Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen trong dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
ĐẶNG NGỌC ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN
TRONG DƯỢC PHẨM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
ĐẶNG NGỌC ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN
TRONG DƯỢC PHẨM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHOÁ: QHY.2012
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ

Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa
Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm
thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có
thể thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban
Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo
trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học
tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện
khóa luận này.

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2017
Sinh viên
Đặng Ngọc Anh


CHỮ VIẾT TẮT
LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid
chromatography)

MS

Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ)

DAD

Máy đo quang (Diode Array Detector)

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược
phẩm sử dụng cho con người (International conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use)

BP

Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)

EP

Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)

USP

Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)

EMA

Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

LD50

Liều gây chết trung bình (Lethal dose, 50%)

GC

Sắc ký khí (Gas Chromatography)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

ACN

Acetonitril

ATC

Phân loại thuốc theo hệ thống Giải phẫu – Điều trị – Hoá học
(Anatomical – Therapeutic – Chemical Code)

NSAIDs

Nhóm thuốc chống viêm không steroid

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN.......................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen................................................................ 3
1.1.1. Cấu trúc, tính chất ................................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng dược lý..................................................................................... 4
1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen ................................................ 4
1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ ............................ 4
1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử ............ 5
1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......... 6
1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí ........................ 11
1.3. Thẩm định quy trình phân tích ................................................................. 11
1.3.1. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 11
1.3.2. Miền giá trị ............................................................................................ 12
1.3.3. Tính tuyến tính ...................................................................................... 12
1.3.4. Giới hạn phát hiện ................................................................................. 13
1.3.5. Giới hạn định lượng .............................................................................. 14
1.3.6. Độ đúng ................................................................................................. 15
1.3.7. Độ chính xác ......................................................................................... 15
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 17
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị .................................................................. 17
2.1.1. Dung môi, hoá chất................................................................................ 17
2.1.2. Trang thiết bị ......................................................................................... 17


2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 18
2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký .................................................................. 18
2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 18

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 20
3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký ..................................................................... 20
3.2. Tính đặc hiệu ............................................................................................ 23
3.2.1. Khả năng phân tách ............................................................................... 23
3.2.2. Thời gian lưu ......................................................................................... 25
3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị ................................................................. 27
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .............................................. 29
3.5. Độ đúng .................................................................................................... 29
3.6. Độ chính xác............................................................................................. 30
3.6.1. Độ lặp lại ............................................................................................... 30
3.6.2. Độ chính xác trung gian ........................................................................ 30
3.7. Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén .................................. 32
3.8. Bàn luận.................................................................................................... 32
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN ........................................................................... 35
4.1. Kết luận .................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị……………………………………………………………….35
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Số trang

Bảng 1

Điều kiện chạy nguồn hoá ESI

10

Bảng 2

Chương trình pha động gradient

11

Bảng 3

Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỉ
lệ pha động khảo sát

21

Bảng 4

Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi
thêm 7,5% AcOH trong pha động

22

Bảng 5

Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu
phân tích và mẫu chuẩn

26

Bảng 6

Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan
giữa nồng độ lý thuyết và diện tích pic của
flurbiprofen

27

Bảng 7

Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương
pháp

29

Bảng 8

Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp

30

Bảng 9

Kết quả xác định độ chính xác trung gian của
phương pháp

31

Bảng 10

So sánh kết quả độ chính xác của các phương

pháp định lượng

32


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Số trang

Hình 1

Công thức cấu tạo của flurbiprofen

3

Hình 2

Minh hoạ các thông số sắc ký

6

Hình 3

Khảo sát độ hấp thụ quang theo bước sóng

20

Hình 4

Hiện tượng kéo đuôi pic trên sắc ký đồ

21

Hình 5

Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá

23

Hình 6

Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydroperoxid

24

Hình 7

Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời
gian xuất hiện các pic

25

Hình 8

Đổ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ
chất phân tích và diện tích pic

28


MỞ ĐẦU
Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống
viêm không steroid (NSAID) với tác dụng giảm đau, hạ sốt. Thuốc nhỏ mắt
flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn
ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ. Flurbiprofen được sử dụng bằng
đường uống để điều trị tấn công trong các bệnh viêm gan cấp tính, viêm
xương khớp cấp tính, đau thắt lưng. Viên nén và gel dùng ngoài chứa
flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh viêm khớp dạng thấp,
viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp [7,11,17,26,29].
Flurbiprofen hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là
các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ dưới nhiều tên thương mại khác nhau như
Antadys, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên các thuốc này lại
chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng không có
chuyên luận về Flurbiprofen.
Phát triển các nghiên cứu về Flurbiprofen là một hướng mới tại Việt
Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm một lựa chọn thuốc trong điều trị.
Một điểm đáng chú ý là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ
thuốc dẫn nano có cấu trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là
hướng nghiên cứu được quan tâm trên thế giới [4,12,16,24].
Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen theo tiêu chuẩn quốc tế
là cơ sở ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm
đau, chống viêm chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu
tương đương sinh học và dược động học của chúng.
Trên thế giới, một số phương pháp định lượng flurbiprofen và các chất
chuyển hóa trong huyết tương, huyết thanh, nước tiểu và trong dịch nước
mắt. Một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được công bố bao gồm
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép đầu dò UV (DAD), đầu dò huỳnh

quang hoặc đầu dò khối phổ (MS). USP 35 và EP 2010 quy định sử dụng
phương pháp HPLC để phân tích flurbiprofen trong nguyên liệu dùng làm
thuốc và trong các dạng thuốc như viên nén, thuốc nhỏ mắt và cao dán
[20,22]
1


Mục tiêu của đề tài này nhằm tiến hành xây dựng và thẩm định quy
trình định lượng flurbiprofen trong dược phẩm bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD theo hướng dẫn của Cơ quan quản
lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency- EMA) [9] và Hội nghị quốc
tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người
(International conference on Harmonisation of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human use) [21].

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen
1.1.1. Cấu trúc, tính chất
Flurbiprofen có danh pháp quốc tế là 2-(3-flouro-4phenylphenyl)propanoic acid. Flurbiprofen là một chất thuộc nhóm acid
phenylalkanoic, có công thức phân tử là C15H13FO2, khối lượng mol phân tử
244,26 g/mol [27]. Cấu trúc phân tử flurbiprofen được mô tả trong hình 1.
Flurbiprofen có các mã ATC là M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04
[28], mã Pubchem là 3394 [27] và mã Drugbank là DB00712 [29].

Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen
Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học
(+) S và (-) R. Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống

nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [6].
Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như
trắng và nóng chảy ở 110 – 111oC. Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22oC
là 8 mg/L (22oC) ,các chỉ số LogP và logS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [27,29].

3


1.1.2. Tác dụng dược lý
Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và
cảm nhận đau. Enzym cyclooxygenase (COX) có vai trò xúc tác cho quá
trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2) và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit
arachidonic. Flurbiprofen có tác dụng chất ức chế cyclooxygenase (COX)
không chọn lọc và ức chế sự hoạt động của cả hai COX-1 và COX-2. Từ đó,
flurbiprofen ngăn cản việc chuyển hoá axit arachidonic thành PGG2, PGH2 là
nguyên liệu trong quá trình tổng hợp các prostaglandin. Từ đó, làm giảm nồng
độ prostaglandin và cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt. Flurbiprofen
cũng là một trong những NSAIDs mạnh nhất về hoạt động ức chế
prostaglandin.
Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp
của hai đồng phân quang học (+) S và (-) R. Đồng phân S-enantiomer thể hiện
hầu hết trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt
tính giảm đau.
Flurbiprofen được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài
đối với bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính
khớp. Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong các trường hợp như
đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch,
viêm gân, chấn thương mô mềm). Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật
nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ. [7,11,16,26,29]
1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen

1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ
Theo dược điển châu Âu (EP) 2010 [20] và dược điển Hoa Kỳ (USP)
35 [22], phương pháp định lượng dựa vào phản ứng acid - base của gốc acid
trong cấu trúc flurbiprofen. Phương pháp được thực hiện bằng cách hòa tan
0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1
M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein, dừng lại khi dung dịch có màu hồng
bền hơn 30 giây [22]. Có thể thay thế chỉ thị phenolphthalein bằng phương
pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện thế [20]. 1 ml dung dịch NaOH
0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2.

4


Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ
chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và
người phân tích.
1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử
Trong nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã
giới thiệu hai phương pháp định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang
phổ phân tử. Phương pháp được hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH
và EMA [5].
Quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp thụ
quang đã được thẩm định. Trong đó, hệ thống sử dụng máy quang phổ UVVis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet
1 cm, tốc độ quét 600 nm/phút, dải quét 190 - 320 nm, độ rộng khe 2 nm.
Tín hiệu được xử lý trên phần mềm Statistical Product and Service Solutions
(SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết
lập trong khoảng nồng độ 1-14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn
định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml.
Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng
máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU

RF-5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm,
λex= 248 nm, λem= 308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product and Service
Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính
được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn
3,8% và LOQ có giá trị là 0,03 μg/ml.
Các phương pháp này có ưu điểm thời gian thực hiện ngắn, độ chính
xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các nồng độ rất
nhỏ. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi
các tạp chất lạ và phải kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh
khiết của mẫu.

5


1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân
tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự
phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền
với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,5,13,18].
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
- Thời gian lưu
tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào
hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký
tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0

W: là chiều rộng đáy pic.
W1/2: là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.

Hình 2. Minh hoạ các thông số sắc ký

- Hệ số dung lượng k

6


Trong đó:
Vs : thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha động
Cần chọn cột, pha động ... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu:
1 < k’< 8.
- Hệ số chọn lọc 

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0
- Hệ số bất đối xứng As
Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2.
Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối.
- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

7


Trong đó
W: Chiều rộng đo ở đáy pic,
W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
- Độ phân giải Rs

Trong đó:
tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn
vị. Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5.
Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng
Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [3,5,13,18]
- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong
đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện.
Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc
chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu
thử
- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những
lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội.Từ những dữ kiện về: diện tích
(hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu
thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong
mẫu thử một cách chính xác.
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của

các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến
hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu

8


thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng
của diện tích hoặc chiều cao pic.
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất
trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic
của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
Định lượng bằng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao ghép đầu dò DAD
Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ
thống HPLC - DAD [20]. Trong đó, dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp
acetonitril : nước 45:55. Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung
môi trên để được 100 ml. Pha tĩnh là octadecylsilyl silicagel kích thước 5 µm
trong cột thép kích thước 3,9 × 150 mm. Pha động là hỗn hợp axit axetic :
acetonitrile : nước tỷ lệ 5 : 35 : 60. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm là
10 µl. Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu
dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm.
Phương pháp có những ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy tốt tách
được các thành phần riêng biệt ra khỏi mẫu và có thể áp dụng được cho
những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Nhược điểm của phương pháp là
phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc
hiện đại.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ
Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen
và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC - MS/MS).

[8,14,15,18]
Ví dụ như nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng
phương pháp LC-MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin,
Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng
Zheng, Hui Chen thực hiện (2015) [8]. Trong đó hệ thống sắc ký lỏng
Shimadzu UFLC LC-30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối
phổ QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ
9


thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy
nguồn hoá ESI liệt kê trong bảng 1.
Bảng 1. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI
Thông số

Giá trị

Áp suất khí phun

30 psi

Thế phun điện tử

-4,5 kV

Nhiệt độ mao quản

400 oC

Nguồn ion

40 psi

Detector với các thông số năng lượng va chạm (CE) = - 12 V, thế phân
nhóm (DP) = - 26 V, Thế đầu vào (EP) = - 8 V, Năng lượng (CXP) = - 8 V.
Ion có dạng 242,9 → 198,7.
Pha tĩnh: cột silicagel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với
một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex.
Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 2.
Bảng 2. Chương trình pha động gradient
Kênh B
(Acetonitril :
Acid formic
99,9 : 0,1)

Thời gian (phút)

Tốc độ dòng
(ml/phút)

Kênh A
(Acid formic :
Nước 99,9 : 0,1)

0,1

0,4

60

40

0,6

0,4

15

85

1

0,4

5

95

2

0,4

5

95

2,5

0,4

60

40

Nhiệt độ cột 40oC và thể tích tiêm mẫu là 5 µl.
Phương pháp đã xác định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml.
Độ chính xác đạt 2,2 - 3,4%.
Phương pháp có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, độ đặc hiệu cao do tính
phân mảnh riêng biệt của các ion, thời phân tích nhanh, có thể định lượng các
chất có thời gian lưu giống nhau và độ phân giải cao. Nhược điểm của
10


phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi,
phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền.
1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí
Trong nghiêm cứu của Yilmaz, Bilal, and Emrah Alkan (2015), các tác
giả đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký
khí ghép đầu dò khối phổ [25]. Trong đó, phân tích sắc ký thực hiện trên hệ
thống sắc ký khí Agilent 6890 N được trang bị đầu dò MS 5973, hệ thống
tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm điều khiển Agilent ChemStation
(Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Cột HP-5 MS có độ dày 0,25 μm (30
m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách. Tiêm mẫu không chia dòng, khí
mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút. Nhiệt độ đầu phun và máy dò là
250°C. Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ
dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV. Miền giá trị được xây dựng
trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml. Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt
99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất,
độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích

tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao tính phân mảnh
riêng biệt của các ion. Phương pháp có nhược điểm là giá thành cao, không áp
dụng được cho những chất không bền nhiệt và chất dễ khó hơi.
1.3. Thẩm định quy trình phân tích
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương
pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của
ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11
năm 2005 [21], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần
thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và
miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc
phải có trong quy trình thẩm định.
1.3.1. Tính đặc hiệu
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
11


Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có
ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn. [1,2,9,21]
Phương pháp xác định
Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng
chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp
chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai
thành phần trở lên.
Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo
ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm
phân huỷ.
1.3.2. Miền giá trị
Khái niệm

Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và
nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ
nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính
chất tuyến tính của phương pháp [1,2,9,21].
Phương pháp xác định
- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định.
-

Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến
tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.

Yêu cầu
Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của
miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,9,21].
1.3.3. Tính tuyến tính
Khái niệm
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
12


của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của
đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).
Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với
hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,9,21].
Phương pháp xác định
-

Khảo sát ở ít nhất 5 [21] hoặc 6 [9] mức nồng độ khác nhau.

-

Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của
phương pháp.

-

Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu.

-

Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc
nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra
tính thích hợp của phương trình.

Yêu cầu
Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1, 2].
1.3.4. Giới hạn phát hiện
Khái niệm
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của
chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác
định chính xác hàm lượng [1,2,9,21].
Phương pháp xác định
Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng
cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ
nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện.
-

Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng

độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3.
-

13


-

Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc
dựa vào đường chuẩn định lượng.
1.3.5. Giới hạn định lượng
Khái niệm
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp
nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ
chính xác phù hợp [1,2,9,21].
Phương pháp xác định
Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính
xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng
biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy
trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp
nhận.
Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là
nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.
-

Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc

14


dựa vào đường cong chuẩn độ
1.3.6. Độ đúng
Khái niệm
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá
trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với
một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định
[1,2,8,20].
Phương pháp xác định
Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần
mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3
lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo
công thức sau:
ỷ ệ
Trong đó:

ụ

ồ

là giá trị mẫu đo được
µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.

Yêu cầu
Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý
mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi
thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2]. Tỷ lệ phục hồi càng gần
giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.
1.3.7. Độ chính xác
Khái niệm
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất
cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,9,21].

15


Phương pháp xác định
Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá
trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định
lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân
tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống
máy thay đổi.
Yêu cầu
Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu
phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên
dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở
giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD
càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2].

16


CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị
2.1.1. Dung môi, hoá chất
Flurbiprofen, natri hydroxid, acid chlorhydric, acid acetic, hydropeoxid
từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn
HPLC.
Nước được tinh chế bằng máy Thermo Scientific GenPure UV-TOC
đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m.
Mẫu dược phẩm được định lượng là viên nén Anadys 100mg
Theramex, Pháp số lô 2M653 05 2015.
2.1.2. Trang thiết bị
Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo
Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự
động.
Đầu dò DAD Diode Array Detector Model: DAD - 3000 Dionex sử
dụng đèn Deuterium (D2) cho khoảng UV và tungsten (W) cho khoảng VIS,
khoảng bước sóng đo được 190 - 800 nm.
Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150
mm và cột C18 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150 mm.
Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang
bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.
Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân
phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo
Scientific, Hoa Kỳ. Bình định mức, ống đong, cối chày,..

17