NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM RPS XỬ LÝ LIGNIN – CELLULOSE TRONG VỎ CÀ PHÊ THÀNH PHÂN HỮU CƠ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM RPS XỬ
LÝ LIGNIN – CELLULOSE TRONG VỎ CÀ PHÊ
THÀNH PHÂN HỮU CƠ
Lời mở đầu
I tổng quan tài liệu
I.1. nghiên cứu ligin – cellulose(lc) trong vỏ cà phê( thành phần hóa học vỏ cà
phê)
Thành phần chủ yếu của tế bào thực vật là xenlulo, hemixenlulo và lignin
I.1.1 Xenlulo.
Thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 505 tổng lượng
hydrocacbon trên trái đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu còn có trong giới
động vật, nhưng số lượng rất ít. Xenlulo là polysacarit gồm có anhydro- D- …..
liên kết với nhau bằng lien kết -1,4-glucozit, mức độ polyme hóa của Xenlulo rất
cao tới 10000-14000 đơn vị glucoza/ phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và
gian phân tử làm cho phân tử Xenlulo có độ cứng và vững chắc
Liên kết glucozit không bền với acid. Xenlulo dễ bị phân hủy bởi acid và tạo
thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro- Xenlulo có độ bền cơ học
kém hơn Xenlulo nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo
thành là D-glucoza
Về bản chất hóa học Xenlulo là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim
loại kiềm tạo thành xenlulo-ancolat. Nguyên tử hydro ở các ở các nhóm OH bậc
một và hai trong phân tử Xenlulo cũng có thể bị thay thế bởi các gốc – metyl,
-etyl, … tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác
nhau.
Xenlulo cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một
phần là oxy- Xenlulo. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO
4
), và
muối của nó. Xenlulo không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng
mạch Xenlulo và hòa tan một phần Xenlulo phân tử nhỏ. Đặc biệt Xenlulo dễ
hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat (Cu(NH

3
)
4
(OH)
2
), và hàng loạt các
dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm….
I.1.2.Hemi Xenlulo.
Cũng là một phần polysacarit thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm
lượng lớn sau Xenlulo
Tuy nhiên Xenlulo, hemixenlulo được hình thành không chỉ một đường mà
nhiều đường khác nhau, thậm chí cả từ acid urnoic của chúng. Người ta gọi tên
cụ thể một loại hemixenlulo là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên nó. Ví
dụ: xylan là một hemixenlulo mà thành phần chủ yếu của nó là xyloza, manan –
manoza,.. Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu hemixenlulo được tạo nên từ loại đường
6 cacbon : galactam, manan…
Khác với Xenlulo, phân tử hemixenlulo nhỏ hơn nhiều thông thường không quá
150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà còn bằng
liên kết -1,3 và -1,6 glucozit tạo ra mạch ngắn và phân nhánh
Vì độ polyme thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemixenlulo không
có cấu trúc chặt chẽ như ở xenlulo và độ bền hóa lý cũng thấp hơn. Hemixenlulo
dễ tan trong dung dịch kiềm, trong nước nóng và dễ bị phân hủy bởi acid long
Xylan là một hemixenlulo phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm 30% khối lượng
rơm, 20-25% cây gỗ lá rộng, 7-17% cây gỗ lá kim.

I.1.3. Lignin
Là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở những mô
hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thắm nước qua
vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh
Khc với xenlulo, hemixenlulo lignin hình thnh từ cc dẫn suất của phenyl, propan,

một chất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin là sản phẩm ngưng
tụ của 3 thành phần chủ yếu rượu trans-p-cumaryl, trans-coniferyl, trans-cynapyl
theo tỷ lệ khác nhau tùy loại thực vật. lignin của cây gỗ thực vật mềm điển hình
(cy vn sm) gồm cĩ 80 conyferyl, 14 cumaryl và 6% coniferyl. Lignin của cây gỗ
cứng gồm lượng bằng nhau của conyferyl và cynapyl, cịn cumaryl khiếm tỷ lệ
rất nhỏ.
Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kết và
loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa monome là
kiểu liên kết aryl-glyxerol--aryl ete. Ngồi ra cịn cc kiểu lin kết phenyl-cumaryl,
biphenyl, diarylete. Vì dẫn suất của cc hợp chất thơm có mạch bên với nhiều
nhớm chức hoạt động, đặc biệt là OH của nguyên tử cacbon(đối với vịng thơm)
nên lignin có thể tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với
xenlulo và hemixenlulo, như các phản ứng thế( clo hóa), phản ứng este hóa, oxy
hóa, dimetyl hóa.
Hịa tan tốt trong dung dịch kiềm nóng, một phần trong dung môi hữu cơ
I.1.4. Lignin-xenlulo tự nhiên là một cơ chất khó phân hủy
Mỗi thnh phần cấu tạo nn lignin- xenlulo riêng, do bản chất các kiên kết hóa học,
do mức độ polyme hóa và tính không tan trong nước là đối tượng khó phân hủy.
tính khó phân hủy lại gia tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và với
các thành phần khác nữa thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp
Cc mạch phn tử xelulo khơng bao giờ tồn tại ring lẻ m nhờ lin kết hydro gian
phn tử tạo thnh các cấu trúc lớn hơn gọi là vi sợi, dọc theo sợi có những vùng tại
đó các phân tử sắp xếp song song và chặt khít gọi là vùng kết tinh, xen kẽ những
vùng mà có sự sắp xếp kém trật tự và chặt chẽ là vùng vô định hình. Cc vi sợi lin
kết với nhau bằng cch đan xen ở những vùng vô định hình ny.
Các vi sợi xenlulo, lignin, hemixenlulo theo những quy tắc những quy tắc nhất
định để hình thnh nn cấu trc vi sợi. với cấu trc nhiều lớp gồm cĩ nhiều thnh phần
cĩ bản chất hĩa học khc nhau như vậy, lignin-xenlulo có độ bền vật lý cao rất khó
xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ thành
phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thành

phần khác. Ví dụ để phân giải LX cần đồng thời phải tác động phân giải cả L, X,
Hx. Nhưng do cả ba điều có tính chất hóa học khác nhau nên cơ chế tác động và
điều kiện tiến hành cũng khác nhau .
I.1.5.Xử lý sơ bộ nguyên liệu
Thành phần hữu ích nhất của nguyên liệu đối với mục đích sinh học là X. hiệu
quả của các quá trình thủy phân X phụ thuộc nhiều vào độ mẫn cảm của nó đối
với tác nhân thủy phân. Trong tự nhiên X rất khó phân hủy vì phn tử của nĩ rất
lớn độ kết tinh cao và nó liên kết chặt chẽ với lignin vì vậy việc xử lý sơ bộ là
cần thiết.
Phương pháp cổ điển là là xử lý bằng kiềm dựa trn tc dung kiềm hịa tan Lignin,
lm phịng xenlulo, kỹ thuật đơn giản chỉ việc ngâm trong dung dịch NaOH 1,5%
ở nhiệt độ thường sau 24h lọc rửa lấy chất cịn lại giu xenlulo cĩ độ thủy phân cao
70% ( ban đầu chỉ 50%) Na
2
CO
3
, NaOCl, acid peracetic… cũng là tác nhân khử
Lignin mạnh. Đặc biệt là nhiệt độ và áp suất cao, etylenglycol ở 120
0
C 1at có thể
khử 84% trong sản phẩm thu hồi chỉ có 1.9% Lignin ( ban đầu là 11.6%)
Các phương pháp cắt, nghiền … tuy không làm giảm lượng Lignin nhưng sẽ làm
tăng tiếp xúc bề mặt của cơ chất, góp phần làm yếu đi liên kết L-X, giảm độ
polyme hóa, độ kết tinh của của Xenlulo do đó làm tăng độ thủy phân
Tia γ có bước sóng ngắn làm giảm độ polyme hóa của X do đó làm tăng độ thủy
phân. Tuy nhiên chúng có thể làm tăng biến tính mạch sacarit có hại cho quá
trình chuyển hĩa sinh học
Cc tc nhn vật lý khc như siêu âm, áp suất cao, nhiệt cũng có kết quả cao
Các phương pháp trên có kết quả tốt nhưng chỉ trong điều kiện thí nghiệm và địi
hỏi tốn nhiều chi phí, nhiều năng lượng và có thể gây ô nhiễm do sản phẩm phụ,

I.2. Các enzyme phn hủy cellulose
I.2.1.Thành phần và cơ chế tác động
a) endo – 1,4--D- glucanaza không tấn công vào X kết tinh tấn công vào X
vô định hình v CMC cũng như các xenlo-oligosacarit mạch dài
b) exo – 1,4- -D- glucanaza tấn công X kết tinh, X vô định hình v xenlo-
oligosacarit, CMC thì khơng.
c) Xenlobiozan ( glucozidaza) chỉ thủy phn xenlobioza v xenlo- oligosacarit
mạch ngắn, glucoza l sản phẩm thủy phn duy nhất v l chất kiềm chế
Theo cơ chế này đầu tiên endo – glucanaza tấn công vào các vùng vô định hình
trn bề mặt xenlulo cắt cc lin kết – 1,4 – glucozit tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp
đến exo – glucanaza tấn công cắt ra từng đoạn 2 đơn vị glucoza, từng mạch đơn
tạo thành. Kết quả tác động của endo-exo glucanaza lm xuất hiện cc xenlo-
oligosacarit mạch ngắn, xenlobioza v cả glucoza, xenlobiza thủy phn tiếp tạo
thnh glucoza.
I.2.2.Sinh tổng hợp cellulase ở nấm
Trong điều kiện hiếu khí, vai trị chính phn giải lignin-cellulose thuộc về nấm
mục nâu và nấm mục trắng. cơ chất bị phân hủy hóa nâu là do lignin tích lũy.
Nấm mục trắng phân giải tất cả các thành phần đó.
Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật
Trong tự nhiên có rất nhiều loài sinh vật có khả năng sinh ra cellulsae, nhưng
nguồn quan trọng và có khả năng phân hủy cao vẫn là nấm, chúng dễ dàng phát
triển trên môi trường đơn giản giải phóng nhiều nhiều enzyme cellulase có hiệu
quả phân hủy cao cellulose
Nhiều tác giả khẳng định cellulase có cơ chất cảm ứng tốt là cellulose, lactoza,
…
Nhưng có một số tác giả lại đưa ra bằng chứng cho rằng cellulase là một enzyme
cấu trúc: có thể tộng hợp cellulase trên môi trường không có cellulose hay các
chất cảm ứng thích hợp. đúng hơn cả cần phải coi sự tổng hợp cellulase có tính
cảm ứng không chặt chẽ. Quan niệm này phù hợp với thực tế và cũng logic khi
cellulose là cơ chất không tan trong nước, phân tử lớn, bản thân nó không thể

xâm nhập vào tế bào để gây ra các phản ứng sinh hĩa bn trong tế bo vi sinh vật.
Các chất gọi là cảm ứng chỉ có tác dụng dương tính trong một giới hạn nhất
định, vượt qua giá trị đó sẽ ức chế tổng hợp cellulase. Sự kiềm chế tổng hợp
celluase xảy ra rất mạnh trong môi trường có cacbon hydrat dễ tiêu, đặc biệt là
glucoza. Khi môi trường cịn cĩ cc cacbon hydrat dễ tiu thì qu trình tổng hợp
cellulase chưa xảy ra, thậm chí khi tế bào đang tổng hợp cellulase m bổ sung vo
glucoza thì ngay lập tức sẽ lm giảm khả năng tổng hợp cellulase. Từ hiện tượng
này các nhà khoa học cho rằng tổng hợp cellulase được kiểm soát bởi cơ chế dị
hóa. Một số chất hữu cơ dễ đồng hóa không phải đường : pepton, glyxerin,
gluxin.. có tác dụng làm tăng tổng hợp cellulase ở nhiều loài nấm
Cĩ lẽ qu trình tổng hợp cellulase chịu điều khiển của nhiều cơ chế: cảm ứng,
kiềm chế bởi sản phẩm cuối, kiềm chí dị hóa vàn hiệu quả của mỗi cơ chế tùy
thuộc vào điều kiện môi trường và loài vi sinh vật
Một hiện tượng phổ biến là: điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase khác
với điều kiện tối ưu cho sinh trưởng, có lẽ đây là một biện pháp thích ứng với
môi trường của vi sinh vật: cơ chế cần tiêu thụ nhiều đường glucoza hơn để bù
đấp lại những bất lợi mà môi trường gây ra, kết quả là cellulase được tổng hợp
nhiều hơn. Cũng có thể sự tổng hợp nhiều cellulase trong môi trường gây bất lợi
cho sinh trưởng chỉ là kết quả của sự mất cân bằng sinh lý .
Tác dụng bất lợi của một số chất hoạt động bề mặt ( twen 80, triton ) tới sự tổng
hợp cellulase cũng được giải thích theo hai cơ chế. Theo sterberg , mandels,
weber chất hoạt động bề mặt làm tăng tính thẩm thấu của màng tế bào, do đó làm
dễ dàng giải phóng ra cellulase ra khỏi màng tế bào. Cịn Hulme v Strans cho
rằng chng lm giảm sự thm nhập của oxy vo tế bo, do đó hạn chế sinh trưởng tăng
tổng hợp cellulase.
I.2.3. Cc enzyme phn giải lignin
Thành phần và cơ chế tác động
Ngay từ 1938, davison và cộng sự đ cho rằng enzyme phenoloxydaza rất phổ
biến ở nấm mục trắng, chắc cĩ một vai trị no đó trong quá trình phn giải lignin,
về sau hng loạt những enzyme oxy hóa phụ thuộc hay không phụ thuộc peroxyt,

NAD, NADP đ được chứng minh là có vai trị trong qu trình phn giải lignin
Eggling nhận thấy rằng tính oxy hóa rất mạnh và không đặc hiệu của các tác
nhân phân giải lignin. Tác giả này cũng gi thiết vai trị quan trọng của gĩc OH.
Ơng cho rằng gốc tự do ny tham gia vo nhiều phản ứng sinh hĩa trong cc phản
ứng của qu trình phn giải lignin, gĩc
.
OH cĩ thể sinh ra từ H
2
O
2
,
O
2
-
+ H
2
O
2
O
2
+OH
-
+
.
OH
Trong vỏ cà phê có đầy đủ điều kiện để nấm tạo ra H
2
O
2
v tiến hnh phản ứng ny,

cịn O
2
-
đđược sinh ra trực tiếp từ phản ứng oxy hóa acol, glucoza, được xúc tác
bởi oxygenaza.
Các tác giả cũng nhận thấy như vậy và chắc rằng các góc tự do mang điện tích
dương có vai trị khơi màu phản ứng cắt mạch bên của đại phân tử lignin
Skersten và cộng tác bằng phương pháp cộng hưởng điện đ chứng minh sự hình
thnh điện tích dương từ metoxybenzen trong quá trình phn giải cc hợp chất
lignin
Skriabin và cộng sự,m maltseva và cộng sự đ xc định được mối quan hệ chặt chẽ
giữa sự hình thnh H
2
O
2
và mức độ lignin. Skriabin cịn chứng minh được sự có
mặt và vai trị của gĩc
.
OH trong qu trình ny. Cho đến nay, những kết quả thu
được và cho phép khẳng định thêm rằng hệ thống phân giải lignin bao gồm rất
nhiều loại enzyme và coenzyme có khả năng oxy hóa cao.
Sinh tổng hợp lignaza
Các nấm mục trắng là nhóm vi sinh vật phân giải lignin. Trong đó có nấm
pharerochaete chrysosporium có hoạt lực lignaza ngoại bào thuộc loại cao nhất.
Một số tc giả thơng bo về về hiệu quả kích thích phân giải lignin, các dẫn suất
thơm thành phần của lignin
Nhiều tác giả thấy rằng sự phân giải lignin chỉ bắt đầu sau pha lag dài hay ngắn
tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường, thường xảy ra mạnh nhất trong pha
cân bằng của chu trình pht triển chính của vi sinh vật.
Theo ý kiến của: Ander P, K.E. Eriksson sự phn giải l một hoạt động trao đổi

chất thứ cấp, các tác giả cũng cho rằng các hoạt động trao đổi chất thứ cấp trong
đó có cả phân giải lignin được khởi đầu bằng sự hạn chế dinh dưỡng và việc bổ
sung dinh dưỡng thường hạn chế sự phân giải
I.3. Lên men rắn và định hưĩng sản xuất chế phẩm RPS
I.3.1. sơ lựoc lịch sử - đặc điểm của phưong php ln men rắn
Tên này được sử dụng đầu tiên vào năm 1977 để phân biệt với tên len men lỏng
hay chìm
Ln men chìm rắn chỉ l sự mơ phỏng một dạng sinh thi của sự tồn tại v hoạt động
của vi sinh vật tự nhiên, thường xảy ra trong quá trình phn giải hiếu khí cc cơ
chất không hịa tan
Sau khi qu trình nghin cứu của takamine sử dụng phương pháp lên men rắn hạt
ngũ cốc và cám bằng aspegillus niger để sản xuất amylaza. Vào đầu thế kỷ 20 thì
phương pháp này được sử dụng rộng ri trong cơng nghệ vi sinh ở u Mỹ
Đặc điểm:
Tồn bộ mơi trường là khối cơ chất xếp rắn, nước rất ít, lớp mỏng trên bề mặt
Hoạt động sống của vi sinh vật chủ yếu trên bề mặt, sự trao đảo khí và nhiệt hầu
như trực tiếp giữa pha rắn và pha khí.
Ưu điểm và nhược điểm
Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng được một khối
lượng lớn cơ chất 4-5 lần lên men lỏng
Môi trường rắn dễ bảo quản
Lượng nước ít nên tiêu hao năng lượng cho việc khử trùng và xử lý sản phẩm ít
Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm
Địi hỏi thiết bị v kỹ thuật đơn giản
Tuy mức độ sử dụng cơ chất và chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm thấp nhưng
tính theo mật độ cơ chất thì năng suất vẫn cao
Nhược điểm:
Khí, nhiệt bị hạn chế vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách khắc phục khó
do khối lượng lên men lớn
I.3.2. Các kiểu lên men rắn

Ln men bề mặt: dựa trn sự thơng khí tự nhin, vì vậy cơ chất lên men rất mỏng
(2-3cm) phương pháp này tốn diện tích, song đơn giản, không địi hỏi phương
pháp kỹ thuật phức tạp
Phương pháp lên men rắn đảo trộn: cơ chất có thể dày 60cm, thông khí tự nhiên
kết hợp với đảo trộn
Lên men rắn quay: cơ chất tự động đảo trộn liên tục trong thùng quay, khả năng
phát triển trong lịng hạt cơ chất của nấm cũng như tốc độ quay và góc quay của
thùng lên men là hai yếu tố quan trọng
Lên men rắn có thổi khí: thông khí bằng cách thổi khí từ dưới lên, dùng khí chỉ
đi theo những kênh nhất định được tạo ra từ trước hay hình thnh một cch tự nhin
trong lịng khối cơ chất.
I.3.3. chuyển hóa phế liệu LC thành phân bón hữu cơ
I.3.4.Sản xuất và bảo quản chế phẩm
I.3.4.1.Chọn giá thể-tỉ lệ phối trộn
1. Chọn giá thể:
Sản xuất chế phẩm vi sinh vật là một phương thức bảo quản giống hoạt hóa
dưới dạng tiềm sinh,phương pháp cũng dựa trên nguyên tắc bào tử vsv được giữ
trong hạt ngũ cốc hoặc ký sinh tạm trên môi trường ở điều kiện chưa thuận
lợi,kìm hãm sự phát sinh của chúng bằng cách chọn giá thể để vsv bám có bổ
sung thêm hạt ngũ cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm<8% ,vẫn giữ được khả năng sinh
tổng hợp enzyme trong một thời gian dài.
Đối với 3 chủng nấm:phanerochaete chrysosporiu(1),schizophyllum
commun(2),lentinula edodes(3) chúng tôi chọn phương án bảo quản giống trong
hạt mùn cưa thu nhận từ phế liệu các xưởng chế biến gỗ(60%),cám(10%) và vỏ
cà phê xay nhuyễn (30%) mà Kirschorff cùng các cộng sự của ông đã nghiên cứu
tỉ lệ tối ưu cho bảo quản chủng nấm liên kết là nấm đảm và nấm sợi trên[4].Đầu
tiên giống được nuôi trong môi trường bột cám,CMC,bột vỏ cà phê,bổ sung
khoáng giảm dần,cho đến khi tạo nhiều bào tử.Bào tử cùng thành phần môi
trường được sấy khô ở nhiệt độ<50
0

C cho đến khi độ ẩm <8%,đưa vào bao,hàn
kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.
2.Tỉ lệ phối trộn:
Qua khảo sát sự phát triển sợi tơ của 3 chủng dòng sau bằng phương pháp lại
mà chúng tôi sẽ trình bày ở mục(II.2.1),chúng tôi chọn được chủng lai tạo
sau[4]:
.Phanerochaete Chrysosporium36201.(PC36201)
.Lentinula edodes.(LE-C).
.Schizophyllum Commune(SC).
Tốc độ phát triển sợi tơ và khả năng phân giải lignin-cellulose của 3 nòi trên dựa
trên sự phối trộn kết quả (Kirschoff và cộng sự 2000) :
Trên môi trường CMC có bố sung 10% cám,30% vỏ cà phê xay nhuyễn,60%
mùn cưa.
Tỉ lệ phối hợp Lignin(%) Cellulose(%)
PC:LE:SC= 1:2:>=3 70% 60%
1:1:3 60% 50%
1:2:1 65% 55%
1:1:1 95% 99,8%
2:1:1 38% 47%
Kirschoff và cộng sự đã nghiên cứu sự 3 chủng phối hợp sau thời gian 33 ngày
,cho thấy sự phân giải cực mạnh gần như hoàn toàn lignin –cellulose(LC),khi cố
định(1)PC36021 tăng hàm lương mật độ của 2 chủng còn lại(2,3) 10
4
bào tử/ml
dịch môi trường nuôi.
Thêm vào đó là sự ảnh hưởng của pH cũng đóng vai trò quan trọng cho tốc độ
phân giải trên như sau: [7] ,PC36201 chỉ hoạt động mạnh ở pH từ 6,5-7,5 trong
khi đó LE và SC hoạt động tốt ở pH 4,5-5 (Ling hue và Mathodoes 1999).