Nghiên cứu phân lập và định lƣợng cryptotanshinon từ cây đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge ) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan sâm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG
CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza
Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG
DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG
CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza
Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG

DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa : QH.2012.Y
Ngƣời hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS
Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y
Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dìu dắt em
trong quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Nhờ có sự chỉ bảo của thầy mà
em đã trưởng thành và cố gắng học hỏi thêm nhiều để hoàn thành được khóa luận tốt
nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong
Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED)- Đề tài mã số 106-YS.05-2015.05 đã tài trợ cho em trong quá trình làm
thực nghiệm đề tài.
Cảm ơn những thành viên của lớp K57 Dược học đặc biệt là các bạn Bích, Huệ,
Hào - những người đã đồng hành cùng mình trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người đã luôn
giúp đỡ, động viên, chia sẻ với con, giúp con có thêm động lực cố gắng mỗi ngày.
Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2017

Đặng Thị Ngần


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

ESI-MS

Carbon (13) Nuclear magnetic resonance
Khối phổ - ion hóa phun mù electron
(Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry)

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

1

Proton nuclear magnetic resonance

H-NMR

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared spectrum)

MeOH

Methanol

Mp

Điểm nóng chảy

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SKĐ

Sắc ký đồ

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc một số abietane diterpenoid

3

Hình 1.2

Cấu trúc một số acid phenolic

4

Hình 1.3

Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L.

5

Hình 1.4

Cấu trúc cryptotanshinon

8

Hình 1.5

Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

15

Hình 2.1

Một số hình ảnh cây đan sâm thu hái tại vườn dược liệu Sa Pa

19

Hình 3.1

Cấu trúc cryptotanshinon

29

Hình 3.2

Sắc ký đồ TLC của cryptotanshinon tinh chế được

30

Hình 3.3

Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng

31

Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic
cryptotanshinon

35


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Bảng

Trang

Bảng 3.1 Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập được

28

Bảng 3.2 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế được

29

Bảng 3.3 Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế được

31

Bảng 3.4 Chương trình sắc ký HPLC

32

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng
cryptotanshinon tinh chế được

33

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

34

Bảng 3.7 Kết quả phân tích độ lặp lại của phương pháp

36

Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ đúng của phương pháp

37

Bảng 3.9 Kết quả phân tích định lượng cryptotanshinon trong đan sâm ở Sa Pa

37

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………………….........2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM ........................................................................................... 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................................ 2
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đan sâm .................................................................... 2
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm ....................................................................... 5
1.1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền ........................................................ 6
1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON .................................................................... 8
1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU .......................... 9

1.3.1. Phương pháp sắc ký ............................................................................................... 9
1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)............................................. 12
1.3.3. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ................................................................ 13
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................... 14
1.3.5. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy .................................................................... 18
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................. 19
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................................. 19

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ....................................................................................... 19
2.1.2. Dung môi, hóa chất .............................................................................................. 19
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ......................................................... 20
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 20

2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học ........................................................................... 20
2.2.2. Xây dựng phương pháp HPLC ............................................................................. 21
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 22
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................ 24

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................................................. 24


3.1.1. Chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm ............................................. 24
3.1.2. Xác định cấu trúc của cryptotanshinon ................................................................ 27
3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất ........................................................ 29
3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ................................................. 31
3.1.5. Sử dụng phương pháp phân tích HPLC đã khảo sát vào phân tích định tính, định
lượng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai ................................................................ 37
3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................................... 38

3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc cryptotanshinon .................................................... 38
3.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích định lượng cryptotanshinon ........................... 38
3.2.3. Phân tích cryptotanshinon trong mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Lào Cai .... 39
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge. (họ Lamiaceae), là một
cây thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc hiện nay được trồng nhiều và sinh trưởng tốt ở
vùng Tây Bắc nước ta. Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô
hoặc sấy khô của cây đan sâm, thường được dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không
đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, mất ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc,
Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm là thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ở
ngực và bụng, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ
[7,14,20]. Nghiên cứu y học hiện đại cho thấy đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm
giãn mạch và tăng lưu lượng động mạch vành, cải thiện vi tuần hoàn, phòng chống tích
cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành mảng xơ vữa động mạch [1].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng dụng
dược liệu quý này. Các kết quả nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy đan sâm có các
thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester,
trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA và tanshinon I… Trong đó,
cryptotanshinon (1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl- (R) -phenanthro (1,2-b) furan10,11-dion) là một trong các thành phần tanshinon chính của đan sâm [25].
Cryptotanshinon màu nâu, không hòa tan trong nước nhưng tan trong một số dung môi
hữu cơ; có nhiều hoạt tính sinh học và dược lý như kháng khuẩn, chống oxy hóa,
chống viêm, chống ung thư,... [3].
Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đan sâm đã được công bố trong nước và quốc
tế, với mục tiêu xây dựng cơ sở khoa học về thành phần hoạt chất dược liệu đan sâm,
đề tài “Nghiên cứu phân lập và định lƣợng cryptotanshinon từ cây đan sâm
(Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan
sâm” được tiến hành với mục tiêu chiết xuất, phân lập và phân tích cryptotanshinon
trong dược liệu đan sâm bao gồm các nội dung nghiên cứu như sau:
-

Chiết xuất, phân lập và xác minh cấu trúc cryptotanshinon từ rễ đan sâm thu hái ở
Lào Cai.
Xây dựng và thẩm định được phương pháp phân tích cryptotanshinon sử dụng
HPLC.

1


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) thuộc chi Salvia, họ Bạc hà
(Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm; cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80
cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính

0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu. Thân vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối 3-5 lá chét,
đặc biệt có thể có 7 lá. Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài,
cuống lá chét ngắn có dìa. Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng
cưa tù. Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh
tro, cũng có lông nhưng dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi
nhỏ. Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa
mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2
môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa
tròn. Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5
mm [1,14].
Salvia miltiorrhiza Bunge. được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó
cũng có mặt tại Nhật Bản [33]. Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc thích
hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [1,6]. Cây trồng ở trại thuốc Sa
Pa (Viện Dược liệu) thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Cây sinh
trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc
Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng kém hơn. Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để
đến tháng 11-12 thu hoạch [1]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9
[14]. Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đan sâm
Thành phần hóa học chính trong cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) là
acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt đất
của loài này có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và
lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [31].

2


Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của đan sâm đã được chia thành hai
nhóm là tanshinon tan trong lipid và acid phenolic tan trong nước. Đến nay, hơn 20
acid phenolic phân lập từ rễ cây đan sâm đã được nghiên cứu. Các chất có hoạt tính

thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon,
và vv. Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và sinh tổng hợp [36].
a. Diterpenoid
Các hợp chất diterpenoid là các chất tan trong nước và có hơn 30 loại
diterpenquinon. Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon
như tanshinon I, II, III, sau đó đến isotanshinon I, II, isocryptotanshinon và
cryptotanshinon. Tỉ lệ các tanshinon quinon là tanshinon I từ 0,12-0,32%, tanshinon
IIA từ 0,02-0,32%, methylen tanshinquinon là 0,05-0,15% [26] (hình 1.1).

19

R = R1 = H, Δ5(10),6(7),15(16)

20

R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

21

R = R1 = OH, Δ15(16)

25

R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

22

23 Δ15(16)
24

19-21.Tanshinon I, II, III

24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II

25. Cryptotanshinon

Hình 1.1. Cấu trúc một số abietane diterpenoid
b. Các dẫn xuất của acid phenolic
Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của
rễ cây đan sâm. Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid
salvianolic từ A- K [30].

3


Hình 1.2. Cấu trúc một số acid phenolic
Acid caffeic đóng vai trò trung tâm trong tác dụng sinh hóa của họ Lamiaceae,
trong đó dạng dimer là quan trọng nhất như acid rosmarinic.
c. Flavonoid
Flavonoid là thành phần có mặt trong bộ phận trên mặt đất của cây đan sâm như
hoa và lá. Gồm flavon, flavonol và các dẫn xuất của chúng [30].
- Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’- trihydroxyflavon) và
luteolin (5,7,3’, 4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6- hydroxylate của chúng.
- Flavon và flavonol glycoside trong đó có các flavon 7-glycoside như apigenin 7glucoside (cosmosiin), luteolin 7-glucoside (cinaroside) và các 7-glucuronide tương
ứng của chúng.

4

- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong các
hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L.
d. Một số thành phần khác
Ngoài ra còn có các thành phần khác như: triterpenoid, β- sitosterol, tanin,
vitamin E, polysaccarid [27].

R

R1

R2 R3 R4

1 R=H, R1=R2=Me, R3=H

3 OH OH H Me Me

2 R=R1=H, R2=R3=Me

5 OH H

4

H Me Me

1.Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol 5.Germanicol
Hình 1.3. Cấu trúc một số triterpen oid có trong chi Salvia L.
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia miltiorrhiza
Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:

- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác dụng này
do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B,
militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác dụng chống đau
thắt ngực [12,26,35].
- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [34].
- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [11,
28].
- Tác dụng an thần do thành phần miltiron, do đó được sử dụng điều trị chứng mất ngủ
[5,28].

5


- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn Staphylococus kháng
thuốc. Các thành phần như dihydrotanshinon I, hydroxytanshinon II-A, tanshinon II-B,
cryptotanshinon và methyl tanshinat được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn
Staphylococus aureus [1,33,39].
- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mày
đay [26].
- Hoạt tính chống viêm do thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ miễn dịch[20].
- Hoạt tính chống oxy hóa mạnh gây bởi dihydrotanshinon I [26], acid salvinolic A, B,
acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [27].
- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [26].
- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [29,31].
- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do
bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các
huyết quản nhỏ [23].
- Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục, làm tăng nhẹ
estrogen và androgen trên chuột [29].
1.1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: vị đắng, tính hàn.
- Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can.
- Tác dụng và công dụng:
+ Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng kinh,
bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn thương mà cơ
gân sưng tấy đau đớn [6].
+ Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh;
dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [6,14].
Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt
[30].

6


+ Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt
nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất bổ huyết thì
dùng đan sâm dạng không qua chế biến.
+ Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp
trùng đều có hiệu quả [4,6].
+ Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [6].
+ Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [14,30].
+ Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính,
tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [34].
- Liều dùng: 8- 20 g [6].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [23].

7


1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON

Cryptotanshinon còn được gọi là cryptotanshinone hoặc tanshinon C, là một
diterpene quinon có nguồn gốc từ rễ của cây Salvia miltiorrhiza Bunge.,
O
12

O

17
13

11
14

O

7
6

hinone IIA (1)

2

14
8

3

2

14

8

4

O

7

5

6

6
18

18

Tanshinone I (2)

15

9

10

3

7

5

4

O

13

16

1

9

10

17

11

16

1

9

12

O

15

13

11

16
8

12

O

15

O

17

19

Cryptotanshinone (3)

Hình 1.4. Cấu trúc cryptotanshinon

+ Tên IUPAC: 1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl-(R)-phenanthro(1,2-b)furan10,11-dione.
+ Công thức phân tử: C19H20O3.
+ Khối lượng phân tử: 296,36 g/mol.
+ Màu sắc: bột màu cam nâu.
+ Điểm nóng chảy: 183°C.
+ Độ tan: cryptotanshinon không hòa tan trong nước, nhưng tan trong dimethyl

sulfoxide, methanol, ethanol, cloroform và ether, và chuyển sang màu đỏ khi tương tác
với acid sulfuric đậm đặc. Cryptotanshinon thuộc dẫn xuất phenanthraquinon, khi tiếp
xúc với ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng quang hóa. Ngoài ra, độ hòa tan của
cryptotanshinon thay đổi chút ít giữa pH từ 2 đến pH 8.
+ Độ ổn định : cryptotanshinon cần được bảo vệ tránh ánh sáng và dưới điều kiện khô
mát (2- 8°C).
Cryptotanshinon đã được tổng hợp bởi Hiroshi Kakisawa và Yoshinobu Inouye,
hai nhà hóa học Nhật Bản, vào năm 1969. Tổng hợp các cryptotanshinon mất nhiều
bước, liên quan đến phản ứng của sản phẩm cộng Diels-Alder giữa 3
methylbenzofuran-4,7-quinon và 6,6-dimethyl-1-vinylcyclohexene trong ethanol ở

8


nhiệt độ phòng, tiếp theo là quá trình oxy hóa không khí và thêm với acid sulfuric đậm
đặc trong ethanol, xúc tác bởi 5% Pd-C (Palladium trên carbon) [25].
+ Tác dụng sinh học: cryptotanshinon được phân lập từ rễ của cây đan sâm, có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh, chống dermatophytic, chất chống oxy hóa, chống viêm và
chống ung thư, hoạt động của cryptotanshinon cũng có thể ức chế các tế bào sản xuất
endothelia endothelin-1 và tạo ra sự khác biệt của một số tế bào như các tế bào gốc
trung mô tủy xương [3].
1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU
1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký
Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương
pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ silica gel pha thường, pha đảo. Sắc ký lớp mỏng
được dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và kiểm tra độ tinh khiết
của các chất phân lập. Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong
nghiên cứu [31].
a. Sắc ký cột
Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt

có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần
phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp
mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi
giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn
ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so
với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các
dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn. ¾ Các
bước thực hiện sắc ký cột gồm:
- Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực
được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Với 2 phân tử không
phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân
tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các
phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân
cực.

9


- Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp
với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10
cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A). Mỗi bản
mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng
đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp.
Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một
dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa (etyl acetat).
- Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho
dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng
khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào
thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ
khoá ở bên dưới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becker trống để bên dưới cột,

dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua
chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất.
- Nạp mẫu: mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng rắn thì hoà
tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký.
- Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy
tinh. Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp
mỏng [3,9,21,24].
b. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Nguyên tắc
Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động
và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion) trên pha tĩnh,
pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Dựa vào hệ số phân
bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành
phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi
hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất
phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun
thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer (một thiết bị

10


đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích). Tuỳ
thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp
trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
- Các đại lượng đặc trưng
+ Hệ số lưu giữ Rf
Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân
tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R

f

=

d
d

(1)

R
M

Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)
Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1
+ Hệ số lưu giữ tương đối Rr:

R=
r

Trong đó:

d
d

R,x

(2)

R,c

dR,x : là đường đi của chất phân tích (cm)
dR,c : là đường đi của chất chuẩn (cm)

(Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)
- Ứng dụng
+ Định tính
Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều
kiện. Đôi khi do sắc ký không liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động,
người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rr để đặc trưng cho chất phân tích.

11


+ Thử tinh khiết
Dùng TLC để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên
sắc ký đồ
+ Định lượng: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:
Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi
làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp như phổ
hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ... Phương pháp này hiện nay ít dùng vì có nhiều trở
ngại lại mất nhiều thời gian.
Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng, đo diện tích hay cường độ màu của vết
sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:
Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ huỳnh quang.
Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh,

nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử
lý dữ liệu bằng máy tính [3,9,21,22].
1.3.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi hay đổi từ
trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng
từ hạt nhân.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có
khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín
hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là những số
chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng
hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh
proton đó.

12


b. Các đại lƣợng đặc trƣng
- Độ chuyển dịch hoá học
Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn
được gọi là độ chuyển dịch hoá học ()
δ  ppm  =

 ν mau -ν TMS 
ν may

×10 6

(3)

Trong đó:

mau

: là độ dịch chuyển hoá học
: tần số của mẫu phân tích

TMS

:

may

: là tần số làm việc của máy

là tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane

- Hằng số tương tác spin
Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng
cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào tương
quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.
- Diện tích dưới tín hiệu
Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường cong
tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu.
- Ứng dụng của phổ NMR
Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diện tích
dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các loại
phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [2,3,22].
1.3.3. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
a. Nguyên tắc

Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân tử
hữu cơ ở môi trường chân không cao (10-3 - 10-6 mmHg). Trong quá trình đó, chất hữu
cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá,
13


được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương
ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập
hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
b. Ứng dụng của MS
- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện
tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử
khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố
trong mẫu.
- Định tính
+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+,
(M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét
thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của các mảnh ion
có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích.
+ Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu
với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.
- Xác định công thức cấu tạo: Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần
dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để
làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR và
phổ IR.
- Định lượng: Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách
thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác
định nồng độ [2,3,22].
1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
a. Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn
hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất
mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.

14


b. Một số thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký

Hình 1.5. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trƣng
-Thời gian lưu :
tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký
đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký
tR’(Thời gian lưu thực):

tR’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi
tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
W : là chiều rộng đáy pic.
W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.
- Hệ số dung lượng k’:
Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

k'=

t 'R t R -t 0 t R

=
= -1
t0
t0
t0

(4)

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ
lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân
bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm

15


giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian
lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất.
- Hệ số chọn lọc :
' t R,B-t 0
α= k B =
k 'A t R,A -t 0

(k’B  k’A)

(5)

 khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường chọn
 nằm trong khoảng 1,05 đến 2.
- Hiệu lực cột:
Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều

cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân
bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả định như
một pha tĩnh có chiều cao H.

t 
N=16
 W 

2

R

hay

 t 
N=5,54

W 

R

(6)
2

(7)

1/2

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng:
H=

L
N

(8)

- Hệ số bất đối AF (tailing factor):
AF =

W1/20
2a

(9)

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

16


a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước
tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2.
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối.
- Độ phân giải (resolution)
Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện
sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

R S=

2  t R,B-t R,A  1,18  t R,B-t R,A 
N  α-1   k 'B 
(10)
=
=


4  α   1+k 'B 
W B+ W A
W1/2B+ W1/2A

Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen
phủ nhau ~ 0,3 %.
Rs = 1,0 : Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%
RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau
c. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC
- Định tính
Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng
phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.
- Xác định tạp chất
Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian
lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
- Định lượng
Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic
của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:
+ Phương pháp chuẩn ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai
mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so
sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết
nồng độ sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử.

17