Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương nhằm bước đầu đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén felodipin tác dụng kéo dài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGÔ THỊ QUỲNH NGA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN
TÁC DỤNG KÉO DÀI


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC




HÀ NỘI - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ QUỲNH NGA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN
TÁC DỤNG KÉO DÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ 60720410

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. TS. Nguyễn Xuân Trường


HÀ NỘI - 2014
LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và sự chân thành, tôi xin được bày tỏ niềm biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó trưởng phòng Quản lý khoa học,
Trường Đại Học Dược Hà Nội và TS. Nguyễn Xuân Trường- Phó giám đốc Trung
tâm Giám định Ma túy, viện Khoa học Hình sự, Bộ Công An - những người đã trực
tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu
cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân Tích và
Độc chất – Trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị ở Trung tâm Giám Định Ma
Túy – Viện Khoa học Hình Sự đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên khích lệ,
ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực
hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học
Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo tận tình trong suốt những
năm tôi học tập tại đây.
.
Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.


Hà Nội, ngày 24 tháng 08 năm 2014

Học viên


Ngô Thị Quỳnh Nga
MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cương về Felodipin 3
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa 3
1.1.2. Dược động học 4
1.1.3. Tác dụng dược lý 4
1.1.4. Chỉ định 5
1.1.5. Chống chỉ định 5
1.1.6. Liều lượng và cách dùng 5
1.1.7. Một số chế phẩm trên thị trường 6
1.2. Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học 7
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 13
1.3.1. Khái niệm sắc kí khí 13
1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng 13
1.3.4. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí khối phổ 14
1.4. Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học 17
1.4.1. Kỹ thuật xử lý mẫu 18
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 21
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 21
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 21
2.2. Đối tượng nghiên cứu 22

2.3. Nội dung nghiên cứu 22
2.4. Phương pháp nghiên cứu 22
2.4.1. Xây dựng phương pháp phân tích 22
2.4.2. Thẩm định phương pháp phân tích 24
2.4.4. Xử lý và biểu thị kết quả nghiên cứu 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích 31
3.1.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội. 31
3.1.2. Khảo sát chương trình sắc ký 34
3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 35
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 40
3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc. 40
3.2.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 45
3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 46
3.2.4. Tỷ lệ thu hồi 48
3.2.5. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 50
3.2.6. Độ ổn định 53
3.2.7. Bước đầu ứng dụng định lượng Felodipin trên mẫu thực 57
3.3. Bàn luận 62
3.3.1. Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích Felodipin bằng GC – MS. 62
3.3.2. Về xây dựng phương pháp định lượng. 62
3.3.3. Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng. 63
3.3.4. Về bước đầu đánh giá sinh khả dụng trên chó 64
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66
4.1. Kết luận 66
4.2. Kiến nghị. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMLO

Amlodipin
DC
Dược chất
FEL
Felodipin
GC
Sắc kí khí
HQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample)
HT
Huyết tương
HTT
Huyết tương trắng
IS
Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ
Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantitation)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample)
MeOH
Methanol
MQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control
Sample)
MS
Phương pháp phổ khối lượng
NIF
Nifedipin

RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
SD
Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
SKD
Sinh khả dụng của thuốc
TDSH
Tương đương sinh học




DANH MỤC CÁC BẢNG
Số bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trường
6
Bảng 1.2
Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng GC
7
Bảng 1.3
Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao.
10
Bảng 1.4
Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí
15
Bảng 2.1

Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2
25
Bảng 2.2
Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương
25
Bảng 2.3
Cách chuẩn bị mẫu QC
26
Bảng 3.1
Thể tích dung môi chiết toluen khảo sát
37
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát dung môi chiết
38
Bảng 3.3
Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp.
44
Bảng 3.4
Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính.
45
Bảng 3.5
Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
47
Bảng 3.6
Tỷ lệ thu hồi của IS
48
Bảng 3.7
Tỷ lệ thu hồi của FEL
49
Bảng 3.8

Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày
50
Bảng 3.9
Độ đúng, độ chính xác khác ngày
51
Bảng 3.10
Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba
chu kì đông rã.
53
Bảng 3.11
Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.
54
Bảng 3.12
Độ ổn định của mẫu sau xử lý
55
Bảng 3.13
Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương
56
Bảng 3.14
Nồng độ FEL trong các mẫu thực
60
Bảng 3.15
Một số thông số dược động học của FEL trên chó
60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hình
Tên hình
Trang

Hình 1.1
Công thức cấu tạo của Felodipin
3
Hình 1.2
Sơ đồ thiết bị sắc ký khí khối phổ
14
Hình 3.1
Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong
methanol
31
Hình 3.2
Phổ khối của Felodipin
33
Hình 3.3
Phổ khối của Nifedipin
33
Hình 3.4
Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong
huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng
36
Hình 3.5
Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết
39
Hình 3.6
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng
41
Hình 3.7
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng thêm IS
42
Hình 3.8

Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn FEL
43
Hình 3.9
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa tỉ lệ diện tích
FEL /IS với nồng độ FEL trong huyết tương (ng/ml)
46
Hình 3.10
Sắc kí đồ mẫu huyết tương chó trước khi uống thuốc
58
Hình 3.11
Sắc kí đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 2,5 giờ
sau khi uống thuốc
59
Hình 3.12
Đường cong dược động học của chó sau khi uống viên
Felutam
61
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch là bệnh khá phổ biến, là gánh nặng sức khỏe chính yếu, để lại
nhiều tàn phế và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Trong đó,
tăng huyết áp là bệnh rất tiêu biểu và thường gặp nhất. Nếu không được chẩn đoán và
điều trị có thể gây ra các biến chứng và di chứng nặng nề, ảnh hưởng xấu đến chất
lượng cuộc sống người bệnh, trở thành gánh nặng cho gia đình và cho xã hội. Do vậy,
thuốc điều trị bệnh tim mạch cũng như tăng huyết áp ngày càng chiếm tỷ trọng lớn, có
vai trò quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong và ngoài
nước trong nhiều năm gần đây, dạng bào chế viên tác dụng kéo dài đã ra đời để phù

hợp với đặc thù điều trị các bệnh tim mạch là phải sử dụng thường xuyên, lâu dài mà
giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi nhiều nhất như: viên nén, viên
nang, thuốc tiêm giải phóng kéo dài, giải phóng tại đích. Nhiều dược chất được dùng
trong các dạng bào chế này như: diltiazem, lercanidipin, nicardipin, nifedipin,
verapamil, metoprolol, felodipin…Ở nước ta, felodipin là một trong những thuốc đang
được sử dụng rộng rãi, là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu và đang được
nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài. Để có thể đưa thuốc vào điều trị,
theo quy định của Cục Quản lý Dược Việt Nam: thuốc dạng rắn của 12 dược chất và
thuốc phóng thích có kiểm soát cần phải đánh giá sinh khả dụng hoặc tương đương
sinh học.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những
nội dung quan trọng là xây dựng quy trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích,
định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu ). Quá trình phân
tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu
2

thường rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân
tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất có thể bị chuyển hoá tạo thành nhiều
dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với dược chất nên việc
phân tách để định lượng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phương pháp phân tích
phải được xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết
quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân tích thuốc trong dịch sinh học sử
dụng sắc ký khí (GC). Nhưng ở Việt Nam, vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố.
Để góp phần nghiên cứu SKD cuả một chế phẩm thuốc mới, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương
nhằm bước đầu đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén Felodipin tác dụng kéo
dài” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương
chó bằng GC-MS.

2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng Felodipin trong huyết tương
chó sau khi cho chó uống viên felodipin 5 mg tác dụng kéo dài.

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về Felodipin
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa
- Công thức hóa học [7]:





Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Felodipin
- Công thức phân tử: C
18
H
19
Cl
2
NO
4
.
- Khối lượng phân tử: 384,3.
- pKa :5,07.
- Tên khoa học: Ethyl methyl (4RS)-4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-
dihydropyridine-3,5-dicarboxylate [28].
- Tính chất lý hóa:
+ Bột tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt.

+ Thực tế không tan trong nước, tan tự do trong aceton, ethanol tuyệt đối,
methanol và methylen clorid.
+ Nhiệt độ nóng chảy dạng khan: 145
o
C [8], [22]
4

1.1.2. Dược động học
Hấp thu: Felodipin hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá sau khi uống
nhưng chuyển hoá lần đầu ở gan và có sinh khả dụng tuyệt đối (SKD) khoảng 15%.
Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau 3-5 giờ. Thức ăn ảnh hưởng đến tốc độ
hấp thu, không ảnh hưởng đến mức độ hấp thu.
Phân bố: Liên kết với protein huyết tương xấp xỉ 99%, chủ yếu là albumin. Thể
tích phân bố ở trạng thái ổn định là 10 L/kg.
Chuyển hóa: Felodipin chuyển hoá mạnh qua gan. Các chất chuyển hóa được
xác định không có hoạt tính gây giãn mạch.
Thải trừ: Bài xuất chủ yếu (khoảng 70% liều dùng) qua nước tiểu dưới dạng
các chất chuyển hoá không hoạt tính, phần còn lại chưa chuyển hoá được đào thải qua
phân, ít hơn 0,5% liều dùng được bài tiết dưới dạng không đổi trong nước tiểu. Thời
gian bán thải t
1/2
của felodipin là 11-16 giờ. Felodipin có độ thanh thải cao, trung bình
1200 mL/phút. Độ thanh thải giảm ở người cao tuổi và bệnh nhân suy giảm chức năng
gan. Không có nguy cơ tích lũy thuốc khi điều trị kéo dài [1] ,[13],[20],[25].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Tác dụng hạ áp động mạch: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci chậm có tính chất
chọn lọc thuộc nhóm dihydropyridin. Felodipin làm giảm trương lực động mạch (nhất
là trên tiểu động mạch), dẫn đến tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp [1], [25], [29].
Tác dụng chống đau thắt ngực: Felodipin cải thiện sự cân bằng trong cung và cầu
oxy của cơ tim. Lưu lượng động mạch vành cũng như lượng cung cấp oxy cho cơ tim

tăng lên nhờ giãn mạch vành. Felodipin giảm huyết áp toàn thân nên làm giảm hậu
gánh thất trái, do đó giảm nhu cầu oxy của cơ tim. Felodipin làm tăng khả năng gắng
sức và giảm số cơn đau thắt ngực ở người bệnh đau thắt ngực ổn định [1],[29].
Giãn mạch não nên tăng máu vào não, được dùng cho những người tai biến mạch
máu não [2].
5

1.1.4. Chỉ định
- Bệnh tăng huyết áp.
- Điều trị dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định [1].
1.1.5. Chống chỉ định
- Nhồi máu cơ tim cấp.
- Suy tim mất bù hoặc chưa kiểm soát được.
- Đau thắt ngực không ổn định.
- Phụ nữ có thai.
- Không dùng felodipin cho trẻ em vì hiệu quả và khả năng dung nạp thuốc ở trẻ
em chưa được xác định [1].
1.1.6. Liều lượng và cách dùng
Điều trị tăng huyết áp: Liều dùng cần điều chỉnh theo đáp ứng của người bệnh
và sự dung nạp thuốc sau khoảng 2 tuần sử dụng. Liều khởi đầu ở người lớn là 5
mg/lần/ngày. Tùy theo đáp ứng của người bệnh, có thể giảm liều tới 2,5 mg/ngày hoặc
tăng liều lên 10 mg/ngày. Nếu liều 10 mg/ngày không đủ để kiểm soát huyết áp, có thể
phối hợp với một thuốc chống tăng huyết áp khác như thuốc chẹn bêta. Đối với bệnh
nhân lớn tuổi nên cân nhắc dùng liều khởi đầu 2,5 mg/ngày.
Liều duy trì thông thường là 2,5-10 mg/ngày, uống một lần vào buổi sáng.
Dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định: Liều dùng là 10 mg/ngày uống một lần.
Nên bắt đầu với liều 5 mg/lần/ngày trong tuần đầu, sau đó tăng liều lên 10 mg/ngày.
Liều dùng cần được điều chỉnh ở người bệnh cao tuổi hoặc suy gan nặng. Liều khởi
đầu thông thường là 2,5 mg/ngày, liều tối đa 5 mg/ngày.
Cách dùng: Dùng đường uống, thuốc nên được uống cùng bữa ăn nhẹ (không

có nhiều chất béo hay carbohydrat). Với các dạng bào chế giải phóng kéo dài, chỉ được
nuốt nguyên viên cùng với nước, không nhai vỡ, không chia nhỏ viên thuốc [1].


6

1.1.7. Một số chế phẩm trên thị trường
Bảng 1.1: Một số chế phẩm Felodipin trên thị trường Việt Nam [3], [6]
STT
Tên biệt
dược
Thành
phần
Dạng thuốc
Nhà sản xuất
1
Enfelo-5
Felodipin
Viên nén
phóng thích
chậm-5mg

Aegis., Ltd - Kibris
2
Felodil ER
Felodipin
Viên nén bao
phim giải
phóng chậm -
5 mg

Korea United Pharm Inc –
Hàn Quốc
3
Felodipin
Stada 10 mg
retard

Felodipin
Viên nén giải
phóng chậm
Stadapharm GmbH – Đức
4
Felodipin
Stada 5 mg
retard

Felodipin
Viên nén tác
dụng chậm
Stadapharm GmbH – Đức
5

Felutam

Felodipin
Viên nén giải
phóng có kiểm
soát

Công ty TNHH Dược phẩm

Vellpharm Việt Nam – Việt
Nam

6
Plendil
Felodipin
Viên nén
phóng thích
chậm-5 mg
Astra Zeneca-Thụy Sĩ
7

1.2. Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học
Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định lượng FEL trong dịch sinh học được tổng hợp ở bảng
1.2 và bảng 1.3 sau:
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong huyết tương bằng GC


Mẫu
thử
Detect
or
Cột sắc ký
Chuẩn
nội
Điều kiện sắc ký
Phương pháp
chiết/Dung
môi chiết

Martin
Ahnoff
và Cs
[19]

HT
người
ECD
-Cộtmao
quản silica
phủ CPtmSil
8 hoặc
CPtmSil 5
(25m×0,32m
m).
H 165/04
- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 270
0
C.
-Nhiệt độ detector: 350
0
C
- Chương trình nhiệt độ:Tăng 8
0
C/ ph đến
270
0
C. Duy trì ở 270
0
C.

-Khí mang: He
-Khoảng tuyến tính:0,8 – 4 ng/ml.
-LLOQ: 0,8 ng/ml.
-Thời gian phân tích: 15,5 phút

- Chiết lỏng-
lỏng
-Toluen:H
2
O
(1:1)
8

J.D- Y.
Dru và
Cs
[10]


HT
người
MS
Cột mao
quản (30m
x0,2 mm, 5
µm) với pha
tĩnh
Methylsilicon
( HP-1,
Hewlett-

Packard)







- Nhiệt độ buồng tiêm: 300
0
C
- Chương trình nhiệt độ:
220
0
C/ 0,6ph. Tăng 15
0
C/ph đến 300
0
C. Duy
trì 10ph
- Khí mang: He. Tốc độ: 0,365ml/ph.
- Chế độ ion hóa ( Áp suất nguồn ion hóa:
2,0.10
-3
Pa
- Chế độ chọn lọc ion(SIM) với mảnh ion mẹ
có m/z=238
-LOQ: 0,1 ng/ml

- Toluen

Takashi
Sakamoto
và Cs
[27]



HT
người
và HT
chó
MS
Cột mao
quản (12,5m
x 0,2 mm,
Ultra 1,
Hewlett-
Packard)

D6-
Felodipin
- Tiêm không chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm:
260
0
C
- Chương trình nhiệt độ: 220
0
C/ 0,6ph. Tăng
24

0
C/ph đến 290
0
C.
- Khí mang: He. Áp suất 0,25 kg/cm
2

- Kỹ thuật ion hóa phun sương điện tử ion
dương( PIEI) với mức năng lượng electron
:70eV
-n-hexan:
toluen
(4:1)


9

-Nhiệt độ nguồn ion hóa : 300
0
C
- Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion mẹ
có m/z=238
-Thời gian phân tích: 13,6 phút
Ryota
Nishioka
và Cs
[23]

HT
người

ECD
và MS
GC-ECD Cột
mao quản(
25m x
0,32mm)
GC-MS Cột
mao
quản(12m x
0,2mm, HP-
1, Hewlett-
Packard)
H165/04
- Tiêm chia dòng. . Nhiệt độ buồng tiêm:
330
0
C
- Chương trình nhiệt độ: 110
0
C/ 1ph. Tăng
10
0
C/ph đến 300
0
C.
- Khí mang: He. Khí bổ trợ:N
2
.
-Tốc độ: 40ml/ph
- Mảnh ion mẹ có m/z=238

-Chiết pha rắn

-Toluen





Yang L.
Và Cs
[30]

HT
người
ECD
Cột SE- 30
(2m x3mm)
Nimodipi
n
-LOD: 0,25 ng/ml
-Chiết lỏng-
lỏng
-Ethyl Ether :
n-hexan (2:1)

10

Bảng 1.3:Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong huyết tương bằng HPLC.

Mẫu
thử
Detector
Cột sắc ký
Chuẩn nội
Điều kiện sắc ký
Phương pháp
chiết/Dung
môi chiết
Luis H.
Migliorança
và cộng sự
[16]
HT
người
MS/MS
Cột C18
(100 x
4,6mm,
3µm)
Nimodipin
- Pha động acetonitril : nước
(80:20) chứa 10 mM acid formic
- Tốc độ dòng 0,8mL/phút
- Thể tích tiêm mẫu 40 µl
-Chế độ ion hóa phun sương điện
tử ion dương
- Thời gian phân tích 5 phút
-Chiết lỏng-

lỏng
-Diethyl
ether/hexan
(80:20)
Soo-Hwan
Kim Hye
Jung Lee
[26]

HT
người


MS-MS
Eclipse
XDB-C18
(3,0 m x
0,975 mm,
3,5 µm.
Agilent,
Littelfall,


Amlodipin
-Pha động: hỗn hợp acetonitril và
acid formic 0.1% (75/25, TT/TT).
-Tốc độ dòng 0,25 mL/phút.
-Cột và khay lấy mẫu tự động được
duy trì ở nhiệt độ 25
0

C và 10
0
C.
-Thời gian phân tích là 5 phút và
thể tích tiêm là 2 µL.
-Chiết lỏng-
lỏng
-Methyl t-
butyl ether
(MTBE)
11

CA, USA)

-Khoảng tuyến tính: 0,1-20 ng/ml
(R
2
> 0,99)
-LOQ: 0,1 ng/ml
-LOD: 0,01 ng/ml
Hohyun kim
và Cs
[9]

HT
người
và HT
chó

MS-MS
C8
Capcell Pak
column (2,0
mm ×150
mm, 5,0 µm
particle)


Nifedipin
-Pha động: hỗn hợp amoni : acetat–
acetonitril (20:80), pH 6,0.
-Tốc độ dòng: 200 µL/phút.
-Tổng thời gian chạy 5,0 phút.


Diethyl ether
Margareth
Gabrielson và
Cs
[18]
HT
UV
-Cột sắc ký
LiChrospher
60 RP (5
µm, 250
mm x 4mm)
-Cột bảo vệ:
cyano

Brownlee
guard (15

-Pha động : Methanol –đệm
Phosphat 0,05M, pH 3,5 (45:80)
-Tốc độ dòng 1,15ml/phút
- phát hiện ở bước sóng 220nm.
-Giới hạn phát hiện: 8ng/ml
-Chiết lỏng-
lỏng
Và chiết pha
rắn
12

mm x 3,2
mm,7 µm)
L.I. Yan-Yan
và Cs
[15]
HT
người
MS-MS
Cột
Nucleosil
C
18
(50 mm
x4,6 mm, 5
µm)
Diphenhidra

min
-Pha động Methanol:Amoni acetat
10 mmol/ ml(80:20)
-Tốc độ dòng 0,7ml/ phút.
-LOQ: 0,05ng/ml
-Tổng thời gian phân tích là 2,5
phút
-Chiết lỏng-
lỏng
-Toluen: Ethyl
acetat (1:1)
13

1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS
1.3.1. Khái niệm sắc kí khí
Sắc ký khí là phương pháp tách các chất ở thể khí bay hơi trong hỗn hợp, trong đó
pha động là một chất khí thường là khí trơ. Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá
trình rửa giải được thực hiện chủ yếu nhờ chương trình nhiệt độ cột sắc ký. Khác với các
dạng sắc ký khác, trong GC pha động không tương tác với chất phân tích mà chỉ làm
chức năng vận chuyển chất phân tích qua cột [3].
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), pha tĩnh là chất lỏng. Pha này được bao hay gắn lên
một chất mang là pha rắn, ta có sắc ký khí phân bố. Trong sắc ký khí-rắn (GCS), pha tĩnh
là chất rắn: pha tĩnh rắn là chất hấp phụ, đó là sắc ký khí khí hấp phụ [3].
1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng
Trong GLC, chất phân tích chỉ có thể di chuyển theo pha động qua cột khi nó ở
thể khí. Vì vậy kỹ thuật này được dùng để tách các chất tan bền với nhiệt. Quá trình tách
phụ thuộc vào tính bay hơi của chất tan- tức là điểm sôi [3].
Hệ số phân bố x/p phụ thuộc vào áp suất hơi của chất phân tích và hệ số hoạt độ
của chất phân tích. Vì vậy, có thể tách được hai chất phân tích có áp suất hơi như nhau
nhưng có hệ số hoạt độ trong pha tĩnh lỏng khác nhau.

Quá trình rửa giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần, ngoại trừ có tương tác đặc biệt
giữa chất phân tích và pha tĩnh. Pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột đến detector.
Nhiệt độ cột dao động trong khoảng 50÷350 ℃ đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh
quá trình rửa giải.
1.3.3. Nguyên tắc khối phổ
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được
tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu. Tỷ số này biểu thị bằng đơn vị
khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon
12
C) hoặc bằng dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên tử hydro).

14


1.3.4. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí khối phổ

Hình 1.2: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí khối phổ
1.3.4.1. Thiết bị sắc ký khí
 Khí mang
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân
tích dọc theo cột sắc ký và tiếp nhận các phân tử chất phân tích đã bị giữ lại trước đó và
tiếp tục tương tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh [3], [21].
Điều kiện của khí mang:
-Trơ về mặt hóa học
-Thuận lợi cho detector sử dụng
-Có khả năng giảm thiểu sự khuếch tán khí
-Tinh khiết
15

 Buồng tiêm mẫu

Buồng tiêm mẫu là nơi khi mẫu được bơm vào sẽ hóa hơi và bị lôi cuốn theo dòng khí
mang
Có ba kỹ thuật tiêm mẫu : Chia dòng, không chia dòng, tiêm thẳng vào cột. Trong đó
kỹ thuật tiêm chia dòng được sử dụng nhiều nhất. Các cách tiêm mẫu trong GC đươc
trình bày ở bảng 1.4:
Bảng 1.4: Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí [5], [11]
Loại cột
Kỹ thuật tiêm
Cách thực hiện
Đánh giá
Mao
quản
Chia dòng
(split)
Chia dòng khí mang
1:10 đến 1:100 để giảm
lượng mẫu vào cột (giảm
90% hoặc hơn).
Thích hợp cho cột mao quản.
Độ nhạy giảm vì chỉ một phần
rất nhỏ của mẫu vào cột.
Không chia
dòng (splitless)
Toàn bộ mẫu ngưng tụ ở
đàu cột đã làm lạnh, sau
đó tăng nhiệt độ làm bay
hơi mẫu.
Độ nhạy tăng. Nhưng có nguy
cơ giãn rộng pic.
Thẳng vào cột

(on – column)
Mẫu được ngưng tụ ở
đầu cột, sau đó làm bay
hơi theo chương trình
nhiệt độ.
Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt.

 Cột tách sắc ký:
Trong thực tế có nhiều cột tách dùng cho các mục đích phân tích khác nhau. Phổ biến
là cột nhồi và cột mao quản. Nhìn chung cột sắc ký cần đạt các yêu cầu sau:
-Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha tĩnh và pha động nhờ việc tối ưu hóa
các thông số của phương trình Van Deemter.
-Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định.
-Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao.
16

Cột tách sắc ký được sử dụng trong GC- MS là cột mao quản. Có 2 loại cột mao
quản:
-Cột mao quản film mỏng: Pha tĩnh được tráng thành lớp mỏng ở thành mao quản
phía bên trong.
-Cột mao quản lớp mỏng: các hạt nhỏ chất hấp phụ (vai trò chất mang) gắn trên
mặt trong cột, sau đó phủ lớp mỏng pha tĩnh lên trên.
Một số pha tĩnh thường dùng:
 Các alcol: không phân cực, rất chọn lọc squalan, dầu parafin, polyethylen.
 Các loại silicon: độ phân cực tăng lên theo số lượng các nhón thế trong
siloxan.
 Các loại ete, este: phân cực .
 Các hợp chất chứa nitơ: rất phân cực.

1.3.4.2. Thiết bị khối phổ
Máy khối phổ gồm 5 bộ phận sau:
 Bộ nạp mẫu: Chuyển các chất phân tích từ đầu ra của máy sắc kí khí vào nguồn
ion hóa của thiết bị khối phổ.
 Bộ nguồn ion: Ion hoặc các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.
Có nhi
ề
u kỹ thu
ậ
t ion hoá khác nhau đ
ượ
c dùng trong các máy GC-MS .
-K
ĩ
thuật ion hóa va chạm đi
ệ
n t
ử
(Electron Impact ionization): Trong
nguồn ion electron t
ạ
o ra t
ừ
một s
ợ
i dây tóc đèn đ
ượ
c đốt nóng, sau đó đ
ượ
c t

ă
ng
tốc h
ướ
ng t
ớ
i anod và va ch
ạ
m v
ớ
i các phân t
ử
khí của m
ẫ
u phân tích đ
ượ
c tiêm
vào nguồn ion. N
ế
u các electron có đủ n
ă
ng l
ượ
ng, khi va ch
ạ
m nó s
ẽ
làm một
electron của phân t
ử

b
ị
b
ắ
n ra. Các ion đ
ượ
c hình thành sau khi va ch
ạ
m s
ẽ
đi
qua một đi
ệ
n tr
ườ
ng kho
ả
ng 400 – 4000V đ
ể
t
ă
ng tốc khi đi vào bộ ph
ậ
n phân
tích khối. Tốc độ chuy
ể
n động của các ion tỷ l
ệ
v
ớ

i khối l
ượ
ng của chúng.


17


-K
ĩ
thuật ion hóa hóa học (Chemical ionization): Trong nguồn ion hóa hóa
học, các ion đ
ượ
c t
ạ
o ra thông qua s
ự
va ch
ạ
m của các phân t
ử
ch
ấ
t phân tích v
ớ
i
các ion s
ơ
c
ấ

p (thuốc th
ử
) đ
ượ
c cho vào nguồn ion. Trong nguồn ion, đ
ầ
u tiên
các electron s
ẽ
ion hóa thuốc th
ử
(các phân t
ử
H
2
, CH
4
, H
2
O, CH
3
OH, ) sau đó
các ion của thuốc th
ử
l
ạ
i va ch
ạ
m v
ớ

i nhau và va ch
ạ
m v
ớ
i phân t
ử
trung hoà của
ch
ấ
t c
ầ
n phân tích t
ạ
o ra một môi tr
ườ
ng ion hóa qua một lo
ạ
t các ph
ả
n
ứ
ng. C
ả

hai d
ạ
ng ion âm và d
ươ
ng của ch
ấ

t phân tích s
ẽ
đ
ượ
c t
ạ
o ra thông qua các ph
ả
n
ứ
ng hóa học v
ớ
i các ion trong môi tr
ườ
ng này.
-K
ĩ
thuật ion hóa đi
ệ
n tr
ườ
ng (Field ionization): Là k
ĩ
thu
ậ
t s
ử
dụng một đi
ệ
n

tr
ườ
ng m
ạ
nh (8-12 kV) gi
ữ
a hai đi
ệ
n c
ự
c đ
ể
t
ạ
o ra các ion t
ừ
các phân t
ử
pha khí.
Các phân t
ử
m
ẫ
u
ở
pha khí ti
ế
n g
ầ
n t

ớ
i b
ề
m
ặ
t đi
ệ
n c
ự
c có đi
ệ
n th
ế
(+) cao. Khi
đi
ệ
n tr
ườ
ng
ở
b
ề
m
ặ
t này đủ m
ạ
nh, một đi
ệ
n t
ử

của phân t
ử
m
ẫ
u s
ẽ
chuy
ể
n vào
đi
ệ
n c
ự
c, k
ế
t qu
ả
là t
ạ
o thành cation gốc M
+
. Ion này b
ị
đi
ệ
n c
ự
c đ
ẩ
y v

ề
phía đi
ệ
n
c
ự
c âm v
ớ
i một khe nhỏ đ
ể
các ion có th
ể
đi vào bộ ph
ậ
n phân tích khối.

 Bộ phân tích khối: Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách
riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector.
 Detector:có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ
điện tử của máy khối phổ.
 Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển
thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ
khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng,
1.4. Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
Trong các nghiên cứu về Dược động học, Sinh khả dụng, Tương đương sinh
học…phương pháp định lượng hoạt chất/chất chuyển hóa trong dịch sinh học đóng vai
trò rất quan trọng, quyết định đến khả năng thành công của các nghiên cứu này. So với