Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc điều trị ung thư ALTRETAMIN

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận văn “ Nghiên cứu và
cải tiến quy trình tổng hợp thuốc điều trị ung thƣ Altretamin” là trung thực và
chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác.

Tác giả

Trần Thái Ngọc


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo trƣờng Đại Học Bách
Khoa Hà Nội, Trung tâm Đào Tạo sau Đại Học trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà
Nôi đã tạo điều kiên hết sức cho tôi hoàn thành khoá học 2014-2016.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TSKH.
Phan Đình Châu ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong nghiên cứu và thục
hiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Bình Dƣơng , Trung tâm
nghiên cứu sản xuất thuốc thực nghiệm – Học Viện Quân Y, thầy đã tận tình chỉ
bảo cho tôi cả trong lý luân và thƣc nghiệm của bản luận văn này; cũng các thầy
cô, các anh chị kỹ thuật viên của Trung tâm nghiên cứu sản xuất thuốc thực
nghiệm, Trung tâm Đào tạo – Nghiên cứu Dƣợc , Trung tâm kiểm nghiệm thuốc
quân đội đã nhiệt tình giúp đơc tôi hoàn thành luân văn này.
Và cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã
luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện hết sức cho tôi trong quá trình
học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này.

Hà Nôi, Ngày 16 tháng 9 năm 2016

Trần Thái Ngọc

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
TT

Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

1

13

2

1

3
4
5

AcOEt
CYC
DMA

6
7

EtOH
FDA

Ethanol
Food and drug administration
(cục quản lý dƣợc phẩm và thực phẩm Mỹ)

8

HPLC

9

HTB

Hight- performance liquid chromatography
(sắc ký lỏng hiệu năng cao)
Hiệu suất trung bình

10

IR

Infared spectrometry (phổ hồng ngoại)

11
12

KLPT
KLSP

Khối lƣợng phân tử
Khối lƣợng sản phẩm

13
14

MeOH
MS

Methanol
Mass spectrometry (phổ khối)

15

Tonc

Nhiệt độ nóng chảy

16

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

17

USP

United State Pharmacopiea (Dƣợc điển Mỹ)

18

WHO

World health organization (Tổ chức y tế thế
giới)

C- NMR

H- NMR

Carbon nuclear magnetic resonance
(phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C)
Proton nuclear magnetic resonance
(phổ cộng hƣởng từ proton)
Ethyl acetat
Cyanuric clorid
Dimethylamin


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên Hình

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của altretamin

2

1.2

Một số biệt dƣợc đang lƣu hành trên thị trƣờng

2

1.3

Chu trình tế bào và vị trí tác động của altretamin

5

1.4

Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Donal W. Kaiser

8

1.5

Sơ đồ phản ứng tổng hợp của H. Von Brachel và cộng sự

9

1.6

Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin của Antonio Herrera

10

1.7

Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo phƣơng pháp của 11
Kapril Arya

1.8

Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Perter Dornan

12

2.1

Sơ đồ phản ứng tổng hợp Altretamin theo Donal W.Kaiser

21

3.1

Hình ảnh mặt đáp về ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến hiệu 46
suất phản ứng

3.2

Đồ thị phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến hiệu suất 46
phản ứng

3.3

Sơ đồ quy trình tổng hợp altretamin có cải tiến

50

3.4

Hình ảnh thực hiển phản ứng tổng hợp altretamin

50

3.5

Sản phẩm trƣớc và sau khi tinh chế

51

3.6

Ảnh SKLM của altretamin chuẩn và altretamin tổng hợp đƣợc 53
với hệ dung môi Toluen: AcOEt: CHCl3: MeOH (6: 1: 4: 3)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Bảng
1.1

Trang

Chỉ tiêu chất lƣợng Altretamin theo Dƣợc điển Mỹ USP 4
37

2.1

Nguyên liệu hoá chất và dung môi

19

2.2

Kí hiệu và mức biến đầu vào

28

3.1

Kết quả khảo sát của chất hấp thụ acid

33

3.2

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của DMA đến hiệu suất 34
phản ứng

3.3

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của KOH

35

3.4

Kết quả khảo sát dung môi phản ứng tỷ lệ 1: 3,6: 3,3

37

3.5

Kết quả khảo sát tỷ lệ CYC: DMA: KOH thực hiện phản 38
ứng trong dung môi 1,4- dioxan

3.6

Khảo sát lƣợng dung môi 1,4- dioxin thực hiện phản ứng 39
tổng hợp altretamin

3.7

Khảo sát nhiệt độ phản ứng tổng hợp altretamin

3.8

Bảng kết quả thiết kế thí nghiệm tối ƣu của phần mềm 43

41

Modde 5.0
3.9

Kết quả tiến hành thí nghiệm theo thiết kế phần mềm 44
Modde 5.0

3.10

Kết quả thực nghiệm kiểm tra kết quả tối ƣu hoá

3.11

So sánh thực hiện phản ứng ở điều kiện tối ƣu của phần 48

47

mềm Modde và khảo sát truyền thống
3.12

Tóm tắt kết quả sắc ký lớp mỏng

52


3.13

Số liệu phổ hồng ngoại của altretamin chuẩn và 54
altretamin tổng hợp đƣợc

3.14

Số liệu phổ cộng hƣởng từ proton (1H- NMR) và cộng 55

hƣởng từ hạt nhân 13C (13C- NMR) của altretamin chuẩn
và altretamin tổng hợp đƣợc

3.15

Số liệu phổ khối lƣợng của altretamin chuẩn và 55
altretamin tổng hợp đƣợc

3.16

Kết quả hàm lƣợng nƣớc trong mẫu altretamin

56

3.17

Kết quả thử giới hạn cắn sau nung của mẫu altretamin

57

3.18

Kết quả định lƣợng của mẫu altretamin

57

3.19

Kết quả đánh giá các chỉ tiêu của altretamin tổng hợp đƣợc
theo USP 37

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục chữa viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN……………………………………………………...2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ALTRETAMIN ............................................................ 2
1.1.1. Tên khoa học, công thức ...................................................................... 2
1.1.2. Tính chất vật lý.................................................................................... 3
1.1.3. Tính chất hoá học ................................................................................ 3
1.1.4. Tiêu chuẩn dƣợc điển .......................................................................... 4
1.1.5. Dƣợc động học .................................................................................... 4
1.1.6. Tác dụng dƣợc lý…………………………………………………….5
1.1.7. Chỉ định, dạng bào chế, liều dùng, cách dùng. ................................... 7
1.1.8. Tác dụng không mong muốn. ............................................................. 7
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ALTRETAMIN .............................. 8
1.2.1. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Donald W. Kaiser và cộng sự. 8
1.2.2. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của H. Von Brachel và cộng sự ..... 9
1.2.3. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Antonio Herrera và cộng sự.. 10
1.2.4. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Kapril Arya và cộng sự ......... 11
1.2.5. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự ....... 11
1.3. LỰA CHỌN PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 12
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP HOÁ LÝ DÙNG TRONG XÁC ĐỊNH CẤU
TRÚC HOÁ HỌC VÀ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ.

.......................................................................................................................... 13
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................. 13
1.4.2. Đo nhiệt độ nóng chảy ....................................................................... 13
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................. 14
1.4.4. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (Ifrared spectrometry – IR) ................ 14
1.4.5. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry- MS) .................. 16
1.4.6. Phƣơng pháp Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ........................... 16
1.5. MÔ HÌNH THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM VÀ TOÁN TỐI ƢU............... 17
1.5.1. Quy trình thực nghiệm………………………………………………17
1.5.2. Quy trình tối ƣu hoá ........................................................................... 18
CHƢƠNG II. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.............................................................................................................................. 19
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ DUNG MÔI ............................ 19
2.2. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ........................................................................ 20
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................. 20


2.3.1. Phƣơng pháp khảo sát xây dựng quy trình tổng hợp altretamin ........ 20
2.3.1.1. Luận giải về lựa chọn phƣơng pháp nghiên cứu ......................... 20
2.3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các chất hấp thụ acid trong quá trình
tổng hợp Altretamin, trong dung môi aceton ở tỷ lệ các tác nhân CYC:
DMA: BASE = 1: 3,6: 3,3........................................................................ 24
2.3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của DMA đến hiệu suất phản ứng tổng hợp
altretamin, sử dụng chất hấp thu acid là KOH (chất hấp thụ acid tốt nhất)
.................................................................................................................. 25
2.3.1.4. Khảo sát ảnh hƣởng của KOH đến hiệu suất phản ứng tổng hợp
altretamin .................................................................................................. 25
2.3.1.5. Khảo sát dung môi thực hiện phản ứng tổng hợp Altretamin ..... 25
2.3.1.6. Khảo sát các chất phản ứng trong dung môi đƣợc chọn ............. 25
2.3.1.7. Khảo sát lƣợng dung môi 1,4- dioxan thực hiện phản ứng tổng

hợp altretamin .......................................................................................... 26
2.3.1.8. Khảo sát nhiệt độ phản ứng tổng hợp altretamin ........................ 26
2.3.1.9. Tối ƣu hoá quy trình tổng hợp bằng phần mềm tin học .............. 26
2.3.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học và kiểm nghiệm sản phẩm
tổng hợp đƣợc theo USP 38 ......................................................................... 29
2.3.3. Phƣơng pháp tính hiệu suất quá trình phản ứng ................................ 31
2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả nghiên cứu................................................. 31
CHƢƠNGIII. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN......................................................... 32
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP
ALTRETAMIN QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ....................................... 32
3.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của chất hấp thu acid đến quá trình tổng hợp
altretamin ...................................................................................................... 32
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của DMA đến hiệu suất phản ứng tổng hợp
altreatamin .................................................................................................... 34
3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của KOH đến hiệu suất phản ứng tổng hợp
altretamin ...................................................................................................... 35
3.1.4. Khảo sát ảnh hƣởng của các loại dung môi đến hiệu suất và thời gian
phản ứng ....................................................................................................... 36
3.1.5. Khảo sát tỷ lệ mol CYC: DMA: KOH thực hiện phản ứng trong dung
môi 1,4- dioxan ............................................................................................ 37
3.1.6. Khảo sát lƣợng dung môi 1,4- dioxan thực hiện phản ứng tổng hợp
altretamin ...................................................................................................... 39
3.1.7. Khảo sát nhiệt độ ảnh hƣởng đến hiệu suất quá trình phản ứng ........ 40
3.1.8. Kết quả tối ƣu hoá quy trình tổng hợp altretamin bằng phần mềm tin
học. ............................................................................................................... 42
3.1.8.1. Kết quả thiết kế thí nghiệm tối ƣu............................................... 42
3.1.8.2. Kết quả tiến hành thí nghiệm theo thiết kế phần mềm ............... 44
3.1.8.3. Phân tích ảnh hƣởng của yếu tố đầu vào đến hiệu suất phản ứng
.................................................................................................................. 45

3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC VÀ KIỂM NGHIỆM
ALTRETAMIN TỔNG HỢP ĐƢỢC .............................................................. 51
3.2.1. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết bằng các hằng số lý hoá .................... 51
3.2.2. Xác định cấu trúc của altretamin tổng hợp đƣợc bằng các loại phổ .. 53
3.2.2.1. Kết quả đo phổ hồng ngoại ......................................................... 53
3.2.2.2. Kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ..................................... 54
3.2.2.3. Kết quả đo phổ khối .................................................................... 55
3.2.3. Kết quả kiểm nghiệm altretamin theo tiêu chuẩn dƣợc điển Mỹ (USP
38)................................................................................................................. 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 60
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 60
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 60


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong khoảng 50 năm trở lại đây, ung thƣ là bệnh gây tử vong xếp thứ hai
sau các bệnh về tim mạch. Hơn 70% tử vong do ung thƣ là ở các nƣớc có thu
nhập thấp và trung bình, nơi các nguồn lực dành cho phòng chống, chẩn đoán,
điều trị ung thƣ còn nhiều hạn chế thiếu thốn [13], [16]. Theo thống kê của
WHO, năm 2008 thế giới có khoảng hơn 12,6 triệu ngƣời mắc bệnh ung thƣ và
hơn 7,6 triệu ngƣời tử vong vì căn bệnh này. Ở Việt Nam, năm 2008 có 111.581
ca mắc mới bệnh ung thƣ và con số này đang ngày một tăng cao [7], [8], [46].
Ở Việt Nam thuốc điều trị ung thƣ phần lớn phải nhập ngoại từ các công
ty dƣợc nƣớc ngoài với giá cả đắt đỏ, kể cả một số thuốc có phƣơng pháp tổng
hợp hoá học không quá phức tạp. Hiện các nghiên cứu trong nƣớc về tổng hợp
thuốc điều trị ung thƣ còn khá nhiều hạn chế nên chƣa thể ứng dụng kết quả
nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất đƣợc [19].

Altretamine là thuốc đƣợc sử dụng khá phổ biến trong điều trị ung thƣ vú,
ung thƣ phổi và ung thƣ buồng trứng. Loại thuốc này hiện đang đƣợc sử dụng
điều trị ung thƣ với biệt dƣợc nhƣ: Hexastat (Pháp), Hexinawas (Tây Ban Nha),
Altretamin (Mỹ)… Hiện nay nhu cầu sử dụng thuốc điều trị ung thƣ rất lớn và
hầu hết phải nhập ngoại khiến giá thành và chi phí điều trị rất cao. Do đó việc
nghiên cứu tổng hợp các thuốc điều trị ung thƣ nói chung và altretamin nói riêng
để tiến tới có thể chủ động sản xuất đƣợc trong nƣớc là rất cần thiết.
Với mong muốn góp phần đƣa ra phƣơng pháp tổng hợp thuốc điều trị
ung thƣ phù hợp với điều kiện trang thiết bị thực tế Việt Nam, đề tài: “Nghiên
cứu tổng hợp Altretamin làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị ung thƣ” đƣợc
tiến hành với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp altretamin quy mô phòng thí
nghiệm
2. Xác định cấu trúc hoá học và kiểm nghiệm sản phẩm thu đƣợc theo
USP 38.

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN


2

1.1.

TỔNG QUAN VỀ ALTRETAMIN

1.1.1. Tên khoa học, công thức
Altretamin tên khoa học là N,N,N’,N’N”,N” – hexamethyl – [1,3,5]- triazin-2,4,6
– triamin và có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.1:
CH 3

CH 3

N

N

N

H 3C

CH 3
N

N

N
H 3C

CH 3

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Altretamin
Công thức phân tử: C9H18N6
Khối lƣợng phân tử: 210,28 đ.v.C
.Biệt dƣợc: Hexastat (Pháp), Hexinawas (Tây Ban Nha), Hexalen (Mỹ), Cantret (
Ấn Độ)…[48].

Hình1.2: Một số biệt dược đang lưu hành ở trên thị trường
1.1.2. Tính chất vật lý

3

- Bột kết tinh màu trắng, khô tơi [21].
- Độ tan:
+ Tan tốt trong chloroform, aceton, ethylacetat, dimethylsulfosid,
dimethylfonamid, ethanol nóng, methanol nóng.
+ Tan một phần trong ethanol lạnh, methanol lạnh.
+ Không tan trong nƣớc.
- Nhiệt độ nóng chảy: 172-174 oC
- Độ ổn định: Altretamin tƣơng đối bền trong quá trình bảo quản, tuy
nhiên dễ hút ẩm, vì vậy cần bảo quản trong lọ kín, tránh ánh sáng, nơi khô mát.
- Tính chất phổ [19], [29]:
+ Phổ UV (

EtOH

max) : 254 nm

+ Phổ IR (KBr, cm-1) : 2859,2278,1528,1385,1211
+Phổ MS (M+, m/z)

: 210

+ Phổ 1H-NMR

: 3,09 (s, 18H, 6-CH3)

+ Phổ 13C-NMR : 165,814 (s, 3C, Ctriazin) ; 35,788 (s, 6C, 6-CH3)
1.1.3. Tính chất hoá học
Altretamin là một dẫn chất của dị vòng 1,2,5-triazin có 3 dị tố nito và 3

nhóm amin bậc 3, thể hiện hoá tính của một dị vòng thơm [35].
Altretamin có tính base, tuy nhiên dung dịch trong nƣớc của altretamin
không làm chuyển màu giấy quỳ.
Altretamin cũng dễ bị oxy hoá bởi các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy
hoá có trong cơ thể nhƣ Cytochrom p450 trở thành các tác nhân akyl hoá có khả
năng tƣơng tác với các trung tâm giàu điện tử là các nguyên tử nito có trong hợp
phần của các base nitơ có trong cấu trúc DNA của tế bào [34].

1.1.4. Tiêu chuẩn dƣợc điển


4

Dƣợc điển Mỹ USP 38 (2015) [45] quy định chỉ tiêu chất lƣợng của
altretamin về tính chất, định tính, hàm lƣợng nƣớc, tro, kim loại nặng, và định
lƣợng nhƣ trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Chỉ tiêu chất lượng của altretamin theo dược điển Mỹ USP 38
Chỉ tiêu

Yêu cầu chất lƣợng

A. Tính chất

Bột kết tinh màu trắng
Phổ IR: Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với
phổ hồng ngoại của altretamin chuẩn.

B. Định tính

Phƣơng pháp HPLC: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải

cho pic có thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của
pic chính trên sắc kí đồ dung dich altretamin chuẩn

Hàm lƣợng nƣớc

Không đƣợc quá 1,0%

Tro

Không đƣợc quá 0,1%

Kim loại nặng

Không đƣợc quá 0,004% (40 g/g)

Định lƣợng

Hàm lƣợng altretamin phải đạt từ 98% đến 102%, tính

(pp HPLC)

theo chế phẩm khan

1.1.5. Dƣợc động học


Hấp thu: Altretamin đƣợc hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hoá sau khi

uống;
Tmax khoảng 0,5-3 giờ; Cmax = 0,2 – 20,8 mg/L



Phân bố: Không liên kết với protein huyết tƣơng.

Altretamin đƣợc phân bố nhiều đến các mô có thành phần chất béo
(ví dụ: mạc nối và các mô dƣới da).


Chuyển hoá: Altretamin trải qua oxy hoá với sự hình thành của

các chất trung gian dẫn xuất hydroxymethyl. Các chất chuyển hoá chính là
pentamethylmelamine và tetramethylmelamine.


Thải trừ: T1/2 khoảng 4,7- 10,2 giờ

90% đƣợc bài tiết qua nƣớc tiểu trong 72 giờ. [22], [48].


5

1.1.6. Tác dụng dƣợc lý


Năm 1976, Sewat và cộng sự [44] đã nghiên cứu tìm ra tác dụng

sinh học của altretamin có tác dụng chủ yếu trong điều trị ung thƣ buồng trứng,
ung thƣ vú và ung thƣ phổi.
Nhiều nghiên cứu tiếp sau đó về tác dụng sinh học của altretamin
cũng Xác định điều này [26], [30], [38], [41], [43]. Đặc biệt altretamin đƣợc sử

dụng điều trị ung thƣ buồng trứng tiến triển sau khi phƣơng pháp trị liệu đầu tiên
thất bại [23], [31], [32], [39].


Tác dụng điều trị ung thư:
 Chu trình tế bào và tác động của Altretamin:
Tế bào ung thƣ cũng nhƣ tế bào thƣờng đều phải đi qua 4 pha của

chu trình tế bào, bao gồm [8], [9]:
 Pha G1 là pha hoạt động cơ năng của tế bào, tế bào trao đổi
chất chuẩn bị cho quá trình tổng hợp DNA. Ở pha G1 tế bào có 2n NST
 Pha S là pha của quá trình tổng hợp DNA
 Pha G2 là pha chuẩn bị phân bào (tiền nguyên phân), tế bào
có 4n NST.
 Pha M là pha phân bào (nguyên phân).

Altretamin

Hình 1.3: Chu trình tế bào và vị trí tác động của Altretamin


6

Ngoài ra tế bào còn có thể đi vào trạng thái nghỉ ngơi, gọi là pha G0, từ
pha G1 (Chủ yếu) hoặc pha G2. Các tế bào này có thể quay lại chu trình tế bào
theo một cơ chế chƣa xác định.
Tuỳ theo cơ chế của từng loại hoạt chất chữa ung thƣ mà thời điểm tác
động của nó vào chu trình tế bào là khác nhau. Altretamin thuộc nhóm tác nhân
chống ung thƣ alkyl hoá [12], tác động vào pha G1 sớm của chu trình tế bào [27],
[33], [40].



Cơ chế tác dụng kháng tế bào ung thư của Altretamin

Từ các nghiên cứu của Ames và cộng sự (1981) [24], Jackson và Harley
(1991) [24] và một số nghiên cứu khác [33], [39], altretamin đƣợc xếp vào nhóm
điều trị ung thƣ kìm tế bào nhóm alkyl hoá.
Một số tài liệu đã công bố cho rằng cơ chế tác dụng chống ung thƣ của
altretamin có liên quan tới sự oxy hoá bởi enzim cytocrom P450, cụ thể là
cytocrom P450 3A4 [33].
Cơ chế quá trình hoạt hoá altretamin và tác dụng akyl hoá DNA của tế bào
ung thƣ có thể đƣợc mô tả nhƣ sau:
 Đầu tiên một nhóm methyl –CH3/ -N(CH3)2 bị oxy hoá thành alcol bậc
nhất – CH2OH bới enzyme cytocrom P450 3A4.
 Tiếp theo là bƣớc dehydrat hoá tạo ra ion methylenniminium, một tác
nhân ái điện tử. Ion methyleniminium mang điện tích dƣơng là tác nhân rất hoạt
động có nhiệm vụ alkyl hoá DNA.
 Theo Garcia và cộng sự, ion methyleniminium tạo thành là chất trung gian
có ái lực electrophil lớn đối với các trung tâm giàu điện tử trên phân tử DNA.
 Tác dụng trị liệu và gây độc tế bào của tác nhân alkyl hoá chống ung thƣ
liên quan trực tiếp và mật thiết với việc alkyl hoá DNA. Nguyên tử N ở vị trí số 1
và vị trí số 3 của hợp phần adenin, nguyên tử N ở vị trí số 7 và nguyên tử O của
hợp phần guanin, nguyên tử N ở vị trí số 3 của hợp phần cytosin đều dễ dàng tạo
ra liên kết với các tác nhân electrophil (ion methylenniminium). Tƣơng tự nhƣ
vậy, các nhóm –CH3 sẽ tiếp tục đƣợc hoạt hoá.


7

 Nghiên cứu của Jacson và cộng sự [33] cũng chỉ ra cơ chế tác dụng

của altretamin là do sự tạo thành liên kết cầu nối (cross linking) liên kết cầu nối
tạo thành bởi tác dụng của forrmaldehyd đƣợc tạo ra bởi quá trình deformyl hoá
của altretamin với các nguyên tử N ở vị trí số 6 của vòng purin trong hợp phần
deoxyadenosin.
1.1.7. Chỉ định, dạng bào chế, liều dùng, cách dùng.
Ngày 26/12/1990 Altretamin với biệt dƣợc Hexalen (US Biosience) đã
đƣợc cục quản lý dƣợc và thực phẩm Mỹ (FDA) cấp phép lƣu hành đƣa vào sử
dụng trong điều trị ung thƣ trên ngƣời. Ngày 5/7/1995 Hexalen chính thức đƣợc
cấp phép lƣu hành tại Châu Âu. Từ đó đến nay Hexalen và nhiều biệt dƣợc khác
của altretamin vẫn đƣợc lƣu hành rộng rãi để sử dụng và điều trị ung thƣ [48].
 Chỉ định: Altretamin đƣợc chỉ định cho điều trị các khối u ở phổi, buồng
trứng và vú. Đặc biệt altretamin đƣợc sử dụng điều trị ung thƣ buồng trứng tiến
triển sau khi phƣơng pháp trị liệu đầu tiên thất bại [28], [48].
 Dạng bào chế: Viên nang 50mg, 100mg.
 Liều dùng, cách dùng: Liều hằng ngày, chia 3,5 lần, uống xa bữa ăn. Liều
dùng phải đƣợc điều chỉnh để đáp ứng từng bệnh nhân, trên cơ sở đáp ứng lâm
sàng và mức độ tác dụng phụ, đặc biệt theo dõi tác dụng phụ trên thần kinh và
huyết học.
-

U buồng trứng: 150-250 mg/m2/ngày, trong 21 ngày/tháng.

-

U phổi: 150-250 mg/m2/ngày, đợt dùng 5 ngày.
Nghỉ 5 ngày lại dùng đợt khác, phối hợp với thuốc kìm tế bào khác.

-

U vú: 150-250 mg/m2/ngày, trong 15 ngày/ tháng.

1.1.8. Tác dụng không mong muốn.
Áp dụng cho viên nang uống [47].
- Tác dụng phụ trên hệ tiêu hoá: Buồn nôn và nôn (33%), tăng phosphatase
kiềm (90%).
- Tác dụng phụ trên hệ thần kinh bao gồm; Bệnh thần kinh ngoại biên cảm
giác (31%), chán ăn và mệt mỏi (1%), và động kinh (14%).


8

- Tác dụng phụ về huyết học bao gồm: Thiếu máu (33%), giảm tiểu cầu
(9%), và giảm bạch cầu (5%).
- Tác dụng phụ trên thận: Nồng độ creatin máu 1,6-3,75 mg/dl (7%) và mức
độ nito ure máu tăng (9%).
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ALTRETAMIN
Có nhiều phƣơng pháp tổng hợp altretamin đƣợc công bố từ nhiều nguồn
nguyên liệu khác nhau.
1.2.1. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Donald W. Kaiser và cộng sự.
Qui trình tổng hợp altretamin của Donald W.Kaiser và cộng sự [29] công
bố lần đầu tiên năm 1951 đi từ nguyên liệu ban đầu là cyanuaric clorid và
dimethylamin với sự có mặt của natri hydroxyd trong dung môi aceton.
CH 3
Cl

N

N

Cl

N

3

NaOH

H 3C

N

CH 3
N

N

CH 3 NH
2
Aceton

N
N

H 3C

Cl

N

CH 3

3 NaCl

3 H2O

CH 3

Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Donal W. Kaiser
Phản ứng gồm 2 bước:
-

Bước 1: Hoà tan 1 mol cyanuric clorid vào 800 ml dung môi

aceton, thêm 3,3 mol dimethylamin, rồi thêm vào 1 mol natri hydroxyd, đun hồi
lƣu ở 50oC trong 1 giờ. Cất loại dung môi. Phần cắn khô thu đƣợc thêm xylen,
lắc đều rồi cất đẳng phí để loại hoàn toàn nƣớc.
-

Bước 2: Thêm vào hỗn hợp phản ứng 2 mol natri hydroxyd khan

rồi đun nóng 3 giờ ở 100oC. Xử lý hỗn hợp phản ứng, thu đƣợc sản phẩm thô.
Kết tinh lại bằng methanol, thu đƣợc sản phẩm kết tinh màu trắng. Hiệu suất quá
trình tổng hợp đạt 37,00%.
Các thông số chính của phương pháp:


9

 Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng: cyanuric clorid/ dimethylamin/
NaOH là 1:3,3:3.

 Hiệu suất 37%
 Sản phẩm kết tinh hình kim màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy là 172oC174oC.
 Sản phẩm phụ là: 4,6- dicloro-2- dimethylamino-s- triazin và 2- cloro4,6- bis –(dimethylamino)-s- triazin. Các sản phẩm này dễ tan trong MeOH,
EtOH lạnh nên loại bằng cách kết tinh lại từ methanol hoặc ethanol.
TS. Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến quy trình này [9]
nhằm hạn chế dùng dung môi ethanol độc hại để kết tinh và đạt hiệu suất cao hơn
(đạt hơn 70,00% sau khi cải tiến). Quy trình đƣợc cải tiến nhƣ sau:
- Tiến hành phản ứng trong hai lần cho NaOH không qua giai đoạn cất
quay loai dung môi aceton và nƣớc.
- Xử lý hỗn hợp sau phản ứng bằng cách cất loại dung môi, dùng hỗn hợp
ethylacetat- nƣớc chiết lấy sản phẩm, rửa với dung dịch NaCl bão hoà, làm khan
bằng Na2SO4 khan, lọc, cất quay loại dung môi, thu sản phẩm thô.
- Thay thế dung môi kết tinh MeOH bằng dung môi EtOH tuyệt đối.
1.2.2. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của H. Von Brachel và cộng sự
H. Von Brachel và cộng sự (1965) [36] công bố phát minh sang chế về
điều chế altretamin đi từ melamin và formalin theo sơ đồ sau:

Hình 1.5: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo H.Von Brachel


10

1.2.3. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Antonio Herrera và cộng sự
Năm 2014, Antonio Herrera và cộng sự [25] tiến hành tổng hợp
altretamin từ nguyên liệu ban đầu là N, N- dimethylcyanamid.

Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Antonio Herrera
Quy trình tổng hợp altretamin theo phƣơng pháp của Antonio Herrera:
Bƣớc 1: Khuấy đều hỗn hợp N, N- dimethylcyanamid và triflic
anhydride trong dicloromethan, ở nhiệt độ thƣờng trong 12 giờ, altretamin sẽ từ

từ tạo thành.
Bƣớc 2: Xử lý hỗn hợp phản ứng: Trung hoà phản ứng bằng dung dịch
NaHCO3 bão hoà rồi chiết dicloromethan (3 lần), gộp các dịch chiết và rửa bằng
dung dịch NaCl bão hoà, sau đó làm khan bằng MgSO4, cất thu hồi dung môi thu
đƣợc cắn khô.
Bƣớc 3: Tinh chế altretamin: Cắn khô đƣợc kết tinh lại 2 lần từ EtOH
tuyệt đối, thu đƣợc altretamin là chất kết tinh trắng, nhiệt độ nóng chảy 174oC175oC.
ThS. Lò Văn Thanh cùng cộng sự [18] đã nghiên cứu tổng hợp
altretamin theo phƣơng pháp của Antonio Herrera và cải tiến nhƣ sau:
-

Tỷ lệ N, N-dimethylcyanamid: trislic anhydride là 1: 0,35

-

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Thay dung môi chiết dicloromethan bằng dung môi
ethylacetat.

-

Thời gian tiến hành phản ứng: 12h

-

Hiệu suất: 77,00%


11

1.2.4. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Kapril Arya và cộng sự

Cũng từ nguồn nguyên liệu ban đầu là cyanuric clorid và dimethylamin,
năm 2007 Kapril Arya và cộng sự đƣa ra phƣơng pháp vi sóng và xúc tác zeolite
vào áp dụng điều chế altretamin [37].
CH 3
Cl

N

N

N

Cl

NH

3

Zeolit
CH 3 NH
2
M W, 6-10'

Cl

CH 3
N

N

H 3C

CH 3
N

N
N

H 3C

CH 3

Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo pp của Kapril Arya
TS. Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự cũng có nghiên cứu tổng hợp
Altretamin theo quy trình tổng hợp của Kapril Arya và cải tiến, khảo sát các yếu
tố ảnh hƣởng đến hiệu suất. Phản ứng tiến hành qua 1 giai đoạn, sử dụng xúc tác
HY zeolit. Quy trình phản ứng đơn giản, cho lần lƣợt cyanuric clorid, HYzeolite,
dimethylamin, nƣớc vào lọ thuỷ tinh pyex, đặt trong lò vi song 6 phút, sau đó xử
lý hỗn hợp phản ứng: Thêm ethanol rồi lọc bỏ loại lớp xúc tác rắn, cất quay loại
dung môi, thu sản phẩm thô, kết tinh trong cồn tuyệt đối, lọc, hút, sấy, kết quả
đƣợc altretamin với hiệu suất 88,00% [12].
1.2.5. Phƣơng pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự
Năm 2008, cũng đi từ nguyên liệu ban đầu là N,N –dimethylcynamid
nhƣng với xúc tác tris(dimethylamido)- aluminium trong n- hexan Peter Dornan
tổng hợp altretamin theo sơ đồ sau [42]:


12

Hình 1.8: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo PeterDornan

Quy trình tổng hợp :
-

Bƣớc 1: Hoà tan N,N –dymethylcynamid và tris (dimethylamido)-

aluminium trong n-hexan, khuấy ở nhiệt độ phòng, altretamin từ từ đƣợc tạo
thành.
-

Bƣớc 2: Xử lý hỗn hợp phản ứng, và kết tinh lại trong ethanol, thu đƣợc

altretamin là chất kết tinh trắng, nhiệt độ nóng chảy 1740C-175oC.
Th.S Lò Văn Thành cùng các cộng sự [18] đã nghiên cứu tổng hợp Altretamin
theo phƣơng pháp của Peter Donal và cải tiến quy trình ở một số điểm nhƣ sau:
 Tỷ lệ N,N- dimethylcyanamid: tris (dimethylamino) aluminium
=1:0,0125.
 Dùng dung môi mesitylen thay cho n- hexan.
 Thời gian tiến hành phản ứng: 24h.
 Hiệu suất: 82,00%.
1.3.

Lựa chọn phƣơng pháp
Trong các phƣơng pháp trên, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp của Donald

W.Kaiser [29], để tiến hành thực nghiệm tổng hợp altretamin vì có các ƣu điểm
nổi bật sau:
-

Hiệu suất của quá trình thấp (37,00%)

-

Các nguyên liệu chính và hoá chất, dung môi cần thiết cho quá trình

tổng hợp: aceton, NaOH…là những hoá chất, dung môi thông dụng, có sẵn trên
thị trƣờng Việt Nam với giá thành hợp lý.


13

- Các giai đoạn phản ứng có thể đƣợc thực hiện trên thiết bị, dụng cụ đơn
giản, điều kiện phản ứng không khắc nghiệt, phù hợp với điều kiện phòng thí
nghiệm cũng nhƣ dễ dàng khi triển khai sản xuất ở quy mô lớn hơn.
Hiệu suất phản ứng qua nghiên cứu sơ bộ cho thấy có thể cải tiến để

-

tăng đƣợc hiệu suất phản ứng [3], [6].
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP HOÁ LÝ DÙNG TRONG XÁC ĐỊNH
CẤU TRÚC HOÁ HỌC VÀ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT
HỮU CƠ.
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [1], [2] là một kỹ thuật sắc ký trong đó pha tĩnh
chứa chất hấp phụ đƣợc trải đều thành lớp mỏng, mịn, và đồng nhất, đƣợc cố
định trên phiến kính hoặc phiến kim loại, nhựa; pha động là một hệ dung môi.
Hệ số lƣu giữ Rf là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ chuyển dịch của các
chất, đƣợc tính bằng tỷ lệ khoảng cách dịch chuyển của pha động. Việc ổn định
giá trị Rf thƣờng phụ thuộc nhiều yếu tố và gặp nhiều khó khăn về mặt kỹ thuật
nên quá trình phân tích thƣờng tiến hành song song với chất chuẩn trong cùng
điều kiện sắc ký.

Ứng dụng:
-

Định tính

-

Thử độ tinh khiết

-

Theo dõi quá trình phản ứng, điểm kết thúc phản ứng

-

Định lƣợng, bán định lƣợng

1.4.2. Đo nhiệt độ nóng chảy
Đối với chất rắn kết tinh, điểm nóng chảy là một tiêu chuẩn vật lý học rất
quan trọng. Thông thƣờng việc phân tích định tính đầu tiên sau khi thu đƣợc một
sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm nóng chảy của nó (hay còn gọi là điểm
chảy, có ký hiệu Đc; Mp) [1].
Điểm chảy là một tiêu chuẩn quan trọng để kiểm tra mức độ tinh khiết của
hợp chất, vì điểm chảy của một chất tinh khiết là một hằng số, là tính chất vật lý


14

đặc trƣng của chất đó. Nếu điểm chảy của tinh thể thu đƣợc qua 2 hoặc nhiều lần
kết tinh chỉ chênh nhau không quá 0,5oC thì có thể xem sản phẩm kết tinh đó

tƣơng đối tinh khiết.
Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa so với điểm chảy lý
thuyết, chứng tỏ sản phẩm thu đƣợc chƣa tinh khiết nên còn phải tiếp tục tinh chế
và kết tinh lại để có đƣợc sản phẩm tinh khiết (do tính chất đặc trƣng của điểm
euteclic – điểm chảy của hỗn hợp luôn thấp hơn điểm chảy của bất cứ thành phần
nào có trong hỗn hợp đó).
Trong nhiều trƣờng hợp, dựa trên điểm chảy xác định đƣợc, đối chiếu so
sánh với tài liệu tham khảo đã có thể đƣa đến kết luận sơ bộ, hoặc nhận định sơ
bộ về chất lƣợng các hợp chất đang nghiên cứu [20].
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- high performance liquid
chromatography) ra đời năm 1967- 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến phƣơng
pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động
là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng
tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã
đƣợc biến bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này
ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lí do: có độ nhạy cao, khả
nặng định lƣợng tốt. Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng, nhƣ
phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực
phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng… [20], [21].
1.4.4. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (Ifrared spectrometry – IR)
Phổ hồng ngoại (Ifrared spectrometry – IR), hay phổ IR là một kỹ thuật
dựa vào sự dao động và quay của các nguyên tử trong phân tử. Nói chung, phổ
IR nhận đƣợc bằng cách cho tia bức xạ IR đi qua mẫu và xác định phần tia tới bị
hấp thụ với năng lƣợng nhất định. Năng lƣợng tại pic bất kỳ trong phổ hấp thu
xuất hiện tƣơng ứng với tần số dao động của một phần phân tử mẫu.


15

Do mỗi dạng liên kết có tần số dao động khác nhau ở trong môi trƣờng
xung quanh khác nhau và do hai dạng liên kết nhƣ nhau trong hai hợp chất khác
nhau ở trong môi trƣờng xung quanh khác nhau, nên không có hai phân tử với
cấu trúc khác nhau có các hấp thụ IR, hay phổ IR, giống nhau. Do đó phổ IR có
thể đƣợc sủ dụng để phân biệt hai hay nhiều hợp chất khác nhau về cấu trúc phân
tử. Nếu phổ IR của chúng trùng nhau về các pic, nhất là trong vùng 1500 – 600
cm-1 (Đƣợc gọi là vùng vân tay) thì trong hầu hết các trƣờng hợp hai chất là đồng
nhất [20].
Phổ hồng ngoại đƣợc xây dựng dựa trên cơ sở sự khác nhau về dao động
của các liên kết trong phân tử một hợp chất dƣới sự kích thích của tia hồng ngoại.
Nhƣ vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của hai dạng năng lƣợng là năng lƣợng
dao động ( ) và năng lƣợng quay ( ).
Các hấp thụ của mỗi dạng liên kết chỉ xuất hiện ở một vùng nhỏ của phổ
IR. Mỗi vùng phổ IR có thể xác định cho một dạng liên kết, ngoài vùng này, hấp
thụ thƣờng thuộc về một số dạng liên kết khác. Tần số hay độ dài sóng hấp thụ
của mỗi chất phụ thuộc vào khối lƣợng tƣơng đối của nguyên tử, vào liên kết và
vào cấu trúc hình học của chúng. Mỗi kiểu liên kết đƣợc đặc trƣng bởi một vùng
bƣớc sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại có thể xác định (nhận biết)
đƣợc các nhóm chức đặc trƣng có trong một hợp chất. Ví dụ nhƣ các dao động
hoá trị ( ) đặc trƣng của một số liên kết nhƣ sau:
- Bất kỳ hấp thụ trong vùng 3000+/- 150cm-1 luôn thuộc về dao động hoá trị
( ) của liên kết C-H trong phân tử.
-

Hấp thụ trong vùng 1715+/- 100 cm-1 là do sự có mặt của liên kết C=O

trong phân tử.
- Hấp thụ trong vùng1715+/- 1000 cm-1 là liên kết ( ) của C-O.
- Liên kết C=N có hấp thụ trong vùng 1690-1640 cm-1 và C N ở vùng
2260-2240 cm-1.

- Dao động hoá trị ( ) của liên kết C=C alken trong vùng 1680-1600 cm-1
trong khi của aren hấp thụ ở vùng 1600 và 1450 cm-1.


16

- Hấp thu của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl và NH là 3300-3600
cm-1.
- Phổ IR thƣờng đo trong vùng 400-4000 cm-1.
1.4.5. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry- MS)
Trong phƣơng pháp phổ khối lƣợng, các phân tử của chất mẫu đƣợc ion
hoá và đƣợc phân mảnh. Các ion xuất hiện đƣợc phân tách theo số khối của
chúng và đƣợc ghi nhận dƣới dạng các tín hiệu trên phổ. Vị trí của tín hiệu cho
biết số khối và cƣờng độ tín hiệu cho biết hàm lƣợng tƣơng đối của ion tƣơng
ứng [20].
Phổ khối lƣợng có hai ứng dụng chính:
-

Nhận biết các chất cùng với công thức cấu trúc của chúng.

-

Xác định công thức cấu trúc của hợp chất chƣa biết.

 Ứng dụng phân tích phổ khối lƣợng trong xác định cấu trúc phân tử.
Để xác định cấu trúc, những mảnh phổ có khối lƣợng lớn có ý nghĩa hơn
những mảnh nhỏ. Những pic có cƣờng độ lớn là những pic ứng với các ion tạo
thành với xác suất cao khi phân mảnh, cho nên cần đƣợc xem xét đầy đủ. Xác
định công thức cấu tạo của hợp chất hữu cơ dựa vào phổ khối theo các bƣớc.
1.4.6. Phƣơng pháp Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonace – NMR) là một
phƣơng pháp phổ quan trọng đối với hoá học hữu cơ trong việc xác định cấu trúc
hợp chất. Phƣơng pháp phổ NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tƣơng tác
bức xạ điện từ tần số radio với tập hợp hạt nhân đƣợc đặt trong từ trƣờng mạnh.
Do vậy, phổ NMR là phƣơng tiện duy nhất có thể cung cấp thông tin chi tiết về
cấu trúc phân tử mà khó có thể nhận đƣợc bằng bất kỳ phƣơng pháp nào khác
[20].
Nguyên lý chung của phƣơng pháp phổ NMR là sự cộng hƣởng khác
nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng
hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học.