Nghiên cứu định lượng indapamid trong huyết tương người bằng LC MS MS phục vụ đánh giá tương đương sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LA

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG INDAPAMID
TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI
BẰNG LC-MS/MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ
TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LA

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG INDAPAMID
TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI
BẰNG LC-MS/MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ
TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60 72 04 10
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đoàn Cao Sơn
TS. Tạ Mạnh Hùng

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Đoàn Cao Sơn, TS. Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa
Phân tích - độc chất đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường.
Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh
giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã chia
sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp
đã giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận
văn.
Hà nội, ngày 03 tháng 04 năm 2017
Học viên: Lê Thị La


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………….

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN………………………………………………..

3

1.1. INDAPAMID……………………………………………………………

3

. . . Công thức cấu tạo và tính chất hóa l …………………………………

3

. .2. Liều dùng và dược động học…………………………………………..

3

. .3. Một số phương pháp định lượng INDA trong dịch sinh học.................

5

.2. SẮC KÝ LỎNG – KHỐI PHỔ (LC-MS)…………………………………

8

1.2.1. Nguyên l hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ…………………

8

.2.2. Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ loại tứ cực chập ba…

9

1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu…………………………………………………………...

9

1.2.2.2. Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)…………………………………

10

1.2.2.3. Bộ phận phân tích khối tứ cực chập ba…………………………………

10

1.2.2.4. Bộ phận phát hiện (detector)……………………………………………..

11

.3. PH

NG PHÁP PH N T CH THUỐC TRONG D CH SINH H C

12

.3. . K thuật x l mẫu…………………………………………………….

12

1.3.1.1. Kỹ thuật tủa protein………………………………………………………..

12

1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng…………………………………………………

13

1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha r n……………………………………………………..

14

.3.2. Th m định phương pháp LC-MS MS phân tích thuốc trong dịch sinh
học…………………………………………………………………………….
1.3.2.1.
ộ ch n l c………………………………………………………………….
..

15
16

1.3.2.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……………………………………….

16

1.3.2.3. ư ng chu n và khoảng tuyến tính……………………………………..

17


1.3.2.4. Ảnh hưởng của nền mẫu…………………………………………………..

17

1.3.2.5. ộ nhiễm chéo………………………………………………………………

17

1.3.2.6. ộ đ ng, độ chính ác trong ngày và khác ngày……………………...

18

1.3.2.7. T lệ thu hồi…………………………………………………………………

18

1.3.2.8. Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh h c…………..

19

CHƢƠNG 2. Đ I TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….

20

2. . NGUY N VẬT LIỆU…………………………………………………...

20

2.2. ĐỐI T

21

NG NGHI N C U…………………………………………...

2.3. NỘI DUNG VÀ PH

NG PHÁP NGHI N C U……………………..

21

2.3. . Xây dựng phương pháp phân tích……………………………………..

21

2.3.1.1. ây dựng điều kiện khối phổ ác định IN

21

và chu n nội………….

2.3.1.2. Khảo sát điều kiện s c k ………………………………………………….

22

2.3.1.3. Khảo sát qui tr nh ử l mẫu huyết tương……………………………….

22

2.3.2. Th m định phương pháp phân tích…………………………………….

23

2.3.3. Xác định nồng độ INDA trong mẫu huyết tương người tình nguyện…

25

CHƢƠNG 3.

27

ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………….

3. . KẾT QUẢ X Y D NG PH

NG PHÁP PH N T CH………………

27

3. . . Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng INDA và chu n nội……….

27

3.1.1.1. iều kiện khối phổ định lượng IN

……………………………………

27

3.1.1.2. Khảo sát lựa ch n chu n nội……………………………………………..

30

3. .2. Khảo sát điều kiện sắc k ……………………………………………...

32

3.1.3. Nghiên cứu quy trình x l mẫu huyết tương…………………………

36

3.1.4. Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS MS định lượng INDA trong
huyết tương…………………………………………………………………...
NG PHÁP PH N T CH……………...

39
40

3.2. . Độ chọn lọc của phương pháp…………………………………………

40

3.2.2. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)…………………………...

43

3.2. KẾT QUẢ TH M Đ NH PH

3.2.3. Xây dựng đường chu n và khoảng tuyến tính………………………...

44

3.2.4. Ảnh hưởng của nền mẫu……………………………………………….

45

3.2.5. Độ nhiễm chéo…………………………………………………………

46

3.2.6. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày...……………………

46

3.2.7. Xác định tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chu n nội........................

51

3.2.8. Nghiên cứu độ ổn định…………………………………………………

53

3.2.8.1. ộ ổn định mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong th i gian ng n………...

53

3.2.8.2. ộ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông………………………………

54

3.2.8.3. ộ ổn định của mẫu sau ử l (trong autosampler)………………….

54

3.2.8.4. ộ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương……………………………..

55

3.2.8.5. ộ ổn định dài ngày dung dịch chu n nội gốc…………………………

56

3.2.8.6. ộ ổn định dung dịch chu n nội làm việc ở nhiệt độ phòng…………

57

3.3. KẾT QUẢ Đ NH L

NG INDA TRONG MẪU HUYẾT T

NG

NTN…………………………………………………………………………..

58

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN…………………………………………………..

63

4. . PH
HUYẾT T

NG PHÁP PH N T CH Đ NH L

NG INDA TRONG

NG NG ỜI................................................................................

63

4. . . Phương pháp định lượng INDA..............................................................

63

4.1.2. K thuật x lý mẫu.................................................................................

64

4.1.3. Th m định phương pháp phân tích.........................................................

65

4.2. KẾT QUẢ PH N T CH MẪU HUYẾT T

NG NTN..........................

66

IẾN NGHỊ.......................................................................

68

ẾT LUẬN VÀ
TÀI LIỆU THAM

HẢO


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AN

: Chất phân tích (Analyte)

AUC

: Diện tích dưới đường cong (Area under the curve)

Cmax

: Nồng độ cực đại

CLR

: Cloramphenicol

CTPT

: Công thức phân t

CV

: Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

DĐH

: Dược động học

EMA

: Cơ quan quản l Dược Châu u
(European Medicines Agency)

ESI

: Ion hóa kiểu phun điện t (Electrospray ionization)

GLB

: Glibenclamid

GLP

: Glipizid

HPLC

: Sắc k lỏng cao áp
(High performance liquid chromatography)

HQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao (High quality control)

HT

: Huyết tương

IS
INDA

: Chu
n nội (Internal standard)
Indapamid

ISMN

: Isosorbid mononitrat

LC-MS

: Sắc k lỏng khối phổ
(Liquid chromatography – Mass spectrometry)

LC-MS/MS

: Sắc k lỏng khối phổ hai lần

(Liquid chromatography – tandem mass spectrometry)

LLOQ

: Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantitation)

LQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp (Low quality control)

m/z

: Khối lượng điện tích


MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

MF

: Hệ số nền mẫu (Matrix factor)

MQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa (Medium quality control)

NTN

: Người tình nguyện

PRED

: Prednison

SKD

: Sinh khả dụng

S Đ

: Sắc k đồ

SPE

: Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

SQC

: Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control)

STT
T1/2

: Số
thứgian

tự bán thải
Thời

TĐSH

: Tương đương sinh học

Tmax

: Thời gian đạt nồng độ cực đại

ULOQ

: Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantitation)

US-FDA

: Cơ quan quản l thuốc và thực ph m M
(United States – Food and Drug Administration)

v/v

: Thể tích thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Trang
Bảng 1.1- Tóm t t thông số dược động h c của INDA trong một số nghiên
cứu……………………………………………………………………………...............

4

Bảng 1.2- Một số phương pháp định lượng INDA trong huyết tương..............

6

Bảng 2.1- ách chu n bị các mẫu

trong huyết tương………………………

24

Bảng 2.2- ách chu n bị các mẫu Q trong huyết tương………………………

24

Bảng 3.1- iều kiện khối phổ định lượng IN

và IS……………….…………..

40

Bảng 3.2- Ảnh hưởng của mẫu tr ng tại th i gian lưu của
INDA…………………………………………………………………………………….

42

Bảng 3.3- Ảnh hưởng của mẫu tr ng tại th i gian lưu của IS........................

42

Bảng 3.4- Kết quả ác định giới hạn định lượng dưới…………………………...

43

Bảng 3.5- Kết quả khảo sát đư ng chu n………………………………………….

44

Bảng 3.6- Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu………………………..

45

Bảng 3.7- Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo……………………………………….

46

Bảng 3.8-1 - 3.8-5- Kết quả độ đ ng, độ chính ác trong ngày..................

47

Bảng 3.9- Kết quả ác định độ đ ng, độ chính ác khác ngày.........................

49

Bảng 3.10- Kết quả ác định t lệ thu hồi của IS..............................................

51

Bảng 3.11- Kết quả ác định t lệ thu hồi của IN

52

…………………………….

Bảng 3.12- Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng trong 6 gi ….

53

Bảng 3.13- Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu
kỳ đông – rã đông……………………………………………………………………..

54

Bảng 3.14- Kết quả độ ổn định của mẫu sau ử l trong autosampler………...

55

Bảng 3.15- Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương………………..

56

Bảng 3.16- Kết quả độ ổn định dài ngày của dung dịch IS gốc………………..

57

Bảng 3.17- Kết quả độ ổn định của dung dịch IS làm việc ở nhiệt độ phòng

57

Bảng 3.18- Kết quả nồng độ IN

60

trong huyết tương NTN…………………….


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
H nh 1.1- ông thức cấu tạo của indapamid……………………………………

3

Hình 1.2- Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ………………………………….

9

Hình 1.3- ấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba………

11

Hình 3.1- Phổ khối MS dung dịch chu n IN

27

………………………………….

Hình 3.2- Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 364 a

28

Hình 3.3- Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [INDA-H] -…………………………

28

Hình 3.4- Giản đồ năng lượng phân mảnh [INDA-H] -…………………………

29

H nh 3.5- SK mẫu huyết tương có chu n IN

và GLP, GLB, ISMN, LR,

PRE …………………………………………………………………………………….
H nh 3.6- SK mẫu chu n chứa IN
và IS khi sử dụng hệ pha động MeOH
: acid formic 0,1% (90 : 10, v/v)…………………………………………………….

31
32

H nh 3.7- SK mẫu chu n chứa IN
và IS khi sử dụng hệ pha động MeOH
: amoni format 2mM (90 : 10, v/v)………………………………………………….

33

H nh 3.8- SK mẫu chu n chứa IN
và IS khi sử dụng pha động với t lệ là
MeOH : amoni acetat 10 mM (70 : 30, v/v)…………………………………..

33

H nh 3.9- SK mẫu chu n chứa IN
và IS khi sử dụng cột 18 (150 4,6
mm; 5 µm)……………………………………………………………………………...

34

H nh 3.10- SK mẫu chu n chứa IN

và IS khi sử dụng cột 8 (100

2,1

mm; 1,9 µm)……………………………………………………………………………
H nh 3.11- SK mẫu chu n chứa IN
và IS với điều kiện s c k đã ây
dựng……………………………………………………………………………………..
Hình 3.12- Sơ đồ chiết IN
trong HT bằng phương pháp LLE…………….
Hình 3.13- SK dòng ion IN

34
35
36

và IS khi phân tích mẫu huyết tương tr ng

đã được ử l tủa protein bằng Me N……………………………………………..

Hình 3.14- SK dòng ion IN
và IS khi phân tích mẫu huyết tương tr ng
đã được ử l tủa protein bằng MeOH……………………………………………
Hình 3.15- SK dòng ion IN
và IS khi phân tích mẫu huyết tương tr ng
đã được chiết lỏng - lỏng bằng tert-butyl methyl ether………………………….
Hình 3.16- SK mẫu huyết tương tr ng…………………………………………..

37
38
39
41


Hình 3.17- SK mẫu huyết tương tr ng có pha IS và chu n IN
ở nồng độ
LLOQ (0,5 ng/mL)…………………………………………………………………….
H nh 3.18- SK mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc.........................
H nh 3.19- SK mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc có thêm IS…….
H nh 3.20- SK mẫu huyết tương NTN ở th i điểm 14 gi sau khi uống thuốc

41

H nh 3.21- ư ng cong nồng độ thuốc - th i gian của NTN…………………

61
60

58
58

59

60


ĐẶT VẤN ĐỀ
Indapamid (INDA) là một sulfonamid có nhân indol không thuộc nhóm
thiazid. Thuốc có tác dụng lợi tiểu và chống tăng huyết áp (có thể dùng một mình
hoặc phối hợp với các thuốc chống tăng huyết áp khác). Theo các nghiên cứu gần
đây [2] và thực tế lâm sàng, INDA có hiệu quả rõ rệt trong điều trị tăng huyết áp
nhưng không ảnh hưởng đến chuyển hóa lipid và đường huyết. Vì vậy, INDA
ngày càng được s dụng nhiều trong điều trị tăng huyết áp thể nhẹ và vừa.
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có nhiều dược ph m chứa INDA của
các công ty trong và ngoài nước. Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng của các
thuốc này thông qua đánh giá tương đương sinh học vẫn chưa được thực hiện đầy
đủ, đặc biệt là các dạng thuốc tác dụng kéo dài [3]. Nồng độ INDA trong máu
khá thấp – Cmax chỉ đạt khoảng 25 ng mL sau khi uống liều đơn 1,5 mg viên kéo
dài [30]. Để xác định được chính xác nồng độ INDA trong máu, cần phải xây
dựng được một phương pháp phân tích có đủ độ nhạy và độ tin cậy. Tuy nhiên,
do nền mẫu dịch sinh học thường rất phức tạp, các k thuật phân tích thường quy
như sắc k lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết nối với các detector UV, huỳnh
quang, … thường không đủ độ nhạy để phát hiện và định lượng được chính xác
nồng độ của thuốc có trong nền mẫu [ 3], [30].
Hiện nay, k thuật LC-MS/MS với ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn
lọc, pic của chất phân tích không cần phải tách khỏi các pic khác có trong nền
mẫu nên ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc trong dịch sinh
học đặc biệt là đối với những thuốc có hàm lượng thấp như INDA [20], [26].
Để góp phần kiểm soát chất lượng và th tương đương sinh học các thuốc
chứa INDA phù hợp với điều kiện hiện có, luận văn: “Nghiên cứu định lượng
Indapamid trong huyết tương ngư i bằng L -MS/MS phục vụ đánh giá tương

đương sinh h c” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1


. Xây dựng và th m định phương pháp định lượng INDA trong huyết tương
người b ng sắc k lỏng khối phổ (LC-MS/MS) theo các hướng dẫn th m định
phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định nồng độ INDA trong các mẫu
huyết tương người tình nguyện (NTN) tham gia th tương đương sinh học đối
với các thuốc chứa INDA.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. INDAPAMID
1.1.1. C ng thức cấu tạo và tính chất hóa lý
 Công thức cấu tạo
Indapamid là một sulfonamid lợi tiểu, có công thức phân t C16H16ClN3O3S,
khối lượng phân t 365,06 g/mol và tên khoa học là 4-chloro-N-(2-methyl-2,3dihydroindol-1-yl)-3-sulfamoylbenzamide [8], [16].
Công thức cấu tạo của indapamid được trình bày ở hình . .

.
H nh 1.1- ông thức cấu tạo của indapamid
 T nh chất hóa
-

Bột kết tinh màu trắng;

-

Không tan trong nước, dễ tan trong một số dung môi hữu cơ như: ethanol,
diethyl ether, methanol, acetonitril, ethyl acetat, cloroform...;

-

Nhiệt độ nóng chảy: 60°C – 162°C;

-

Là

-

Hệ số phân bố: Log P (octanol) = 2,2.

acid yếu với pKa = 8,8;

1.1.2. Liều dùng và dƣợc động học
 Liều dùng: INDA được dùng để điều trị bệnh tăng huyết áp vô căn, thể nhẹ
và vừa. Liều dùng điều trị tăng huyết áp: từ 1,25 mg đến 2,5 mg/ngày, uống
một lần.
 Dược động học:

3


Các chế ph m INDA được lưu hành trên thị trường thường dưới dạng viên
nén bao phim với hàm lượng 1,25 mg; 1,5 mg hoặc 2,5 mg/viên. Dạng bào chế

chủ yếu là viên nén giải phóng kéo dài. Nồng độ tối đa trong máu của thuốc đạt
được trong khoảng từ 2 – 2,5 giờ sau khi uống với dạng giải phóng qui ước, từ 8
– 4 giờ với dạng giải phóng kéo dài [22]. Thời gian bán thải của thuốc khoảng
14 - 8 giờ ở người trưởng thành với chức năng thận bình thường. Thức ăn hay
thuốc kháng acid hầu như không ảnh hưởng đến sự hấp thu của INDA. Khoảng
60% thuốc bài tiết qua nước tiểu trong vòng 48 giờ, chỉ có 7% thuốc bài tiết dưới
dạng nguyên thể [2].
Các thông số dược động học của INDA trong một số nghiên cứu tương
đương sinh học và 0 nghiên cứu dược động học trên mẫu huyết tương NTN
được trình bày trong bảng . .
Bảng 1.1- Tóm t t thông số dược động h c của INDA trong một số nghiên cứu
Thiết kế

Cmax

nghiên cứu

(ng/mL)

AUC0-t giờ

Tmax (giờ)

AUC0-∞

T1/2

Tài

(ng/mL.giờ) (ng/mL.giờ) (giờ)

liệu

Liều đơn ,5
mg, viên kéo
dài, 6 người

25,0 ± 2,4

14 ± 2,1

49,5 ± 5,5*

1,9 ± 0,6

842,9 ±

912,4 ±

15,8

128,3

133,8

± 2,0

859,5 ±

934,4 ±

22,5

160,9

190,6

± 5,9

[26]

tình nguyện
Liều đơn 5
mg, 20 người
tình nguyện

Liều đơn 3

[20]
47,8 ± 4,7**

2,0 ± 0,5

60,3 ± 22,6*

13,1 ± 6,9

840,9 ±

919,5 ±

23,2

170,6

179,8

± 4,5

1964 ± 554

1964 ± 554

21,1

mg viên kéo

± 6,2

dài; 20 người

21,6

tình nguyện

[22]
57,6 ± 18,7**

18,3 ± 7,4

1863 ± 469

4

1863 ± 469

± 5,1


Liều: 2 viên
1,5 mg, viên

40,6 ± 11,1*

8,6 ± 4,1

1293,6 ±

1330,6 ±

15,9

314,0

335,2

± 2,2

kéo dài, 46
người

tình

[21]
43,6 ± 16,1**

10,3 ± 5,3

nguyện

1317,7 ±

1350,6 ±

15,6

303,0

319,2

± 2,0

(*): thuốc th ; (**): thuốc chứng
Các thông số dược động học của INDA (bảng . ) cho thấy: sau khi uống
viên nén INDA với mức liều thông thường từ 1,5 mg đến 5 mg, nồng độ Cmax dao
động từ 25 - 60 ng/mL. Vì vậy, phương pháp phân tích INDA trong dịch sinh học
cần có giới hạn định lượng dưới khoảng từ 0,5 – 1,0 ng/mL (khoảng

30 - 1/20

Cmax) và giới hạn trên của đường chu n khoảng 00 ng mL (khoảng 2-3 lần
Cmax).
1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng INDA trong dịch sinh học
Trong phân tích thuốc trong dịch sinh học, mẫu máu thường được s dụng
phổ biến hơn so với các mẫu khác như nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy, ... do
thao tác lấy mẫu thường dễ dàng và chủ động hơn. Các mẫu máu sau khi lấy
được chuyển vào các ống nghiệm có chứa chất chống đông Na2-EDTA, ly tâm,
tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ qui định cho đến khi được phân
tích.
Với các thuốc chứa INDA, 60% hoạt chất được bài tiết qua nước tiểu trong
vòng 48 giờ, trong đó chỉ có 7% ở dạng nguyên thể [2]. Do vậy, nồng độ INDA
trong nước tiểu thường thấp hơn nhiều so với nồng độ INDA trong huyết tương.
Chính vì lý do này, đa số các nghiên cứu định lượng INDA trong dịch sinh học
được tiến hành trên mẫu huyết tương [25], [20], [22], [33], [26], [30], [13].

5


Bảng 1.2- Một số phương pháp định lượng INDA trong huyết tương
Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký
-

Cột: C 8; 00 x 2, mm; ,7 µm.

-

Pha động: MeCN - amoni acetat

LLOQ

Tài liệu

(ng/mL)

tham khảo

0,5

[25]

1,0

[20]

2,0

[22]

0,5

[33]

2mM (thêm 0,5 mL acid formic/1 L
Chiết SPE.

Kiềm

hoá

đệm) (90 - 10).

b ng

-

Detector: LC-MS/MS.

-

Thời gian phân tích: 2,5 phút.

-

Cột: CN; 250 x 4,6 mm; 5 µm.

-

Pha động: MeOH - amoni acetat

Na2CO3 bão hoà,

10 mM (pH 5,0) (50 - 50).

sau đó chiết b ng
-

Detector: MS/MS.

-

Thời gian phân tích: 3 phút.

b ng

-

Cột: C 8; 50 x 3,9 mm; 5 µm.

Na2CO3, sau đó

-

Pha động: MeCN - nước (60 - 40).

-

Detector: MS/MS.

-

Thời gian phân tích: 9 phút.

-

Cột: C 8, 50 x 2,0 mm; 5 µm.

-

Pha động: MeOH - amoni acetat,

diethyl ether.

Kiềm

hoá

chiết b ng hỗn hợp
dung môi n-hexan:
dicloromethan
(1:1).

Kiềm
NaOH,

hóa
sau

b ng
đó

gradient.

chiết b ng diethyl
ether.

-

Detector: MS.

-

Thời gian phân tích: 7,5 phút.

6


-

Cột: C 8, 00 x 2, mm; ,7 µm.

-

Pha động: MeCN - amoni format
2mM (90 - 10).

Chiết SPE.

Kiềm

hóa

b ng

-

Detector: MS/MS.

-

Thời gian phân tích: 2,5 phút.

-

Cột: C 8, 250 x 4,6 mm; 5 µm.

-

Pha động: Đệm phosphat – MeCN -

KH2PO4, sau đó

MeOH (55-40-5).

chiết b ng diethyl
ether.

-

Detector: UV, 240 nm.

-

Thời gian phân tích: 20 phút.

-

Cột: C8, 250 x 4,6 mm; 5 µm.

-

Pha động: Triethylamin 0,1% (pH
3,5) - MeCN (63 - 37).

Chiết SPE.
-

Detector: UV, 240 nm.

-

Thời gian phân tích: 25 phút.

1,0

[26]

10

[30]

10

[13]

Các kết quả nghiên cứu định lượng INDA trong huyết tương được tổng hợp
trong bảng .2, cho thấy những ưu nhược điểm còn tồn tại như sau:
+ Phương pháp [26], [25]: s dụng detector khối phổ có giới hạn định lượng
dưới đáp ứng yêu cầu, thời gian phân tích ngắn. Tuy nhiên việc s dụng k thuật

chiết pha rắn có chi phí thí nghiệm tốn kém, chưa thực sự phù hợp với điều kiện
kinh tế tại Việt Nam.
+ Phương pháp [30], [13]: định lượng INDA b ng HPLC với detector UV,
phương pháp này có ưu điểm nổi bật là trang thiết bị khá phổ biến. Tuy nhiên,
giới hạn định lượng dưới cao (10 ng/mL) và thời gian phân tích mẫu khá dài
(khoảng 20 phút mẫu). Ngoài ra, phương pháp [ 3] còn s dụng k thuật chiết
SPE nên tương đối tốn kém về chi phí thí nghiệm.

7


+ Phương pháp [33], [20]: s dụng detector khối phổ, s dụng dung môi
chiết dễ bay hơi, có giới hạn định lượng dưới phù hợp với yêu cầu đề ra, tuy
nhiên thời gian phân tích mẫu khá dài (khoảng 7,5 phút mẫu [33], 13 phút [20]).
+ Phương pháp [22]: s dụng detector khối phổ, tuy nhiên giới hạn định
lượng dưới cao (2 ng mL), thời gian phân tích mẫu dài (9 phút mẫu). Hơn nữa,
phương pháp này còn s

dụng hỗn hợp dung môi chiết (n-hexan và

dicloromethan) khó bay hơi nên không phù hợp để triển khai với số lượng mẫu
nhiều trong nghiên cứu SKD và TĐSH.
1.2. SẮC Ý LỎNG – H I PHỔ (LC-MS)
1.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ
Sắc k lỏng khối phổ là một k thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả
năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối của
detector khối phổ [1].
Trong k thuật LC-MS, sắc k lỏng hiệu năng cao có vai trò phân tách (một
phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có
trong nền mẫu, hạn chế số lượng các chất đồng r a giải cùng với hoạt chất đi vào

nguồn ion. Do vậy, hiệu suất ion hóa được cải thiện góp phần làm tăng độ nhạy
của phương pháp phân tích [9].
Phương pháp khối phổ là một k thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện
tích của ion (m z) được tạo thành trong pha khí từ phân t hoặc nguyên t của
mẫu. Tùy thuộc vào cấu tạo của chất phân tích và k thuật ion hóa được s dụng
mà chất phân tích có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểu phân tích điện hoặc
bị phân mảnh, bẻ gẫy cấu trúc phân t để hình thành các ion hoặc các tiểu phân
mang điện có khối lượng nhỏ hơn. Hỗn hợp các ion, tiểu phân mang điện hình
thành ở nguồn ion, được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân tích khối. Dưới tác
động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác nhau sẽ chuyển động
với tốc độ và qu đạo khác nhau. Tốc độ, qu đạo chuyển động của ion phụ
thuộc vào cường độ điện trường của bộ phận phân tích khối; điện tích và khối

8


lượng của ion. Do vậy, sau khi đi qua bộ phận phân tích khối, các ion trong hỗn
hợp sẽ được phân tách riêng thành từng loại. Bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận loại
ion được lựa chọn thành từng vạch phổ tương ứng trên phổ đồ.
Năng lượng phân mảnh ion là một yếu tố quyết định sự phân mảnh của các
hợp chất. Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của mỗi phân t và là cơ
sở để nhận dạng, định danh, định tính chất phân tích [7].
1.2.2. Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ loại tứ cực chập ba
Trong số các k thuật LC-MS, k thuật sắc k lỏng hiệu năng cao ghép nối
với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa kiểu phun điện t
(ESI) có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao thường được s dụng để phân
tích thuốc trong dịch sinh học [32].
Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong Hình .2.

Hình 1.2- Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ

1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị
khối phổ. Tùy thuộc vào trạng thái vật l của mẫu phân tích mà có thể nạp mẫu
trực tiếp vào thiết bị MS hoặc nạp mẫu vào MS gián tiếp thông qua các thiết bị
phân tích kết hợp, ghép nối như GC, HPLC hoặc CE. Căn cứ vào thiết bị phân
tích ghép nối, mà người ta chia thành các phương pháp như GC-MS, LC-MS hay
CE-MS [1], [6].
Một ghép nối LC-MS cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC
sang MS mà không làm phá hủy hay mất chất phân tích, loại bớt dung môi r a
giải, giảm pha loãng mẫu.

9


1.2.2.2. Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)
Trong nguồn ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế
cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ
mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm
bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ
điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn
(giới hạn ổn định Rayleigh), lực đ y lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương
thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành
những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Từ những hạt rất nhỏ mang
điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ phận
phân tích khối. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion
qua bơm chân không của thiết bị khối phổ [7].
Trong k thuật ESI, phân t nhất thiết phải được biến thành chất điện ly,
tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi,
pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.
Nguồn ESI, với k thuật ion hóa mềm, nhiễm điện bề mặt nên có thể áp

dụng để ion hóa nhiều hoạt chất với các đặc điểm hóa l khác nhau như: chất
phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân t lớn (protein,
peptid) và các chất kém bền với nhiệt [32].
1.2.2.3. Bộ phận phân t ch khối tứ cực chập ba
Bộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3 nối tiếp nhau. Mỗi tứ
cực này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song và sát nhau tạo
thành hai cặp điện cực (hình 1.3).

10


Hình 1.3- ấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba
Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp
đối diện của tứ cực. Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các
ion có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và qu đạo khác nhau. Ion có số
khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.
Tại Q sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m z xác định và được đưa đi thẳng đến
Q2, những ion khác sẽ bị loại đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu. Quá
trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2. Trong
buồng Q2, ion mẹ chuyển động Brown, va chạm với các phân t khí trơ có mặt
trong buồng (khí argon). Nhờ va chạm này năng lượng động học của các ion
chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion
con). Các ion con mới hình thành được phân tích khối tách riêng tại Q3 và cuối
cùng được đưa đến detector.
Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m z của ion mẹ cũng như cơ
chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy, có
thể định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích b ng phương pháp LCMS/MS [32].
1.2.2.4. Bộ phận phát hiện (detector)
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối
của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phép phát hiện và

khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được
chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ [31].

11


1.3. PHƢƠNG PHÁP PH N T CH THU C TRONG DỊCH SINH HỌC
Do mẫu sinh học thường có nồng độ hoạt chất thấp, nền mẫu phức tạp
(chứa muối vô cơ, lipid, protein, chất nội sinh,…), lượng mẫu ít và số lượng mẫu
phân tích nhiều nên các phương pháp phân tích cần phải có độ nhạy, độ chọn lọc
cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ lặp lại tốt và thời gian phân tích cho một
mẫu đủ ngắn. Đối với những mẫu dịch sinh học có nồng độ dược chất thấp
(khoảng ng/mL) k thuật phân tích khối phổ thường được s dụng, đặc biệt là k
thuật sắc k lỏng khối phổ hai lần (LC-MS MS) vì có khả năng giảm nhiễu
đường nền, tăng độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp lên nhiều lần [ ].
1.3.1. Kỹ thuật ử lý mẫu
Phần lớn các phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học đều không
thể xác định được trực tiếp chất phân tích mà chỉ có thể xác định được sau khi
mẫu đã được x l . Vì vậy, mẫu cần phải được chiết tách, x l để loại bỏ các tạp
chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ nhạy của
phương pháp. Lựa chọn k thuật x l mẫu, tách chiết hoạt chất cần phân tích
trong các mẫu dịch sinh học cần phải dựa trên đặc điểm hóa l của hoạt chất, đặc
điểm mẫu sinh học và đặc điểm của phương pháp phân tích. Một k thuật x l
mẫu được coi là phù hợp nếu: chiết được chất cần phân tích với độ thu hồi cao và
lặp lại; quy trình x l mẫu đơn giản, kinh tế và an toàn; loại bỏ được tạp chất và
các ảnh hưởng của nền mẫu đối với phương pháp phân tích.
Ba k thuật cơ bản thường được s dụng để x l mẫu sinh học là: tủa
protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [28]. Ngoài ra, trong một số trường
hợp, có thể s dụng đồng thời hai hoặc cả ba k thuật x l mẫu cơ bản đã nêu để
tăng độ thu hồi hoạt chất cũng như loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu [6].

1.3.1.1. Kỹ thuật tủa protein
Tủa protein là phương pháp đơn giản để chiết các chất phân tích khỏi nền
mẫu. Tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học thường dùng là: dung môi hữu
cơ, muối vô cơ, acid,…. [23].

12


- Gây tủa protein b ng dung môi hữu cơ: Độ hòa tan của protein trong dung
dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là h ng số điện môi của dung
dịch. Những phân t

dung môi có h ng số điện môi lớn như nước,

dimethylsulphoxid… có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân t protein
và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại,
các dung môi với h ng số điện môi nhỏ như acetonitril, methanol… sẽ ngăn cản
sự phân tán của các phân t protein trong môi trường làm giảm độ hòa tan của
protein và xảy ra kết tủa protein [29].
- Tủa protein b ng muối vô cơ: Một số muối như (NH4)2SO4, NaCl… vừa
trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu),
vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân t protein gây ra hiện tượng tủa protein.
- Tủa protein b ng acid (do thay đổi pH): Mỗi protein sẽ có một điểm đẳng
điện (pI). Ở giá trị pH = pI, phân t protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch
trong điện trường. Lúc này, phân t protein sẽ kém bền nhất và dễ bị kết tủa. Các
tác nhân gây tủa protein do thay đổi pH thường là các acid như trichloroacetic,
trifluoracetic, perchloric…. Phương pháp tủa protein b ng acid được áp dụng cho
những hoạt chất dễ tan trong nước và bền với acid.
K thuật tủa protein có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, s dụng lượng dung
môi ít và kinh tế. Trên thực tế, để x l mẫu huyết tương dùng cho phân tích định

lượng, người ta hay dùng k thuật tủa protein b ng dung môi hữu cơ hoặc acid.
Nhược điểm của k thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa b ng dung môi
hữu cơ hoặc hoạt chất có thể bị biến đổi khi thêm acid vào mẫu phân tích. Mẫu
sau x l còn chứa nhiều tạp chất làm giảm tuổi thọ của cột sắc k và gây nhiễu
đường nền, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả khi phân tích b ng các
phương pháp sắc k , đặc biệt là phương pháp sắc k lỏng khối phổ [14].
1.3.1.2. Kỹ thuật chiết ỏng - ỏng
Chiết lỏng - lỏng là phương pháp được dùng phổ biến nhất để phân tích
thuốc trong dịch sinh học. Nguyên l của k thuật này là chuyển chất phân tích

13


được hoà tan trong dung môi này (thường là pha nước) sang dung môi khác
không đồng tan. Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong
dung môi chiết, tính phân cực của dung môi chiết, pH của pha nước, hệ số h ng
số phân bố của hoạt chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau [23], [29].
Để tăng tỉ lệ thu hồi hoạt chất có thể áp dụng những giải pháp sau [24]:
- Thay đổi dung môi hữu cơ chiết (có thể phối hợp một vài dung môi hữu cơ khác
nhau theo tỷ lệ thích hợp) hoặc tăng thể tích dung môi chiết.
- Nếu chất phân tích ở dạng ion hoặc có khả năng ion hóa, hệ số phân bố của chất
phân tích có thể tăng lên b ng cách ức chế sự ion hóa, chuyển hoạt chất về dạng
phân t (điều chỉnh pH hoặc chiết tạo cặp ion…).
- Các ion kim loại có thể tạo thành một phức hợp kỵ nước với hoạt chất cần phân
tích, nhờ đó có thể tăng hiệu suất chiết hoạt chất với dung môi hữu cơ.
Với k thuật chiết lỏng – lỏng, mẫu thu được tương đối sạch, có thể làm
giàu mẫu, phù hợp với nhiều dược chất trong điều kiện hiện có ở hầu hết các
phòng thí nghiệm. So với k thuật tủa protein, k thuật chiết lỏng – lỏng có một
số nhược điểm như s dụng nhiều loại dung môi hơn, mất nhiều thời gian x l
mẫu, mẫu cần phải bay hơi dung môi chiết trước khi phân tích, có thể hình thành

nhũ tương trong quá trình chiết gây sai lệch kết quả phân tích.
Với một số hoạt chất phân cực, dễ tan trong nước, có thể dùng kết hợp đồng
thời k thuật tủa protein và chiết lỏng - lỏng để thu được nền mẫu sạch hơn và
tăng khả năng thu hồi chất phân tích so với k thuật tủa protein đơn thuần [14],
[28].
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha r n
K thuật SPE dựa vào sự phân bố giữa một pha lỏng (nền mẫu hoặc dung
dịch chất phân tích) và một pha rắn (chất hấp phụ). Các chất phân tích có thể
được hấp phụ vào pha rắn hoặc giữ lại trong pha lỏng khi nó đi qua pha rắn. Khi
hai pha cân b ng, chúng có thể được tách ra nhờ gạn, lọc, ly tâm hoặc một quá
trình khác tương tự. Nếu chất phân tích bị hấp phụ trên bề mặt pha rắn, chúng có
14