỏp chun khỏc v thi gian v nhy [63].
Trong cm bin min dch, khỏng th, phi t/th th v khỏng nguyờn c s
dng nh cỏc vt liu sinh hc cú kh nng gn kt vi cht phõn tớch khụng cựng
húa tr. [48], [70]. Trong ú, khỏng th thng xuyờn c s dng lm phn t u
dũ, do khỏng th l yu t nhn bit rt thớch hp trong quỏ trỡnh to ra cm bin
min dch. i lc v c hiu cao ca mt khỏng th vi mt khỏng nguyờn
tng ng cho phộp to ra s gn kt cú chn lc trong cht phõn tớch mc
nano n pico mol cho dự cú s hin din ca hng trm cht khỏc nhau, thm chớ
cỏc tp cht ny vt quỏ nng cht phõn tớch ti 2 n 3 ln [37].
iu kin thit yu cho vic ch to thnh cụng cm bin trờn c s ỏi lc l quỏ
trỡnh c nh ca phn t dũ (phn t gn kt). Quỏ trỡnh ny thng c thc hin

K810 Khoa Công nghệ sinh học

10

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

nh ng dng cỏc polyme nh: 3-aminopropyl-triethoxy-silance (APTES)
polypyrrole (PPy), APTES l loi polyme thng c s dng lm phn t gn
kt trung gian do cú tớnh tng thớch sinh hc tt nht, polyme húa pH trung
tớnh v cỏc phn t sinh hc khỏc nhau cú th c c nh d dng trờn polyme ny
Ngoi ra, mt s polyme dn cng c cỏc nh nghiờn cu quan tõm nhm tng
nhy ca cm bin. Do loi polyme ny cú kh nng truyn ti in tớch v tng

thớch sinh hc. Tuy nhiờn, trong khuõn kh lun vn, tỏc gi la chn APTES c
nh khỏng th cho cm bin min dch, õy cng l loi polyme c s dng ph
bin trong vic phỏt trin cm bin sinh hc Vit Nam phỏt hin tỏc nhõn gõy bnh.
Cm bin min dch cú hai cỏch phỏt hin l: cm bin phỏt hin trc tip v cm
bin phỏt hin thụng qua cht ỏnh du trung gian. Cm bin phỏt hin giỏn tip cú
u im l lm tng nhy, nhng li lm gim tớnh chn lc do s dng cht
ỏnh du trung gian, hn na k thut ny tn nhiu húa cht v thi gian do cn
thi gian khỏng th vi cht ỏnh du. Do ú cm bin min dch phỏt hin trc
tip khụng cn cht ỏnh du thng c quan tõm hn, loi cm bin ny cho
phộp o mu vi kt qu tc thi m khụng cn thờm bt k cht no khỏc [68]. Dũ
tỡm cht phõn tớch bng in húa khụng s dng cht ỏnh du c phỏt trin mt
cỏch nhanh chúng v rt cú ớch khi cht phõn tớch khụng trong sut hoc cú mu
nh dũ tỡm trong c th bnh nhõn. a s cỏc k thut min dch in húa khụng s
dng cht ỏnh du da trờn s thay i mt hoc dn thc hin quỏ trỡnh
chuyn i m khụng cn bt c phn ng in húa ph tr no.
Ngy nay, tng kh nng ng dng, tc nhanh, c hiu cao, cm bin
min dch ó cú nhiu ci tin c phỏt trin da trờn nguyờn lý c nh cỏc phõn
t sinh hc trờn pha rn, trong ú khỏng th hoc khỏng nguyờn c c nh trờn
b mt cm bin dũ tỡm khỏng nguyờn hoc khỏng th cú trong mu. [20].
Vi nhng u im trờn cm bin min dch ngy cng c nghiờn cu phỏt trin
v ng dng rng rói trong chn oỏn y hc nh xỏc nh cỏc tỏc nhõn gõy bnh

K810 Khoa Công nghệ sinh học

11

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

truyn nhim, phõn tớch mụi trng v kim soỏt thc phm. Qua cng thụng tin
ca Vin thụng tin khoa hc (ISI Web of Science) trong 10 nm tr li õy ó cú ti
65 cụng trỡnh nghiờn cu v cm bin min dch phỏt hin vi rỳt c cụng b
trờn cỏc tp trớ, cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ny c cụng b trong 10 nm gn õy
(2001 2010).
Bng 1.1. Mt s kt qu ca cm bin min dch trong phỏt hin vi rỳt gõy bnh
Loi cm bin
Cm bin min
dch in húa
Cm bin min
dch quang hc
Cm bin min
dch quang hc
Cm bin min
dch in húa
Cm bin min
dch quang hc
Cm bin min
dch quang hc
Cm bin min
dch quang hc
Cm bin min
dch quang hc

nhy
Tỏc gi
Gii hn dũ Thi gian

tỡm
phỏt hin
nhy ln hn 10 ln so
vi phng phỏp ELISA,
Vetcha v cs.,
Vi rỳt Hanta
thi gian phõn tớch khong 2001
25 phỳt
Boli v cs.,
SARS-CoV
0,6 àg/ml
<2 phỳt
2004
1,727 àg/ml
(protein E)
Khụng
Tzong v cs.,
Vi rỳt Dengue
0,74 àg/ml
a ra
2005
(protein NS1)
Khụng
Patolsky v cs.,
Vi rỳt cỳm A 50 ht/ ml
a ra
2005
Aurel v cs.,
Vi rỳt herpes 850 ht/ml
~ giõy

2007
Khụng
Gin v cs.,
HIV
40ng/ml
a ra
2008
Khụng
Naoyoshi v cs.,
Vi rỳt cỳm
2pg/ml
a ra
2008
Gii hn dũ tỡm thp hn
Danit v cs.,
Vi rỳt Dengue 100 ln so vi phng
2009
phỏp MAC-ELISA
i tng
dũ tỡm

K810 Khoa Công nghệ sinh học

12

Đại học Bách khoa Hà Nội


Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

S ln g cụ n g trỡn h cụ n g b

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Thi gian cụng b

Hỡnh 1.4. S phỏt trin cm bin min dch phỏt hin vi rỳt gõy bnh trong 10
nm gn õy (ngun d liu ISI Web of Science t nm 2000 n 7/2010)
Cm bin ADN (DNA sensors)
Nguyờn lý hot ng ca cm bin ADN da trờn s bt cp b sung c hiu ca
hai mch n ADN. Phõn t ADN trong c th sng thng tn ti di dng xon
kộp, di tỏc ng ca nhõn t gõy bin tớnh nh: nhit , pH, húa cht mt mc
nht nh no ú s lm cho hai mch ny phõn tỏch nhau ra. S lai húa gia hai
mch n ADN ( ADN mch dũ ADN mch ớch) s to ra tớn hiu dũ tỡm.
Cm bin enzym ( enzyme sensor)
Nguyờn lý hot ng ca cm bin enzym da trờn s bin i trờn mng enzym
di s tng tỏc ca c cht. Trong loi cm bin ny cú mt mng enzym c
c nh trờn b mt in cc. Ti õy phn ng oxy húa kh (c cht enzym) s
xy ra lm thay i nng lng t do, s thay i ny l tớn hiu ca phộp o. Tớn
hiu ny thng c o di dng in th hoc dũng in [8].

K810 Khoa Công nghệ sinh học

13

Đại học Bách khoa Hà Nội

Luận văn thạc sĩ khoa học

Phạm Văn Chung

Bng 1.2. Cỏc loi enzym thng dựng
Tờn enzym

C cht xỏc nh

Sn phm

Urease

Ure

NH4+, CO2

Alcol oxydase

Alcohl

H2O2

Glucoxydase, Catalase

Glucose

H2O2, O2

Invertase, Glucoxydase

Saccarose

H2O2

galactosidase, Glucoxydase

Lactose

H2O2

Penicillinase

Penicillin

H+

Cm bin vi sinh vt (Microbial sensor)
Cm bin vi sinh vt c ch to ch yu phỏt hin cỏc cht húa hc, da trờn
kh nng trao i cht cng nh hụ hp ca vi sinh vt.
Tựy theo yu t phõn tớch ta cú th chia thnh hai loi:
- Cm bin o s thay i hot lc hụ hp ca vi sinh vt c c nh sn trờn b
mt cm bin, loi cm bin ny thng s dng phộp o in th.
- Cm bin o cỏc cht do vi sinh vt sinh ra cú kh nng phn ng d dng vi cỏc
in cc.
Trong quỏ trỡnh sng ca vi khun hiu khớ thng s dng oxy v sn sinh ra nng
lng. Nh vo lng oxy tiờu th thụng qua in cc O2, ta cú th ỏnh giỏ hot
lc hụ hp. Oxy thm qua mng teflon v b kh trờn in cc platin. Nu vt liu
trong dung dch mu cú nh hng n hot lc hụ hp thỡ nng ca nú cú th
nh lng thụng qua vic xỏc nh nng oxy.

Loi cm bin ny thng c ng dng xỏc nh ch s BOD. Ch s BOD l
ch s ỏnh giỏ mc ụ nhim ca nc do cỏc hp cht hu c gõy nờn. Cỏc cht
hu c ny cú th b phõn hy bi vi sinh vt nh s dng oxy. Vỡ vy mc ụ

K810 Khoa Công nghệ sinh học

14

Đại học Bách khoa Hà Nội