Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ tách từ chuột cống trắng của ba hợp chất flavonoid nụ vối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TĂNG SINH
TẾ BÀO CƠ TRƠN ĐỘNG MẠCH CHỦ TÁCH
TỪ CHUỘT CỐNG TRẮNG CỦA BA HỢP
CHẤT FLAVONOID NỤ VỐI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TĂNG SINH
TẾ BÀO CƠ TRƠN ĐỘNG MẠCH CHỦ TÁCH
TỪ CHUỘT CỐNG TRẮNG CỦA BA HỢP
CHẤT FLAVONOID NỤ VỐI

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 60720405

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế
2. TS. Trần Thị Hiền

HÀ NỘI - 2017


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 2
1.1. Vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch trong xơ vữa động mạch ..... 2
1.1.1. Một vài nét về bệnh xơ vữa động mạch .................................................. 2
1.1.2. Cấu tạo động mạch, sự hình thành mảng xơ vữa và vai trò của sự tăng
sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch ............................................ 5
1.2. Một số phương pháp cô lập và tách tế bào cơ trơn động mạch từ động vật..... 12
1.2.1. Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Ricardo
Villa-bellosta ................................................................................................... 12
1.2.2. Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Rupande Tripathi .. 13
1.2.3.Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Neeta
Adhikari ........................................................................................................... 14
1.3. Một số phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế
bào cơ trơn động mạch chủ ............................................................................. 14
1.3.1. Phương pháp Alamar Blue .................................................................... 14
1.3.2. Phương pháp MTT ................................................................................ 16
1.3.3. Phương pháp SRB ................................................................................. 16

1.4. Một vài nét về cây vối .............................................................................. 17
1.4.1. Tên khoa học ......................................................................................... 17
1.4.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 17
1.4.3. Phân bố, sinh thái .................................................................................. 17
1.4.4. Thành phần hóa học .............................................................................. 18
1.4.5. Công dụng và tác dụng dược lý ............................................................ 19
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 22
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 22
2.1.1. Động vật nghiên cứu ............................................................................. 22
2.1.2. Hóa chất và trang thiết bị ...................................................................... 22


2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23
2.2.1. Triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống............... 23
2.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của
một số chất chiết tách từ nụ Vối...................................................................... 26
2.2.3. Xử lý số liệu .......................................................................................... 28
CHƢƠNG 3:29 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ......... 29
3.1. Kết quả tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống ...................... 29
3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của
một số chất chiết tách từ nụ Vối...................................................................... 35
3.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của
một số chất chiết tách từ nụ Vối ..................................................................... 35
3.2.2. Đánh giá độc tính trên tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất
chiết tách từ nụ Vối ......................................................................................... 37
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 38
4.1. Tách tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột cống trắng ............................. 40
4.2. Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất
chiết tách từ nụ Vối ......................................................................................... 44
KẾT LUẬN .................................................................................................... 49

KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
OxLDLs Lipoprotein tỉ trọng thấp bị oxy hóa
NO

Nitric oxid

AT-II

Angiotensin

MTT

3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid

LPS

Lipopolysaccharide

VSMC

Tế bào cơ trơn động mạch chủ


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1: Bố trí trong từng giếng với dịch chiết CO1, CO2, CO3 ................ 27

Bảng 3.1. Giá trị mật độ quang của các lô thử so với lô chứng ...................... 35
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độc tính của các mẫu thử CO1, CO2 và CO3 .... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu tạo động mạch ........................................................................... 7
Hình 3.1. Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 1. 29
Hình 3.2. Bộc lộ động mạch chủ chuột ........................................................... 30
Hình 3.3. Đăt động mạch chủ trong dung dịch collagenase tuýp 2 ................ 30
Hình 3.4. Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 2. 32
Hình 3.5. Tế bào cơ trơn động mạch chủ thu được theo phương pháp 1 ....... 34
Hình 3.6. Tế bào cơ trơn động mạch chủ thu được theo phương pháp 2 ....... 34
Hình 3.7. Số lần tăng sinh tế bào của các lô thử so với lô chứng trắng .......... 36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xơ vữa động mạch là bệnh ngày càng phổ biến đặc biệt ở các nước có
kinh tế phát triển trên thế giới. Bệnh thường tiến triển âm thầm nhưng để lại
những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe và cuộc sống. Theo ước tính của tổ
chức Y tế thế giới WHO, hàng năm có khoảng 17 triệu người tử vong do bệnh
tim mạch có nguyên nhân từ xơ vữa động mạch. Các nghiên cứu về bệnh
cũng đã được triển khai nhằm hiểu rõ hơn về nguyên nhân gây bệnh và các
phương pháp điều trị. Kết quả cho thấy sự tăng sinh của tế bào cơ trơn đóng
vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh xơ vữa động mạch [12]. Vì vậy đã
có những nghiên cứu được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh
của tế bào cơ trơn của các chất trong điều trị xơ vữa động mạch.
Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên
có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tốt
đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh bởi ưu điểm dễ
hấp thu, chuyển hóa trong cơ thể, ít tác dụng phụ và ít độc tính hơn so với các

chất có nguồn gốc tổng hợp hóa học. Ở nước ta, cây Vối có tên khoa học là
Cleistocalyx operculatus (Roxb). Merr et Perry họ Sim Myrtaceae, đã được sử
dụng theo kinh nghiệm dân gian điều trị nhiều chứng bệnh như chữa sốt, viêm
dạ dày, đặc biệt là đái tháo đường, mỡ máu [2]... Tuy nhiên các công trình
khoa học nghiên cứu về cây Vối còn ít. Đặc biệt chưa có nghiên cứu nào về
tác dụng của nụ Vối trên các bệnh và các biến chứng liên quan đến đái tháo
đường, mỡ máu như xơ vữa động mạch. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ
tách từ chuột cống trắng của ba hợp chất dịch chiết nụ Vối” với hai mục
tiêu:
1. Triển khai kỹ thuật tách tế bào cơ trơn động mạch chủ tách từ chuột cống
trắng.
2. Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột
cống trắng do yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF) của một
số chất từ nụ Vối bằng kỹ thuật MTT.
1


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch trong xơ vữa động mạch
1.1.1. Một vài nét về bệnh xơ vữa động mạch
1.1.1.1. Định nghĩa
Tổ chức Y tế thế giới định nghĩa: “Xơ vữa động mạch là sự phối hợp
các hiện tượng thay đổi cấu trúc nội mạc của các động mạch lớn và vừa, bao
gồm sự tích tụ cục bộ của các lipid, các phức hợp glucid, máu và các sản
phẩm của máu, mô xơ và cặn lắng acid, các hiện tượng này kèm theo sự thay
đổi ở lớp trung mạc” [1].
Xơ vữa động mạch là hiện tượng xơ hóa thành động mạch trong đó chủ
yếu xảy ra ở các động mạch trung bình và động mạch lớn. Biểu hiện chủ yếu

là sự lắng đọng mỡ và các mảng tế bào tại lớp bao trong thành động mạch
(gọi là mảng vữa). Xơ vữa động mạch là bệnh do động mạch bị xơ cứng và
nhỏ hẹp hơn bình thường, bệnh có thể xảy ra ở bất kỳ vùng nào trong cơ thể
và là nguyên nhân chính gây đột quỵ (rối loạn tuần hoàn não), cơn đau tim và
thiểu năng tuần hoàn ở cẳng chân. Xơ vữa động mạch gây ra hai biến chứng
nguy hiểm là nhồi máu cơ tim và tai biến mạch não.
Xơ vữa động mạch là sự nhiễm mỡ và xơ hóa một số chỗ ở thành các động
mạch. Lipid đến gắn vào thành động mạch ở các vị trí tổn thương thành từng
mảng gọi là mảng xơ vữa. Xơ vữa động mạch thường xảy ra ở các động mạch lớn
và vừa, ít đi vào các tiểu động mạch. Các mảng xơ vữa gây bệnh nhiều ít rất khác
nhau, có những mảng nằm yên trong thời gian dài nhưng không có một tác hại
nào, một số mảng xơ vữa nằm ở những nơi “xung yếu” như lỗ đi vào hai động
mạch thận, khúc gần của động mạch vành trái, cửa ngõ các động mạch sọ não...
thì có thể gây tăng huyết áp, gây tai biến nặng mạch vành, mạch não [3].

2


1.1.1.2. Phân loại xơ vữa động mạch
Có một số cách phân loại xơ vữa động mạch như phân loại theo nguyên
nhân, phân loại theo vị trí tổn thương, phân loại theo các giai đoạn của xơ vữa
động mạch…
Phân loại xơ vữa động mạch theo nguyên nhân:
Xơ vữa động mạch nguyên nhân huyết động: trong loại này, tăng huyết
áp đóng vai trò rất quan trọng, xơ vữa động mạch xuất hiện sớm. Hiện tượng
co mạch nhiều và kéo dài gặp trong tăng huyết áp, tạo điều kiện cho các tổn
thương xơ vữa động mạch hình thành tại chỗ hay ở từng vùng. Các rối loạn
vận mạch khác gây tình trạng mất ổn định của trương lực động mạch, có thể
dẫn tới tình trạng tăng lipid máu [9], [6].
Xơ vữa động mạch nguyên nhân chuyển hóa: các rối loạn di truyền liên

quan đến chuyển hóa lipid nhất là cholesterol là một trong những yếu tố nguy
hại lớn nhất. Chế độ ăn uống không hợp lý, nhất là việc sử dụng quá nhiều mỡ
động vật đã làm tăng loại cholesterol có hại như cholesterol tỷ trọng thấp
(LDL) và rất thấp (VLDL). Trong các bệnh nội tiết dễ gây vữa xơ động mạch
phải kể đến bệnh đái tháo đường, thiểu năng giáp, thiểu năng hormon sinh
dục [9].
Xơ vữa động mạch nguyên nhân hỗn hợp: trong đó có mặt các nguyên
nhân nói trên, nhất là tăng huyết áp và tăng lipid máu.
Phân loại xơ vữa động mạch theo vị trí tổn thƣơng: theo vị trí tổn
thương gồm xơ vữa động mạch chủ và các nhánh động mạch lớn, xơ vữa
động mạch vành, não, thận, mạc treo. Các động mạch ngoại vi nhất là chi
dưới. Xơ vữa động mạch nơi khác ít gặp hơn.
Phân loại theo các giai đoạn của xơ vữa động mạch: Xơ vữa động
mạch gồm hai giai đoạn. Giai đoạn đầu gọi là giai đoạn tiền lâm sàng. Ở giai
đoạn này, tại một cơ quan nhất định, các tổn thương chưa đủ lớn để có thể
phát hiện được bằng các phương pháp hiện dùng như chụp cản quang động
3


mạch, siêu âm doppler. Tuy nhiên ở giai đoạn này cũng đã có một số triệu
chứng có ý nghĩa báo hiệu. Các dấu hiệu chung nhất là sự thay đổi về sinh
hóa thành phần lipid trong máu và các biểu hiện có tính chất toàn thể. Giai
đoạn này có thể phân chia thành hai thời kỳ. Thời kỳ trước xơ vữa và thời kỳ
xơ vữa động mạch tiềm tàng. Trong giai đoạn này đã có những rối loạn chức
năng thành mạch nhưng chưa đáng kể về cấu trúc và chức năng của các cơ
quan được động mạch đó nuôi dưỡng [9].
Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn đã có các biểu hiện lâm sàng. Trong
giai đoạn này có thể chia làm ba thời kỳ. Thời kỳ một, cơ quan được nuôi
dưỡng bởi động mạch bị thiểu năng tuần hoàn và đã có những rối loạn dinh
dưỡng nhưng còn khả năng phục hồi. Thời kỳ hai, đã có các thương tổn thoái

hóa và hoại tử nặng hơn, có nhiều biểu hiện lâm sàng đặc hiệu tùy theo từng
vị trí tổn thương. Thời kỳ ba, tại các cơ quan bị bệnh, tổ chức sẹo phát triển
sau nhiều biến đổi liên tiếp và kéo dài [9].
Cách phân loại khác: theo tính chất tiến triển của vữa xơ động mạch
dựa vào một số tiêu chuẩn gián tiếp như các kết quả sinh hóa máu, nghiệm
pháp gắng sức, chụp động mạch, triệu chứng lâm sàng…trên cơ sở đó chia xơ
vữa động mạch làm ba loại: loại đang phát triển, tức là loại hoạt động; loại đã
ổn định, tức là không còn hoạt động nữa và loại thoái triển trong đó có các
thương tổn giảm dần tuy không thể hết hẳn [9].
1.1.1.3. Một vài nét về dịch tễ xơ vữa động mạch
Xơ vữa động mạch cùng với các biến chứng của nó là nguyên nhân
hàng đầu gây tử vong và bệnh tật ở các nước phát triển. Chỉ tính riêng ở
Hoa Kỳ, một thống kê gần đây cho thấy có 60 triệu người trưởng thành
đang bị bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch. Tử vong do xơ vữa động
mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong hàng năm và phí tổn do bệnh lên
đến 128 tỉ đô la mỗi năm [42]. Tỷ lệ người trên 60 tuổi mắc xơ vữa động
mạch lên tới 88% [1].
4


Các yếu tố chính gây ra sự tăng tần suất xơ vữa động mạch là hút thuốc
lá, ít vận động thể lực và chế độ ăn nhiều năng lượng, giàu chất béo và
cholesterol. Trong những năm gần đây xơ vữa động mạch bắt đầu trở thành
một vấn đề lớn đối với ngành y tế ở nhiều nước đang phát triển. Theo ước
tính của các chuyên gia y tế, tử vong do bệnh tim mạch ở các nước đang phát
triển là 9 triệu ca trong năm 1990 sẽ tăng đến 19 triệu ca trong năm 2020 [31].
Ở một số nước Châu Á, Trung Đông và Mỹ La tinh tỷ lệ tử vong do bệnh tim
mạch hiện đã cao hơn tử vong do bệnh truyền nhiễm [32].
Tại Việt Nam, năm 1986, tử vong do nguyên nhân xơ vữa động mạch
gây nên chủ yếu là tai biến mạch mãu não (85,14%) và tai biến mạch vành

(14,8%) [5].
Tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108, theo Nguyễn Văn Tảo, từ 1985
đến 1989 số tử vong của bệnh nhân thuộc nhóm 7 đứng hàng thứ hai trên 17
nhóm bệnh và chiếm 14% tổng số tử vong, 2/3 các trường hợp trong nhóm này
chết ở tuổi 50 do các biến chứng của xơ vữa động mạch và tăng huyết áp [10].
Theo thống kê của tác giả Phạm Trường Sơn năm 2013, trong các nghiên
cứu giải phẫu bệnh ở các bệnh nhân đái tháo đường có tới 75% bệnh nhân không
có biểu hiện lâm sàng của bệnh động mạch vành nhưng có xơ vữa động mạch
mức độ nặng và tỷ lệ nhồi máu cơ tim, thiếu máu cơ tim thầm lặng tăng cao [8].
Theo thống kê của Viện Tim Mạch Việt Nam, tỉ lệ bệnh động mạch
vành chủ yếu do nguyên nhân xơ vữa động mạch gây ra tăng dần trong những
năm gần đây.
1.1.2. Cấu tạo động mạch, sự hình thành mảng xơ vữa và vai trò của sự
tăng sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch
1.1.2.1. Cấu tạo động mạch
Các động mạch có cấu trúc bao gồm ba lớp là lớp áo trong, lớp áo giữa
và lớp áo ngoài [4]:
Lớp áo trong: lớp trong cùng. Lớp áo trong bao gồm:
5


Lớp tế bào nội mô lót mặt trong lòng ống mạch máu. Các tế bào nội mô
không chỉ tạo nên một bề mặt trơn phẳng mà còn tiết collagen tuýp II, IV và
V, lamin, endothelin, nitric oxid (NO). Ngoài ra tế bào nội mô thành mạch
còn tiết ra men chuyển angiotensin, bradykinin, serotonin, các prostaglandin,
thrombin, norepinephrin.
Lớp dưới nội mô: nằm ngay dưới lớp tế bào nội mô (nằm ở giữa của lớp
nội mô và lá chun trong) bao gồm những mô liên kết lỏng lẻo và các tế bào cơ
trơn nằm rải rác.
Phía dưới lớp dưới nội mô là lá chun trong, có các sợi chun, ngăn cách

lớp áo trong với lớp áo giữa.
Lớp áo giữa: là lớp dày nhất, cấu tạo chủ yếu gồm các tế bào cơ trơn
được bao quanh bởi rất nhiều sợi collagen, chất nền ngoại bào và các vòng lá
chun có các lỗ hở không đều. Các sợi collagen tạo khung nâng đỡ các tế bào
cơ trơn và chống phình giãn thành mạch. Khoảng gian bào giữa các tế bào cơ
trơn cũng chứa nhiều các glycoprotein như fibronectin, vitronectin… Elastin
cũng được xếp xen kẽ giữa các lớp tế bào.
Lớp áo ngoài (vỏ ngoài): ở ngoài cùng, gồm nhiều sợi nguyên bào,
cấu tạo chủ yếu gồm mô liên kết. Ngăn áo giữa với áo ngoài là lá chun ngoài.
Áo ngoài của các mạch máu lớn như động mạch, tĩnh mạch còn có các mạch
máu nhỏ nằm trong vùng ngoài của lớp áo giữa để cung cấp oxy và các chất
nuôi dưỡng cho các tế bào này hoạt động.

6


Hình 1.1. Cấu tạo động mạch
1.1.2.2. Sự hình thành mảng xơ vữa
Mảng vữa xơ hình thành âm thầm từ rất sớm khi còn trẻ, tiến triển lặng
lẽ hàng chục năm và thường chỉ biểu hiện khi ở tuổi 40-60. Theo thuyết về “đáp
ứng với tổn thương”: khi động mạch có những tác động gây tổn thương như tình
trạng tăng lipid máu, tăng huyết áp, lipoprotein phân tử lượng thấp (LDL) và các
tác nhân kích thích khác tác động vào tế bào nội mô gây ra đáp ứng dẫn đến tình
trạng viêm. Quá trình viêm mạn tính sẽ dẫn đến xơ vữa động mạch.
Xơ vữa động mạch bắt đầu từ tổn thương của tế bào nội mô. Khi tế bào
nội mô tổn thương, biểu hiện bằng sự giảm sản xuất nitric oxid (NO), đảo lộn
cấu trúc sợi chun làm mất dần các sợi tạo keo, tăng tính thấm của tế bào nội
mô với lipoprotein và các thành phần khác của huyết tương, tăng khả năng
bám dính của tế bào nội mô với bạch cầu và tiểu cầu, tăng khả năng hình
thành huyết khối. Đây là sự đáp ứng thích nghi của thành mạch máu với các

tác nhân kích thích. Khi có các kích thích các tế bào nội mô bộc lộ trên bề mặt
tế bào các phân tử bám dính nội bào (ICAM-1) có khả năng liên kết với nhiều
loại bạch cầu khác nhau và phân tử bám dính tế bào mạch máu (VCAM-1)
7


liên kết với các tế bào mono và lympho-T [34]. Sau khi tế bào mono bám dính
vào các tế bào nội mô chúng được cố định tại lớp áo trong thành mạch, lúc
này nếu gặp các yếu tố gây tổn thương như chemokin và các lipoprotein bị
oxi hóa đặc biệt là LDL sẽ kích thích và biến đổi chúng thành các đại thực
bào [36]. Đại thực bào sản xuất interleukin (IL)-1, và các yếu tố hoại tử khối
u (TNF) càng làm tăng cường sự bám dính hơn nữa của các đại thực bào.
Đồng thời đại thực bào cũng sản xuất ra các chemokin, bao gồm protein hoá
hướng động bạch cầu mono (MCP)-1, thu hút nhiều bạch cầu tới mảng xơ
vữa. Khi có LDL trong thành mạch máu, các phân tử LDL sẽ bị các đại thực
bào thu dọn thông qua các receptor dọn rác trên bề mặt đại thực bào dẫn tới
hình thành nên các peroxid lipid và tạo điều kiện để hình thành cholesterol
ester và như vậy hình thành nên tế bào bọt. Các tế bào bọt tụ lại thành đám
dưới lớp nội mô.
Giai đoạn hai là giai đoạn hình thành các vệt nhiễm mỡ. Trên bề mặt
của lớp nội mô động mạch xuất hiện các vệt nhỏ màu vàng nhạt, kéo dài, dọc
theo dòng máu, rải rác từng chỗ, ít nổi gờ. Ban đầu các vệt mỡ chỉ gồm các tế
bào mono, lympho và tế bào bọt, về sau có mặt của rất nhiều tế bào cơ trơn
mạch máu. Tế bào mỡ tăng sinh dần làm thành các hạt mỡ. Bao bọc các hạt
mỡ là các tế bào cơ trơn và xung quanh là chất nền giàu collagen. Sự tích tụ
cholesterol trong mảng xơ vữa phản ánh sự mất cân bằng giữa lượng
cholesterol đi vào và đi ra khỏi mạch máu. Trong trường hợp này sự xuất hiện
HDL là có ích, nồng độ cao HDL có thể giúp thu dọn cholesterol từ các mảng
xơ vữa. Lúc đầu các vệt nhiễm mỡ còn thưa, càng về sau càng dày làm thành
các đám dạng lưới. Các thương tổn ở giai đoạn này chứa rất nhiều mỡ trong

và ngoài tế bào.
Giai đoạn ba là giai đoạn hình thành các thương tổn xơ vữa động mạch.
Đến giai đoạn này, các thương tổn xơ vữa động mạch tiến triển nhanh. Tổn
thương khiến cho các tế bào nội mô sinh ra các yếu tố tiền đông thay vì các
8


chất chống đông và hình thành các chất tạo mạch, các cytokin và các yếu tố
tăng trưởng. Quá trình viêm kích thích sự di chuyển và tăng sinh của các tế
bào cơ trơn mạch máu tới ổ viêm để hình thành các tổn thương. Kết hợp hai
yếu tố trên với sự tích lũy dịch ngoại bào sẽ làm thành động mạch dày lên làm
cho lòng động mạch hẹp dần.
Khi quá trình viêm vẫn tiếp diễn dẫn đến sự gia tăng số lượng đại thực
bào, tế bào lympho và các tiểu cầu có nguồn gốc từ máu, tế bào cơ trơn mạch
máu vẫn di chuyển tới lớp áo trong, tăng sinh và sản xuất dịch gian bào,
chuyển các vết mỡ thành các mảng xơ vữa bền vững làm tổn thương lan rộng.
Quá trình viêm kéo dài sẽ gây tổn thương vừa và nặng, lúc này sẽ có một vỏ
chất xơ bao quanh một lõi hoại tử gồm bạch cầu, lipid và các mảnh vỡ, tổn
thương bị cô lập khỏi thành mạch. Lõi hoại tử là kết quả của sự gia tăng hoạt
động của yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), TGF-β, IL-1,
TNF-α, osteoponin, và sự giảm thoái hoá các mô liên kết. Lúc này bạch cầu
xâm nhập vào tổn thương và bám dính tại đó làm tăng kích thước của tổn
thương. Các yếu tố kích thích sự tập trung của các đại thực bào bao gồm yếu
tố kích thích đại thực bào (MCSF), MCP-1 và LDL bị oxi hoá.
Giai đoạn bốn tổn thương canxi hóa, loét. Lắng đọng can xi ở vùng
hoại tử của vùng xơ vữa. Các vùng bị canxi hóa đều bị cản quang, nên khi
chụp xquang đều có thể thấy dạng chấm kiểu “vỏ trứng”. Loét có thể xuất
hiện ở ngay giữa mảng xơ vữa hay ở vùng xung quanh. Loét bao giờ cũng mở
vào lòng động mạch. Trên cơ sở các thương tổn trên, thường hình thành huyết
khối. Bất cứ thương tổn nào ở nội mô dù do bất cứ nguyên nhân nào cũng làm

tăng độ dính tiểu cầu vị trí đó. Huyết khối tiểu cầu bám chặt vào nội mô và
được một lớp fibrin phủ lên, dần dần hợp nhất với mảng xơ vữa có sẵn, làm
cho mảng này dày lên. Các vi huyết khối tiểu cầu có thể gây đông máu tại chỗ
làm thành cục máu đông. Những cục máu đông này có thể bong ra, trôi đi
dòng máu và gây nên tắc mạch.
9


Ở giai đoạn cuối, các mảng xơ vữa ngày càng nhiều, diện tích ngày
càng lớn, các mảnh canxi hóa có xu hướng nối tiếp nhau, đồng thời tổ chức
xơ cũng phát triển ngày càng rộng. Thương tổn đến giai đoạn này sẽ không
hồi phục được, làm hẹp dần lòng động mạch, cản trở tuần hoàn gây bít tắc
động mạch sẽ gây nên nhiều hậu quả nghiêm trọng.
1.1.2.3. Vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch
Quá trình hình thành mảng xơ vữa động mạch được bắt đầu khi nội
mạc bị viêm do một số chất như lipoprotein tỉ trọng thấp bị oxy hóa
(OxLDLs). Các nguyên nhân gây nên tình trạng trên có thể là các chất hóa
học như tăng cholesterol máu, hoặc do nguyên nhân cơ học như tăng huyết
áp, hoặc do nguyên nhân miễn dịch như trong trường hợp bệnh nhân có ghép
tim hay ghép thận. Chính những thương tổn đầu tiên ở lớp tế bào nội mô động
mạch này làm cho một số thành phần của huyết tương bám vào và làm tăng
kết dính tiểu cầu [9]. Khi các phân tử kết dính tế bào trên bề mặt nội mô ngày
càng nhiều sẽ thúc đẩy quá trình kết dính bạch cầu và kích hoạt các quá trình
tiếp theo của chúng trong nội mạc.
Tế bào cơ trơn thành mạch máu có thể tồn tại ở hai trạng thái, trạng thái
đàn hồi và trạng thái tổng hợp, trong đó trạng thái đàn hồi là trạng thái không
hoạt động của tế bào, trạng thái tổng hợp là trạng thái hoạt động của tế bào cơ
trơn. Khi ở trạng thái tổng hợp, các tế bào cơ trơn sản sinh các collagen,
elastin, các proteoglycan, các yếu tố tăng trưởng và các cytokin. Một trong
những yếu tố tăng sinh mạnh mẽ tế bào cơ trơn động mạch được các đại thực

bào và tiểu cầu khi xâm nhập vào tiết ra là yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu
cầu (PDGF). PDGF hoạt động thông qua receptor tyrosine kinase thúc đẩy hoạt
hóa enzym kinase phụ thuộc cyclin, tổng hợp ADN và tham gia vào pha S của
chu kỳ tế bào. Thậm chí một LDL bị oxi hóa nhẹ thông qua tín hiệu của thụ
thể PDGF cũng gây ra những thay đổi trong mảng xơ vữa. Chính những
yếu tố này sẽ tác động đến tế bào cơ trơn thành mạch máu (VSMC) làm các
10


tế bào cơ trơn biến đổi dần và chuyển đổi kiểu hình theo hướng lan rộng,
tăng sinh và tăng tiết, đây chính là “trạng thái tổng hợp” của tế bào cơ trơn.
Sau khi chuyển đổi sang trạng thái tổng hợp, các tế bào cơ trơn mạch máu
tiết ra quá nhiều collagen ảnh hưởng đến chu trình hoạt động bình thường
của mạch máu. Mất chu trình hoạt động bình thường của mạch máu và tính
toàn vẹn nội mô, tiếp theo là việc tích tụ của VSMC do tăng sinh quá mức,
dẫn đến dày lòng mạch trong xơ vữa động mạch.
Các tế bào cơ trơn tổng hợp phần lớn chất nền ngoại bào là thành phần
quan trọng trong tổn thương xơ vữa động mạch. Đây là bước chuyển tiếp
quan trọng trong quá trình xơ hóa các vệt mỡ. Các tế bào cơ trơn trong các
mạch máu được bao bọc bởi một chất dịch gian bào có cấu trúc phức tạp bao
gồm một lượng lớn collagen tuýp I và III, elastin và các proteoglycan. Các
chất này có tác dụng giữ vững cấu trúc mô và giúp thực hiện các chức năng
của tế bào. Matrix metallo proteinases (MMPs) là yếu tố định cư trên bề mặt
tế bào có khả năng làm giảm dịch gian bào, MMPs xúc tác và loại bỏ màng
đáy xung quanh tế bào cơ trơn và tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác với
dịch gian bào, tạo điều kiện để các tế bào cơ trơn di chuyển ra ngoài khi có
tổn thương và thúc đẩy sự biến đổi tế bào từ trạng thái không hoạt động sang
trạng thái hoạt động. Khi tế bào cơ trơn di chuyển từ lớp áo giữa ra lớp áo
ngoài, tại đây chúng tăng sinh và làm lắng đọng các thành phần của dịch gian
bào, chuyển vệt mỡ thành các mảng xơ vữa trưởng thành, và góp phần vào sự

phát triển của các tổn thương xơ vữa động mạch. Hoạt động di chuyển và tăng
sinh của tế bào cơ trơn được điều hoà bởi các yếu tố kích thích tăng trưởng và
các chất ức chế. Các chất kích thích như PDGF, ET-1, thrombin, FGF, FN-1 và
IL-1. Yếu tố ức chế bao gồm: heparin sulfat, nitric oxid (NO) và yếu tố tăng
trưởng chuyển dạng β (TGF-β). Các yếu tố điều hoà khác bao gồm: angiotensin
(AT)-II, các catecholamine, estrogen receptor, và osteopontin, một thành phần
của dịch gian bào. Các cytokine gây viêm như: IL-1, IL-4 và yếu tố hoại tử khối
11


u (TNF-α) hiệp đồng tác dụng với PDGF và các yếu tố tăng sinh xơ (FGF-2) sản
sinh một lượng lớn MMP trong đó PDGF đóng vai trò quan trọng nhất.
Như vậy các tổn thương trên thành mạch máu, sự tạo thành các vệt mỡ,
tế bào bọt hoặc các yếu tố tăng trưởng tiểu cầu, yếu tố tăng sinh xơ sẽ tăng hoạt
hóa tế bào cơ trơn chuyển sang trạng thái hoạt động, tăng sinh và tăng di chuyển
các tế bào cơ trơn mạch máu từ màng trong ra ngoài. Tế bào cơ trơn tăng sản xuất
các chất góp phần hình thành mảng xơ vữa trong đó yếu tố tăng trưởng tiểu cầu
đóng vai trò quan trọng trong hình thành mảng xơ vữa. Vì vậy, ức chế tăng sinh tế
bào cơ trơn mạch máu do các yếu tố trên đặc biệt do yếu tố tăng trưởng tiểu cầu
có tác dụng quan trọng trong phòng và điều trị xơ vữa động mạch.
1.2. Một số phƣơng pháp cô lập và tách tế bào cơ trơn động mạch từ
động vật
1.2.1. Phƣơng pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Ricardo
Villa-bellosta
Sử dụng động vật nghiên cứu là chuột cống trưởng thành, 5 tuần tuổi.
Các hóa chất sử dụng bao gồm: collagenase tuýp 2, môi trường nuôi cấy sử dụng
là MEM có bổ sung penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 mg/mL, huyết
thanh bò (FBS). Dung dịch đệm được sử dụng là đệm phosphat (PBS): 1,54 mM
KH2PO4, 155,17 mM NaCl và 2,70 mM Na2HPO4, pH 7.4 [39].
Phương pháp cô lập và tách tế bào cơ trơn động mạch chủ của Ricardo

được tiến hành gồm các bước cơ bản như sau:
Động mạch chủ sau khi được tách khỏi cơ thể sống được đặt trong đệm
PBS. Loại bỏ các mô xung quanh động mạch chủ mới được cô lập. Chuyển
động mạch chủ vào đĩa có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 và đặt trong tủ
ấm ở 37°C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2 trong 15 phút
mà không tác động gì thêm. Loại bỏ các mảng mô bám xung quanh động
mạch. Cắt động mạch chủ thành các mảnh nhỏ, chuyển vào ống falcon có

12


chứa collagenase tuýp 2 tiếp tục ủ ở 37° C trong 90 phút. Khuấy trộn nhẹ
nhàng liên tục trong suốt quá trình ủ [39].
Ly tâm hỗn hợp tế bào với tốc độ 3000 vòng trong 5 phút. Loại dịch nổi
và thêm vào môi trường MEM. Rửa tế bào 2 lần bằng môi trường MEM bổ
sung 10% FBS. Tế bào thu được đem nôi cấy trong đĩa petri ở 37°C trong môi
trường không khí có 95% O2 và 5% CO2. Thay môi trường nuôi cấy sau mỗi 2
ngày (sử dụng MEM bổ sung với 10% FBS).
1.2.2. Phƣơng pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả
Rupande Tripathi
Về hóa chất sử dụng: ngoài enzym collagenase tuýp 2 như trong
phương pháp của tác giả Ricardo Villa-bellosta, tác giả Rupande Tripathi còn
sử dụng thêm enzym elastase (Worthington Biochemical LS002279) và chất
ức chế trypsin (Worthington Biochemical LS003570). Sử dụng đệm HBSS
(Hank’s Buffered Salt Solution) thay cho đệm phosphat PBS. Môi trường
nuôi cấy tế bào MEM được thay thế bằng môi trường DMEM/F12 (Gibco
11.320) [38].
Về phương pháp tiến hành, tác giả Rupande Tripanthi cũng sử dụng
động vật nghiên cứu là chuột cống trưởng thành tuy nhiên theo tác giả
Rupande Tripathi thì quá trình cô lập tế bào sẽ thành công hơn nếu sử dụng

chuột dưới 10 tuần tuổi, và tác giả này đã lựa chọn chuột 3-4 tuần tuổi để tiến
hành thí nghiệm tách tế bào cơ trơn. Để tách tế bào cơ trơn động mạch chủ,
các bước tiến hành tương tự như phương pháp của tác giả Ricardo Villabellosta nhưng sau khi ủ với collagenase từ 8-10 phút tác giả Rupande
Tripanthi tiếp tục ủ động mạch chủ với collagenase và elastase ở nhiệt độ
37oC trong 1 giờ.
Về nuôi cấy tế bào sau khi tách: sau khi tách được tế bào cơ trơn mạch
máu các tế bào sẽ được nuôi cấy trong đĩa petri bằng môi trường DMEM có
bổ sung 10% FBS và để yên trong 5-7 ngày trước khi tiến hành thay môi
13


trường nuôi cấy lần 1. Các bước cấy chuyển tế bào tương tự như phương pháp
của tác giả Ricardo Villa-bellosta.
1.2.3. Phƣơng pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Neeta
Adhikari
Về hóa chất đã sử dụng, tác giả Neeta Adhikari đã tiến hành tách tế
bào cơ trơn động mạch ở chuột nhắt C57BL6J, giống đực, trưởng thành
(14-16 tuần tuổi). Sử dụng enzym collagenase tuýp 2, trypsin, đệm
phosphat PBS, môi trường DMEM.
Phương pháp cô lập tế bào cơ trơn giống phương pháp của tác giả
Ricardo Villa-bellosta [13].
Về phương pháp tiến hành và nuôi cấy: tác giả Neeta Adhikari cấy
chuyển tế bào giống tác giả Rupande Tripanthi vào ngày thứ 5, pha loãng ½,
sử dụng một nửa để thí nghiệm. Phần còn lại được nhuộm xanh trypan để đếm
số lượng tế bào sống. Kết quả cho thấy số lượng tế bào trong 1mL là 25-35 x
103 tế bào/mL sau 5 ngày phát triển.
1.3. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tăng sinh
tế bào cơ trơn động mạch chủ
Có nhiều phương pháp để nghiên cứu sự tăng sinh của tế bào đã được
áp dụng. Một số tác giả sử dụng các chất đồng vị phóng xạ như 51Cr hoặc các

chất sinh hóa có gắn phân tử phóng xạ ví dụ như (3H) thymidin hoặc (125I)
iododeoxyuridin [35]. Bên cạnh đó có những phương pháp không sử dụng
chất phóng xạ đã được phát triển như sử dụng MTT, XTT, MTS và INT [16,
18, 22] hoặc sử dụng lysozomal hexosaminidase NAG [24] hoặc BrDU (5bromo-2-deoxyuridin) [30] hoặc nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm đặc hiệu
DNA có huỳnh quang Hoechst 33258 [15].
1.3.1. Phƣơng pháp Alamar Blue
AlamarBlue là một chất chỉ thị cho khả năng sống của tế bào. Thành phần
của thuốc thử Alamar Blue là resazurin, một hợp chất không độc đối với tế bào,
14


có khả năng thấm qua tế bào, có màu xanh và không phát huỳnh quang. Khi đi
vào tế bào, resazurin chuyển thành resorufin có huỳnh quang đỏ. Chỉ tế bào sống
mới có khả năng chuyển resazurin thành resorufin. Số lượng huỳnh quang tạo ra
tỉ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót, do đó mức độ phát quang là thước đo về
khả năng sống sót của tế bào.
O

-

O

O

O

-

O

O

+

N

O

N
-

Resazurin

Resorufin

(Xanh)

(Hồng)

Theo protocol đã được công bố, Alamar Blue (resazurin natri) được hòa
tan trong đệm phosphat (PBS), pH 7,4, và được sử dụng ở nồng độ 0,1
mg/mL. Theo dõi thay đổi màu, đo quang ở bước sóng 570 nm để đánh giá sự
giảm nồng độ resazurin trên tế bào và đo quang ở bước sóng 595 nm để ghi
lại sự oxy hóa của các resazurin.
Tế bào cơ trơn động mạch chủ tách từ chuột được chia thành các lô và
được kích thích bằng 50 ng/mL PDGF-BB. Lô chứng tế bào được ủ với dung
môi dùng để pha mẫu thử. Lô thử tế bào được ủ với mẫu thử trong 24 giờ. Sau
khi ủ tế bào với mẫu thử, ủ tế bào với Alamar Blue. Tiến hành đo quang ở
bước sóng 570 nm và 595 nm. So sánh mật độ quang của lô ủ mẫu thử và lô
chứng để đánh giá tác dụng của thuốc.

Ưu điểm của phương pháp so với những phương pháp sử dụng chất
phóng xạ lớn nhất là không độc hại, đơn giản và dễ sử dụng [28]. Thuốc thử
được bổ sung trực tiếp vào môi trường nuôi cấy tế bào ở giai đoạn cuối cùng,
không gây độc hại cho tế bào và cho cả người sử dụng. Không như phương
pháp truyền thống sử dụng các đồng vị phóng xạ, phương pháp Alamar Blue
không đòi hỏi phải xử lý đặc biệt nên ít tốn kém hơn. Phương pháp này có thể

15


áp dụng cho việc sàng lọc in vitro ở quy mô lớn do có tính chất đồng nhất.
Đồng thời phương pháp Alamar Blue cho kết quả chính xác tương đương với
các phương pháp có chất sinh hóa phóng xạ kết hợp với thymidin hoặc
phương pháp đo lượng giảm tetrazolium trong các thí nghiệm về sự tăng sinh
và độc tính của tế bào [14, 17, 29].
1.3.2. Phƣơng pháp MTT
Kỹ thuật MTT được dựa trên nguyên tắc MTT [3- (4,5- dimethylthiazol
- 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid] tham gia phản ứng oxy hoá khử
với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Dùng một số
dung dịch (như ethanol, DMSO) để phá huỷ màng tế bào đồng thời hoà tan
các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 550 nm
để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử trên mức độ sống chết của tế bào.

Cách tiến hành
Tế bào cơ trơn động mạch chủ sau khi tách được chia thành các lô và
được kích thích bằng 50 ng/mL PDGF-BB. Lô thử tế bào được ủ với mẫu thử
ở các nồng độ khác nhau trong 24 - 48 giờ. Sau đó ủ tế bào với MTT trong 4 5 giờ. Hút loại bỏ dung dịch nổi, bổ sung ethanol hoặc DMSO và đo độ hấp
thụ quang học ở bước sóng 550 nm.
1.3.3. Phƣơng pháp SRB
Phương pháp SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm

1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế

16


bào. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ở
Mỹ và các nước khác [36].
SRB (Sulforhodamine B) là tinh thể màu tím thẫm, có màu ánh hồng
khi tan trong dung môi acid yếu được dùng làm thuốc nhuộm tế bào. SRB
bám vào các acid amin kiềm của protein trong tế bào. Lượng SRB tỷ lệ thuận
với lượng protein trong tế bào, do đó định lượng được SRB sẽ định lượng
được tế bào cần nghiên cứu. Dựa trên nguyên tắc đó, SRB được sử dụng để
đánh giá sự tăng sinh của tế bào và độc tính của chế phẩm.
1.4. Một vài nét về cây vối
1.4.1. Tên khoa học
Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry
Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb.
Tên khác: Vối nhà
Tên nước ngoài: Lid eugenia (Anh), jambosier à thé (Pháp)
Họ: Sim (Myrtaceae)
1.4.2. Đặc điểm thực vật
Cây to, cao 12-15 m, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành lúc đầu dẹt sau
hình trụ. Lá dày, mọc đối, hình trái xoan hoặc bầu dục, dài 9-18 cm, rộng 4-8
cm, gốc nhọn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn, gần như cùng màu, soi lên có nhiều
phiến mờ, ở lá già, mặt dưới có những chấm đen, cuống lá ngắn [2].
Hoa gần như không cuống, nhỏ, màu lục trắng nhạt, hợp thành cụm hoa
hình tháp tỏa ra ở kẽ những lá đã rụng.
Quả hình cầu hoặc bầu dục, mặt ngoài nhăn nheo, khi chín màu tím.
Mùa hoa quả: tháng 4-5
1.4.3. Phân bố, sinh thái

Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt
đới Đông Nam Á. Việt Nam có ba loài. Vối là cây đặc hữu của vùng Bắc Việt

17


Nam và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, Vối mọc tự nhiên dọc theo các bờ
suối hay bờ các ao hồ ở vùng núi thấp và trung du thuộc các tỉnh Cao Bằng
(Hà Quảng, Nông Thôn, Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc
Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế…); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam
Dương), Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình… Cây Vối còn được
trồng rải rác ở các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ. Cây được trồng ở bờ
ao vừa để chống sạt lở đất, vừa để tận dụng khoảng không gian.
Vối thuộc loại cây gỗ ưa sáng, ưa ẩm, sinh trưởng và phát triển nhanh
chóng, trong vòng ba năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m. Cây phân cành
nhiều, chồi và lá non ra nhiều trong mùa xuân hè. Những cây mọc ở chỗ được
chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt khỏe. Ngoài ra,
để cho cây có nhiều cành lá, người ta thường chặt bớt cành hàng năm, nhằm
kích thích cho sự sinh chồi mới. Chồi mới mọc ra theo kiểu lưỡng phân,
những chồi phát triển thành cành có trên một năm tuổi mới ra hoa [2].
1.4.4. Thành phần hóa học
Tinh dầu lá vối có khoảng 30 thành phần đã được xác định trong đó các
thành phần chính là (Z)-β-ocimen 32,1%, myrcen 24,6%, β-caryophylen
14,5% và (E)-β-ocimen 9,4% [2].
Theo nghiên cứu của Hà Thị Kim Quý và cộng sự năm 2016, từ lá
Cleistocalyx operculatus tìm thấy hai acetophenon mới là (2S)-2,6-dihydroxy4-methoxy-5,7-dimethylcoumaran-3-one và 2,4,6-trihydroxy-2-methoxy3,5-dimethylacetophenone, một flavonoid mới là (2S)-7,2-dihydroxy-5methoxy-6,8-dimethylflavanone, cùng với sáu hợp chất đã biết là (2S)-7hydroxy-5-methoxy-6,8-

dimethylflavanone,

7-hydroxy-5-methoxy-6,8-

dimethylisoflavone,2,4-dihydroxy-6-methoxy-3,5-dimethylchalcone
myricetin-3-methylether

3-O-β-Dgalactopyranoside,

18

myricetin-3,5-