NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và HOẠT TÍNH SINH học một số LOÀI ARDISIA THUỘC họ MYRSINACEAE ở VIỆT NAM TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

TRỊNH ANH VIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI ARDISIA THUỘC HỌ MYRSINACEAE
Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62.44.01.17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội-2017


Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:

1. GS. TS Phạm Quốc Long
2. TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Phản biện 1:
Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2017.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, đa dạng về địa hình, thổ
nhưỡng và đặc trưng khí hậu khác nhau giữa các vùng miền. Đây là điều
kiện thuận lợi để các loài sinh vật phát triển đa dạng về số lượng các loài,
phong phú về chủng loại, trong đó có nhiều loài thực vật được sử dụng làm
thuốc trong dân gian.
Họ Đơn nem (Myrsinaceae) là một họ thực vật khá lớn, bao gồm 50 chi
và khoảng 1400 loài, được phân bố rộng rãi trên thế giới, nhất là ở các
nước có khí hậu ôn đới và nhiệt đới. Trong đó, chi Cơm nguội (Ardisia) có
khoảng 400 - 500 loài. Kết quả nghiên cứu tài liệu cho thấy các loài Ardisia
có nhiều hoạt tính sinh học rất đáng quý, như: hoạt tính kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng virut, hoạt tính chống oxi hóa, chống lao, antileishmania,
chống đái tháo đường, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, chống loãng
xương và đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt. Các
hợp chất đã được phân lập từ một số loài Ardisia có cấu trúc phong phú,
bao gồm các tritecpen saponin, benzoquinon, flavonoid, alkylphenolic, các
dẫn xuất của bergenin, các dẫn xuất của resorcinol…, trong đó có nhiều

chất có cấu trúc mới.
Ở Việt Nam, họ Đơn nem có khoảng 140 loài và được phân thành 6 chi
(gồm có: Ardisia, Embelia, Maesa, Aegyceras, Rapanea và Myrsine) phân
bố rộng ở Việt Nam, nhất là ở các vùng đồng bằng trung du. Chi Ardisia có
khoảng 101 loài, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học các loài thực vật này còn hạn chế ở Việt Nam, chúng chỉ mới được sử
dụng trong phạm vi dân gian để chữa bệnh. Các loài trong chi Ardisia
thường có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu thũng và được sử dụng để
chữa các bệnh viêm khớp, đòn ngã tổn thương, sưng đau hầu họng, trị tiêu
chảy, lậu, sốt rét, viêm ruột, mụn nhọt ghẻ lở và trị các bệnh về gan. Vì


2
vậy, với mong muốn tìm kiếm các hoạt chất ứng dụng trong Y-Dược từ
nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã chọn các loài thuộc chi Cơm nguội
(Ardisia), họ Đơn nem (Myrsinaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài
Ardisia thuộc họ Myrsinaceae ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Phân lập các hợp chất sạch từ một số loài Ardisia ở Việt Nam.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
- Thăm dò hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus và hoạt tính gây
độc tế bào của một số hợp chất phân lập được.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và gây độc tế bào
của các cặn chiết metanol tổng của 09 loài Ardisia thu hái ở Việt Nam.
- Nghiên cứu phân lập các hợp chất sạch từ 4 loài Ardisia là A. balansana,
A. splendens, A. insularis và A. incarnata.
- Nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập
được bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.

- Nghiên cứu thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng vi rút và hoạt
tính gây độc tế bào của một số hợp chất sạch phân lập được.
4. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 155 trang đánh máy với 54 bảng, 48 hình. Phân bố cụ thể
như sau: Mở đầu 02 trang, tổng quan 37 trang, đối tượng và phương pháp
nghiên cứu 08 trang, thực nghiệm 20 trang, kết quả và thảo luận 68 trang,
kết luận và kiến nghị 03 trang, danh mục các công trình đã công bố 02
trang, tài liệu tham khảo 15 trang.


3
NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN
Chƣơng 1 . TỔNG QUAN
Bao gồm ba phần: phần 1 là tổng quan về đặc điểm hình thái và phân
loại họ Đơn nem (Myrsinaceae) và chi Cơm nguội (Ardisia) cùng các thông
tin về các loài Ardisia được sử dụng làm thuốc trong dân gian ở Việt Nam;
phần 2 là tổng quan về tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học của chi Ardisia trên thế giới; phần 3 là tổng quan về tình hình
nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Ardisia ở Việt
Nam.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là 9 loài Ardisia, bao gồm: A.
incarnata, A. insularis, A. pseudocrispa, A. splendens, A. stangii, A.
balansana, A. caudata, A. maculosa và A. primulaefolia, trong đó có 04
loài được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học là A.
balansana, A. splendens, A. insularis, A. incarnata.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu
Các mẫu thực vật sau khi thu hái được rửa sạch, thái nhỏ, phơi trong

bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 50-60oC và nghiền thành bột. Bột được chiết
kết hợp siêu âm và gia nhiệt trong dung môi metanol ở 50oC (3 lần × 2 giờ
mỗi lần). Dịch chiết metanol sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất
giảm thu được cao chiết metanol. Cao metanol được bổ sung thêm nước và
chiết phân bố lại lần lượt với các dung môi n-hexan, cloroform, etyl axetat
và n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết
tương ứng.
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây
Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây được thực hiện


4
bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc
ký cột (CC) với pha tĩnh là silica gel pha thường và silica gel pha đảo YMC
RP 18, sắc ký rây phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc
ký trên cột diaion.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại đồng thời kết hợp phân tích, tra
cứu tài liệu tham khảo để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân
lập được. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm: Điểm nóng chảy
(Mp); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1HNMR, 13C-NMR và DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY.
2.2.4. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.4.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định: vi khuẩn Gram (+) B. subtillis, S.
aureus; vi khuẩn Gram (-) E. coli, P. aeruginosa; nấm men S. cerevisiae,
C. albicans và nấm mốc Asp. niger, F. oxysporum. Các chứng dương tính
là: ampicilin cho vi khuẩn Gram (+), tetracylin cho vi khuẩn Gram (-),
nystatin cho nấm sợi và nấm men.
2.2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi rút
Hoạt tính kháng virut được đánh giá theo phương pháp SRB trong đó có

đánh giá hiệu quả gây bệnh tế bào (CPE). Ribavirin được sử dụng làm
chứng dương, DMSO được sử dụng làm chứng âm.
2.2.4.3. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro
Hoạt tính gây độc tế bào được thử tại Phòng Sinh học thực nghiệm,
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Viện Công nghệ sinh học-Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phép thử này được thực hiện
theo phương pháp của Monks và Skehan. Các dòng tế bào ung thư thử
nghiệm: KB; LU-1; MCF7; HepG2; LNCaP; A-549, HT-29 và OVCAR


5
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM
3.1. Sàng lọc các đối tƣợng nghiên cứu theo định hƣớng hoạt tính
kháng nấm, kháng khuẩn và gây độc tế bào
3.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất sạch
3.2.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất sạch từ rễ cây A. balansana
3.2.1.1. Xử lý mẫu từ rễ cây A. balansana
Từ các cao chiết cloroform (AB/B, 50 g), etyl axetat (AB/C, 30 g), và
phần cặn nước (AB/F, 8 g) của rễ cây cơm nguội balansa (A. balansana),
06 hợp chất sạch đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học.
3.1.2.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ
rễ cây A. balansana
3.2.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất sạch từ lá cây A. splendens
3.2.2.1. Xử lý mẫu lá cây A. splendens
Từ các cao chiết n-hexan (AS1; 50 g), etyl axetat (AS2; 80 g) và cặn
nước (AS3; 70 g) của loài cơm nguội rạng (A. splendens), chúng tôi đã
phân lập và xác định được cấu trúc của 12 hợp chất, trong đó một hợp
chất có cấu trúc mới.
3.2.2.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ
lá cây A. splendens

3.2.3. Chiết tách, phân lập các hợp chất sạch từ lá cây A. insularis
3.2.3.1. Xử lý mẫu lá cây A. insularis
Từ các cao chiết n-hexan (AI1; 40 g), etyl axetat (AI2; 45 g) và cặn
nước (AI3; 65 g) tương ứng, chúng tôi đã phân lập và xác định được cấu
trúc của 14 hợp chất, trong đó một hợp chất có cấu trúc mới.
3.2.3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ
lá cây A. insularis
3.2.4. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ lá cây A. incarnata
3.2.4.1. Xử lý mẫu lá cây A. incarnata


6
Từ các cao chiết n-hexan (AInc1; 55g), etyl axetat (AInc2; 86g) và cặn
nước (AInc3; 72g), chúng tôi đã phân lập và xác định được cấu trúc của 8
hợp chất.
3.2.4.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ lá cây
A. incarnata
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính các cao chiết metanol tổng
4.1.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn
Bảng 4.1. Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của các cao chiết metanol
tổng
STT

Tên mẫu
thử

1
2
3

4
5
6
7
8
9

AC
AInc
AI
AM
APr
APs
AS
ASt
AB

VK Gram (-)
E. c
P. e
200
200
200
200
200
200

Giá trị MIC (µg/ml)
VK Gram (+)
Nấm mốc

B. s
S. a
A. n
F. o
200
200
200
200
200
200
200
200
200

Nấm men
C. a
S.s
200
200
200
200
-

Ghi chú các ký hiệu viết tắt trong bảng: E. c: E. Coli; P. e: P. Earuginosa; B.s:
B.subtilis, S. a: S.aureus; A. n: A.niger; F. o:F.oxysporum; C. a: C.albicans; S. s: S.
serevisiae.

Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy: Một số loài cơm nguội thể hiện khả năng
kháng lại một số chủng vi khuẩn và chủng nấm thử nghiệm với các giá trị
MIC là 200 µg/ml, đó là các loài: A. incarnata, A. insularis, A.

pseudocrispa, A. splendens, A. stangii và A. balansana.
4.1.2. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của các cao metanol tổng
Bảng 4.2. Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của các cao chiết metanol
tổng
STT

Tên
mẫu
thử

KB

LU-1

Giá trị IC50 (µg/ml)
HepG2
LNCaP

MCF7


7
2
3
4
5
6
7
8
9

10

AC
AInc
AI
AM
APr
APs
AS
ASt
AB

>100
6,09
41,55
>100
> 100
99,85
55,52
57,18
53,67

>100
8,46
45,31
>100
> 100
> 100
56,51
44,77

54,11

>100
5,26
45,62
>100
93,79
> 100
50,62
50,41
47,68

>100
5,59
56,13
>100
>100
> 100
59,20
59,51
67,09

>100
12,63
61,13
>100
89,05
> 100
52,99
55,84

74,27

Từ các kết quả Bảng 4.2, có thể thấy rằng: cao chiết metanol của loài
cơm nguội thắm (Ardisia incarnata) thể hiện hoạt tính tốt nhất đối với cả 5
dòng tế bào ung thư thử nghiệm, các giá trị IC50 nằm trong khoảng 5,26 –
12,63 µg/ml. Cao chiết metanol của các loài A. insularis, A. splendens, A.
balansana và A. stangii thể hiện hoạt tính trung bình đối với 5 dòng tế bào.
Cao chiết metanol của các loài còn lại không thể hiện có hoạt tính.
4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất đƣợc phân lập
4.2.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ rễ cây cơm
nguội balansa (A. balansana)
Từ rễ cây A. balansana, 6 hợp chất bao gồm: angelicoidenol (AB-1), axit
gallic (AB-2), metyl gallate (AB-3), quercetin (AB-4), myricitrin (AB-5) và
rutin (AB-6) đã được phân lập và xác định cấu trúc. Trong đó, hợp chất
AB-1 và AB-3 lần đầu tiên được phân lập từ chi Ardisia.
4.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ lá cây
cơm nguội rạng (A. splendens)
Từ lá cây cơm nguội rạng (Ardisia splendens), 12 hợp chất bao gồm một
chất mới là myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-1) và 11 hợp
chất đã biết khác là myricitrin (AS-2), desmanthin-1 (AS-3), myricetin 3O-(3"-O-galloyl)α-L-rhamnopyranoside

(AS-4),

quercetin

3,-O-α-L-

rhamnopyranoside (AS-5), quercetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS6), catechin (AS-7), benzyl O-β-D-glucopyranoside (AS-8), 2-phenylethyl
O-β-D-glucopyranoside (AS-9), 3S, 5R, 6R, 9S-tetrahydroxymegastigman-

8
7-ene (AS-10), corilagin (AS-11) và (2S)-3-O-(9, 12, 15-octadecatrienoyl)glyceryl-β-D-galactopyranoside (AS-12) đã được phân lập và xác định cấu
trúc. Các hợp chất AS-3, AS-4, AS-5, AS-6, AS-8, AS-9, AS-10, AS-11 và
AS-12 lần đầu tiên được phân lập từ chi Cơm nguội (Ardisia).
Hợp chất mới AS-1 (myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside)
Hợp chất AS-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. Các tín hiệu thu
được trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AS-1 gợi ý đây có thể là một hợp
chất falavonoid.
Cụ thể, phổ 1H-NMR của hợp chất AS-1 cho thấy sự có mặt của các tín
hiệu sau: hai tín hiệu doublet với hằng số tương tác J = 2,5 Hz tại δH 6,39
(1H, d) và 6,64 (1H, d) đặc trưng cho hai proton ghép cặp meta của vòng
A; tín hiệu singlet tại δH 6,95 (2H, s) đặc trưng cho hai proton của vòng B.
Về phía trường cao hơn có sự xuất hiện của hai tín hiệu của hai proton
anomeric tại δH 5,31 (br s) và 5,52 (br s). Điều này gợi ý AS-1 là một
flavonoid glycoside.
Phổ 13C-NMR (Bảng 4.9) chỉ ra sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng
của 27 nguyên tử cacbon, trong đó có 15 cacbon thuộc khung flavonol và
12 cacbon của hai cấu tử đường. Các dữ liệu phổ 1H-NMR và

13

C-NMR

của AS-1 có dạng tương tự của hợp chất quercetin 3,7-di-O-α-Lrhamnopyranoside ngoại trừ sự xuất hiện thêm một nhóm hydroxyl tại vị trí
C-5´. Tiến hành thủy phân hợp chất AS-1 thu được L-rhamnose (được xác
định bởi dẫn xuất trimetylsilyl bằng phương pháp GC-MS). Điều này đã
khẳng định sự có mặt của hai cấu tử đường α-L-rhamnopyranosyl trong cấu
trúc của AS-1. Trên phổ HMBC có sự xuất hiện các tương tác giữa proton
anomeric của cấu tử đường rhamnose thứ nhất H-1" (δH 5,31) với cacbon

C-3 (δC 136,5); giữa proton anomeric của cấu tử đường rhamnose thứ hai
H-1"' (δH 5,52) với cacbon C-7 (δC 163,4), cho thấy hai cấu tử đường này
được gắn lần lượt váo các vị trí C-3 và C-7 của khung flavonol. Các kết


9
quả phổ NMR trên của AS-1 hoàn toàn phù hợp với dữ kiện thu được trên
phổ khối lượng phân giải cao: phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS
của hợp chất AS-1 cho pic ion phân tử tại m/z 609,1455 [M-H]-, tính toán
lý thuyết cho 609,1461 phù hợp với công thức phân tử C27H29O16.

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất AS-1

Hình 4.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất AS-1

Hình 4.12. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất AS-1
Từ các dữ liệu phổ thu được, hợp chất AS-1 được xác định là myricetin
3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside và có cấu trúc hóa học như ở Hình 4.13
dưới đây. Đây là một hợp chất mới.


10
Bảng 4.9: Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất AS-1
C
2
3
4
5
6
7

8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'

Hợp chất AS-1
δC, ppm
δH, ppm (J, Hz)
159,8
136,5
179,6
162.8
99,8
6,39 (d, 2,0)
163,4
95,4
6,64 (d, 2,0)
157,9
107,4
121,6
109,6
6,95 (s)
146,7
138,0
146,7

109,6
6,95 (s)

C
1"
2"
3"
4"
5"
6"
1'"
2'"
3'"
4'"
5'"
6'"

Hợp chất AS-1
δC, ppm δH, ppm (J, Hz)
103,5
5,31 (br s)
71,8
4,22 (m)
72,0
3,79 (dd, 3,2/9,2)
73,3
3,30 (m)
71,6
3,50 (m)
17,6

0,95 (d, 6,0)
99,79
5,52 (br s)
72,0
4,00 (m)
72,0
3,82 (dd, 3,2/9,2)
73,5
3,47 (m)
71,2
3,59 (m)
18,1
1,24 (d, 6,0)

Hình 4.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất AS-1
4.2.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá cây
cơm nguội đảo (A.insularis)
Từ lá cây cơm nguội đảo (Ardisia insularis), 14 hợp chất bao gồm 01
chất mới có khung flavonoid glycoside được đặt tên là ardinsuloside (AI1), 04 dẫn xuất bergenin (bergenin (AI-2), norbergenin (AI-3),
demethoxybergenin (AI-4), 4-O-galloylbergenin (AI-5), 06 hợp chất
flavonoid

(myricitrin

(AI-6),

myricetin

3-O-(3″-O-galloyl)-α-L-

rhamnopyranoside (AI-7), desmanthine-2 (AI-8), quercetin 3-O-α-Lrhamnopyranoside (AI-9), 3-O-galloylepicatechin (AI-10), 3-O-galloyl-3'methoxyepicatechin (AI-11), 02 hợp chất phenolic (axit gallic (AI-12),


11
metyl gallat (AI-13) và 01 dẫn xuất của megastigman lần đầu tiên được
phân lập từ chi Ardisia là (3S, 5R, 6R, 7E, 9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AI-14) đã được phân lập và xác định cấu
trúc.
Hợp chất mới AI-1 (ardinsuloside) :
Hợp chất AI-1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR
của AI-1 cho thấy có sự xuất hiện của các tín hiệu sau: sáu tín hiệu singlet
của 6 nhóm metyl bậc 4 tại δH 0,73, 0,87, 0,88, 0,99, 1,00 và 1,20 cùng với
một tín hiệu broad singlet của một proton olefinic tại δH 5,17 và một tín
hiệu doublet của proton nhóm oximetin tại δH 3,61, gợi ý rằng hợp chất AI1 có cấu trúc kiểu khung tritecpen olean. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR
của AI-1 còn có sự xuất hiện của hai proton anomeric tại δH 4,35 (1H, d, J
= 7,6 Hz) và 4,54 (1H, d, J = 7,6 Hz) chứng tỏ trong cấu trúc của AI-1 có
chứa hai cấu tử đường.
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của AI-1 cho thấy sự xuất hiện của các tín
hiệu của 41 nguyên tử cacbon, bao gồm: 07 cacbon bậc bốn, 14 cacbon
nhóm metin, 14 cacbon nhóm metylen và 6 cacbon nhóm metyl. Các dữ
liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AI-1 tương tự với các số liệu phổ của
hợp chất assamicoside A, tuy nhiên ở hợp chất AI-1 không xuất hiện hai
nhóm hydroxy tại C-16 và C-21 của khung aglycone. Trên phổ HMBC, các
mối tương tác giữa proton H-23 (δH 3,33 và 3,64) với cacbon C-3 (δC 83,5),
C-4 (δC 43,8), C-5 (δC 48,2) và C-24 (δC 13,4); giữa proton H-24 (δH 0,73)
với cacbon C-3 (δC 83,5), C-4 (δC 43,8), C-5 (δC 48,2), và C-23 (δC 65,2)
cho thấy hai nhóm hydroxyl được gắn vào vị trí C-3 và C-23 của khung
aglycon. Cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-3 và của nhóm metyl tại C-4
được xác định là cấu hình β bởi sự xuất hiện trên phổ ROESY các tương
tác giữa các proton H-3 (δH 3,61)/H-23 (δH 3,33 và 3,64)/H-5 (δH 1,22)
cùng với hằng số tương tác lớn JH2a/H3a = 10,4 Hz. Mặt khác, trên phổ

12
HMBC, các tương tác giữa proton H-28 (δH 3,10) với các cacbon C-16 (δC
22,9), C-17 (δC 38,1), C-18 (δC 43,9) và C-22 (δC 32,3) đã khẳng định nhóm
hydroxyl được gắn vào vị trí C-28. Thủy phân hợp chất AI-1 thu được Dglucose và L-arabinose. Hằng số tương tác của các proton anomeric của hai
cấu tử đường là JH-1′/H-2′ =7,6 Hz và JH-1″/H-2″ = 7,6 Hz đã chứng tỏ hai cấu tử
đường này có cấu hình là -D-glucopyranoside và -L-arabinopyranoside.
Ngoài ra, trên phổ HMBC của hợp chất AI-1 còn xuất hiện các tương tác
giữa proton anomeric H-1″ (δH 4,54) của cấu tử đường glucopyranoside với
cacbon C-3′ (δC 84,2) của cấu tử đường arabinopyranoside, tương tác giữa
proton H-3′ (δH 3,64) của cấu tử đường arabinopyranoside với cacbon C-1″
(δC 105,5) của cấu tử đường glucopyranoside chứng tỏ hai cấu tử đường
này được gắn với nhau thông qua liên kết  -D-glucopyranosyl-(13)--Larabinopyranoside. Phần cấu tử đường này lại được gắn vào vị trí C-3 của
khung aglycon thông qua sự xuất hiện của mối tương tác giữa proton H-3
(δH 3,61) và cacbon C-1′ (δC 106,1) của arabinopyranoside, tương tác giữa
proton anomeric H-1′ (δH 4,35) của arabinopyranoside với cacbon C-3 (δC
83,5) của khung aglycon trên phổ HMBC.
Ngoài ra, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất AI-1
cho pic ion giả phân tử tại m/z 787,4394 [M+Cl]– (tính toántheo lý thuyết
cho công thức phân tử C41H68O12Cl, Calcd. 787,4405).

Hình 4.23. Phổ 1H-NMR của hợp chất AI-1


13

Hình 4.24. Phổ 13C-NMR của hợp chất AI-1

Hình 4.30. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất AI-1

Tổng hợp các dữ liệu phổ thu được trên đây, hợp chất AI-1 được xác
định là 3,23,28-trihydroxyolean-12-ene-3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→3)-L-arabinopyranoside. Đây là hợp chất mới và đƣợc chúng tôi đặt tên là
ardinsuloside.
Bảng 4.20. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất AI-1
C
1
2

Hợp chất AS-1
δC, ppm
δH, ppm (J, Hz)
39,6
0,96 (m)/1,62 (m)
26,3
1,73 (m)/1,81 (m)

C
21
22

3

83,5

3.61 (br d, 10,4)

23

4
5

6
7

43,8
48,2
18,9
33,3

1,22 (m)
1,40 (m)/1,50 (m)
1,32 (m)/1,65 (m)

24
25
26
27

8

41,0

-

28

9
10

49,0
37,6

1,64 (m)
-

29
30

Hợp chất AS-1
δC, ppm
δH, ppm (J, Hz)
35,3
1,12 (m)
32,3
1,35 (m)/1,52 (m)
3,33 (d, 10,4)
65,2
3,64 (d, 10,4)
13,4
0,73 (s)
16,6
1,00 (s)
17,4
0,99 (s)
26,6
1,20 (s)
3,10 (d, 11,2)
69,8
3,51 (d, 11,2)
33,8
0,87 (s)

24,0
0,88 (s)


14
11
12
13
14

24,7
123,4
145,7
42,9

1,89 (m)
5,17 (br s)
-

1
2
3
4

106,1
72,1
84,2
69,5

15

26,6

1,32 (m)/1,84 (m)

5

66,9

16
17
18
19
20

22,9
38,1
43,9
47,8
31,8

1,19 (m)
1,97 (m)
1,04 (m)/1,77 (m)
-

1″
2″
3″
4″

5″

105,5
75,3
77,9
71,1
77,6

6″

62,3

4,35 (d, 7,6)
3,68 (dd, 7,6/8,0)
3,64 (m)
4,03 (br s)
3,56 (d, 12,0)
3,86 (d, 12,0)
4,54 (d, 7,6)
3,30 (m)
3,35 (m)
3,30 (m)
3,30 (m)
3,65 (d, 4,8/12,0)
3,83 (d, 12,0)

Hình 4.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất AI-1
4.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây cơm nguội
thắm (Ardisia incarnata)
Từ lá cây cơm nguội thắm (Ardisia incarnata), 8 hợp chất bao gồm

myricitrin (AInc-1), quercitrin (AInc-2), afzeline (AInc-3), 3S, 5R, 6R, 9Stetrahydroxymegastigman-7-ene (AInc-4), (3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AInc-5), (2S)-3-O-(9, 12, 15octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AInc-6), angelicoidenol
(AInc-7) và axit gallic (AInc-8) đã được phân lập và xác định cấu trúc.
Nhận xét chung về kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của 04
loài cơm nguội : Như vậy, kết quả nghiên thành phần hóa học từ 4 loài
cơm nguội là A. balansana, A. splenden, A. insularis và A. incarnata,
chúng tôi đã phân lập và xác định được cấu trúc của 40 hợp chất, trong đó
có 2 hợp chất mới và 12 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Ardisia.
Cấu trúc của 40 hợp chất phân lập được trình bày ở Bảng 4.30 dưới đây.


15
Bảng 4.30: Tổng hợp cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

ST
T

Tên hợp chất

Ký hiệu
chất

1

Myricetin 3,7-di-O-αL-rhamnopyranoside

AS-1
Chất
mới

2

ardinsuloside

AI-1
Chất
mới

3

myricitrin

AB-5
AS-2
AI-6
AInc-1

4

desmanthin-1

AS-3

5

myricetin 3-O-(3"-Ogalloyl)-α-Lrhamnopyranoside

AS-4
AI-7

6

desmathine-2

AI-8

7

quercetin

AB-4

Cấu trúc


16

8

quercetin 3-O-α-Lrhamnopyranoside

AS-5
AI-9
AInc-2

9

quercetin 3,7-di-O-αL-rhamnopyranoside

AS-6

10

rutin

AB-6

11

afzeline

AInc-3

12

catechin

AS-7

13

3-O-galloylepicatechin

AI-10

14

3-O-galloyl-3'methoxyepicatechin

AI-11

15

Axit gallic

16

Metyl gallat

17

bergenin

AB-2
AI-12
AInc-8
AB-3
AI-13
AI-2


17

18

norbergenin

AI-3

19

demethoxybergenin

AI-4

20

4-O-galloylbergenin

AI-5

21

β-1-O-galloyl-3,6-(R)hexahydroxydiphenoyl
-D-glucose

AS-11

22

benzyl O-β-Dglucopyranoside

AS-8

23

2-phenylethyl O-β-Dglucopyranoside

AS-9

24

angelicoidenol

AB-1
AInc-7

25

26

27

3S, 5R, 6R, 9Stetrahydroxymegastig
man-7-ene
(3S, 5R, 6R, 7E, 9S)megastigman-7-ene3,5,6,9-tetrol 3-O-β-Dglucopyranoside
(2S)-3-O-(9,12,15octadecatrienoyl)glyceryl-β-Dgalactopyranoside

AS-10
AInc-4
AI-14
AInc-5

AS-12
AInc-6


18
4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập đƣợc
4.3.1. Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn
Bảng 4.31. Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập

được
S
T
T
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Ký hiệu
chất
AB-4
AB-6
AS-3
AS-11
AI-2
AI-3
AInc-1
AInc-2
AInc-3

VK Gr (-)
E. c
P. e
200

200
200
200
200

Giá trị MIC (µg/ml)
VK Gr (+)
Nấm mốc
B. s
S. a
A. n
F. o
200
200
200
200
-

Nấm men
C. a
S.s
200
200
200
-

Ghi chú các ký hiệu viết tắt trong bảng: E. c: E. Coli; P. e: P. Earuginosa; B.s:
B.subtilis, S. a: S.aureus; A. n: A.niger; F. o: F.oxysporum; C. a: C.albicans; S. s: S.
serevisiae.

Kết quả thu được trong Bảng 4.31 cho thấy: một số hợp chất như AB-6
(rutin), AS-3 (desmanthin-1), AI-3 (norbergenin), AInc-1 (myricitrin),
quercitrin (AInc-2), afzeline (AInc-3) thể hiện có hoạt tính đối với một số
chủng vi sinh vật kiểm nghiệm với các giá trị MIC đều là 200 µg/ml.
4.3.2. Hoạt tính kháng virut Coxsackie A16
Bảng 4.32. Hoạt tính kháng virut của một số hợp chất phân lập được
STT
1
2
3

Ký hiệu chất
AS-2 (AInc-1)
AS-3
AS-11

Tên hợp chất
Myricitrin
Desmanthin-1
Corilagin

IC50 (µM)
40,1
32,2
30,5

Các kết quả thu được trong Bảng 4.32 cho thấy: các hợp chất myricitrin,
desmanthin-1, corilagin đều có hoạt tính ức chế virut CA16 với các giá trị
IC50 tương ứng là 40,1, 32,2 và 30,5 µM.
4.3.3. Hoạt tính gây độc tế bào

Một số hợp chất được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào
A-549, HT-29 và OVCAR, kết quả thu được trong bảng dưới đây.


19
Bảng 4.33. Hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được
Ký hiệu chất
AI-1
AI-2
AI-3
AI-4
AI-5
AI-6
AI-7
AI-8
AI-9
AI-10
AI-11
AI-12
AI-13

A-549
14,6±3,1
94,4±8,2
94,4±7,4
99,3±12,4
65,6±10,4
71,5±5,7
76,2±4,5
53,1±5,6

66,4±8,8
99,2±5,3
43,3±2,6
79,7±6,6
91,5±7,5

(%) Tế bào sống sót
HT-29
OVCAR
21,7±5,3
16,2±2,8
92,7±5,9
97,0±6,7
87,5±6,2
99,9±6,6
97,9±9,9
80,8±5,5
88,9±7,3
76,7±4,5
73,4±5,6
93,6±3,6
86,4±7,2
89,0±2,1
69,3±3,9
59,4±9,7
76,0±5,4
69,7±12,1
98,8±8,9
91,4±6,1
56,2±6,4

48,8±4,6
65,9±7,1
81,8±8,7
83,7±5,8
82,3±4,3

Các kết quả thu được trong Bảng 4.33 cho thấy: hợp chất mới
ardinsuloside (AI-1) thể hiện khả năng ức chế đối với các dòng tế bào A549, HT-29 và OVCAR với tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót tương ứng là:
14,6; 21,7 và 16,2%, các hợp chất còn lại được thử nghiệm không có khả
năng ức chế hoặc ức chế kém trên các tế bào ung thư thử nghiệm. Do đó,
hợp chất AI-1 đã được lựa chọn tiếp tục nghiên cứu để xác định giá trị IC50.
Bảng 3.34 dưới đây đưa ra các giá trị IC50 của hợp chất AI-1 và chất đối
chứng dương mitroxantrone.
Bảng 4.34. Giá trị IC50 của hợp chất mới AI-1 trên các dòng tế bào
A-549, HT-29 và OVCAR.
Ký hiệu chất
AI-1
Mitroxantrone

A-549
8,5± 1,2
7,2±0,5

Giá trị IC50 (μM)
HT-29
16,4± 3,1
3,1±0,3

OVCAR
13,6±3,4

8,4±0,9

Kết quả thu được cho thấy, hợp chất AI-1 có hoạt tính gây độc tế bào
mạnh trên cả ba dòng tế bào thử nghiệm là A-549, HT-29 và OVCAR với
các giá trị IC50 tương ứng lần lượt là 8,5; 16,4; 13,6 μM.
Ngoài ra, chúng tôi cũng đã tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào của


20
một số hợp chất sạch trên các dòng tế bào ung thư như: KB (ung thư biểu
mô), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) và
LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt). Kết quả được đưa ra trong Bảng 4.35 dưới
đây.
Bảng 4.35. Hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được
STT

Ký hiệu chất

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

AB-4

AB-6
AS-3
AS-11
AI-2
AI-3
AInc-1
AInc-2
AInc-3
Elippticine

KB
>100
>100
62,12
57,8
>100
53,37
48,96
>100
>100
1,13

LU-1
>100
>100
76,48
85,97
>100
57,99
52,45

>100
>100
0,96

Giá trị IC50 (µg/ml)
HepG2
LNCaP
>100
>100
>100
>100
67,89
81,57
>100
>100
>100
>100
>100
>100
49,95
48,79
68,92
75,83
>100
>100
0,08
0,97

MCF7
>100

>100
>100
>100
>100
32,09
81,92
>100
>100
1,22

Các kết quả thu được trong Bảng 4.35 cho thấy: hợp chất myricitrin
(AInc-1 hay AS-2) có hoạt tính trung bình đối với các dòng tế bào ung thư
thử nghiệm KB, LU-1, HepG2 và LNCaP. Các hợp chất còn lại không biểu
hiện có hoạt tính hoặc có hoạt tính yếu đối với một số dòng tế bào thử
nghiệm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã thu được các kết quả như sau:
1. Về thành phần hóa học:
Đã phân lập và xác định được cấu trúc của 40 hợp chất từ 04 loài
Ardisia, trong đó có 02 hợp chất có cấu trúc mới, 12 hợp chất lần đầu tiên
được phân lập từ chi Ardisia. Cụ thể như sau:
- Từ lá cây cơm nguội rạng (Ardisia splendens), đã phân lập và xác định cấu
trúc của 12 hợp chất, bao gồm myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside
(AS-1) và 11 hợp chất đã biết khác là myricitrin (AS-2), desmanthin-1 (AS-


21
3), myricetin 3-O-(3"-O-galloyl)α-L-rhamnopyranoside (AS-4), quercetin 3,O-α-L-rhamnopyranoside (AS-5), quercetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside
(AS-6), catechin (AS-7), benzyl O-β-D-glucopyranoside (AS-8), 2phenylethyl

O-β-D-glucopyranoside

(AS-9),

3S,5R,6R,9S-

tetrahydroxymegastigman-7-ene (AS-10), corilagin (AS-11) và (2S)-3-O(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AS-12). Trong đó,
hợp chất AS-1 là hợp chất mới; các hợp chất AS-3, AS-4, AS-5, AS-6, AS-8,
AS-9, AS-10, AS-11 và AS-12 lần đầu tiên được phân lập từ chi Ardisia.
- Từ lá cây cơm nguội đảo (Ardisia insularis), đã phân lập và xác định cấu trúc
của 14 hợp chất, bao gồm: ardinsuloside (AI-1), 04 dẫn xuất bergenin
(bergenin (AI-2), norbergenin (AI-3), demethoxybergenin (AI-4), 4-Ogalloylbergenin (AI-5), 06 hợp chất flavonoid gồm myricitrin (AI-6), myricetin
3-O-(3″-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside

(AI-7),

desmanthine-2

(AI-8),

quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside (AI-9), 3-O-galloylepicatechin (AI-10), 3O-galloyl-3'-methoxyepicatechin (AI-11), 02 hợp chất phenolic là axit gallic
(AI-12), metyl gallat (AI-13) và 01 dẫn xuất của megastigman là (3S, 5R, 6R,
7E, 9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AI-14).
Trong đó, hợp chất AI-1 là hợp chất mới, hợp chất AI-14 lần đầu tiên được
phân lập từ chi Ardisia.
- Từ lá cây cơm nguội thắm (Ardisia incarnata), đã phân lập và xác định
cấu trúc của 8 hợp chất, bao gồm myricitrin (AInc-1), quercitrin (AInc-2),
afzeline (AInc-3), 3S,5R,6R,9S-tetrahydroxymegastigman-7-ene (AInc-4),
(3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside
(AInc-5), (2S)-3-O-(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside

(AInc-6), angelicoidenol (AInc-7) và axit gallic (AInc-8).
- Từ rễ cây cơm nguội balansa (Ardisia balansana), đã phân lập và xác
định cấu trúc của 6 hợp chất, bao gồm: angelicoidenol (AB-1), axit gallic
(AB-2), metyl gallate (AB-3), quercetin (AB-4), myricitrin (AB-5) và rutin


22
(AB-6). Trong đó, hợp chất AB-1 và AB-3 lần đầu tiên được phân lập từ
chi Ardisia.
2. Về hoạt tính sinh học:
* Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn:
Đã khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của một số chất sạch phân
lập được. Kết quả cho thấy, một số hợp chất như AB-6 (rutin), AS-3
(desmanthin-1), AI-3 (norbergenin), AInc-1 (myricitrin), quercitrin (AInc2), afzeline (AInc-3) thể hiện có hoạt tính đối với một số chủng vi sinh vật
kiểm nghiệm với các giá trị MIC đều là 200 µg/ml.
* Hoạt tính gây độc tế bào:
Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của một số chất sạch phân
lập được. Kết quả cho thấy, hợp chất mới ardinsuloside (AI-1) thể hiện khả
năng ức chế đối với các dòng tế bào A-549, HT-29 và OVCAR với các giá
trị IC50 tương ứng là 8,5; 16,4 và 13,6 μM. Hợp chất myricitrin (AInc-1
hay AS-2) có hoạt tính trung bình đối với các dòng tế bào ung thư thử
nghiệm KB, LU-1, HepG2 và LNCaP.
* Hoạt tính kháng virus:
Đã khảo sát hoạt tính kháng virut của một số chất sạch phân lập được.
Kết quả thu được cho thấy, các hợp chất myricitrin (AInc-1), desmanthin-1
(AS-3) và corilagin (AS-11) có hoạt tính kháng virut Coxsackie A16 (một
loại virut gây bệnh chân tay miệng ở trẻ em) với các giá trị IC50 tương ứng
là 40,1; 32,2 và 30,5 µM.
KIẾN NGHỊ
Trong số các chất phân lập được từ các loài Ardisia, có hợp chất

myricitrin có trong cả 4 loài Ardisia đã nghiên cứu (A. splendens, A.
balansana, A. insularis, A. Incarnata). Đây là một hợp chất flavonoid
glycoside, được biết đến có các hoạt tính như kháng virut, kháng viêm,


23
giảm đau, chống oxi hóa ... Đặc biệt, trong khuôn khổ đề tài luận án này,
myricitrin đã được chứng minh có khả năng ức chế virus Coxsackie A16
gây bệnh chân tay miệng ở trẻ em. Do đó, chúng tôi đề xuất cần nghiên cứu
sâu hơn nữa về dược lý của hợp chất myricitrin để ứng dụng trong hóa
dược.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học của 04 loài Ardisia ở
Việt Nam, đó là các loài: cơm nguội thắm (A. incarnata), cơm nguội
balansa (A. balansana), cơm nguội rạng (A. splendens), cơm nguội đảo (A.
insularis).
- Đã phân lập và xác định được cấu trúc của 40 hợp chất, trong đó có 2 hợp
chất mới

là myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-1) và

ardinsuloside (AI-1); 12 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Ardisia
gồm : angelicoidenol (AB-1), metyl gallate (AB-3), desmanthin-1 (AS-3),
myricetin 3-O-(3"-O-galloyl)α-L-rhamnopyranoside (AS-4), quercetin 3,O-α-L-rhamnopyranoside

(AS-5),

quercetin

3,7-di-O-α-L-

rhamnopyranoside (AS-6),benzyl O-β-D-glucopyranoside (AS-8), 2phenylethyl

O-β-D-glucopyranoside

(AS-9),

3S,5R,6R,9S-

tetrahydroxymegastigman-7-ene (AS-10), corilagin (AS-11), (2S)-3-O(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AS-12) và (3S,
5R,

6R,

7E,

9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol

3-O-β-D-

glucopyranoside (AI-14).
- Đã thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut của một số hợp
chất phân lập được. Kết quả cho thấy hợp chất myricitrin (AInc-1),
desmanthin-1 (AS-3) và corilagin (AS-11) có hoạt tính kháng virut
Coxsackie A16 (một loại virut gây bệnh chân tay miệng ở trẻ em) với các
giá trị IC50 tương ứng là 40,1, 32,2 và 30,5 µM