Nghiên cứu thiết kế và cố định ADN đầu dò ứng dụng trong cảm biến ADN định hướng phát hiện vi khuẩn streptococcus suis gây bệnh viêm màng não

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG
TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG
TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO

Chuyên ngành: Công nghệ Nano Sinh học
Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thị Hiên

‘HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN
Luận văn tốt nghiệp này sẽ không bao giờ ra đời nếu thiếu sự tận tình hướng dẫn
của TS. Lê Thị Hiên. Em xin thể hiện lòng biết ơn sâu sắc vì những nhận xét và sửa
chữa quý giá cũng như những lời động viên của cô khi em gặp khó khăn trong từng
bước hoàn thiện luận văn.
Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, các cô khoa Vật lý Kỹ thuật và
Công nghệ Nano, trường Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt là
các thầy cô bộ môn Công nghệ nano sinh học, vì những kiến thực quý báu đã tận tình
truyền dạy cho em góp phần giúp em hoàn thành tốt luận văn này trong suốt hơn một
năm học vừa qua.
Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS.Vũ Thị Huyền và các em sinh
viên học tập, nghiên cứu tại phòng thí nghiệm trọng điểm micro – nano đã giúp đỡ em
trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng em xin được cảm ơn tới gia đình và bạn bè. Những người luôn ở bên
cạnh và ủng hộ em, đã cho em những lời khuyên, động viên tạo mọi điều kiện tốt nhất
để em hoàn thành luận văn. Một lần nữa em xin được chân thành cảm ơn tất cả mọi
người.

Luận văn này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài mã số QGTĐ.13.24 và
đề tài mã số QG.15.28


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của chính tôi – học viên
Nguyễn Thị Thùy Dung, chuyên ngành Công nghệ Nano Sinh học hoàn thành với sự
hướng dẫn của TS. Lê Thị Hiên. Kết quả luận văn là trung thực và không sao chép bất
cứ tài liệu nào. Những nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông
tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí được liệt kê trong danh mục tài liệu tham

khảo của luận văn.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Học viên

Nguyễn Thị Thùy Dung


MỤC LỤC
GIỚI THIỆU .................................................................................................................. 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Cảm biến sinh học và xu thế ............................................................................... 3
1.1.1. Tổng quan cảm biến sinh học ......................................................................... 3
1.1.2. Cảm biến ADN ............................................................................................... 5
1.1.3. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang .............................................. 7
1.1.4. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa .......................................... 9
1.1.5. Cảm biển ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ ................................................... 10
1.1.6. Cảm biến sử dụng một lần ............................................................................ 11
1.2. Các phương pháp cố định đầu dò ADN .......................................................... 13
1.2.1. Phương pháp vật lý ....................................................................................... 14
1.2.2. Phương pháp hóa học ................................................................................... 14
1.2.3. Phương pháp sinh học .................................................................................. 17
1.3.

Giới thiệu vi khuẩn Streptococcus suis ............................................................ 18

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ................................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu ......................................................................................................... 20
2.1.2. Hóa chất và dung dịch .................................................................................. 20
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ..................................................................... 22

2.2. Phương pháp chế tạo ......................................................................................... 23
2.2.1. Phương pháp thiết kế đầu dò ........................................................................ 23
2.2.2. Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR ............................................. 24
2.2.3. Chế tạo thẻ SPA sử dụng một lần ................................................................. 25
2.2.4. Lai ADN với đầu dò trên thẻ SPA ................................................................ 29
2.2.5. Đánh dấu ADN bằng hạt từ-streptavidin ...................................................... 30
2.2.6. Tách ADN từ khuẩn lạc ................................................................................ 30
2.2.7. Phương pháp PCR ........................................................................................ 31
2.3. Phương pháp nghiên cứu mẫu ......................................................................... 33
2.3.1. Điện di ADN ................................................................................................. 33
2.3.2. Khảo sát bằng góc thấm ướt của đế qua các bước biến đổi bề mặt .............. 35
2.3.3. Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier ........................................ 36
2.3.4. Xác định nồng độ ADN bằng quang phổ kế................................................. 36
2.3.5. Phương pháp kính hiện vị quang học ........................................................... 37


CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 38
3.1. Chế tạo thẻ sử dụng một lần ................................................................................ 38
3.1.1. Chế tạo đế thẻ ................................................................................................... 38
3.1.2. Thiết kế ADN đầu dò đặc hiệu cho vi khuẩn S.suis ....................................... 39
3.1.3. Cố định đầu dò SPA lên bề mặt đế thẻ sử dụng một lần ................................. 43
3.1.3.1. Lựa chọn phương pháp cố định đầu dò SPA ............................................. 43
3.1.3.2. Khảo sát thời gian cố định đầu dò SPA ..................................................... 47
3.1.3.3. Khảo sát lượng đầu dò SPA cố định trên đế thẻ........................................ 47
3.2. Khảo sát thẻ SPA với ADN ............................................................................... 49
3.2.1. Lai đầu dò SPA với ADN đích ..................................................................... 50
3.2.2. Lai đầu dò SPA với ADN đối chứng ............................................................ 51
3.3. Đánh dấu ADN bằng hạt từ và đánh giá kết quả bằng cảm biến AMR....... 52
3.3.1. Đánh dấu ADN bằng hạt từ .......................................................................... 52
3.3.2. Đánh giá kết quả đánh dấu ADN bằng hạt từ bằng cảm biến AMR ............ 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 59


DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Từ viết tắt

Viết đầy đủ

ADN

Axit Deoxiribonucleic

APTES

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

bp

base pair

AMR

Từ điện trở dị hướng (Anisotropic magnetoresistance)

EDC

1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

FTIR

Fourier transform infrared spectroscopy
(Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier)

MES

2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PBS

Phosphate buffered saline

PCR

Polymerase chain reaction

PDMS

Poly dimethyl siloxane

SAA

Succinic acid anhydride

S.suis

Streptococcus suis

UVO

Ultraviolet Ozone

16S rARN

Axit Ribonucleic 16S ribosome


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chất nối sử dụng để cố định ADN với đế .............................................. 16
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn ADN ................................................................................. 20
Bảng 2.2. Các hóa chất .................................................................................................. 21
Bảng 2.3. Các dung dịch................................................................................................ 22
Bảng 2.4. Các thiết bị, dụng cụ ..................................................................................... 22
Bảng 2.5. Bảng tổng hợp các đặc tính riêng của 2 cặp mồi .......................................... 25
Bảng 2.6. Tên các mẫu .................................................................................................. 26
Bảng 2.7. Nồng độ ADN toàn phần tách từ khuẩn lạc của S.suis và các liên cầu khuẩn
khác ................................................................................................................................ 31
Bảng 2.8. Thành phần mẫu PCR 1 ................................................................................ 32
Bảng 2.9. Thành phần mẫu PCR 2 ................................................................................ 33
Bảng 2.10. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 1 và PCR 2 .................................................... 33
Bảng 2.11. Thành phần gel acrylamide (đệm TBE) 15% (gel cô và gel tách) .............. 34
Bảng 2.12. Các mẫu phân tích bằng phương pháp FTIR .............................................. 36

Bảng 3.1. Trình tự của ADN đặc trưng cho gen 16S rARN và đầu dò SPA ................ 41
Bảng 3.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR 1 ....................................................................... 42
Bảng 3.3. Cặp mồi cho PCR 2 ....................................................................................... 43
Bảng 3.4. Lượng đầu dò SPA ban đầu, còn lại và đã cố định được theo 2 phương pháp
vật lý và hóa học ............................................................................................................ 44
Bảng 3.5. Bảng so sánh kết quả cố định đầu dò ADN .................................................. 49
Bảng 3.6. Trình tự của đầu dò SPA, ADN đích và ADN đối chứng ............................. 49
Bảng 3.7. Tỉ lệ phản ứng, lượng lai được và hiệu suất lai của ADN đích tương ứng với
các lượng ADN đem lai ................................................................................................. 51


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu tạo cảm biến sinh học ............................................................................... 3
Hình 1.2. Biểu đồ nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới 2018................ 5
Hình 1.3. a. Cấu trúc một đoạn phân tử ADN. b. Liên kết hydro giữa các bazơ của 2
mạch ADN sợi đơn trong một xoắn kép AND. ............................................................... 6
Hình 1.4. Sự bắt cặp của ADN đích và ADN đầu dò trên cảm biến ADN ..................... 6
Hình 1.5. Cấu trúc kẹp tóc (hair pin) ............................................................................... 7
Hình 1.6.a. Cơ chế hoạt động của cảm biến ADN sử dụng cặp đầu dò bắt và đầu dò
phát hiện kết hợp Cy5 với chấm lượng tử để đánh dấu. b. Ảnh chồng huỳnh quang cho
thấy việc ở cùng vị trí của QD và Cy5 ............................................................................ 8
Hình 1.7.a. Cấu trúc cảm biến SPR. b. Đồ thị phụ thuộc cường độ ánh sáng phản xạ
vào góc tới trước và sau khi có phân tử ADN đích lai với đầu dò trên bề mặt cảm biến.
c. ADN đầu dò và ADN đích trên bề mặt cảm biến SPR. ............................................... 9
Hình 1.8 . Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa sử dụng chất chỉ thị oxi
hóa – khử ....................................................................................................................... 10
Hình 1.9. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa sử dụng hạt nano ............. 10
Hình 1.10. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ .................................................. 11
Hình 1.11.a. Máy đo đường huyết On-Call EZ II. b. Cấu trúc que thử. ....................... 12
Hình 1.12. a. Hệ thống sử dụng chip một lần Biacore T200. b. Chip một lần. c. Cấu tạo

bề mặt chip..................................................................................................................... 12
Hình 1.13.a. Phương pháp vật lý. b. Phương pháp hóa học. c. Phương pháp sinh học.13
Hình 1.14.a. Cấu trúc nhóm thiol. b. Cố định ADN có nhóm thiol lên đế vàng. .......... 14
Hình 1.15. Sơ đồ chức năng hóa đế và cố định ADN ................................................... 15
Hình 1.16. Cấu trúc của một số chất nối thường dùng .................................................. 16
Hình 1.17. Cố định đầu dò ADN bằng EDC và NHS ................................................... 17
Hình 1.18.a. Cố định streptavidin lên đế. b. Cố định ADN đầu dò có gắn biotin lên đế
đã phủ streptavidin. ....................................................................................................... 17
Hình 1.19. Sơ đồ cố định ARN có nhóm biotin lên bề mặt đế được chức năng hóa bởi
streptavidin. ................................................................................................................... 18
Hình 1.20. Vi khuẩn liên cầu lợn qua kính hiển vi điện tử ........................................... 18
Hình 2.1. Sơ đồ chế tạo thẻ sử dụng một lần SPA ........................................................ 26
Tên sản phẩm được tạo thành qua mỗi bước được liệt kê trong bảng 3.1. ................... 26
Hình 2.2. Thẻ SPA và diện tích tiến hành cố định đầu dò SPA .................................... 29
Hình 2.3. Mẫu bệnh phẩm được cấy trên môi trường thạch máu .................................. 30
Hình 2.4. Minh họa góc thấm ướt ................................................................................. 35
Hình 2.5. Sơ đồ hệ chụp ảnh góc thấm ướt ................................................................... 35
Hình 3.1. Phổ FTIR của màng PDMS qua các bước chức năng hóa ............................ 38
Hình 3.2. Góc thấm ướt của các bề mặt thẻ sau mỗi bước biến đổi .............................. 39
Hình 3.3. Kết quả chạy chương trình ClustalX 2.0.11 chọn đoạn ADN đặc trưng cho
gen 16S rARN của loài S.suis........................................................................................ 40
Hình 3.4. Sơ đồ vị trí các cặp mồi và sản phẩm PCR ................................................... 41


Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR 198 bp của cặp mồi SF-SR trên gel agarose 1.5%. L:
Thang ADN 100 bp (ThermoFisherTM SM0242). Ss01-Ss05, Ss07, Ss08, Ss10, Ss11:
các chủng S.suis. Các đối chướng LM: Listeria monocytogenes. Sa01, Sm01,Sv01,
Spn02: các loài thuộc giống Streptococcus. .................................................................. 42
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR gen 16S rARN sử dụng cặp mồi SF2-SRB trên gel
polyacrylamide 15%. L: Thang ADN 50 bp (ThermoFisherTM SM0371). Ss07, Ss08,

Ss09, Ss10 và Ss11 thuộc loài S.suis. Sm01, Sa01, Spn02 là đối chứng. ..................... 43
Hình 3.7. Các phương pháp cố định đầu dò ADN lên bề mặt đế thẻ sử dụng một lần . 44
Hình 3.8. Phổ hấp thụ của đầu dò SPA trong dung dịch trước và sau khi cố định lên bề
mặt đế thẻ PDMS carboxyl của 2 phương pháp ............................................................ 45
Hình 3.9. Phổ FTIR của thẻ PDMS carboxyl và thẻ SPA ............................................. 46
Hình 3.10. Phóng to vị trí các đỉnh đặc biệt từ hình 3.9 ................................................ 46
Hình 3.11. Ảnh FESEM bề mặt màng mỏng PDMS (a) và thẻ SPA (b), (c) ................ 47
Hình 3.12. Đồ thị tối ưu thời gian cố định .................................................................... 47
Hình 3.13. Đồ thị tối ưu lượng đầu dò SPA cố định lên đến PDMS carboxyl ............. 48
Hình 3.14. Sơ đồ lai ADN đích với đầu dò SPA trên thẻ SPA ..................................... 50
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn lượng ADN đích phản ứng được ứng với nồng độ đầu vào
....................................................................................................................................... 50
Hình 3.16. Sơ đồ lai ADN đối chứng với đầu dò SPA và ADN đích với bề mặt đế thẻ
PDMS carboxyl không có đầu dò SPA ......................................................................... 51
Hình 3.17. Các lượng ADN lai được tương đương với các lượng ADN đem lai của
ADN đích, ADN đối chứng và ADN đích trên đế không có đầu dò SPA .................... 52
Hình 3.18. Sơ đồ biểu diễn quá trình đánh dấu ADN bằng hạt từ ................................ 53
Hình 3.19. a. Ảnh FESEM của hạt từ. b. Cấu trúc của streptavidin và biotin .............. 53
Hình 3.20. Sơ đồ mô tả thí nghiệm lai ADN và đánh dấu từ trên thẻ SPA với mẫu
ADN đích và ba mẫu đối chứng .................................................................................... 53
Hình 3.21. Hình ảnh quan sát bề mặt thẻ SPA bằng kính hiển vi quang học với độ
phóng đại của vật kính 50x ............................................................................................ 54
Hình 3.22. Sơ đồ cấu tạo và cách sử dụng của cảm biến AMR .................................... 55
Hình 3.23. a. Tín hiệu ra của cảm biến đối với thẻ SPA với các lượng ADN đích khác
nhau và các đối chứng. b. Đồ thị phụ thuộc tín hiện ra của cảm biến vào lượng ADN
đích trên thẻ SPA ........................................................................................................... 55


1
GIỚI THIỆU

Với xu thế phát triển hiện nay là tìm ra các vật liệu mới, kỹ thuật mới kế thừa
và phát triển hơn các phương pháp truyền thống để cho ra kết quả xét nghiệm mẫu
bệnh phẩm một cách nhanh chóng, chính xác và độ nhạy cao đang là vấn đề bức thiết
và đáng quan tâm. Một trong các xu hướng nghiên cứu phát triển gần đây các cảm biến
sinh học trong phân tích y sinh là chế tạo và phát triển các thẻ sử dụng một lần, trên
đó cố định các đầu dò sinh học và sử dụng cảm biến làm bộ phận phát hiện. Ở các cảm
biến truyền thống, các đầu dò ADN được cố định trực tiếp trên bề mặt cảm biến và
mẫu cần phân tích được xử lý ngay trên bề mặt cảm biến, do đó chất lượng bề mặt cảm
biến sẽ bị kém đi sau mỗi lần sử dụng và khó có thể tái sử dụng lại được nên giá thành
cho một mẫu phân tích khá cao. So với các cảm biến truyền thống thì hệ thống phân
tích y sinh với các thẻ dùng một lần trong có nhiều ưu điểm hơn. Trước hết, quá trình
xử lý và đánh dấu mẫu được thực hiện trên thẻ, sau đó thẻ được đưa vào cảm biến để
phát hiện, do đó không làm ảnh hưởng đến chất lượng của cảm biến sau mỗi lần sử
dụng. Nhờ vậy, cảm biến có thể sử dụng để phát hiện nhiều mẫu, chỉ cần thay thẻ cho
mỗi mẫu phân tích. Một ưu điểm khác của việc sử dụng thẻ dùng một lần là có thể
phát hiện các loại mẫu phân tích khác nhau trên một cảm biến chỉ cần sử dụng các thẻ
khác nhau với các loại đầu dò khác nhau đặc hiệu loại mẫu cần phân tích đó. Bên cạnh
đó, việc chế tạo các thẻ dùng một lần thường không phức tạp, ít tốn kém và quan trọng
hơn là chúng phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp hiện đại.
Streptococcus suis (S.suis) là liên cầu khuẩn gây bệnh ở lợn, gọi tắt là liên cầu
lợn, là một tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở lợn xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới và
gây tổn thất lớn về kinh tế. Năm 1960 phát hiện ra ca nhiễm bệnh ở người đầu tiên sau
đó số lượng bệnh nhân nhiễm ngày càng gia tăng. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là:
viêm màng não (biểu hiện chủ yếu), xuất huyết, viêm phổi, viêm cơ tim và viêm khớp;
người bệnh nặng có thể tử vong. Theo Hướng dẫn Giám sát và phòng, chống bệnh liên
cầu lợn ở người của Bộ Y Tế ngày 7 tháng 11 năm 2014, tỉ lệ tử vong từ 5% tới 20%.
Cũng theo báo cáo của Cục Y tế dự phòng, năm 2016 vừa qua bệnh do liên cầu lợn đã
giảm 19.4% từ 514,299 trường hợp năm 2015 xuống còn 414,587 trường hợp. Tử vong
do bệnh này cũng giảm tới 58% từ 17 trường hợp năm 2015 xuống còn 7 trường hợp
năm 2016. Bệnh có thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày và có thể dẫn đến tử

vong trong vòng 1 – 2 ngày sau khi biểu hiện bệnh. Hiện nay, chưa có vắc xin phòng
bệnh và nhiều phòng xét nghiệm trong và ngoài nước vẫn đang áp dụng các kỹ thuật:
phân lập liên cầu (định danh qua nuôi cấy trên thạch máu cừu và ngựa), phản ứng
PCR, định danh bằng hệ thống test Rapid Strep và một số các phương pháp khác như
kháng thể huỳnh quanh hay ELISA. Mỗi loại kỹ thuật xét nghiệm đều có đặc thù và
thế mạnh riêng nhưng các hạn chế chung của chúng vẫn là vấn đề giá thành cao, các
bước thực hiện phức tạp và thời gian khá lâu để thu được kết quả. Trong hoàn cảnh đó,
việc kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản (PCR) và các kỹ thuật vật lý, hóa học


2
khác cùng vật liệu nano (hạt nano từ) với ứng dụng của cảm biến ADN dựa trên bộ
chuyển đổi từ đã cho ra một hướng nghiên cứu mới cho việc xây dựng bộ cảm biến
phát hiện liên cầu khuẩn S.suis gây bệnh.
Theo định hướng nghiên cứu gắn với xu thế phát triển trên, tôi đã thực hiện
luận văn với đề tài “Nghiên cứu thiết kế và cố định ADN đầu dò ứng dụng trong cảm
biến ADN định hướng phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm màng
não”. Luận văn gồm các nội dung chính như sau:
1. Thiết kế ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S.suis.
2. Chế tạo thẻ sử dụng một lần mang ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S.suis.
3. Đánh giá quá trình lai ADN đích với ADN đầu dò trên thẻ.
4. Đánh dấu ADN đích bằng hạt từ để phát hiện trên cảm biến từ.


3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Cảm biến sinh học và xu thế

1.1.1. Tổng quan cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học (biosensor viết tắt của biological sensor) là loại thiết bị phân
tích bao gồm phần cảm nhận sinh học kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu (hình 1.1)
chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện, nhiệt hoặc quang... Theo IUPAC
(International Union of Pure ADN Applied Chemistry) “Cảm biến sinh học
(biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định
lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết sinh học
(bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi”.

Hình 1.1. Cấu tạo cảm biến sinh học (internet)
Cấu tạo của một cảm biến sinh học gồm 3 phần chính:
1. Đầu thu sinh học (bioreceptors/sensitive biological elements) là các nhân tố
sinh học hoặc giả sinh học như các thụ thể tế bào, enzymes, kháng thể, tế bào,
ADN, ARN... được cố định trên bề mặt của cảm biến sinh học có tác dụng
tương tác đặc hiệu với chất cần phân tích;
2. Bộ phận chuyển đổi tín hiệu (transducer/detector element): làm việc dựa trên
một số nguyên lý như quang, điện hóa, lý hóa, điện áp...giúp chuyển các biến
đổi sinh học giữa đầu thu sinh học và các chất cần phân tích thành các tín hiệu
có thể đo đạc được;
3. Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (electronic system/biosensor reader device): bộ
phận này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị
khác có thể xử lý, được đánh giá mà bộ phận có giá thành cao nhất cấu tạo nên
một cảm biến sinh học.
Ngoài ra, còn cần có một vài bộ phận phụ khác để cấu thành nên một thiết bị
cảm biến sinh học đầy đủ như tác nhân cố định (recognition), giúp gắn các đầu thu có
bản chất sinh học lên giá đỡ hoặc bề mặt đế - bản chất vô cơ.
Cảm biến sinh học được phân loại dựa vào bản chất các đầu thu sinh học, gồm
các loại chính như cảm biến sinh học có đầu thu làm từ enzyme, các kháng

4
nguyên/kháng thể, protein, axit nucleic, đầu thu kết hợp và đầu thu làm từ tế bào.
Ngoài ra, cảm biến sinh học còn được phân loại dựa vào nguyên lý hoạt động của bộ
chuyển đổi tín hiệu. Khi đó cảm biến sinh học có thể được chia ra thành các loại chính
sau: cảm biến sinh học điện hóa (electrochemical biosensor), cảm biến sinh học quang
(optical/visual biosensor), cảm biến sinh học nhiệt (calorrimetric/thermal biosensor),
cảm biến sinh học áp điện (piezo-electric biosensor). Bên cạnh đó, theo xu hướng hiện
nay hướng tới việc ứng dụng công nghệ cao vào cảm biến sinh học nhằm cải thiện cảm
biến sinh học theo hướng tiện dụng cũng như có độ nhạy và độ chính xác cao hơn đã
cho ra đời các loại cảm biến mới như cảm biến sinh học silica, thạch anh, thủy tinh
(silica, quartz/crystal, glass biosensor) và cảm biến sinh học dựa trên vật liệu nano
(nanomaterials-based biosensor) [35]. Các ưu điểm của cảm biến sinh học là tính đặc
hiệu (do đầu thu sinh học liên kết đặc hiệu với chất cần phân tích), thời gian phân tích
ngắn, cho kết quả nhanh, dễ sử dụng, độ chính xác và độ nhạy cao… Bên cạnh đó,
cảm biến sinh học có một số điểm yếu như đầu thu sinh học là enzyme, tế bào, kháng
thể, mô... nên có thể bị biến tính dưới điều kiện khắc nghiệt của môi trường ngoài (pH,
nhiệt độ, ion...); cảm biến không thể được tiệt trùng bằng nhiệt do các vật liệu sinh học
có thể bị biến tính; các tế bào được sử dụng trong cảm biến sinh học có thể bị giảm
chức năng khi tiếp xúc với các phân tử khác.
Cảm biến sinh học đã được đưa vào ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống
như y học, nha khoa, chẩn đoán bệnh, kiểm định chất lượng (đất, thức ăn, nước), nông
nghiệp, thú y hay trong kiểm soát nước thải công nghiệp, khai khoáng và cả quân sự...
[4, 23]. Để định lượng, cảm biến sinh học phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo
lường như khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm,
vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt. Hình 1.2 dưới đây là biểu đồ
biểu thị nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới nay và dự đoán tới năm
2018 được tính trên đơn vị triệu đô la. Trong đó, hơn 80% nhu cầu sử dụng cảm biến
để đo nồng độ glucose [34]. Có thể thấy rằng nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học ngày
càng gia tăng trong những năm gần đây và nó sẽ còn gia tăng mạnh hơn trong những
năm tiếp theo, với hi vọng cảm biến sinh học đóng một vai trò quan trọng giúp ích

cuộc sống hơn trong tương lai gần.


5
Triệu đô la

Năm

Hình 1.2. Biểu đồ nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới 2018 [34]
1.1.2. Cảm biến ADN
Cảm biến ADN là cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học là các đoạn
ADN. Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn ADN có trình tự bổ sung
với nhau, mỗi sợi đơn ADN là một chuỗi nucleotide (hình 1.3.a). Mỗi nucleotide gồm
ba thành phần nhóm photphat, đường deoxyribose và một trong bốn bazơ (A, C, G và
T). Hai sợi đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các bazơ bổ
sung nằm trên hai sợi, A bổ sung cho T và C bổ sung cho G. Mỗi sợi đơn có một trình
tự định hướng với một đầu 5’ photphat tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là
5’- 3’) (hình 1.3.b). Hướng của hai sợi đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên
được gọi là hai sợi đối song song.


6
Đầu 5’

Liên kết hydro
Đầu 3’

Đầu 3’

a)

b)

Đầu 5’

Hình 1.3. a. Cấu trúc một đoạn phân tử ADN. b. Liên kết hydro giữa các bazơ của 2
mạch ADN sợi đơn trong một xoắn kép AND (internet).
Trong cảm biến sinh học ADN, một đoạn ADN ngắn đặc hiệu cho một gen của
một loài sinh vật nào đó được cố định trực tiếp lên bề mặt đế của cảm biến, được gọi là
đầu dò (probe). Đoạn đầu dò này sẽ được dùng để bắt cặp/lai với đoạn ADN bổ sung
(có trình tự các nucleotide bổ sung với đầu dò). Đoạn ADN bổ sung này còn được gọi
là ADN đích. ADN đích là các trình tự ADN đặc hiệu ở một gen đặc trưng cho một
loài sinh vật nào đó đang mong muốn được phát hiện. ADN đầu dò có khả năng bắt
cặp với các ADN có trình tự không bổ sung hoàn toàn với nó, tuy nhiên sợi đôi tạo
thành đó có độ bền nhiệt kém hơn so với sợi đôi có trình tự bổ sung hoàn toàn. Quá
trình nhận biết ADN đích dựa trên sự bắt cặp/lai đặc hiệu giữa ADN đầu dò được gắn
trên bề mặt của cảm biến và ADN đích (ADN cần phát hiện) được minh họa trên hình
1.4. Trong quá trình này, ADN đích và ADN đầu dò đều ở dạng sợi đơn.

ADN đầu dò

Bắt cặp/lai

Tín hiệu

ADN đích
Hình 1.4. Sự bắt cặp của ADN đích và ADN đầu dò trên cảm biến ADN (internet)


7

Người ta phân chia đầu dò làm hai loại phụ thuộc vào chiều dài của chúng là
đầu dò gen (gene probe) (dài hơn 500 nucleotide chứa toàn bộ hay phần lớn trình tự
gen đích, thường được tạo ra bằng phương pháp PCR từ các gen đích) và đầu dò
oligonucleotide (oligonucleotide probe) (được tổng hợp nhân tạo bằng thiết bị tổng
hợp với chiều dài nhỏ hơn 100 nucleotide). Trong cảm biến ADN, người ta thường
dùng các đầu dò oligonucleotide với chiều dài từ 18 đến 50 nucleotide để nhận biết
gen đích.
Quá trình lựa chọn đầu dò oligonucleotide cho cảm biến ADN có thể thực hiện
sử dụng những trình tự gen đã biết, với các điều kiện chú ý sau. 1. Chiều dài đầu dò
thường dao động trong khoảng 18 – 50 nucleotide, kích thước dài hơn sẽ khiến thời
gian lai lâu hơn và hiệu suất tổng hợp thấp, kích thước ngắn hơn sẽ làm giảm độ đặc
hiệu của đầu dò. 2. Thành phần G – C nên từ 40 – 60%, nguy cơ lai không đặc hiệu
tăng khi tỉ lệ G – C nằm ngoài khoảng trên. 3. Tránh sự có mặt của các vùng bổ sung
bên trong mẫu dò vì chúng có thể tạo cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin) và ngăn cản quá
trình lai (hình 1.5). 4. Tránh các trình tự chứa các đoạn nucleotide đơn liên tiếp (ví dụ
như AAAA). Một khi trình tự đạt những yêu cầu trên, vẫn cần thiết phân tích trình tự
trên máy tính. 5. Nên so sánh trình tự đầu dò với các vùng trình tự nguồn hay hệ gen
nguồn cũng như so sánh với các trình tự bổ sung của các trình tự nguồn đó. Nếu độ
tương đồng với các vùng (không phải đích) > 70% hoặc >=8 nucleotide trong một
hàng được quan sát, mẫu dò đó không đủ điều kiện sử dụng. Tuy nhiên, để xác định
điều kiện lai tối ưu, nên tiến hành lai đầu dò với các ADN đích và ADN đối chứng
trong các điều kiện lai được tối ưu.

Hình 1.5. Cấu trúc kẹp tóc (hair pin) (internet)
Cảm biến sử dụng đầu dò ADN có thể kết hợp với các bộ chuyển đổi khác
nhau: bộ chuyển đổi quang, bộ chuyển đổi điện hóa, bộ chuyện đổi từ.
1.1.3. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang
Cảm biến dựa trên bộ chuyển đổi quang là loại phổ biến nhất cho cảm biến nói
chung và cảm biến ADN nói riêng, với các ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy cao

8
… Trong suốt một thập kỷ vừa qua việc nghiên cứu cũng như công nghệ cho cảm biến
dựa trên bộ chuyển đổi quang đã phát triển một cách vượt trội [8]. Cảm biến hoạt động
dựa trên các tính chất vật lý của ánh sáng để định lượng chất cần phân tích. Cảm biến
ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang có thể chia ra làm hai loại: đánh dấu và không
đánh dấu. Với phương pháp đánh dấu, người ta sử dụng những vật liệu có khả năng
phát quang hoặc hấp thụ ánh sáng để đánh dấu ADN đích. Chất đánh dấu thường được
sử dụng là chất phát huỳnh quang như Cy3, Cy5, ethidium bromide, picogreen hoặc
các vật liệu nano như chấm lượng tử/QD, hạt nano vàng. Ví dụ như người ta có thể
dùng cặp đầu dò bắt (capture probe) và đầu dò phát hiện (reporter probe) mang chất
nhuộm Cy5 có trình tự bổ sung với đầu 5’ và đầu 3’ của ADN đích tạo tổ hợp [30]
(hình 1.6.a). Chấm lượng tử được bọc streptavidin sẽ liên kết với các đầu dò bắt có gắn
biotin ở đuôi, do đó chất màu Cy5 đóng vai trò là chất nhận (acceptor) tiến gần chấm
lượng tử - đóng vai trò là chất cho (donor) làm xảy ra hiệu ứng truyền năng lượng
cộng hưởng huỳnh quang (FRET) khi kích thích chấm lượng tử. Hiệu ứng FRET chỉ
xảy ra khi chất cho và chất nhận ở rất gần nhau. Nếu không có ADN đích, thì Cy5 và
chấm lượng tử không ở gần nhau nên khi được kích thích tại bước sóng 488 nm chấm
lượng tử sẽ phát xạ ở bước sóng 605 nm. Nếu có mặt ADN đích sẽ xảy ra hiệu ứng
FRET khi đó chấm lượng tử được kích thích tại bước sóng 488 nm sẽ truyền năng
lượng cho Cy5 làm cho Cy5 sẽ phát xạ tại bước sóng của nó ở 670 nm (hình 1.6.b)
[30].
a)

b)

Hình 1.6.a. Cơ chế hoạt động của cảm biến ADN sử dụng cặp đầu dò bắt và đầu dò
phát hiện kết hợp Cy5 với chấm lượng tử để đánh dấu. b. Ảnh chồng huỳnh quang cho
thấy việc ở cùng vị trí của QD và Cy5 [30].
Cảm biến sử dụng cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasma Resonance SPR) là loại cảm biến không cần đánh dấu ADN đích. Hệ thống này dựa trên sự thay

9
đổi cường độ ánh sáng phản xạ khi có sự lai hóa của đoạn ADN đầu dò và ADN đích
trên bề mặt lớp cảm biến làm bằng màng vàng (hình 1.7) [24]. Loại cảm biến này có
ưu điểm là: độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng cũng có nhược điểm là giá thành cao.

b)
c)

a)

Hình 1.7.a. Cấu trúc cảm biến SPR. b. Đồ thị phụ thuộc cường độ ánh sáng phản xạ
vào góc tới trước và sau khi có phân tử ADN đích lai với đầu dò trên bề mặt cảm biến.
c. ADN đầu dò và ADN đích trên bề mặt cảm biến SPR [24].
1.1.4. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa
Cảm biến ADN dựa trên chuyển đổi điện hóa được biết đến như một công cụ
hứa hẹn với nhiều ứng dụng hữu ích vào chẩn đoán bệnh, kiểm định môi trường,
nghiên cứu trong sinh học bởi độ nhạy cao, giá thành thấp, dễ dàng tương thích với các
công nghệ vi chế tạo hiện đại cũng như có thể cầm tay [7, 42]. Cách phát hiện ADN sử
dụng cảm biến ADN với bộ chuyển đổi điện hóa có thể tiến hành theo phương pháp
đánh dấu đoạn ADN đích. Chia ra làm hai loại là cảm biến ADN sử dụng chất chỉ thị
oxi hóa – khử (redox indicator) và cảm biến ADN sử dụng hạt nano. Phương pháp sử
dụng chất chỉ thị oxi hóa – khử nhận biết sự bắt cặp ADN dựa vào sự khử của chất chỉ
thị oxi hóa – khử (chất hữu cơ) được gắn vào đoạn ADN đích hoặc ADN đầu dò. Khi
có sự kết cặp của ADN đầu dò và ADN đích sẽ hình thành đoạn xoắn kép, dẫn đến
nồng độ chất chỉ thị tăng ở bề mặt cảm biến làm thay đổi tín hiệu điện hóa trong quá
trình đó (hình 1.8 ) [40].

10

Hình 1.8 . Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa sử dụng chất chỉ thị oxi
hóa – khử [40]
Cảm biến ADN sử dụng hạt nano, hạt nano kim loại được giữ ở điện cực khi có
sự bắt cặp của các đoạn ADN đích với ADN đầu dò trên điện cực (hình 1.9) [9].

Hình 1.9. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa sử dụng hạt nano [9]
1.1.5. Cảm biển ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ
Nguyên tắc hoạt động của phương pháp cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi
từ là thông qua việc phát hiện từ trường được sinh ra từ các hạt siêu thuận từ bị từ hóa
[41]. Các hạt từ được chức năng hóa bằng đơn lớp streptavidin thường được sử dụng
để đánh dấu các ADN đích có gắn biotin nhờ liên kết đặc hiệu streptavin với biotin


11
(hình 1.10). Hơn nữa, chúng có thể tích hợp các chức năng trên cùng một chíp, độ
nhạy cao và phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp hiện đại
a)

b)

c)

Hình 1.10. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ (internet)
1.1.6. Cảm biến sử dụng một lần
Cảm biến đo đường huyết cá nhân là một trong các ví dụ điển hình cho cảm
biến sử dụng một lần. Cảm biến đo đường huyết cá nhân được phân thành hai loại dựa
theo phương pháp thực hiện gồm phương pháp đo trực tiếp (thông qua việc lấy mẫu
máu) (phương pháp phổ biến) và phương pháp gián tiếp (không cần lấy mẫu máu).

Hình 1.11.a. biểu thị máy đo đường huyết On-Call EZ II xuất xứ từ Mỹ đang một sản
phẩm theo phương pháp đo trực tiếp thịnh hành trên thị trường với giá thành hợp lý
cũng như tiết kiệm thời gian (kết quả chính xác sau 10 giây). Hình 1.11.b. biểu thị cấu
trúc que thử gồm là tấm nhựa gồm 2 điện cực, hai lớp bảo vệ, một lớp kết dính,một
điện cực hoạt động chính gắn enzym glucose oxidase (GOD) và chất trung gian. OnCall EZ II hoạt động dựa trên nguyên tắc của cảm biến điện hóa. Sau khi mẫu máu đưa
vào que thử glucose trong máu được oxi hóa nhờ xúc tác đặc hiệu của enzym glucose
oxidase (C6H12O6 + O2 => C6H10O6 + H2O2). Mỗi phân tử glucose phản ứng sẽ có 2
điện tử được trao đổi và vận chuyển qua phần tử chất trung gian (chất trung gian giúp
điện tử di chuyển nhanh). Dưới tác dụng của điện thế giữa 2 điện cực sẽ xuất hiện
dòng điện. Thông qua tín hiệu dòng điện xác định được nồng độ glucose trong máu.
Bộ phận vi xử lý cho hiển thị số trên màn hình.


12
b)

a)

Hình 1.11.a. Máy đo đường huyết On-Call EZ II. b. Cấu trúc que thử. (internet)
Bên cạnh đó, để quản lý bệnh nhân tiểu đường người ta còn sử dụng cảm biến
sinh học đo glucose trong nước mắt (VD: Noviosense) hoặc có thể là cảm biến không
phải là cảm biến sinh học (không dùng đầu thu sinh học) như IR, siêu âm… Loại cảm
biến khác có tên là máy đo đường huyết gián tiếp (không xâm lấn). Như vậy, người
bệnh sẽ không bị đau khi đo chỉ số đường huyết và tiết kiệm được chi phí que thử.
Hệ thống sử dụng chip một lần Biacore là một trong những công cụ hữu ích cho
việc nghiên cứu và phân tích các mối quan hệ giữa các chất như protein, nucleic acids,
carbohydrates, lipids…Hệ thống này giúp phân tích thông tin quan trọng thông qua sự
liên kết của các chất (hình 1.12).
a)

b)

c)

Hình 1.12. a. Hệ thống sử dụng chip một lần Biacore T200. b. Chip một lần. c. Cấu
tạo bề mặt chip. (internet)
Trong hệ thống Biacore T200 minh họa ở trên gồm có 4 bộ phận chính: sensor
chip (hình 1.12.b); hệ vi lỏng (microfluidic system); khu vực chứa mẫu và thuốc thử
(sample ADN reagents); máy tính; các bình chứa đệm, các dung dịch và bình chứa


13
chất thải. Mỗi bộ phận hoạt động theo các chức năng riêng của nó, tuy nhiên 2 bộ phận
quan trọng nhất là sensor chip và hệ vi lỏng. Hệ thống Biacore T200 hoạt động dựa
theo nguyên lý cộng hưởng plasmon bề mặt. Lựa chọn sensor chip được gắn các ligand
thích hợp (tương tác đặc hiệu với chất cần phân tích) để đưa vào hệ thống. Sensor chip
được di chuyển đến khu vực tạo hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt và được gắn kết
với hệ vi lỏng. Nó tạo thành đường dẫn truyền các phân tử phân tích tới bề mặt của
một lớp vàng phủ trên một tấm thủy tinh (hình 1.12.c). Trên bề mặt vàng của sensor
chip có gắn kết các ligand như một đầu thu tạo các liên kết với chất phân tích (nếu có).
Khi cần phân tích các chất khác nhau chỉ cần thay sensor chip với các ligand đặc hiệu
cho các chất đó.
Tóm lại, với sự phát triển của công nghệ và nhu cầu xã hội, cảm biến ADN đã
được quan tâm nghiên cứu và chế tạo dựa trên nguyên lý các loại bộ chuyển đổi ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như phát hiện vi rút, vi khuẩn gây bệnh, phát hiện
chuyển gen cây trồng, xác định ion kim loại nặng trong lĩnh vực bảo vệ môi trường…
1.2.

Các phương pháp cố định đầu dò ADN

Kỹ thuật cố định ADN đầu dò lên bề mặt cảm biến sinh học có ảnh hưởng lớn
đến độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định của cảm biến. Quá trình cố định đoạn ADN cần
thỏa mãn các yêu cầu như: không ảnh hưởng đến cấu trúc các phân tử ADN, không
làm biến đổi và ít ảnh hưởng đến các tính chất của lớp màng bề mặt, liên kết tạo ra bền
trong điều kiện sinh lý. Hiện nay, có ba phương pháp cố định ADN lên bề mặt đế phổ
biến được nghiên cứu và phát triển là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và
phương pháp sinh học (hình 1.13). Mỗi phương pháp cố định có ưu và nhược điểm
riêng. Tùy mục đích sử dụng mà chúng ta lựa chọn phương pháp phù hợp.
a)

b)

c)

Hình 1.13.a. Phương pháp vật lý. b. Phương pháp hóa học. c. Phương pháp sinh học.
(internet)


14
1.2.1. Phương pháp vật lý
Phương pháp vật lý hay còn được gọi là phương pháp hấp phụ ADN lên bề mặt
của màng đã được chức năng hóa. Bản chất của các liên kết là các liên kết tĩnh điện.
Tuy nhiên các liên kết tĩnh điện lại phụ thuộc chủ yếu vào độ pH và nồng độ muối của
dung dịch, nên khi thay đổi dung dịch đệm với độ pH và nồng độ muối cao hơn, tương
tác giữa ADN và màng chức năng sẽ bị suy yếu và kết quả là ADN có thể bị tách khỏi
màng chức năng. Khả năng hấp phụ phụ thuộc vào các điều kiện: nhiệt độ, nồng độ
ADN ban đầu, diện tích bề mặt tiếp xúc của màng chức năng. Như vậy, phương pháp
vật lý tương đối đơn giản, ADN gắn trên màng đã chức năng bền trong môi trường mà
chúng vừa tạo thành, nhưng không bền khi thay đổi môi trường; khó kiểm soát được
số lượng, định hướng vị trí phân tử ADN liên kết với bề mặt đế (hình 1.14.b).

Tương tác thiol với kim loại vàng là một trường hợp đáng chú ý thường được
dùng cho việc kiên kết phân tử ADN biến đổi có nhóm thiol trên bề mặt đế vàng (hình
1.14). Nhóm thiol có liên kết mạnh với kim loại vàng [25]. Đầu dò ADN-thiol sẽ tự
liên kết để cố định được lên bề mặt của đế vàng tạo thành đơn lớp tự sắp xếp (Self
assambled monolayer).
a)

b)

Hình 1.14.a. Cấu trúc nhóm thiol. b. Cố định ADN có nhóm thiol lên đế vàng.
(internet)
1.2.2. Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phương pháp sử dụng các phản ứng hóa học để liên kết
các phân tử ADN với đế đã được chức năng hóa thông qua các liên kết cộng hóa trị.
Các liên kết hóa học này thường bền, không phụ thuộc vào nồng độ muối và ít phụ
thuộc vào pH của môi trường. Do đó, ADN cố định tạo bằng phương pháp hóa học bền
trong các dung dịch đệm khác nhau với các nồng độ muối cao và giá trị pH thay đổi.
Có hai bước cơ bản khi tiến hành phương pháp hóa học: Bước 1) Chức năng hóa bề
mặt đế, Bước 2) Cố định đầu thu sinh học (hình 1.15).


15

Hình 1.15. Sơ đồ chức năng hóa đế và cố định ADN
Phương pháp hóa học cho phép gắn các ADN nguyên thể hoặc ADN biến đổi
có nhóm amin hoặc nhóm thiol lên bề mặt đế đã được chức năng hóa có nhóm amin,
cacboxyl, hay aldehyde. Như đã trình bày ở trên, phản ứng tạo liên kết ADN–bề mặt
đế đã được chức năng hóa cần được thực hiện trong điều kiện ôn hòa để không làm
ảnh hưởng đến tính chất của ADN cũng như tính chất của bề mặt đế đã được chức
năng hóa.

Cố định ADN nguyên thể lên bề mặt đế đã được chức năng hóa là phương pháp
tương đối đơn giản và phổ dụng để tạo phức hợp vì chỉ cần sử dụng ADN nguyên thể
với nhóm photphat ở đầu 5’. Khi đó, bề mặt đế đã được chức năng hóa cần có nhóm
chức amin. Dưới tác dụng của chất xúc tác N-methyl-imidazole (MIA) và sự có mặt
của chất carbodiimide tan trong nước EDC (1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl)
carbodiimide), nhóm photphat ở đầu 5’ của ADN nguyên thể được kích hoạt để phản
ứng với nhóm amin trên bề mặt màng đã được chức năng hóa tạo thành liên kết cộng
hóa trị bền.
Khi cố định ADN biến đổi có nhóm amin và thiol lên bề mặt đế đã được chức
năng hóa, tùy thuộc vào các nhóm chức trên bề mặt màng đã được chức năng hóa mà
người ta lựa chọn các chất nối (crosslinker) khác nhau (bảng 1.1) [2]. Trong số đó,
EDC là một loại carbodiimide tan trong nước được sử dụng phổ biến nhất trong hóa
sinh hữu cơ và công nghệ sinh học nano để nối nhóm carboxyl và amin tạo thành liên
kết amide. Các chất nối NHS và DSS (hình 1.16) [2]. không tan trong nước nên phải
hòa tan chúng trong dung môi hữu cơ như DMSO trước khi trộn lẫn với ADN trong
dung dịch đệm. Để không phải sử dụng dung môi hữu cơ trong phản ứng, người ta đã
tổng hợp các chất nối tan trong nước Sulfo-NHS và BS3 dựa trên nền hai chất kể trên.