Nghiên cứu tạo chủng vắc xin salmonella choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạ

LÂM THỊ HUẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---***---

LÂM THỊ HUẾ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN
Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC
LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA: 2010B

Hà Nội – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---***---

LÂM THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN
Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC
LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. VŨ KHẮC HÙNG
2. PGS. TS. NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

Hà Nội – 2012


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình làm luận án, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện
công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội, Ban
lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các thầy cô giáo trong Viện công nghệ sinh
học – công nghệ thực phẩm của trường, các cán bộ - Bộ môn công nghệ sinh học
và tập thể cán bộ công nhân viên ở Phân viện.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện công
nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội và Ban lãnh
đạo Phân viện Thú y miền Trung.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Khắc Hùng, người đã trực tiếp hướng dẫn
tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tại Bộ môn công nghệ sinh học – Phân viện
Thú y miền Trung. Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cô
chú, anh chị trong bộ môn công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo trong
thời gian tôi thực hiện luận án ở đây.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm, người đã
hướng dẫn tôi cùng các thầy cô giáo trong Viện công nghệ sinh học – công nghệ
thực phẩm.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến những người thân trong

gia đình đã động viên, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm
luận án.
Hà Nội, ngày 20 tháng 03 năm 2012
Tác giả luận văn


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH

....................................................................................... iv

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 5
1.1. BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN......................................... 5
1.1.1. Bệnh phó thương hàn ................................................................................ 5
1.1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh ....................................................................... 5
1.1.1.2. Triệu chứng – Bệnh tích ..................................................................... 5
1.1.1.3. Chẩn đoán ........................................................................................... 7
1.1.1.4. Phòng và trị bệnh................................................................................ 7
1.1.2. Bệnh phù đầu (Edema Disease)................................................................. 8
1.1.2.1. Nguyên nhân gây bệnh ....................................................................... 8
1.1.2.2. Triệu chứng – Bệnh tích ..................................................................... 8
1.1.2.3. Chẩn đoán ........................................................................................... 9
1.1.2.4. Phòng và trị bệnh................................................................................ 9
1.2. VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN
TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC ................................................... 9

1.2.1. Vắcxin thú y .............................................................................................. 9
1.2.2. Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc.. 11
1.2.3. Vắcxin phòng bệnh phó thương hàn và phù đầu ở lợn ............................ 13
1.3. VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S. choleraesuis) .................................. 14
1.3.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 14


1.3.2. Đặc tính về nuôi cấy .................................................................................. 15
1.3.3. Đặc tính sinh hóa ....................................................................................... 15
1.3.4. Sức đề kháng ............................................................................................. 15
1.3.5. Cấu trúc kháng nguyên .............................................................................. 16
1.3.6. Tính gây bệnh ............................................................................................ 16
1.4. GEN CRP (cAMP RECEPTOR) VÀ ASD (β-ASPARTIC
SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE) ...................................................... 17
1.4.1. Gen crp (cAMP receptor) .......................................................................... 17
1.4.2. Gen asd (β-aspartic semialdehyde dehydrogenase) .................................. 19
1.5. PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG............................. 19
1.5.1. Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+) .................................................... 20
1.5.2. Plasmis pRE112 ........................................................................................ 21
1.6. TẾ BÀO CHỦ ĐỂ KHUẾCH ĐẠI GEN .......................................................... 21
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 23
2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .......................... 23
2.2. VẬT LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU......................................................... 23
2.2.1. Chủng vi sinh vật ...................................................................................... 23
2.2.2. Hóa chất và môi trường ............................................................................. 23
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................... 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 25
2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số ...................................................... 25
2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN plasmid .................................................... 26
2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di ................................... 27

2.3.4. Phương pháp PCR .................................................................................... 27
2.3.5. Phản ứng phân cắt sản phẩm PCR, plasmid và lai của Vu-Khac H và
Kurt Miller ............................................................................................... 30


2.3.6. Phương pháp biến nạp của Kang và cs ..................................................... 31
2.3.7. Phương pháp tạo tế bào E. coli khả biến ................................................... 32
2.3.8. Phương pháp tiếp hợp của Kang và cộng sự ............................................ 33
2.3.9. Phương pháp lên men các loại đường ....................................................... 33
2.3.10. Phương pháp ngưng kết kháng huyết thanh O và H ................................ 33
2.3.11. Kiểm tra tính ổn định của gen đột biến ................................................... 33
2.3.12. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 33
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 34
3.1. TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆crp ...................................... 34
3.1.1. Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo - polymerase.............. 34
3.1.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 .............................................. 35
3.1.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆crp .............................................. 36
3.1.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆crp ................................................ 36
3.2. TẠO CHỦNG S. choleraesuis Smith MANG GEN CRP ĐỘT BIẾN ............ 38
3.3. KIỂM TRA ĐẶC TÍNH CỦA S. choleraesuis 539 ......................................... 40
3.3.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 40
3.3.2. Tốc độ sinh trưởng ..................................................................................... 40
3.3.3. Khả năng lên men đường ........................................................................... 41
3.3.4. Giám định kháng nguyên H, O .................................................................. 42
3.3.5. Kết quả giải trình tự ................................................................................... 42
3.3.6. Kiểm tra tính ổn định của gen ∆crp trong chủng S. choleraesuis 539 ...... 43
3.4. TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆asd ..................................... 45
3.4.1. Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 với enzyme Pwo - polymerase ............. 45
3.4.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆asd ............................................. 46
3.4.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆asd ............................................... 47

3.5. TẠO CHỦNG S. choleraesuis 539 MANG GEN ASD ĐỘT BIẾN ................ 48


3.6. KIỂM TRA CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG S. choleraesuis 179 ................ 50
3.6.1. Tốc độ sinh trưởng của S. choleraesuis 179.............................................. 50
3.6.2. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis 179 .................................... 50
3.6.3. Xác định dạng kháng nguyên O và H ....................................................... 51
3.6.4. Tính ổn định của gen ∆asd trong hệ gen S. choleraesuis 179 ................... 51
3.6.5. Kết quả giải trình tự gen asd của S. choleraesuis 179............................... 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 55
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 55
KIẾN NGHỊ.............................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 56


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là người trực tiếp tham gia thực hiện nội dung của đề tài. Các kết quả,
số liệu, hình ảnh trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan.
Tôi chịu trách nhiệm về lời cam đoan của tôi.
Tác giả luận văn

Lâm Thị Huế

i


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
ADN
asd

Tên đầy đủ
Desoxyribonucleic acid

bp

Aspartic semialdehyde dehydrogenase
Base pair

CIP

Alkaline phosphate

CIRAD

Centre de Coopération Internationale en Recherche
Agronomique pour le Développement (French Agricultural
Research Centre for International Development)

Cm

Chloramphenicol

crp

cAMP receptor protein

DAP
E. coli

Diaminopimelic acid
Escherichia coli

F

Forward

Kb

Kilobase

Km

Kanamycin

LB
MR

Luria Bertani
Methyl rouge

NA

Nutrient agar

NB

Nutrient broth

PBS

Phosphate buffer saline

PCR

Polymeration Chain Reaction

R
SPI-1
S. choleraesuis

Reverse
Salmonella pathogenicity island 1
Salmonella choleraesuis

TBE

Tris-Borate-EDTA

T3SS

Type III secretion system
Voges prosskauer

VP
Uasd, Ucrp

Đột biến gen asd, crp

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng

Bảng 2.1: Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR ........................................................ 24
Bảng 2.2. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR ................................................... 27
Bảng 2.3. Bảng chu trình nhiệt .................................................................................... 28
Bảng 2.4. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR ................................................... 28
Bảng 2.5. Bảng chu trình nhiệt .................................................................................... 28
Bảng 2.6. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR ................................................... 29
Bảng 2.7. Bảng chu trình nhiệt .................................................................................... 29
Bảng 2.8. Thành phần cho một mẫu phản ứng colony PCR ....................................... 30
Bảng 2.9. Bảng chu trình nhiệt .................................................................................... 30
Bảng 3.1. So sánh khả năng lên men đường của S. choleraesuis 539
và S. choleraesuis Smith ............................................................................. 42
Bảng 3.2. So sánh khả năng lên men đường của S. choleraesuis 179
và S. choleraesuis Smith ............................................................................. 51

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già

lợn mắc bệnh ............................................................................................... 6
Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn S. choleraesuis......................................... 14
Hình 1.3. Plasmid pBSIIK+ ........................................................................................ 20
Hình 1.4. Plasmid pRE112 ........................................................................................... 21
Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là ADN tổng số của
chủng S. choleraesuis Smith với cặp mồi Pr1F-Pr2R, Pr3F-Pr4R và
enzyme Pwo-polymerase ............................................................................ 34
Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết plasmid pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN
plasmid của 4 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với enzyme cắt
giới hạn BamHI/XbaI (B) ........................................................................... 35
Hình 3.3. Sản phẩm cắt ADN plasmid của 3 dòng pBSIIK(+)/∆crp với enzyme cắt
giới hạn XhoI/KpnI ..................................................................................... 36
Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại ∆crp (2,7kb) từ plasmid tái
tổ hợp pBSIIK+/∆crp (A) và sản phẩm cắt của 4 dòng pRE112/∆crp
bằng XbaI-KpnI (B) .................................................................................... 37
Hình 3.5: Các khuẩn lạc S. choleraesuis Smith sau khi tiếp hợp với E. coli
χ7213/pRE112/∆crp mọc trên môi trường chọn lọc LB chứa Cm ............. 38
Hình 3.6: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 539(1),
S. choleraesuis Smith(2), plasmid của χ7213/pRE112/∆crp(3) với cặp
mồi Pr5F-Pr6R(A) và Pr6R-Pr7F(B).......................................................... 39
Hình 3.7: Hình ảnh khuẩn lạc của chủng S. choleraesuis Smith (A) và chủng S.
choleraesuis 539 (B) sau 24 giờ nuôi cấy .................................................. 41

iv


Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của chủng S. choleraesuis 539 và chủng S.
choleraesuis Smith ..................................................................................... 41
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen khuếch đại gen crp của S. choleraesuis 539 từ cặp mồi
Pr5F- Pr6R mất đoạn gen 322bp (545-867) so với gen crp của S.

choleraesuis ............................................................................................... 43
Hình 3.10. Sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 539 các đời 1, 5, 10, 15,
20 với cặp mồi Pr5F-Pr6R (trắng) và Pr7F-Pr6R (trắng) ........................... 44
Hình 3.11: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là ADN tổng số của
chủng S. choleraesuis Smith với cặp mồi Pa1F-Pa2R, Pa3F-Pa4R và
enzyme Pwo-polymerase ............................................................................ 45
Hình 3.12: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pa12
với BamHI/XbaI (A) và 6 dòng pBSIIK(+)/∆asd với BamHI/KpnI (B) .... 46
Hình 3.13: Điện di sản phẩm cắt pBSIIK+/∆asd bằng cặp enzyme XbaI-KpnI ......... 47
Hình 3.14: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng plasmid tái tổ hợp
pRE112/∆asd bằng cặp enzyme XbaI/KpnI .............................................. 48
Hình 3.15. Hình khuẩn lạc chủng S. choleraesuis 539 sau khi tiếp hợp với chủng
E. coli χ7213/pRE112/∆asd-1 trên môi trường chọn lọc ........................... 48
Hình 3.16: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của các chủng S.
choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B) ................... 49
Hình 3.17: Đường cong sinh trưởng của S. choleraesuis 179 và S. choleraesuis Smith ....... 50
Hình 3.18: Sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 179 các đời 1, 5, 10, 15,
20 với cặp mồi Pa5F-Pa6R (trắng) và Pa7F-Pa6R (trắng). ........................ 51
Hình 3.19: Trình tự đoạn gen khuếch đại gen asd của chủng S. choleraesuis 179 từ
cặp mồi Pa5F- Pa6R mất đoạn gen 1485 bp (434-1902) so với gen asd
của S. choleraesuis ..................................................................................... 54

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của
người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là
ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm
trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD - Trung tâm

hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp vì phát triển , thịt lợn chiếm 77% tổng
lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam [25].
Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo chiến lược
phát triển chăn nuôi đến 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con
năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010,
lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191,3 ngàn
tấn năm 2010; 2794,7 ngàn tấn năm 2015 và 3493,1 ngàn tấn năm 2020. Trong đó đàn
lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm 19,3%) năm 2010, lên 8,9 triệu con (chiếm
27,0%) năm 2015 và lên 12,9 triệu con (chiếm 37,0%) năm 2020. Sản phẩm thịt hơi
nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010; 1851,5 ngàn tấn
(chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59,%) năm 2020 [7].
Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác
giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý; đặc biệt nhiệm vụ
của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp
khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là
điều hết sức quan trọng.
Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh
vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm
chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn
vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó
thương hàn và phù đầu do vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli (E. coli) gây ra.
Bệnh do vi khuẩn Salmonella và E. coli xảy ra ở hầu hết các loại hình chăn
nuôi và gây ra thiệt hại rất lớn về kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng
kháng sinh tràn lan đã dẫn đến tỷ lệ rất lớn các chủng vi khuẩn kháng lại kháng
1


sinh, do vậy việc điều trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn. Các loại vắcxin thú y ngoài
việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng,
bởi vì việc sử dụng vắcxin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh và các

loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá
trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người [47, 61]. Sử dụng vắcxin phòng
bệnh vẫn là một lựa chọn số 1 đối với các nhà chăn nuôi.
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vắcxin vi trùng, trong đó hai loại
vắcxin chết và vắcxin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắcxin chết ít hiệu quả
hơn so với các loại vắcxin sống nhược độc [30]. Những năm gần đây có rất nhiều
nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắcxin sống nhược
độc. Tuy nhiên các loại vắcxin sống nhược độc tạo ra qua tác dụng lý hóa hoặc bằng
phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất
định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắcxin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất
lớn [43, 56]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắcxin thế hệ mới ra đời,
một trong số đó là vắcxin tái tổ hợp. Quá trình tạo vắcxin tái tổ hợp bắt đầu bằng
việc tạo chủng vi khuẩn nhược độc. Sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ những gen gây
bệnh của vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và phát
triển như vi khuẩn ban đầu [23, 37, 51]. Sau đó tổ hợp gen biểu hiện kháng nguyên
ngoại lai cùng với hệ thống khởi động được thiết kế và ghép vào chủng vi khuẩn
nhược độc. Chủng này mang plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên ngoại lai. Vì
vậy trên chủng vắcxin mang đồng thời 2 loại kháng nguyên, kháng nguyên của vi
khuẩn và kháng nguyên ngoại lai.
Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vắcxin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó
là vắcxin chết và vắcxin nhược độc. Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E. coli gây ra,
hiện nay có một số cơ sở sản xuất vắcxin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin. Đến
nay, vẫn chưa có vắcxin kép phòng hai bệnh trên. Vì vậy, để phòng cả hai bệnh trên
thì phải tiêm hai mũi vắcxin khác nhau, ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lợn. Việc
áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của Mỹ để nghiên cứu chế tạo vắcxin tái tổ hợp đa
giá chất lượng cao, giá thành hạ với một lần tiêm có thể phòng được nhiều bệnh là

2

việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do bệnh gây ra.
Từ yêu cầu thực tế và những tìm hiểu về tình hình nghiên cứu chế tạo vắcxin
thế hệ mới đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, việc
nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S. choleraesuis) nhược độc
mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde
dehydrogenase) đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang plasmid ngoại lai của
E. coli để phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn được đặt ra có ý nghĩa về
khoa học và thực tiễn cao.
Để góp phần đi tới đích chung nêu ra ở trên trong luận văn này tôi thực hiện
các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: ”Nghiên cứu tạo chủng vắcxin S.
choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp”.
Mục tiêu:
+ Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen crp đột biến (pRE112/∆crp).
+ Tạo chủng Salmonella cholerasuis nhược độc mang gen crp đột biến.
+ Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen asd đột biến (pRE112/∆asd).
+ Tạo chủng Salmonella cholerasuis nhược độc mang hai gen crp và asd đột
biến.
+ Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S. choleraesuis mang hai
gen crp và asd đột biến.
Mục đích:
Tạo được chủng vắcxin S. choleraesuis nhược độc mang hai gen crp, asd đột
biến làm chủng vi khuẩn biến nạp.
Để đạt được những mục tiêu và mục đích trên, các nội dung nghiên cứu bao
gồm:
- Tạo dòng plasmid pRE112/∆crp. Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid
pRE112/∆crp.
- Chuyển nạp plasmid pRE112/∆crp vào chủng S. choleraesuis nhược độc
gây đột biến gen crp. Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp.
- Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S. choleraesuis mang gen
crp đã bị đột biến (S. choleraesuis ∆crp).

3


- Tạo dòng plasmid pRE112/∆asd. Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid
pRE112/∆asd.
- Chuyển nạp plasmid pRE112/∆asd vào chủng S. choleraesuis ∆crp. Kiểm
tra kết quả gây đột biến gen asd.
- Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S. choleraesuis mang hai
gen crp, asd đột biến.
Đối tượng nghiên cứu: chủng S. choleraesuis nhược độc (S. choleraesuis
Smith) do Phân viện Thú y miền Trung cung cấp.

4


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN
1.1.1. Bệnh phó thương hàn [67]
Bệnh phó thương hàn lợn (Salmonellosis of Swine typhoid - Swine Entoritis
Swine paratyphoid) là một bệnh truyền nhiễm xảy ra trên lợn ở mọi lứa tuổi, thường
gặp ở lợn con đặc biệt là lợn sau cai sữa từ 2 - 4 tháng tuổi, ở lợn trưởng thành thì ít
thấy. Hầu như không thấy trường hợp lợn đang bú sữa mắc bệnh (do lợn con có
kháng thể truyền từ sữa mẹ). Bệnh có đặc điểm gây bại huyết, viêm dạ dày, ruột,
tiêu chảy, mụn loét ở ruột già, viêm phổi, viêm gan, viêm màng não. Các đàn lợn bị
nhiễm bệnh không những gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn
tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người [53, 62].
1.1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh phó thương hàn lợn gây ra chủ yếu do 2 loài vi khuẩn là S. choleraesuis
chủng Kunzendorf gây thể cấp tính, S. typhisuis chủng Voldagsen gây thể mãn tính.

Ngoài ra có các chủng khác như S. enteritidis, S. typhimurium, S. dublin.
Vi khuẩn có thể tồn tại nhiều ngày, hàng tuần, thậm chí cả năm trong những
điều kiện thích hợp, nhưng dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ cao và các loại hoá chất sát trùng
như Glutaraldehyde, Benzalkonium chloride, Formaldehyde. Ở lợn bệnh, vi khuẩn có ở
trong máu, phủ tạng, các chất tiết (nhiều nhất ở trong phân); ở lợn nái có nhiều trong
dịch tiết đường sinh dục, thai bị sẩy. Những lợn khoẻ mang trùng có ý nghĩa rất quan
trọng đối với lưu hành dịch bệnh và nguy cơ đối với sức khoẻ cộng đồng. Một vài yếu
tố như: cai sữa, vận chuyển, thay đổi thời tiết đột ngột làm giảm sức đề kháng của heo,
có thể là những nguyên nhân làm dịch bệnh bộc phát.
1.1.1.2. Triệu chứng – Bệnh tích
Thời kỳ nung bệnh từ 3 - 6 ngày có khi kéo dài đến 1 tuần lễ hay 1 tháng tùy
thuộc số lượng vi khuẩn xâm nhập, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể
con vật.
5


Thể cấp tính: con vật sốt cao 41,50C - 420C, kém ăn hoặc không ăn, không
bú. Con vật táo bón, phân có màu đen có màng giả, bí đại tiện, nôn mửa, tiêu chảy,
phân thối có màu vàng, da tụ máu thành từng nốt, đỏ ửng rồi chuyển thành màu tím
xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi, ngực. Bệnh thường kéo dài 2 - 4 ngày, con vật gầy
còm, còi cọc, tiêu chảy nhiều rồi chết. Tỷ lệ chết có thể từ 25 - 95%, có khi bệnh
chuyển sang thể mãn tính.
Một số bệnh tích có thể thấy như: lá lách sưng to do dai như cao su, màu xanh
thẫm; hạch lâm ba sưng, mềm, đỏ; thận có những nốt hoại tử ở vỏ thận; gan tụ máu,
có nốt hoại tử; niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, có điểm xuất huyết, có khi có vết
loét nhỏ như hạt đậu, hoại tử ở dạ dày (trên đỉnh các nếp nhăn), ở ruột non và từng
đoạn dài biến thành khối vàng bột như cám; phổi tụ máu và có các ổ viêm.
Thể mãn tính: bệnh phát ra lúc đầu không rõ triệu chứng. Con vật sốt nhẹ,
gầy yếu dần, ăn uống giảm sút, chậm lớn, da xanh, trên da có những mảng đỏ hoặc
xám tím bầm. Con vật tiêu chảy, phân lỏng, có màu vàng rất thối. Bệnh tiến triển

trong vài tuần. Tỉ lệ chết từ 25 - 75%. Một số có thể khỏi bệnh nhưng tiêu hoá thức
ăn kém, chậm lớn.
Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột. Thành ruột dày và có nhiều chỗ bị hoại tử,
có bã đậu (casein hoá), xuất huyết, vết loét liền nhau thành mảng, hạch ruột xuất
huyết, có khi có mủ, gan, lách sưng, mềm, có những đốm hoại tử, xoang bụng tích
nước viêm.

Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già
lợn mắc bệnh
6


1.1.1.3. Chẩn đoán
Chẩn đoán lâm sàng
Ở thể cấp tính: lợn sốt cao, chết nhanh, viêm cata dạ dày, ruột, lách sưng to,
đàn hồi, dai như cao su, có màu xanh sẫm, gan sưng, có ổ hoại tử, xuất huyết ở thận,
tương mạc.
Ở thể mãn tính: lợn bị tiêu chảy dai dẳng, gầy còm, suy nhược, chết do kiệt
sức, viêm ruột, gan, phổi.
Chẩn đoán phân biệt
Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng
dấu…vv. Để xác định chắc chăn nguyên nhân bệnh cần thiết phải lấy mẫu để làm
các xét nghiệm tại phòng thí nghiệm.
1.1.1.4. Phòng và trị bệnh
Phòng bệnh
Mua lợn từ nơi không có dịch, cách ly theo dõi ít nhất 10 ngày trước khi nhập
đàn.
Khi có lợn bệnh phải cách ly ngay để theo dõi và điều trị, kịp thời báo cho
chung quanh biết để cùng nhau phòng chống dịch.
Không bán chạy lợn bệnh, không mổ thịt ở ao, hồ, sông; phân và nước rửa phủ

tạng phải chôn. Tiêu độc chuồng trại và dụng cụ chăn nuôi.
Dùng vắcxin phó thương hàn keo phèn tiêm liều 2ml/con, miễn dịch 6 tháng, 4
tháng tiêm lại. Kháng huyết thanh điều chế từ ngựa, tiêm liều 30, 40ml/con.
Điều trị
Chưa có biện pháp đìều trị có hiệu quả cao. Chỉ nên điều trị những trường hợp
nhẹ, tiến triển chậm.
Chloramphenicol 10%, chlotetrasone, oxycaf, biocortyl O.P.C, T.P.C, tylo
P.C, tylo D.C.... liều: 1 – 1,5ml/10 kg thể trọng (20 mg/ kg); gentamycine: 250 mg,
2 lần/ngày; các loại sulfamid: sulfadiazin, sulmet, sulfaprim, septotryl 24% dùng 1
ml/5, 10 kg thể trọng.

7


1.1.2. Bệnh phù đầu (Edema Disease) [68]
Bệnh phù đầu ở lợn được Shanks mô tả lần đầu tiên vào năm 1938 và đặc
biệt phổ biến ở Châu Âu vào sau Thế chiến thứ II. Tại Việt Nam, bệnh phù đầu và
tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi; từ rất sớm các
tác giả Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã nghiên cứu về bệnh này; bệnh xảy ra ở tất cả
ba miền Nam, Trung và Bắc [5]. Tại miền Nam, bệnh xảy ra ở các tình đồng bằng
sông Cửu Long [4], các tỉnh phía Bắc [1, 3, 6] và các tỉnh miền Trung [6] với tỷ lệ
nhiễm dao động 15,72 – 58,78% . Bệnh thường xảy ra đột ngột ở lợn con cai sữa
với các dấu hiệu điển hình của bệnh sưng mí mắt, mặt phù thũng, đi lảo đảo.
1.1.2.1. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh phù đầu lợn do vi khuẩn E. coli mang kháng nguyên bám dính F18ab
và sản xuất độc tố shiga biến thể 2e (Stx2e) gây ra cho lợn con trước và sau cai sữa.
Các chủng vi khuẩn E. coli này có đặc điểm gây dung huyết khi cấy trên thạch máu.
Vi khuẩn E. coli dung huyết gây bệnh phù đầu thường xuyên có mặt trong đường
ruột lợn với số lượng rất ít. Khi xuất hiện các yếu tố bất lợi làm giảm sức đề kháng
cơ thể lợn như cai sữa, thay đổi thời tiết hoặc thức ăn, quần thể E. coli gây bệnh sẽ

phát triển nhanh, lây lan gây thành dịch.
Nguyễn Viết Không và cộng sự khi nghiên cứu về kháng thể kháng E. coli
phù đầu ở lợn chăn nuôi công nghiệp cho thấy chỉ có 6,25% lợn con theo mẹ có
kháng thể này [2]. Gần đây, khi phân tích kháng nguyên bám dính F4 và F18 trên
184 chủng E. coli phân lập từ lợn con bị phù đầu ở các tỉnh Nam Trung bộ và Tây
Nguyên. Võ Thành Thìn và cộng sự tìm thấy 27/184 chủng mang kháng nguyên
bám dính F18ab [9]. Cù Hữu Phú và cộng sự đã chọn một số chủng E. coli phân lập
từ lợn bị bệnh phù đầu tại Hà Tây và Bình Định để sản xuất vắcxin dưới dạng chết
có bổ trợ keo phèn để phòng bệnh phù đầu [6]. Gần đây, bộ môn Vi Trùng Phân
viện Thú y miền Trung cũng đã nghiên cứu chế tạo vắcxin phòng bệnh phù đầu
dưới dạng bacterin có bổ trợ keo phèn.
1.1.2.2. Triệu chứng – Bệnh tích
Thường xảy ra một cách đột ngột với các triệu chứng ban đầu là bỏ ăn và rất
8


khát nước, sau đó xuất hiện các triệu chứng thần kinh như run rẩy, nằm đạp chân
kiểu bơi chèo hoặc chạy quanh, liệt hoặc nằm úp trên 4 chân. Đa số lợn con sẽ chết
trong vòng 24 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng thần kinh. Kiểm tra kỹ, thấy
phù ở mí mắt, xung huyết kết mạc mắt, phù đầu.
Ngoài ra còn thấy khó thở, táo bón hoặc tiêu chảy trước khi xuất hiện triệu
chứng thần kinh. Đa số không thấy thân nhiệt tăng cao.
1.1.2.3. Chẩn đoán
Chẩn đoán dễ dàng trên cơ sở dựa vào các đặc điểm là chỉ xảy ra sau khi cai
sữa 1 – 2 tuần với các triệu chứng thần kinh, phù nề ở niêm mạc mặt và dạ dày.
1.1.2.4. Phòng và trị bệnh
Phòng bệnh
- Chuồng trại khô ráo, thoáng mát, định kỳ sát trùng tẩy uế chuồng trại.
- Khi cai sữa nên giữ heo con ở lại chuồng và chuyển heo mẹ sang chuồng
khác. Trong những ngày đầu cai sữa không cho ăn quá nhiều, giảm chất bột, đạm và

tăng chất xơ trong khẩu phần.
- Tiêm vaccin E. coli phòng bệnh, tiêm bắp hoặc dưới da, liều 2ml/con.
Điều trị
- Khi độc tố của E. coli đã nhiễm vào máu và heo đã sưng phù đầu thì việc
điều trị sẽ không hiệu quả.
- Thường điều trị dự phòng bằng cánh sử dụng 1 trong các loại kháng sinh sau:
Sodibio, Mycofloxacine 10%, Bio và B12, Clamoxyl L.A, Multibio : 1ml/10kg thể
trọng, tiêm bắp 1lần/ngày liên tục trong 3 - 5 ngày.
1.2. VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN TỪ
VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC
1.2.1. Vắcxin thú y
Việc phát triển vắcxin thú y có nhiều mục đích như ngăn ngừa và kiểm soát
bệnh truyền nhiễm trên động vật, bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi, giảm giá
thành thức ăn cho vật nuôi [48, 61]. Mặt khác, khi tiêm phòng vắcxin cho vật nuôi
cũng ngăn chặn được khả năng lây lan bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người.
Ngoài ra các chương trình tiêm chủng vắcxin đại trà cho vật nuôi, sẽ làm giảm đáng
kể sử dụng thuốc thú y, dẫn đến hạn chế tác dụng phụ của thuốc thú y đối với môi
9


trường cũng như hạn chế được sự tồn đọng thuốc thú y trong động vật nuôi [60].
Tóm lại, các loại vắcxin sử dụng trong thú y, ngoài việc cải thiện sức khỏe cho động
vật nuôi còn có tác dụng nâng cao sức khỏe cộng đồng.
Mặc dù các loại vắcxin dùng trong thú y chỉ chiếm khoảng 23% trên tổng số
các loại sinh phẩm bảo vệ động vật nuôi trên thị trường toàn cầu, nhưng những
nghiên cứu về các loại vắcxin ngày một tăng do việc áp dụng những tiến bộ khoa
học để nghiên cứu và phát triển vắcxin, do số lượng rất lớn các loại vi khuẩn kháng
lại kháng sinh, và do sự xuất hiện các loại dịch bệnh mới. Các loại vắcxin thú y
ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng
đồng, bởi vì việc sử dụng vắcxin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh

và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng
trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người. Điều này sẽ thúc đẩy làm
tăng các hoạt động của cơ quan soạn thảo luật nhằm bảo vệ quyền lợi của người tiêu
dùng thực phẩm tại thị trường lớn như Mỹ và liên minh Châu Âu [55].
Các loại vắcxin thú y được cấp phép sử dụng bao gồm các loại vắcxin chết
và vắcxin sống nhược độc. Mặc dù các loại vắcxin này đã và đang được sử dụng
rộng rãi và góp phần đáng kể bảo vệ sức khỏe cho vật nuôi cũng như cộng đồng trên
toàn cầu, nhưng vẫn còn một số hạn chế nhất định. Các loại vắcxin truyền thống
thường giá thành sản xuất cao, đòi hỏi phải có chất bổ trợ và phải tiêm chủng nhiều
lần mới tạo được miễn dịch tốt, hơn nữa các loại vắcxin này có thể ảnh hưởng đến
việc tạo kháng thể trên gia súc mẹ dẫn tới khả năng bảo hộ thấp hoặc không có khả
năng bảo hộ đối với gia súc non [19, 48]. Các loại vắcxin độc tố có thể tạo miễn
dịch dịch thể tốt, tuy nhiên không có tác dụng hoặc tác dụng ít trong việc tạo miễn
dịch trung gian tế bào. Các loại vắcxin chết toàn khuẩn thường chứa cơ chất kháng
nguyên và không kháng nguyên, các đáp ứng miễn dịch chống lại cơ chất không
kháng nguyên hoàn toàn trái ngược với sự ngăn chặn nhiễm trùng và có thể làm ảnh
hưởng hoặc làm giảm đáp ứng miễn dịch đối với cơ chất kháng nguyên. Chúng có
thể tạo ra phản ứng phụ có hại do các cơ chất ngoài mong muốn như các loại nội
độc tố [62]. Các loại vắcxin sống nhược độc có khả năng tạo ra hai loại miễn dịch,
10


miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào. Những năm gần đây có rất nhiều
nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắcxin sống nhược
độc. Tuy nhiên các loại vắcxin sống nhược độc chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh
nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắcxin nhược độc quay trở lại độc lực cao
là rất lớn [57]. Để khắc phục những nhược điểm của các loại vắcxin trên, vắcxin thế
hệ mới ra đời dựa trên kỹ thuật gen, một trong số đó là vắcxin tái tổ hợp. Có nhiều
đối tượng vi sinh vật có thể sử dụng làm chủng vi khuẩn biến nạp trong vắcxin tái tổ
hợp như vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Lao, E. coli,... hoặc một số loại virus như

virus đậu, virus adeno,...
Ưu thế của vắcxin tái tổ hợp sử dụng vi khuẩn Salmonella là dễ dàng thao
tác, dễ sử dụng, dễ nhân lên và dễ phân phối kháng nguyên cho cơ thể. Việc nuôi
cấy chủng vi khuẩn tái tổ hợp không phức tạp do đó đảm bảo việc tiếp giống, nhân
giống và sản xuất vắcxin để ứng dụng. Salmonella hiện đang được sử dụng làm
chủng vi khuẩn biến nạp mang các loại gen kháng nguyên của virus cúm, HBV,
virus sốt xuất huyết, vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn tả, liên cầu khuẩn, ký
sinh trùng sốt rét,...
1.2.2. Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc
Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc đầu tiên được sử dụng làm
vắcxin phòng các bệnh do vi khuẩn Salmonella gây trên người và động vật. Hiện
nay, việc sử dụng các chủng Salmonella nhược độc mang một số gen đột biến
làm chủng vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng
nguyên ngoại lai để tạo thành các chủng sản xuất vắcxin phòng nhiều bệnh đang
là hướng nghiên cứu thu hút nhiều sự tham gia của các nhà khoa học [23, 37].
Những vắcxin tái tổ hợp này tạo miễn dịch do các kháng nguyên ngoại lai đồng
thời tạo miễn dịch do các kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella. Các chủng
vắcxin Salmonella đã được loại bỏ gen asd nhưng mang plasmid asd+ tái tổ hợp
đã chủng hóa các gen kháng nguyên ngoại lai nên mang trên mình đồng thời hai
hoại kháng nguyên đó là kháng nguyên của Salmonella và kháng nguyên ngoại
lai [28].
11


Gần đây, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các chủng vắcxin Salmonella
nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các
kháng nguyên ngoại lai phòng các bệnh do Salmonella cũng như các bệnh do các
kháng nguyên ngoại lai gây ra cho người và động vật. Bucley và cộng sự sử dụng
chủng Salmonella typhimurium DeltaaroA nhược độc làm tế bào chủ mang plasmid
tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của Campylobacter làm vắcxin phòng

bệnh do Campylobacter jejuni gây ra trên gia cầm [13]. Zekarias và cộng sự đã
dùng chủng Salmonella typhimurium nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang
plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen Alpha tốc xin của Clostridium perfingens làm
vắcxin phòng bệnh viêm ruột hoại tử trên gà. Gà tiêm vắcxin được bảo hộ tốt khi
công cường độc với chủng Clostridium perfringens cường độc [63]. Tương tự, Xin
và cộng sự cũng sử dụng Salmonella typhimurium làm vi khuẩn biến nạp mang
plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen của kháng nguyên protein bề mặt A của
Streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi, viêm màng não trên người; khi thử
nghiệm trên chuột, vắcxin có tác dụng tạo miễn dịch tốt [67]. Branger và cộng sự
khi nghiên cứu vắcxin tái tổ hợp phòng bệnh do Yersinia gây ra trên người, chủng
vi khuẩn vắcxin nhược độc Salmonella typhimurium được sử dụng làm tế bào chủ
mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các gen kháng nguyên Lcrv và Lcrv196 [16].
Zhao và cộng sự khi nghiên cứu thử nghiệm vắcxin phòng bệnh sảy thai truyền
nhiễm, các tác giả này đã dòng hóa các gen kháng nguyên protein L7/L12 của vi
khuẩn Brucella trên plasmid plasmid và biến nạp vào chủng vắcxin nhược độc
Salmonella typhirmurium; vắcxin có hiệu lực cao khi thử nghiệm trên chuột [65].
Các chủng vắcxin Salmonella nhược độc không những là tế bào chủ mang các
plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên vi khuẩn mà còn là vật mang cho
các plasmid tái tổ hợp dòng hóa các kháng nguyên vi rút và ký sinh trùng. Benitez
và cộng sự đã sử dụng chủng vắcxin Salmonella typhimurium nhược độc SL3261
làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của
Cryptosporidium parvum [11]. Ning và cộng sự nghiên cứu vắcxin tái tổ hợp phòng
bệnh đốm trắng trên tôm trong đó kháng nguyên protein vỏ V28 được dòng hóa trên
12


plasmid pcADN3,1-VP28 và biến nạp vào chủng Salmonella nhược độc SV4089;
vắcxin có tác dụng bảo hộ cao trên tôm [44].
Plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai đã được chứng minh là ổn định trong tế
bào chủ trong điều kiện invitro. Garmory và cộng sự khi nghiên cứu về các chủng

vắcxin Salmonella typhimurium mang plasmid tái tổ hợp đã được dòng hóa kháng
nguyên F1 của vi khuẩn Yersinia pestis, đã kiểm tra sự ổn định của plasmid tái tổ
hợp bằng phương pháp cấy truyền [29]. Các tác giả này nhận thấy sau khi cấy
truyền 60 lần plasmid tái tổ hợp vẩn ổn định trong tế bào chủ. Zekarias và cộng sự
sau khi cấy truyền 50 lần thì plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên độc tố Alpha
toxin (PLcC) trong chủng vắcxin Salmonella typhimurium vẫn ổn định [63]. Tương
tự hai nghiên cứu trên, Branger và cộng sự đã chứng minh được sự ổn định của
plasmid tái tổ hợp trong tế bào chủ sau 70 lần cấy truyền [16].
1.2.3. Vắcxin phòng bệnh phó thương hàn và phù đầu ở lợn
Hiện nay, tại Việt nam có hai loại vắcxin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó
là vắcxin chết và vắcxin nhược độc. Vắcxin Phó thương hàn chết được sản xuất
dưới dạng nước có bổ sung các chất bổ trợ làm tăng cường và kéo dài khả năng
miễn dịch. Vắcxin nhược độc được sản xuất dạng đông khô kết hợp với Pasteurella
Mutocida nhược độc phòng 2 bệnh Phó thương hàn và Tụ huyết trùng lợn. Ưu điểm
của vắcxin kép nhược độc dạng đông khô là an toàn, hiệu lực cao, giá thành hạ.
Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E. coli gây ra, hiện nay có một số cơ sở sản
xuất vắcxin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin. Đến nay, vẫn chưa có vắcxin tái
tổ hợp phòng hai bệnh trên, để phòng hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắcxin
khác nhau, gây stress lớn cho lợn ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lơn.
Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của khoa học để nghiên cứu chế tạo
vắcxin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, an toàn, giá thành hạ với một lần tiêm có
phòng được nhiều bệnh là việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do
bệnh gây ra.
1.3. VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S. choleraesuis)
13