Nghiên cứu thành phần hóa học trong rễ cây phong quỳ sapa (anemone chapaensis gagnep )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

HOÀNG VĂN HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC TRONG RỄ CÂY
PHONG QUỲ SAPA
(Anemone chapaensis Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

HOÀNG VĂN HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC TRONG RỄ CÂY
PHONG QUỲ SAPA
(Anemone chapaensis Gagnep.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa : QH.2012.Y
Người hướng dẫn
1. ThS. HÀ THỊ THANH HƯƠNG
2. PGS.TS. PHƯƠNG THIỆN THƯƠNG

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Hà Thị Thanh Hương, Giảng viên Bộ môn Dược
liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; PGS.TS. Phương
Thiện Thương - Trưởng Khoa Hoá Phân Tích -Tiêu Chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế
đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn thầy TS.Vũ Đức Lợi đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo
em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin đặc biệt cảm ơn anh ThS.Nguyễn Ngọc Hiếu đã giúp đỡ và hướng dẫn
em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị trong khoa Hóa phân tích –
Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc
gia Hà Nội đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận, cũng như
đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường.
Cảm ơn bạn Phạm Giang Nam đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian
làm thực nghiệm tại Viện Dược Liệu.
Xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan
tâm và tạo điều kiện giúp em có thể hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Hoàng Văn Hùng

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
BuOH

n-Buthanol

13

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

C-NMR

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ESI-MS

Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

Ethyl acetate

GF254

Gypsum fluorescent 254nm

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

MeOH

Metanol

MS

Mass Spectroscopy

RP18

Reverse Phase C-18

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

s

singlet

d

doublet

dd

double doublet

brs

broadsinglet

m

multiplet


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết
ethanol rễ Phong quỳ Sa Pa

16

2

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 2
hợp chất PQRB 2 và PQRB 3

28-29


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT

Tên hình vẽ

Trang

1

Hình 1.1: Một số Flavonoid

3

2

Hình 1.2: Một số saponin tách ra từ Anemone amurensis (Korsh.) Kom

4

3

Hình 1.3: Một số saponin tách ra từ Anemone anhuiensis Y. K. YANG,

4

N. WANG et W. C. YE
4

Hình 1.4: Một số saponin tách ra từ Anemone begoniifolia H.Lév. & Vaniot

5

5

Hình 1.5: Một số saponin tách ra từ Anemone coronaria L.

5

6

Hình 1.6: Một số saponin tách ra từ Anemone hupehensis LEM. var. japonica
(THUNB.) BOWLES et STEARN

6

7

Hình 1.7: Một số saponin tách ra từ Anemone raddeana Regel

6

8

Hình 1.8: Một số saponin tách ra từ Anemone rivularis var. flore-

7

minore Maxim
9

Hình 1.9: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.)
C.Pei

7

10

Hình 1.10: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.)
C.Pei

8

11

Hình 1.11: Tiêu bản thực vật Anemone chapaensis Gagnep.

9

12

Hình 1.12: Ảnh chụp rễ Phong Quỳ Sapa (Anemone chapaensis
Gagnep.)

10

13

Hình 1.13: Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep.

10

14

Hình 2.1: Sơ đồ quá trình chiết xuất Rễ Phong quỳ Sapa

13

15

Hình 3.1 : Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ
cây Phong quỳ Sapa

17

16

Hình 3.2: 7 tín hiệu methyl mũi đơn

18

17

Hình 3.3: Tín hiệu CH3 trên phổ DEPT

18

18

Hình 3.4: Phổ 13C-NMR : Tín hiệu olefin và cacboxylic

19

19

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR : 3 protons anomer hợp chất PQRB 2

20

20

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR : 3 proton anomer hợp chất PQRB 2

20


21

Hình 3.7: Các tương tác trên phổ HMBC hợp chất PQRB 2

21

22

Hình 3.8: Cấu trúc hóa học hợp chất PQRB 2 (Huzhangoside A)

22

23

Hình 3.9: 7 tín hiệu methyl mũi đơn

23

24

Hình 3.10: Phổ DEPT : Tín hiệu CH3

23

25

Hình 3.11: Phổ 13C-NMR : Tín hiệu olefin và cacboxylic

24

26

Hình 3.12: Cấu trúc khung oleanan

25

27

Hình 3.13: Phổ 1H-NMR: 6 proton anomers hợp chất PQRB 3

25

28

Hình 3.14: Phổ HMBC hợp chất PQRB 3

26

29

Hình 3.15: Cấu trúc hóa học hợp chất PQRB 3 (Huzhangoside C)

27


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG .....................................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ...............................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1.TỔNG QUAN VỀ CHI Anemone ............................................................................................. 2
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis Gagnep.) ................ 9

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 11

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 11
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................................. 11
2.2.1. Hóa chất và dung môi .......................................................................................................... 11
2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ ................................................................................................. 11
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 12
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất ................................................................................ 12
2.3.2. Phương pháp phân lập......................................................................................................... 14
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học ............................................................................ 14

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 15
3.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn .................................................................. 15
3.1.1. Lấy mẫu và xác định độ ẩm ................................................................................................ 15
3.1.2. Chiết xuất .............................................................................................................................. 15
3.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây Phong quỳ Sapa ......... 16
3.2.1. Phân lập một số hợp chất trong rễ cây Phong quỳ Sa Pa ................................................. 16
3.2.2. Nhận dạng các chất phân lập .............................................................................................. 18

CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN ................................................................................................ 30
4.1. Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ phần rễ Phong quỳ Sa Pa .......................... 30
4.2. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất .................................................................... 30
KẾT LUẬN ..................................................................................................................................... 31
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................................... 31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh năm nên Việt Nam
có hệ sinh thái vô cùng phong phú và đa dạng; đi cùng với đó là tiềm năng to lớn về
tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung và tài nguyên cây
thuốc nói riêng..
Hiện nay một lượng lớn các hợp chất thiên nhiên được sàng lọc và phân lập từ

động thực vật, chúng đã được chứng minh giá trị đối với khả năng chữa bệnh cho
người, hoặc trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm ... Trải qua hàng nghìn năm,
kinh nghiệm sử dụng cây cỏ trong chữa bệnh dân gian, các bài thuốc cổ phương, chân
truyền ... đã được cha ông ta đúc kết và truyền lại; đó là nguồn kiến thức quý báu mà
chúng ta cần đầu tư nghiên cứu và ứng dụng; đây là xu hướng và là mối quan tâm
hàng đầu của các nhà nghiên cứu dược phẩm, thực vật học hiện nay.
Ở độ cao 1500-1800m, đèo Hoàng Liên thuộc Ô Qui Hồ huyện Sapa tỉnh Lào
Cai quanh năm mây mù và độ ẩm rất lớn; nơi đây có một loài thực vật được nhà thực
vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên năm 1929 [11] mang tên gọi Phong quỳ Sapa
(Anemone chapaensis Gagnep.). Kinh nghiệm dân gian địa phương cho thấy rễ cây
Phong quỳ Sapa được người dân sử dụng để chữa các bệnh viêm họng, viêm túi mật,
đau dạ dày, đau răng, phong thấp , xương khớp đau nhức... Mặc dù được đánh giá là
có nhiều tiềm năng khai thác cho mục đích chữa bệnh , nhưng cho đến nay mới chỉ
có một số rất ít nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tác dụng sinh học và thành phần hóa
học phần trên mặt đất của cây Phong quỳ Sapa .
Với mục đích tìm hiểu về thành phần hóa học của rễ cây Phong quỳ Sa Pa,
một cây đặc hữu của địa phương, để góp phần vào việc khai thác bảo tồn và phát triển
loài này, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC TRONG RỄ CÂY PHONG QUỲ SAPA (Anemone chapaensis Gagnep.)”
với mục tiêu: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 1-2 chất trong
rễ cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.).

1


CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CHI Anemone

1.1.1. Thực vật học
- Vị trí phân loại
Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên
(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
[2], [3]
- Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống nhiều năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi. Lá
mọc so le, bị chia cắt sâu nhiều hay ít. Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có một
bao chung gồm 3 lá chét. Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5-10 phiến;
tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy. Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp thành
đầu. [3]
- Phân bố
Phân bố chủ yếu ở miền bắc Ấn Độ, Nepal, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản,
Bắc Mỹ… [13,30]; chi Anemone có khoảng 120-150 loài [4,27,11], trong đó đã phát
hiện ở Trung Quốc khoảng 50 loài.
Chi Anemone hay Phong quỳ ở Việt Nam, xuất hiện nhiều ở các tỉnh vùng núi
phía Bắc như: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang và vùng núi cao miền trung [1], [2], [3].
Việt Nam có 05 loài là A. japonica, A. rivularis, A. chapaensis, A. polilanei, A.
sumatrana, trong đó có 02 loài được nghiên cứu nhiều là A. japonica và A. rivularis
[11], [2], [13], [5].
1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chính trong các loài thuộc chi Anemone là saponin và
flavonoid trong rễ và lá của các loài như Anemone tomentosa, Anemone rivularis,
Anemone altaica, Anemone amurensis, Anemone anhuiensis, Anemone begoniifolia,
Anemone coronaria, Anemone flaccida var. hofengensis, Anemone hupehensis,
Anemone raddeana, Anemone taipaiensis..[8,14,15,17,18,20-23,31-34]. Ngoài ra
trong các loài Anemone còn chứa diterpenoid glycosid, coumarin, một số acid béo
[7].

2

Sơ lược các hợp chất được tách ra từ chi Anemone
Flavonoid trong chi Anemone

Quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside

Astragalin

Hình 1.1: Một số Flavonoid

3


Saponin chính trên chi Anemone
Anemone amurensis (Korsh.) Kom, [22]

Hình 1.2: Một số saponin tách ra từ Anemone amurensis (Korsh.) Kom

Anemone anhuiensis Y. K. YANG, N. WANG et W. C. YE (Ranunculacese) [32,33]

Hình 1.3: Một số saponin tách ra từ Anemone anhuiensis Y. K. YANG, N. WANG
et W. C. YE
4


Anemone begoniifolia H.Lév. & Vaniot [20]

Hình 1.4: Một số saponin tách ra từ Anemone begoniifolia H.Lév. & Vaniot

Anemone coronaria L. [23]

5


Hình 1.5 : Một số saponin tách ra từ Anemone coronaria L.

Anemone hupehensis LEM. var. japonica (THUNB.) BOWLES et STEARN [17,29,34]

Hình 1.6: Một số saponin tách ra từ Anemone hupehensis LEM. var. japonica
(THUNB.) BOWLES et STEARN

Anemone raddeana Regel (Rununculaceae) [21,18]

Hình 1.7: Một số saponin tách ra từ Anemone raddeana Regel

6


Anemone rivularis var. flore-minore Maxim. [8]

Hình 1.8: Một số saponin tách ra từ Anemone rivularis var. flore-minore Maxim.

Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei [14,15,31]

Hình 1.9: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei

7

Hình 1.10: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei

1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng
1.1.3.1. Công dụng trong dân gian
Cây phong quỳ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các bệnh về
tim (phối hợp với các thuốc khác), điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm
túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong
thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu. [2]
1.1.3.2. Tác dụng sinh học
Các saponin nhóm triterpenoid là thành phần chính trong rễ của chi này có tiềm
năng cao trong kháng u, kháng khuẩn, chống oxi hóa, chống viêm… [9], [28], [35]
Trong y học dân gian Trung Quốc, hơn 10 loài đã được nhắc đến và sử dụng.
Ví dụ: trong dược điển Trung Quốc, thân rễ của A. raddeana được dùng để điều trị
bệnh thấp khớp và đau thần kinh [26]; A. rivularis được sử dụng để điều trị bệnh viêm
gan, viêm cơ, đau khớp, phù nề… [30]; rễ của A. tomentosa được người dân Trung
Quốc dùng điều trị bệnh lỵ, sốt rét, suy dinh dưỡng trẻ em.Ở một số nước Châu Á thì
A. japonica dùng chữa bệnh về tim (phối hợp với thuốc khác), A. rivullaris để điều
trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống,
bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô
đầu [3].

8


1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis
Gagnep.)
Đến nay mới thấy các tài liệu mô tả về hình thái thực vật của Phong quỳ Sa Pa
A. chapaensis Gagnep., và một nghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực vật (vi phẫu, soi
bột), và một nghiên cứu về thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây.

1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.2.1.1. Đặc điểm thực vật
Vào năm 1929, Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep. được nhà thực
vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên [11]. Cây Phong quỳ Sa Pa được mô tả là cây
thảo, thân 2-4cm mang lá chụm ở đất. Lá có cuống dài 10-15cm, mềm, có lông rải
rác; phiến hình tim có 3 thùy, không lông, bìa có răng tròn. Trục mang hoa cao hơn
20cm; lá hoa 6-7, dài 2-3,5cm; lá đài 5, đầu tù hay lõm, cao 2-4cm; tiểu nhụy nhiều;
tâm bì không lông, không vòi nhụy. Quả bế không cọng, không lông, dẹp dẹp, dài 45mm [13], [36], [11].

Hình 1.11: Tiêu bản thực vật Anemone chapaensis Gagnep [37]

9


Hình 1.12: Ảnh chụp rễ Phong Quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)

Hình 1.13. Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep.
(Hình ảnh từ internet: />1.2.1.2. Phân bố
Anemone chapaensis là loài đặc hữu của miền Bắc Việt Nam mới chỉ gặp ở Sa
Pa, tỉnh Lào Cai., Cây mọc rải rác trong rừng vùng núi đá, nơi ẩm, ven khe suối, ở độ
cao 1200-1500m. Ưa bóng, mát. Tái sinh bằng thân rễ [13], [1], [11].

1.2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học
Hiện tại đã có một số nghiên cứu về đặc điểm thực vật , thành phần hoá học
và tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis
Gagnep.).

10

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thực vật được tiến hành trên phần rễ cây Phong quỳ Sa Pa khi cây
có đủ hoa, quả được thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m),
thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
Mẫu tiêu bản khô gồm có cành, lá, hoa số 01 thu hái ngày 11/9/2013 và mẫu
tiêu bản số 02 thu hái ngày 24/5/2015 tại đèo Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai
được giám định bởi TS.Đỗ Thị Xuyến; được lưu giữ tại phòng Bách thảo thực vật,
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và
Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
Mẫu dược liệu được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược
liệu.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hóa chất và dung môi
-

Các dung môi công nghiệp dùng để chiết: cồn 96%, n-hexan, ethyl acetat, nbutanol, nước cất.
Các dung môi tinh khiết (PA) dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột.
Acid acetic, HCl (Merk).
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.

2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ
-

-

Bản mỏng silica gel F254 và RP-18 F254S tráng sẵn trên tấm nhôm (Merck).
Bột silica gel pha thường cỡ hạt 40-200 µm, pha đảo RP-18 cỡ hạt 30-50 µm

(Merck).
Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa XT 220A.
Máy xác định độ ẩm Precisa XM60-HR, tủ sấy Shellab, đèn tử ngoại.
Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 10 lít, máy cất quay.
Dụng cụ thủy tinh: các loại cột sắc ký đường kính từ 1-10cm, dài từ 30-100
cm; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR,
pipet chính xác…
Máy đo phổ khối lượng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap.

11


-

Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR
Spectrometer.

-

Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dược liệu - Bộ Y tế; Bộ môn Dược
liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất
Rễ cây Phong quỳ được rửa sạch sau khi thu hái, sau đó được thái nhỏ và phơi
khô trong bóng râm. Mẫu tiếp tục được đem chiết nóng ở 70oC bằng dung môi cồn
96%, chiết 3 lần sau đó gộp dịch lại và tiến hành cất thu hồi dung môi và thu được
cao toàn phần Ethanol .
Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân bố qua ba phân đoạn nhexan, ethyl acetat, n-Butanol. Mỗi phân đoạn chiết 3 lần, sau đó dịch chiết ở mỗi
phân đoạn được đem đi cô thu hồi dung môi và thu được cao trên các phân đoạn.

12


Dược liệu

chiết nóng 3 lần với cồn 96%
Dịch chiết Ethanol

thu hồi dung môi
Cắn toàn phần
Phân tán trong H2O
chiết phân đoạn với n-Hex
thu hồi dung môi
Phân đoạn n-Hexan

Phân đoạn nước 1

Chiết phân đoạn với EtOAc
thu hồi dung môi
Phân đoạn Ethyl
Acetat

Phân đoạn nước 2

Chiết phân đoạn với BuOH

thu hồi dung môi
Phân đoạn BuOH

Phân đoạn nước 3

Hình 2.1: Sơ đồ quá trình chiết xuất Rễ Phong quỳ Sapa

13


2.3.2. Phương pháp phân lập
Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng và tiến hành xử lý và phân lập. Quá trình
phân lập các hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương pháp sắc kí cột với các
chất hấp phụ là hạt silica gel pha thường, pha đảo. Sắc ký lớp mỏng được dùng để
theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các
chất phân lập.
Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu [6]:


Sắc ký cột:
o Cột thủy tinh: đường kính thay đổi từ 1-10cm, chiều dài từ 30-100 cm.
o Pha tĩnh: thường dùng hạt silica gel pha thuận cỡ hạt 63-200 μm (dùng
cho cột to đường kính khoảng 10 cm) hoặc 40-63 μm (dùng cho cột có
đường kính 5 cm trở xuống); silica gel pha đảo cỡ hạt 30 - 50 μm.
o Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột: Hạt silica gel được nạp vào
cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là
pha động để rửa giải. Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào bản mỏng
sắc ký. Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách đưa thẳng dung dịch
hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó làm khô silica
gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột.
o Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng
ống thủy tinh. Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết
quả phân tích sắc ký lớp mỏng.



Sắc ký lớp mỏng (TLC):
o Bản mỏng: sắc ký TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha
thuận DC-Alufolien 60 GF254 và pha đảo RP-18 (Merck).
o Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử
ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng được phun dung
dịch acid sulfuric 10% sau đó sấy nóng bản mỏng ở 1100C trong khoảng
5 - 10 phút.

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết sơ
bộ bằng SKLM ) được xác định căn cứ vào tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng
chảy) và các dữ liệu phổ: phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13CNMR, DEPT, HSQC, HMBC ) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với
các dữ liệu đã công bố.

14


CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
3.1.1. Lấy mẫu và xác định độ ẩm
Rễ Phong quỳ thu hái tại Sa Pa được sấy ở 60oC đến khô, làm nhỏ, bảo quản
trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu.
Lấy khoảng 2g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ
ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 130oC. Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và
đợi máy tự động hiện kết quả, đo 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
Độ ẩm mẫu nghiên cứu xác định được là 12,7%

3.1.2. Chiết xuất
Rễ Phong quỳ làm nhỏ được chiết nóng với cồn 96% ở 70oC (chiết 3 lần, mỗi
lần 8 tiếng). Dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm đến cắn
để thu được cắn toàn phần, ký hiệu là PQR. Với 2500g rễ Phong Quỳ thu được 245g
cắn toàn phần.
Hòa cắn toàn phần PQR với một lượng vừa đủ nước nóng 60oC. Sử dụng
phương pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, ethyl acetat
và n-butanol. Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn để được kí
hiệu lần lượt là PQRH, PQRE và PQRB.

15


Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết Ethanol rễ Phong quỳ Sa Pa

Phân đoạn

STT

1

Cắn toàn phần EtOH

2

Cắn n-hexan

3
4

Khối lượng

Khối lượng cắn

dược liệu (g)

(g)

% so với
nguyên liệu
khô

245 (g)

9,8%

7,7 (g)

0,3%

Cắn ethyl acetat

15,8 (g)

0,6%

Cắn n-butanol

102 (g)

4,1%

2500 (g)

3.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây Phong
quỳ Sapa
3.2.1. Phân lập một số hợp chất trong rễ cây Phong quỳ Sa Pa
Phân lập các chất có trong phân đoạn BuOH bằng sắc ký cột. Cột sắc ký được
làm sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột
ướt với chất nhồi cột pha thuận là silica gel. Ổn định cột trong 12-24h.
Cắn Buthanol (PQRB – 100g) được phân lập trên cột pha thuận silica gel, rửa
giải với hệ dung môi EtOAc:MeOH:H2O theo gradient nồng độ từ tỷ lệ
EtOAc:MeOH: H2O =15 :1: 0,3 đến MeOH 100%. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng
sắc ký lớp mỏng và dồn các ống có sự tương đồng cao, loại dung môi dưới áp suất
giảm thu được 2 phân đoạn có tiềm năng: PĐ13 và PĐ25.
Phân đoạn PĐ13 (1,3 g) được tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa giải
gradient với hệ dung môi metanol-nước với tỷ lệ metanol tăng dần từ 70% đến 85%.
Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành
phần thu được 2 phân đoạn nhỏ có tiềm năng : PĐ13.1, PĐ13.2. Phân đoạn PĐ13.2
có hợp chất kết tinh màu vàng, loại dung môi thu được chất PQRB2 (60mg).

16


Phân đoạn PĐ25 (1,5g) được tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa
giải gradient với hệ dung môi metanol-nước đẳng dòng với tỷ lệ metanol 70%.
Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành
phần thu được 2 phân đoạn nhỏ PĐ25.1 và PĐ25.2. Phân đoạn PĐ25.1 có hợp chất
kết tinh màu vàng nhạt, loại dung môi thu được PQRB3 (75mg)

Cắn BuOH (100g)

Pha thường

EtOAc:MeOH:H2O = 15 : 1 : 0,3

MeOH 100%

PĐ13.1

PĐ25.1

PĐ13.2

PQRB2

Pha đảo

MeOH 70%

PĐ25

Pha đảo

MeOH 70-85%

PĐ13

PĐ25.2

PQRB3

Hình 3.1 : Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ cây Phong
quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)
17