Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá cây lá diễn (dicliptera chinensis (l ) nees)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

PHẠM KIM THOA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA LÁ CÂY LÁ DIỄN
(Dicliptera chinensis (L.) Nees)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: PHẠM KIM THOA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA LÁ CÂY LÁ DIỄN
(Dicliptera chinensis (L.) Nees)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS. VŨ ĐỨC LỢI

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực và
cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm ân cần, nhiệt tình giúp
đỡ của mọi người. Thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, động viên và giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Lời đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
tới TS. Vũ Đức Lợi - Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Khoa
Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các giảng viên, các anh chị kỹ thuật viên Bộ
môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược
phẩm, Bộ môn hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dược, Đại học Quốc
gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận, cũng
như xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô trong trường đã dạy dỗ, trang bị
kiến thức cho tôi trong suốt 5 năm theo học tại trường.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên,
quan tâm và tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2017
Sinh viên

Phạm Kim Thoa


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT
STT

Kí hiệu, viết tắt

Tên đầy đủ

1

ALT

Aspartate Amino Transferase

2

AST

Alanin Amino Tranferase

3

DCP

Dicliptera Chinensis polysaccharid

4

DMN

Dimethyl nitrosamin

5

ESI-MS

Phổ khối

6

EtOH

Ethanol

7

EtOAc

Ethylacetat

8

HF

Bệnh xơ gan

9

HPLC

10

HSC

Tế bào hình sao ở gan

11

H&E

Hematoxylin & Eosin

12

MDA

Malondialdehyd

13

MeOH

Methanol

14

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

15

TLC

Sắc ký lớp mỏng

16

UV- VIS

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phổ tử ngoại- khả kiến


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Hình 2.1

Sơ đồ chiết xuất cao dược liệu

17

Hình 2.2

Sơ đồ phân lập chất

18

Hình 3.1

Tiêu bản khô cây Lá diễn

20

Hình 3.2

Các bộ phận của cây Lá diễn

21

Hình 3.3

Tiêu bản thân của cây Lá diễn

22

Hình 3.4

Tiêu bản lá của lá cây Lá diễn

23

Hình 3.5

Tiêu bản bột của lá cây Lá diễn

24

Hình 3.6

Cấu trúc hóa học của hợp chất HD1-CDCl3-1H

27

Hình 3.7

Phổ ESI-MS của hợp chất HD1-CDCl3-1H

28

Hình 3.8

Phổ 13C-NMR của hợp chất HD1-CDCl3-1H

29

Hình 3.9

Phổ 1H-NMR của hợp chất HD1-CDCl3-13CCPD

30

Hình 3.10

Phổ 13C-NMR của hợp chất HD1-CDCl3-13CCPD

31

Hình 3.11

Cấu trúc hóa học của hợp chất

31

HD1-CDCl3-13CCPD

Trang


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Tên bảng

Bảng
Bảng 1.1
Bảng 1.2

Bảng 3.1

Bảng 3.2

Mô ̣t số đă ̣c điể m chiń h của các loài thuô ̣c chi
Dicliptera
Công thức cấ u ta ̣o các hơ ̣p chấ t đã phân lâ ̣p đươ ̣c từ
chi Dicliptera
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương
pháp hóa học
Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HD1-CDCl3-1H và
chất so sánh L

Trang
4

7

25

26, 27


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1.

Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố ........................................ 3

1.1.1. Vi ̣trí phân loa ̣i chi Dicliptera ............................................................... 3
1.1.2. Đă ̣c điể m thực vâ ̣t của ho ̣ Acanthaceae ................................................ 3
1.1.3. Đặc điểm các loài thuô ̣c chi Dicliptera ................................................ 3
1.1.4. Đă ̣c điể m thực vâ ̣t của cây Lá diễn ....................................................... 5
1.2.

Thành phầ n hóa ho ̣c của Lá diễn .......................................................... 6

1.3.

Tác dụng dược lý của Lá diễn .............................................................. 8

1.3.1. Tác dụng được chứng minh khoa học................................................... 8
1.3.2. Tác dụng cổ truyền.............................................................................. 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 12
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 12

2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................... 12
2.1.2. Hóa chấ t sử du ̣ng................................................................................. 12
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ ........................................................................ 12
2.2.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 13

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật .................................. 13
2.2.2. Nghiên cứu về hóa ho ̣c........................................................................ 14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 19
3.1.

Kết quả nghiên cứu thực vật ............................................................... 21

3.2.

Kết quả định tính hóa học từ lá cây Lá diễn ....................................... 26


3.3.

Kết quả phân lập hợp chất .................................................................. 26

3.3.1. Hợp chất HD1-CDCl3-1H .................................................................. 26
3.3.2. Hợp chất HDl-CDCl3-Cl3CPD .......................................................... 30
3.4.

Bàn luận .............................................................................................. 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
Tài liệu Tiếng Anh
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
Sự phát triển của ngành Dược có ảnh hưởng rất lớn tới sức khỏe của con
người. Đời sống của con người càng nâng cao thì nhu cầu sử dụng dược phẩm
ngày càng lớn, trong đó phải kể đến nhu cầu sử dụng dược phẩm có nguồn gốc
thực vật.
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiều loại địa hình nên
có nguồn động thực vật đa dạng. Vậy nên nguồn thực vật có hoạt tính sinh học
cũng rất dồi dào và phong phú. Ngay từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng nguồn
tài nguyên thực vật này làm thuốc chữa bệnh như bôi ngoài da, sử dụng trực
tiếp hay sắc uống… Ngày nay, các nhà khoa học đã dựa vào khoa học kĩ thuật
để tìm hiểu và phân tích các hoạt chất có tác dụng sinh học trong thực vật, dược
liệu và tìm các câu trả lời về thành phần hoạt chất và cơ chế tác dụng của chúng.
Cây Lá Diễn có tên khoa học là Dicliptera chinensis (L.) Nees thuộc chi
Dicliptera họ Acanthaceae là một cây thuốc quý, được sử dụng từ lâu đời.
Trong đời sống, ngoài việc sử dụng cây Lá diễn để nhuộm thực phẩm thì trong

Y học Việt Nam và Trung Quốc, toàn cây lá diễn được dùng để chữa cảm ma ̣o,
số t cao, lên sởi, giảm niêu;
̣ dùng ngoài tri lơ
̣ ̉ , sưng, rôm sẩ y, mu ̣n nho ̣t…[1,2,46,11]. Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy tác dụng hiệu quả trong
điều trị gan bị tổn thương do viêm, xơ gan,… [17,19,22,26]. Hiện các nhà khoa
học đang tiếp tục nghiên cứu các loài thuộc chi Dicliptera để tìm ra các tác
dụng mới ứng dụng trong điều trị bệnh.
Việc nghiên cứu xác định thành phần hóa học và tác dụng sinh học của
các loài cây thuốc là cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, an toàn và
hiệu quả. Sử dụng các phương pháp chiết xuất, phân lập để xác định thành phần
hóa học của cây thuốc.
Tuy nhiên, ở Việt Nam cho tới thời điểm này chưa có nhiều nghiên cứu
về thành phần hóa học của cây Lá diễn. Nhằm mục đích góp phần vào việc tìm
hiểu về cây Lá diễn thu hái ở Trực Ninh, Nam Định, luận văn với đề tài “Nghiên
cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá cây Lá diễn (Dicliptera
chinensis (L.) Nees)” có các mục tiêu:

1


1. Xác định được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của cây
Lá diễn trồng ở huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định.
2. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hoạt chất
phân lập từ cây Lá diễn.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố

1.1.1. Vi tri
̣ ́ phân loa ̣i chi Dicliptera
Theo “Hê ̣ thố ng phân loa ̣i về ngành Ngo ̣c lan (Magnoliophyta)” của tác
giả A.Takhtajan, chi Dicliptera có vi tri
̣ ́ phân loa ̣i như sau [22]:
Giới thực vâ ̣t: Plantae.
Ngành Ngo ̣c Lan: Magnolipphyta
Lớp Cỏ Tháp Bút: Equisetopsida C. Agardh
Phân lớp Mô ̣c Lan: Magnoliidae Novák ex Takht
Bô ̣ Hoa Môi: Lamiales
Ho ̣ Ô Rô: Acanthaceae
Chi: Dicliptera
1.1.2. Đă ̣c điể m thư ̣c vâ ̣t của ho ̣ Acanthaceae
Ho ̣ Ô rô phầ n lớn là cây thân cỏ, cây bu ̣i hay dây leo, mô ̣t số bì sinh. Lá
đơn, mo ̣c đố i, chéo chữ thâ ̣p; không có lá kèm. Lá có thể chứa các chùm đá,
nhiǹ thấ y dưới da ̣ng các so ̣c trên bề mă ̣t. Hoa đầ y đủ, đố i xứng hai bên tới gầ n
như đố i xứng tỏa tròn. Cu ̣m hoa bông, chùm hoă ̣c xim. Thường có lá hoa nhiề u
màu sắ c đố i diê ̣n với mỗi hoa. Đài thường 4-5 thùy; tràng có hiǹ h ố ng, 2 môi
hay 5 thùy; nhi đực
2 hay 4 xế p thành că ̣p và lồ ng vào tràng; bầ u lớn, 2 lá noañ ,
̣
đính noañ tru ̣. Quả nang mở 2 ô. Ha ̣t không nô ̣i nhũ, phôi lớn [4,8].
1.1.3. Đăc điểm các loài thuô ̣c chi Dicliptera
- Trên thế giới
Chi Dicliptera (ho ̣ Acanthaceae) bao gồ m hơn 150 loài vùng nhiêṭ đới
và câ ̣n nhiêṭ đới. Chi này phân bố ở Châu Á: Trung Quố c, Lào, Campuchia,
Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Châu Phi, Châu Úc và U.S.A [2,4,8].

3


Bảng 1.1. Mô ̣t số đă ̣c điể m chính của các loài thuô ̣c chi Dicliptera [2,4]
STT

Loài

Đă ̣c điể m chính

1

D. brachiate Spreng

Lá bắ c hiǹ h trứng hay hình mác

2

D. clinopodia Nees

Lá bắ c hiǹ h chữ nhâ ̣t, tràng hoa màu tím

3

D. suberecta UFP

Lá bắ c hình trứng, hoa hình ố ng màu đỏ

4

D. foetida (Forssk) Blatt Hoa đơn dô ̣c, tràng hoa màu tím nha ̣t

5

D. resupinata Juss

Lá bắ c hình trứng mỏng, hoa màu hồ ng

6

D. ciliate Decne

Lá bắ c dài 25mm

7

D. spicata Decne

Cu ̣m hoa nhỏ go ̣n, hiǹ h trứng

8

D. trifurca Juss

Lá bắ c dài 20mm, tràng hoa hình ố ng màu tím

9

D. squarrosa

Lá bắ c dài 15mm, hoa hiǹ h ố ng màu vàng cam

10

D. sexangularis Juss

Lá bắ c dài 7mm, hoa hình ố ng màu hồ ng.

 Ở Viê ̣t Nam
Chi Dicliptera gồ m 4 loài [4,8].
 Loài D. Bupleuroides Nees in Wall (Lưỡng thiê ̣t):
Cây cỏ cứng cao 30cm; thân vuông, thường đen khi khô, có khi nâu đâ ̣m,
không có lông, lóng dài 3-4cm. Lá mo ̣c đố i, phiế n lá hình trái xoan, mă ̣t trên
nâu đen, mă ̣t dưới nâu. Hoa hình môi mo ̣c thành chùm ít hoa mo ̣c ở nách lá;
đài 6-8mm; vành cao 1,5mm.
 Loài D.chinensis Nees in DC (Cửu căn):
Cây cỏ thân có bốn ca ̣nh, có lông mịn. Lá mo ̣c đố i hình bầ u du ̣c thon, có
lông min.
̣ Hoa hình môi be ̣t, môi trên nguyên. Quả nang, ha ̣t có ít lông. Cây
được phân bố ở các khu vực: Cao Bằ ng, Bắ c Ca ̣n (chơ ̣ Đồ n), Thái nguyên, Hà
Giang, Yên Bái, Hòa Bình, Nam Định, Hà Nô ̣i, Huế , Sài Gòn…
 Loài D. Leonotis Dalz. Ex C. B. Clarke (lưỡng thiêt):
̣
Cây cỏ nằ m rồ i đứng, thân tròn, có lông lúc còn non. Lá có phiế n thon
to 2- 6 x 2 cm, nho ̣n hai đầ u, mỏng, dài 2-10cm. Hoa mo ̣c thành chùm ở kẽ lá,
hiǹ h môi; môi trên hình xoan nho ̣n, môi dưới ba rang. Quả nang có lông. Ha ̣t
hiǹ h tròn hoă ̣c det.̣ Cây được phân bố ở các khu vực: huyê ̣n miề n núi Chiêm
4

Hóa, Na Hang tỉnh Tuyên Quang, huyê ̣n miề n núi tin̉ h Quảng Nam, huyê ̣n Hòa
Vang thành phố Đà Nẵng và mô ̣t số tỉnh khác (Viñ h Phúc, Phú Tho ̣, Thái
Nguyên).
 Loài D. Vestita R. Ben (Ha ̣ mái phủ):
Cây cỏ có thân mảnh, lóng dài 4-7cm. Lá hình bầ u du ̣c hay hình trái
xoan, to 4- 7 x 3 cm có lông sáp min.
̣ Hoa hình môi, môi trên xon rô ̣ng (hia
rang) to hơn môi dưới (ba rang) mo ̣c ở nách lá có nhiề u lông, lá đài hiǹ h kim.
Quả nang nhỏ, có lông. Cây mo ̣c hoang và đươ ̣c trồ ng nhiề u ở điạ phương các
tỉnh miề n núi và trung du phía bắ c như: Cao Bằ ng (Tha ̣ch An), La ̣ng Sơn (Văn
Quan), Bắ c Ka ̣n (chơ ̣ Đông), Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Ninh, Sơn
La…[2,8].
1.1.4. Đă ̣c điể m thư ̣c vâ ̣t của cây Lá diễn
1.1.4.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa ho ̣c:
Dicliptera chinensis (Linnaeus) Nees, ho ̣ Ô rô
(Acanthaceae) [12]
Tên đồ ng nghiã :

Dicliptera javanica Nees [12]

Tên khác:

cửu căn, cây gan heo, can thái [12]

Tên nước ngoài:

Dicliptère (Pháp) [12]

Ho ̣:

Ô rô (Acanthaceae)

Lá diễn là cây thảo, cây nửa bu ̣i hoă ̣c bu ̣i số ng mô ̣t hay vài ba năm, cao
30-80 cm. Thân và cành non có 4 cạnh, có lông tơ, các mấ u phình to tựa như
đầ u gố i. Lá mo ̣c đố i màu xanh lu ̣c, phiế n lá hình trứng thuôn dài 2-7 cm, rô ̣ng
2-4 cm, đầ u và gố c đề u nho ̣n, có lông rải rác [2,4].
Hoa màu trắ ng hồ ng. Cu ̣m hoa mo ̣c ở kẽ lá xim, bao gồ m những lá bắ c
không bằ ng nhau, hin
̀ h trứng thuôn; lá bắ c con hình chi;̉ đài có răng đề u, rời
nhau, hình rải hep;
̣ tràng hoa hai môi, môi dưới hơi xẻ ba thùy, môi trên hình
trứng nguyên; nhi ̣ hai đính ở ho ̣ng tràng, bao phấ n hai ô; bầ u nhẵn. Mùa hoa
tháng 12-5. Quả nang ngắ n, có lông tơ ở đầ u, ha ̣t deṭ [4].
1.1.4.2. Phân bố cây Lá diễn
Tìm thấy tại phía Nam Trung Quố c, Viêṭ Nam, Lào [4].
5


Phân bố tương đố i phổ biế n ở các tin̉ h thuô ̣c vùng núi thấ p và trung du
phía Bắ c gồ m Cao Bằ ng, La ̣ng Sơn, Quảng Ninh, Nam Định, Yên Bái, Tuyên
Quang, Bắ c Ca ̣n, Thái Nguyên…[2,8,12].
1.2.

Thành phầ n hóa ho ̣c của Lá diễn

Trên thế giới đã có mô ̣t số những nghiên cứu về thành phầ n hóa ho ̣c của
các loài thuô ̣c chi Dicliptera như sau:
Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của Yinggang Luo, Chun Feng

và cộng sự năm 2002 cho thấy lá của D. riparia có chứa các hợp chất thuộc
nhóm glycosid, flavonoid, monoterpenoid: diclipariside A, diclipariside B,
diclipariside C, acid vanillic, β – sitosterol, 2,5 – Dimethoxy – bezoquinone,
daucosterol, lugrandoside và poliumonside [25].
Trong nghiên cứu của Gao YT, Yang XW và cô ̣ng sự la ̣i cho thấ y loài
D. chinensis có chứa bảy hợp chất được phân lập từ dịch chiết ethyl acetate
[11]. Các hợp chất được tách bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng (TLC)
và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cấu trúc của chúng đã được xác định
bằng các phương pháp phổ UV, NMR và MS. Cấu trúc của chúng được xác
định là:
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)

Octasulphur
Secoisolariciresinol dimethyl ether diacetate
5-methoxy-4,4’-di-O-methyl secoisolariciresimol
Chinensis naphthol methyl ester
Loliolide
Beta-sitosterol 3-O-beta-D-glucopyranoside

6


Bảng 1.2. Công thức cấ u ta ̣o các hơ ̣p chấ t đã phân lâ ̣p đươ ̣c từ chi Dicliptera
Tên

STT

1

Octasulphur

2

Secoisolariciresinol

Công thức cấ u ta ̣o

O

dimethyl lether diacetate

OH
OH

HO

O
OH

3

5-methoxy-4,4’-di-O-

O

methyl

O

secoisolariciresimol

H
OH
OH
H

H 3C

O

O

CH3

O
CH3

4

H3C

Chinensis naphthol

O

O
O

methyl ester

O
O

O
O
H3C

5

H3C

Loliolide

CH3

CH3
O

HO

6

Beta-sitosterol 3-O-betaD-glucopyranoside

7

O
CH3


1.3.

Tác dụng dược lý của Lá diễn

1.3.1. Tác dụng được chứng minh khoa học
1.3.1.1. Tác du ̣ng gây đô ̣c tế bào
Trong họ Acanthanceae có 20 loài sau khi được chiế t xuấ t bằ ng CH2Cl2
và MeOH đã phát hiê ̣n thấy các dịch chiết có tác du ̣ng gây đô ̣c tế bào, chố ng
số t rét, chố ng oxi hóa và loa ̣i bỏ các gố c tự do.
Trong 20 loài thực vâ ̣t đó thì có 9 loài cây bao gồ m: Dicliptera burmanni,
Hygrophila ringens, Justicia balansae, J. procumbens, L. incurve, Peristrophe
lanceolaria, P.dorsiflora, Strobilanthes corrugate và S. maxwellii đươ ̣c chiế t
bởi CH2Cl2 cho ra dich
̣ chiế t có khả năng gây đô ̣c tế bào với IC (50) trong
khoảng nồ ng đô ̣ 3,5 – 46,0 µg/ml [17].
1.3.1.2. Tác dụng trên gan
Cây gan heo có nhiề u tác du ̣ng dươ ̣c lý khác nhau nhưng các nghiên cứu
chủ yế u tâ ̣p trung vào tác du ̣ng trên gan.
 Tác dụng ngăn cản sự phát triển của bệnh xơ gan:
Các polysaccharid của Dicliptera chinensis tác dụng vào TGF-β / Smad
và ức chế hoạt động của tế bào hình sao ở chuột đã bị làm xơ gan bởi
dimethylnitrosamine. Nghiên cứu này nhằm nghiên cứu tác động của Dicliptera
chinensis polysaccharide (DCP) trên bệnh xơ gan (HF) và sự hoạt động các tế
bào hình sao gan (HSC). Trong kết luận, nghiên cứu này cho thấy rằng DCP
làm suy giảm sự tiến triển của bệnh xơ gan thông qua ức chế TGF-β / Smad.

DCP là một polysaccharide thực vật tiềm năng cho bệnh xơ gan [28].
Các phân đoạn n-butanol và nước có thể ngăn chặn sự gia tăng của ALT,
AST và MDA (P < 0.01; P < 0.05), và tăng SOD ở chuột được gây tổn thương
gan bởi CCl4 chiết xuất từ dịch chiết EtOH của Dicliptera chinensis [27].
 Tác dụng bảo vệ gan của Lá diễn:
Chuột thí nghiệm dược chẩn đoán xơ gan sau khi tiêm DMN. Sau đó,
chuột được điều trị bằng DCP và phân tích các chỉ số sinh học, nhận thấy: Sự
thay đổi các chỉ số enzym huyết thanh ALT, AST, ALB, TBIL có giá trị lâm
sàng trong chẩn đoán chức năng gan. Sự ức chế chuyển hóa collagenic như là
8


một biện pháp đối phó hiệu quả để điều trị xơ gan.
Kết quả của nghiên cứu cho thấy DCP có thể làm giảm độc tính của
DMN, giảm hàm lượng collagen, cải thiện chức năng tế bào gan và ức chế hình
thành viêm [26].
 Tác dụng chống lại tổn thương gan:
Các DCP có tác dụng làm giảm tổn thương gan ở chuột khi cho chuột sử
dụng thuốc chống lao isoniazid và rifampicin.
Chuột bị tổn thương gan trước và sau khi điều trị với DCP đã được lấy
mẫu máu và gan để xét nghiệm các chỉ số ALT, AST, AKP, NO, TNF-α, IL-6,
xét nghiệm miễn dịch ELISA. Kết quả cho thấy bệnh lý trên gan ở chuột đã
được cải thiện, số lượng các tế bào viêm đã giảm, các chỉ số xét nghiệm đều
giảm nên có thể kết luận rằng DCP có hiệu quả điều trị trên gan bị tổn thương
gây ra bơi thuốc kháng lao và có cơ chế liên quan tới tác dụng kháng viêm của
nó [19].
1.3.1.3. Tác dụng chống OXH
Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Ahmad cùng cộng sự đã nghiên cứu
dịch chiết các thành phần trên mặt đất của Dicliptera roxburghiana (DR) trong
MeOH, n-hexane, chloroform, EtOAc, n-butanol để đánh giá khả năng chống

OXH của chúng.
Kết quả cho thấy: các dịch chiết có khả năng chống OXH là: dịch chiết
từ MeOH, chloroform, EtOAc, n-butanol. Còn lại, dịch chiết n-hexan không có
khả năng chống OXH [14].
1.3.1.4. Ảnh hưởng tới thông số chuyển hóa trên chuột cái
 Ảnh hưởng tới thông số sinh lý, sinh hóa trên chuột cái chưa trưởng
thành.
Dân gian đã sử dụng dịch chiết của hỗn hợp lá có tên khoa học là Aloe
buettneri, Justicia insularis, Macranthus hibiscus và Dicliptera verticillata để
điều chỉnh chu kì kinh nguyệt, đau bụng kinh và vô sinh ở phụ nữ. Theo đó,
năm 1998 nhóm tác giả Telefo PB, Moundipa PF, Tchana AN, Tchouanguep
Dzickotze C, Mbiapo FT đã nghiên cứu tác dụng dịch chiết của hỗn hợp lá này
trên chuột cái chưa trưởng thành bằng đường uống.

9


Kết quả cho thấy: nồng độ protein buồng trứng, tử cung, nồng độ
estradiol huyết thanh đều tăng cao khi sử dụng liều 49-94 mg/ngày. Trong khi
đó, nồng độ cholesterol buồng trứng lại giảm.
Dựa vào kết quả trên, rất có thể trong hỗn hợp dịch chiết chứa oestrogen
[23].
 Hỗn hợp dịch chiết của Dicliptera verticillata làm thay đổi nồng độ
estradiol (hormone nữ) và ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa gan trên chuột
cái chưa trưởng thành:
Năm 2002, nhóm tác giả gồm Telefo PB, Moundipa PF, Tchouanguep
FM nghiên cứu tác dụng của hỗn hợp dịch chiết từ lá của các loài Aloe buettneri,
Justicia insularis, Hibiscus macranthus và Dicliptera verticillata. Nhận thấy
khi cho chuột cái chưa trưởng thành uống hỗn hợp dịch chiết, ở liều 13, 49 và
94 mg/kg mỗi ngày trong 15 ngày gây ra một sự gia tăng đáng kể nồng độ

estradiol trong buồng trứng, trong huyết thanh và trọng lượng tử cung cũng
tăng. Đồng thời cũng phát hiện sự giảm hoạt động của N-demethylase
aminopyrine ở chuột điều trị [24].
1.3.2. Tác dụng cổ truyền
Tính vi:̣ Lá diễn có vi ngo
̣
̣t, nha ̣t, tính mát [2,10].
Quy kinh: Can, phế , thâ ̣n [10].
Công năng: thanh nhiê ̣t, tiêu viêm, lơ ̣i tiể u, làm mát máu, sinh tân dich
̣
[2].
Toàn cây đươ ̣c dùng làm thuố c, dùng ngoài, sắc uống, có thể làm phẩ m
nhuô ̣m màu. Lá non, ngo ̣n cây làm thực phẩ m [4,5,10-12,27].
Toàn cây dùng để chữa cảm ma ̣o, số t cao, lên sởi; viêm phổ i nhe ̣, viêm
ruô ̣t thừa cấ p, viêm gan cấ p, viêm kế t ma ̣c, viêm ruô ̣t, kiế t ly,̣ viêm khớp, giảm
niêu,
̣ đái ra dưỡng chấ p. Ngày dùng 30-60 g dươ ̣c liê ̣u là toàn cây khô hoă ̣c
dùng 60-120 g cây tươi sắ c lấ y nước uố ng [2,4].
Dùng ngoài tri lơ
̣ ̉ , sung, rôm sẩ y, mu ̣n nho ̣t; dùng lá tươi giã nát xoa hoă ̣c
đắ p. Ngoài ra nhân dân còn dùng lá nấ u canh ăn với thịt lơ ̣n, ngon như rau ngót
với tác du ̣ng mát gan [2,4,8].
10


Ở Trung Quố c, lá diễn đươ ̣c dùng để lương huyế t, chữa nhiê ̣t bê ̣nh, số t,
cảm ma ̣o, ban chân, bình can, minh mu ̣c, tri ̣tiể u tiêṇ ra máu, bí đái, ung sang
thũng đô ̣c. Nước sắ c chữa khó tiêu, số t cao. Lá tươi giã nát đắ p lên mắ t hoă ̣c
nấ u nước rửa mắ t. Ở Indonesia lá tươi đươ ̣c dùng để tri ̣táo bón [2].

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Nguyên vật liệu
Mẫu cây lá diễn được thu hái vào tháng 5 năm 2016 tại thị trấn Cổ Lễ
huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định. Mẫu thực vật gửi đến là mẫu tiêu bản dạng
cây tươi ( có ảnh chụp chi tiết dạng sống, hoa, lá...). Mẫu thực vật đã được Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là: Dicliptera chinensis
(L.) Nees, họ Ô rô-Acanthaceae, mẫu được lưu giữ tại Khoa Y Dược,
ĐHQGHN.
Mẫu khô: Cây Lá Diễn được rửa sạch, làm khô và thái nhỏ, bảo quản để
nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập.
2.1.2. Hóa chấ t sử du ̣ng
 Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như: nước cất, EtOH,
Cloroform, n-hexan, EtOAc, DCM… đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được
chưng cất lại trước khi dùng.
 Các dung môi phân tích gồm: MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O dùng để
phân tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích. Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là
silicagel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nicalai Tesque Inc, Nhật Bản), YMC
ODS-A (50μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản). Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm
loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S
(Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254
nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % hơ nóng để phát
hiện vết chất.
 Các thuốc thử: dragendoff, mayer, bouchardat, ninhydrin, lugol, acid

sulfuric, acid acetic, gelatin, xanh methylene, javen, muối FeCl3, bột Na2CO3,
NaOH...
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ
- Các du ̣ng cu ̣ thí nghiê ̣m thường quy: ống nghiệm, biǹ h nón, biǹ h ga ̣n,
cố c có mỏ, pipet...
- Thiết bị để nghiên cứu thực vật: kính hiển vi, lam kính, máy ảnh… dùng

12


để quan sát phân tích đặc điểm lá, thân và chụp ảnh.
- Các thiết bị khác: Tủ sấ y, tủ hút, cân phân tích, kính hiển vi.
- Sắc ký cột: sắc ký cột sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck)
và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác
nhau.
- Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap
(Agilent Technologies, Hoa Kỳ).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance
500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
- Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments,
Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật

Quan sát và mô tả hin

̀ h thái thực vâ ̣t, điều kiện sinh trưởng và phát triển
của cây: thân, lá, hoa,...


Phương pháp làm tiêu bản tạm thời để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu:
- Chọn dược liệu thích hợp.
- Dược liệu tươi gồm thân và lá đem cắt ngang, cắt bản mỏng bằng dao
cạo.
- Ngâm nước Javen 5 phút để tẩy các chất chứa trong tế bào. Sau đó rửa
bằng nước, rửa bằng acid acetic rồi rửa lại bằng nước.
- Nhuộm vi phẫu bằng xanh metylen khoảng 10 giây rồi rửa bằng nước.
- Nhuộm đỏ son phèn trong 30 phút rồi đem rửa lại bằng nước.
- Đặt vi phẫu vào 1 giọt nước trên phiến kính, đậy lá kính, soi trên kính
hiển vi.

Phương pháp làm tiêu bản cố định: Tiêu bản sau khi đã nhuộm xanh
methylene và đỏ son phèn xong, rửa lại với nước và tiếp tục được làm như sau:
- Loại nước lần lượt bằng cồn 300, 500, 700, 950 và cồn tuyệt đối.
- Lắc vi phẫu ba lần trong xylen.
- Đặt vi phẫu vào một giọt bôm Canada trên phiến kính, đậy lá kính, để chỗ
13


thoáng 3 tuần.

Giám đinh
̣ tên khoa ho ̣c của mẫu nghiên cứu: Đối chiếu với mô tả trong
tài liệu chuyên sâu về thực vật như:
- Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [2].
- Từ điể n thực vâ ̣t thông du ̣ng, tâ ̣p I [4].

- Cây cỏ Việt Nam, tâ ̣p III [8].
- Cây thuố c và đô ̣ng vâ ̣t làm thuố c ở Viê ̣t Nam, tâ ̣p III [3].
2.2.2. Nghiên cứu về hóa ho ̣c
2.2.2.1. Định tính bằng phương pháp hóa học
Chiết xuất lấy dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau
(nước, EtOH, ether) để định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học [7].
- Định tính saponin bằng phản ứng tạo bọt.
- Định tính alcaloid bằng các thuốc thử Mayer, Dragendorff và thuốc thử
Bouchardat.
- Định tính anthranoid bằng Phản ứng Borntrager.
- Định tính glycosid tim bằng các phản ứng Liebermann- Burchardt, Phản
ứng Legal Phản ứng Baljet và Phản ứng Keller kiliani.
- Chiết xuất dịch chiết EtOH để định tính flavonoid và coumarin. Định
tính flavonoid với các phản ứng Cyanidin, phản ứng với NH3, NaOH và phản
ứng với FeCl3. Định tính coumarin bằng phản ứng đóng mở vòng lacton.
- Chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu
cơ, acid amin, đường khử. Định tính tannin bằng các phản ứng với FeCl3 5%,
gelatin 1% và chì acetat 10%. Định tính acid hữu cơ bằng phản ứng với Na2CO3. Định tính acid amin bằng phản ứng với thuốc thử Ninhydrin. Định tính
đường khử bằng phản ứng với thuốc thử Fehling.
- Chiết xuất dịch chiết hexan để làm các phản ứng định tính, chất béo,
carotene.
2.2.2.1. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Định tính các nhóm chất bằng phương pháp TLC: Tiến hành thăm dò
trên các hệ dung môi để chọn ra các hệ cho kết quả tách tốt nhất.
- Mẫu nghiên cứu: Lá cây Lá diễn thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam
Định vào tháng 5/2016.
14


- Dịch chấm sắc ký: chuẩn bị dịch chiết toàn phần (ngâm dược liệu trong

EtOH rồi cô quay chân không lấy cao, thu được dịch chiết tổng). Hòa tan dịch
chiết tổng vào EtOH, sau đó lọc, thu được dịch chấm sắc ký.
- Điều kiện sắc ký:
 Pha tĩnh Bản mỏng TLC Siliga gel GF254 (Merck), kích thước 3×10 cm,
hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
 Pha động: khảo sát các hệ dung môi sau:
 Hệ 1: n-hexan : axeton (25:1)
 Hệ 2 : n-hexan: aceton (12,5:1)
 Hệ 3: Cloroform- Methanol (19:1)
 Hệ 4: Cloroform- Methanol- Nước (6,5:3,5:1)
 Hệ 5: Ethylacetat- Methanol- Nước (10:1,7:1,3)
 Hệ 6: Ethylacetat- Methanol- Nước (10:2:5)
 Chấm mẫu:
 Thể tích chấm: 5µ.
 Các vết chấm dài 8mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10mm, cách cạnh
bên 15mm.
 Triển khai: Bão hòa cốc đựng dung môi triển khai trong 30 phút bằng
10ml dung môi pha động. Đặt cốc ở nơi kín gió và đậy kín. Sau khi khai triển
xong, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi trong tủ hút.
 Phát hiện: bằng cách quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và
366nm. Chụp lại sắc ký đồ bằng máy chụp Camag TLC Visualier.
2.2.2.2. Chiết xuất và phân lập
- Chiết xuất:
Mẫu lá cây lá diễn được phơi khô, nghiền thành bột (6,5 kg), sau đó chiết
trong EtOH (3×8 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (50oC,3 h). Dịch chiết được
lọc qua giấy lọc, gộp dịch chiết lại và cất loại dung môi ở áp suất giảm thu được
630,0 g cặn chiết ethanol. Lấy 120 g cặn chiết này phân tán vào 1,2 lít nước cất
và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexan và EtOAc (mỗi loại 3×1,5 lít).
Các dịch chiết n- hexan, ethylacetat được cất thu hồi dung môi thu được các
cặn dịch tương ứng n- hexan (H, 31,0 g) và (E, 56,0 g) và lớp nước (N, 33,0 g)

15


( Sơ đồ chiết xuất hình 2.1).
- Phân lập
Cao n-hexan (30,0 g) được phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ
silicagel, sử dụng hệ dung môi n-hexan: axeton (25/1). Hứng dịch rửa giải vào
các ống nghiệm và kiểm tra bằng TLC, gộp các ống nghiệm giống nhau lại và
bay hơi dung môi thu được 3 phân đoạn H1 (9,4 g), H2 (8,6 g), H3 (6,5 g). Tiến
hành sắc ký cột cao phân đoạn H2 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa
giải n-hexan: ethylacetat (10/1, 5/1, 2,5/1), thu được 3 phân đoạn nhỏ H2.1 (2,3
g), H2.2 (2,5 g), H2.3 (3,0 g). Phân đoạn H2.1 phân tách trên cột silicagel pha
thường với hệ dung môi rửa giải diclometan : metanol (10/1) thu được hợp chất
HDl –CDCl3 –H1 (55 mg). Phân đoạn H2.2 phân tách trên cột silicagel pha
thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan: ethylacetat (2/1) thu được chất sạch
HDl –CDCl3 –Cl3CPD (62 mg) (Hình 2.2).

16


Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất dược liệu.

17