Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (LA tiến sĩ)

B GIO DC V O TO

VIN HN LM KHOA HC
V CễNG NGH VIT NAM

HC VIN KHOA HC V CễNG NGH

HONG TH BCH

Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách
và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên

LUN N TIN S HO HC

H NI - 2017


B GIO DC V O TO

VIN HN LM KHOA HC
V CễNG NGH VIT NAM

HC VIN KHOA HC V CễNG NGH

HONG TH BCH

Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách
và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên

Chuyờn ngnh: Húa hc cỏc hp cht t nhiờn
Mó s: 62.44.01.17

LUN N TIN S HO HC

Ngi hng dn khoa hc:

1. PGS.TS. Lờ Mai Hng
2. PGS.TS. Nguyn Quyt Chin

H NI - 2017


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được hình thành
và phát triển từ những quan điểm của cá nhân tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.
Lê Mai Hương và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo thêm các tài liệu đáng
tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận án là hoàn toàn trung
thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này.

Tác giả luận án

Hoàng Thị Bích


ii
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Lê
Mai Hương và PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm huyết
của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia

sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi nghiên cứu luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. TS. Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án
của mình
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các anh chị phụ trách của Học Viện Khoa
học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị em đồng nghiệp Trung tâm Nghiên cứu
và Phát triển các SPTN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi cảm ơn đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tạo chế phẩm
acid béo đa nối đôi (n3 - PUFA) từ nguyên liệu tự nhiên bổ sung vào thức ăn ương
nuôi một số đối tượng cá biển chủ lực” và “Nghiên cứu thành phần hóa học, điều tra
và đánh giá chất lượng tinh dầu trầm hiện đang được sản xuất ở Việt Nam”, mã số
VAST 04; đã tài trợ kinh phí.
Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn
động viên để tôi có động lực trong công việc và hoàn thành công trình nghiên cứu
khoa học này.
Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Hoàng Thị Bích


iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ............................................................................................................... i
Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii

Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt .................................................................... vii
Danh mục bảng ......................................................................................................... ix
Danh mục hình vẽ .......................................................................................................x
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Tổng quan về ứng dụng công nghệ enzyme - giải pháp “Hóa học xanh”
trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ... 3
1.1.1. “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn
gốc thiên nhiên ............................................................................... 3
1.1.2. Cơ sở ứng dụng enzyme hỗ trợ chiết xuất các sản phẩm có nguồn
gốc thiên nhiên ............................................................................... 4
1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bởi enzyme ..... 7
1.1.4. Lợi ích và khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE ....................... 9
1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ enzyme hỗ trợ chưng cất (EAD) và
enzyme hỗ trợ chiết xuất (EAE)............................................................. 10
1.2.1. Các enzyme phân giải cấu trúc thành tế bào nguyên liệu
lignocellulose ............................................................................... 10
1.2.2. Enzyme protease phân giải cấu trúc nguyên liệu giàu protein ..... 16
1.2.3. Enzyme lipase thủy phân lipid thành axit béo tự do .................... 19
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất và
làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước......................... 22
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 22
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước .......................................................... 26
1.4. Tổng quan về quế Cinnamomum cassia ................................................ 27


iv
1.4.1. Giới thiệu về Quế C.cassia........................................................... 27
1.4.2. Những nghiên cứu về thành phần hóa học C. cassia ................... 29

1.4.3. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học C. cassia ...................... 31
1.4.4. Các phương pháp chiết xuất tinh dầu quế .................................... 33
1.5. Tổng quan về cá ngừ .............................................................................. 35
1.5.1. Sản lượng và giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm cá ngừ................ 35
1.5.2. Dầu cá và các axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA ............... 37
1.5.3. Các phương pháp chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo không
no .................................................................................................. 39
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....41
2.1. Nguyên liệu ............................................................................................ 42
2.1.1. Mẫu nguyên liệu ........................................................................... 42
2.1.2. Enzyme sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 43
2.1.3. Bộ chủng vi sinh vật kiểm định .................................................... 44
2.1.4. Dòng tế bào .................................................................................. 45
2.2. Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 45
2.2.1. Hóa chất ........................................................................................ 45
2.2.2. Thiết bị ......................................................................................... 46
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 46
2.3.1. Các phương pháp phân tích hóa sinh ........................................... 46
2.3.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học ......................... 46
2.3.3. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme ................................ 47
2.3.4. Các phương pháp thủy phân ......................................................... 49
2.3.5. Các phương pháp xác định sản phẩm thủy phân .......................... 50
2.3.6. Phương pháp làm giàu các axit béo bằng kết tinh ure ................. 52
2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu .................................. 52
2.3.8. Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học ............................. 53
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .............................................................................54
3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ
phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia ................................ 54

v
3.1.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền và tinh dầu của mẫu cành
lá và mẫu vỏ quế C. cassia ........................................................... 55
3.1.2. Nghiên cứu tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá
trình chưng cất tinh dầu ................................................................ 55
3.1.3. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme
kết hợp Laccase-Htec2 ................................................................ 58
3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong
chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ...... 60
3.2.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A.
crassna........................................................................................... 60
3.2.2. Nghiên cứu thăm dò tác động của việc xử lý enzyme Laccase- Htec2
lên quá trình chưng cất tinh dầu từ bột gỗ gió bầu A. crassna ........ 60
3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu
các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares ... 61
3.3.1. Nghiên cứu thành phần chất nền và lipid tổng của một số loại đầu
cá ngừ của Việt Nam .................................................................... 62
3.3.2. Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chiết xuất lipid từ đầu
cá ngừ vây vàng T. albarcares ..................................................... 62
3.3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase kết hợp ure trong quá trình
làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T.
albacares ...................................................................................... 64
CHƯƠNG 4. KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................66
4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu
từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia................. 66
4.1.1. Kết quả phân tích các chất nền và tinh dầu của cành lá và vỏ quế C.
cassia ............................................................................................ 66
4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng
cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia ............................................ 71
4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng

cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia ................................................... 85


vi
4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết
hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá và vỏ quế . 95
4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng
cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ............. 106
4.2.1. Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A.
crassna ........................................................................................ 106
4.2.2. Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên hàm lượng
và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu A.
crassna ....................................................................................... 107
4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm
giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus
albarcares ............................................................................................. 111
4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit béo của một số
loại đầu cá ngừ của Việt Nam .................................................... 111
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid từ đầu
cá ngừ vây vàng T. albarcares ................................................... 115
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL trong quá trình
làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T.
albacares bằng phương pháp ure ............................................... 118
4.3.4. Đề xuất qui trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết
xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T.
albacares .................................................................................... 126
KẾT LUẬN ................................................................................................ 130
KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 132
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................ 133

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................. 134
PHỤ LỤC


vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ALA

: Alpha linolenic acid

Axit Alpha linolenic

CMC

: Carboxymethylcellulose

Carboxymethylcellulose

DHA

: Docosahexaenoic acid

Axit Docosahexaenoic

DMSO

: Dimethyl Sulphoxide

Dimethyl Sulphoxide

DNS

: 3,5-dinitrosalicylic acid

3,5-dinitrosalicylic acid

DPA

: Docosapentaenoic acid

Axit Docosapentaenoic

DPPH

: Diphenylpicrylhydrazyl

Diphenylpicrylhydrazyl

EAD

: Enzyme assisted distillation

Chưng cất có enzyme hỗ trợ

EAE

: Enzyme assisted extraction

Chiết xuất có enzyme hỗ trợ

EAMD

: Enzyme assisted microway extraction

Chiết xuất có enzyme kết hợp vi
sóng

EDTA

: Ethylene Diamine Triacetic Acid

Ethylene Diamine Triacetic Acid

EPA

: Eicosapentaenoic acid

Axit Eicosapentaenoic

FAO

: Food and Agriculture Organization of Tổ chức Lương nông Thế giới
the United Nations

FPH

: Fish protein hydrolysate

Protein thủy phân từ cá

GC

: Gas chromatography

Sắc ký khí

GC-MS

: Gas chromatography mass spectrometry

Sắc ký kết hợp khối phổ

HD

: Hydrodistillation

Chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hep-G2

: Human hepatocellular carcinoma

Dòng tế bào ung thư gan

HPLC

:

High

Performanc/e

liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
Htec2

: Cellic HTec2 Enzyme

Enzym Cellic HTec2

IC50

: Inhibitory concentration at 50%

Nồng độ ức chế 50%

KPH

:

Không phát hiện

Laccase

: Laccase enzyme

Enzym laccase


viii
LD100

Liều lượng gây chết cho 100% số

: Lethal Dose at 100%

động vật thử nghiệm
LU

: Human lung adenocarcinoma

Dòng tế bào ung thư phổi

MCF-7

: Michigan Cancer Foundation 7

Dòng tế bào ung thư vú

MIC

: Minimum Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

MTT

:(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium Bromide

Diphenyltetrazolium Bromide

MUFA

: Monounsaturated fatty acid

Axit béo không no 1 nối đôi

NO

: Nitric oxid

Nitơ mônôxit

PUFA

: Polyunsaturated fatty acid

Axit béo không no đa nối đôi

RD

: Human rhabdomyosarcoma

Dòng tế bào ung thư mô liên kết

SCFE

: Supercritical fluid extraction

Chiết Siêu tới hạn

SE

: Solvent extraction

Chiết xuất bằng dung môi

SFA

: Saturated fatty acid

Axit béo no

TCVN

:

Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC

: Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TT

:

Thứ tự

TS

: Transition state

Trạng thái chuyển

USD

: United States dollar

Đô la Mỹ

USDA

:

United

States

Department

of Bộ Nông nghiệp Hoa kỳ

Agriculture
VSV

:

Vi sinh vật


ix
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong một số loại sinh khối.........................11
Bảng 1.2. Tỉ lệ các thành phần của cá ngừ

...................................................36

Bảng 3.1. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế..............56
Bảng 3.2. Một số thông số của quá trình thủy phân bởi enzyme protease..............62
Bảng 4.1. Kết quả phân tích chất nền của nguyên liệu ...........................................66
Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu ...............................67
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức
độ thủy phân các chất nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế..............72
Bảng 4.4. Hàm lượng tinh dầu thu nhận theo thời gian chưng cất mẫu cành lá quế có

và không có enzyme hỗ trợ.......................................................................................73
Bảng 4.5. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được
từ cành lá quế có và không có xử lý với enzyme......................................................79
Bảng 4.6a. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.................................81
Bảng 4.6b. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 03 dòng tế bào ung thư.........82
Bảng 4.6c. Kết quả thử khả năng ức chế sự sinh NO trên tế bào RAW 264.7.........83
Bảng 4.6d. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH...............................84
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức
độ thủy phân thành tế bào và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ vỏ quế......................85
Bảng 4.8. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu vỏ quế có và không có
enzyme hỗ trợ...........................................................................................................87
Bảng 4.9. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được
từ vỏ quế có và không có xử lý với enzyme.............................................................93
Bảng 4.10a. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng.......................................100
Bảng 4.10b. Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm...................................101
Bảng 4.11a. Kết quả phân tích thành phần bột gỗ gió bầu A. crassna...................107
Bảng 4.11b. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương thu được
từ gỗ cây gió bầu A. crassna bằng 2 phương pháp khác nhau.....................................107
Bảng 4.12. Thành phần các chất nền của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam...........111


x
Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu một số loài cá
ngừ của Việt Nam..................................................................................................113
Bảng 4.14. Sản phẩm của quá trình chiết xuất lipid..............................................115
Bảng 4.15. Thành phần axit béo của các lipid chiết xuất từ đầu cá ngừ vây vàng
T. albacare bằng các phương pháp khác nhau....................................................116
Bảng 4.16a. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do
của lipase CRL......................................................................................................119
Bảng 4.16b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố pH......120

Bảng 4.17a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự
do của lipase CRL..................................................................................................120
Bảng 4.17b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố nhiệt
độ...........................................................................................................................121
Bảng 4.18a. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân lipid thành
axit béo tự do của lipase CRL...............................................................................121
Bảng 4.18b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất
...............................................................................................................................122
Bảng 4.19a. Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân lipid thành axit
béo tự do của enzyme lipase..................................................................................122
Bảng 4.19b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của thời gian thủy phân
...............................................................................................................................122
Bảng 4.20. Thành phần axit béo trước và sau khi làm giàu n-3 PUFA.................124
Bảng 4.21a. Các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm axit béo giàu n-3 PUFA................129
Bảng 4.21b. Các thành phần axit amin tự do của sản phẩm bột đạm hòa tan giàu axit
amin........................................................................................................................129


xi
DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. So sánh năng lượng của phản ứng có và không có xúc tác nhờ
enzyme ............................................................................................ 5
Hình 1.2. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose

6

Hình 1.3. Công nghệ enzyme kết hợp dung môi sinh học chiết xuất các hợp
chất thiên nhiên ............................................................................... 7
Hình 1.4a. Các đơn vị cơ bản của lignin ....................................................... 11

Hình 1.4b. Cấu trúc của lignin ...................................................................... 12
Hình 1.5a. Công thức hóa học của cellulose ................................................ 13
Hình 1.5b. Cơ chế phân giải cellulose của hệ enzyme cellulase ................. 14
Hình 1.6a. Cấu trúc polymer xylan .............................................................. 15
Hình 1.6b. Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan ..... 15
Hình 1.7. Phản ứng thủy phân protein của enzyme protease ........................ 17
Hình 1.8. Phân tử lipid và các vị trí thủy phân của enyme lipase ................. 20
Hình 1.9a. Cành lá và hoa C. cassia ............................................................. 27
Hình 1.9b. Cây C. cassia ............................................................................... 27
Hình 1.10a. Một số polyphenol trong quế Cinnamomum............................. 29
Hình 1.10b. Một số thành phần chính và phụ trong tinh dầu C. cassia ........ 30
Hình 1.11. Sơ đồ chưng cất tinh dầu quế có nồi hơi riêng............................ 34
Hình 1.12. Cấu trúc của một số acid béo nhóm n-3 PUFA .......................... 38
Hình 2.1. Mẫu cành lá quế Cinnamomum cassia .......................................... 42
Hình 2.2. Mẫu vỏ quế Cinnamomum cassia ................................................. 42
Hình 2.3. Mẫu bột gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ................................... 42
Hình 2.4. Mẫu đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares .............................. 43
Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn Glucose theo phương pháp DNS.................. 51
Hình 2.6. Đồ thị đường chuẩn protein .......................................................... 51
Hình 3.1. Qui trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất tinh dầu 54
Hình 3.2. Quy trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid và
làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ ................................................ 61


xii
Hình 3.3. Ba pha sản phẩm sau ly tâm .......................................................... 63
Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid ....................... 69
Hinh 4.1b. Một số thành phần thuộc nhóm sesquiterpenoid ......................... 70
Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân các chất
nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế ...................... 72

Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu
cành lá quế có và không có enzyme hỗ trợ................................... 74
Hình 4.4a. Sắc ký đồ của tinh dầu cành lá quế chưng cất theo cách thông
thường, nguyên liệu không qua xử lý enzyme ............................ 75
Hình 4.4b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme
Laccase EAD .............................................................................. 76
Hình 4.4c. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme
Htec2 EAD ................................................................................. 77
Hình 4.4d. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ
enzyme Laccase-Htec2 ............................................................... 78
Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân thành tế
bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế ............................................ 86
Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu
vỏ quế có và không có enzyme hỗ trợ .......................................... 87
Hình 4.7a. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu không xử lý enzyme ..... 89
Hình 4.7b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ
enzyme Laccase- EAD ............................................................... 90
Hình 4.7c. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme
Htec2-EAD ................................................................................. 91
Hình 4.7d. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme
Laccase - Htec2- EAD ................................................................ 92
Hình 4.8a. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của pH lên hàm lượng đường
khử ................................................................................................ 96
Hình 4.8b. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của nhiệt độ lên hàm lượng
đường khử ................................................................................... 97


xiii
Hình 4.8c. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Laccase/cơ chất lên hàm
lượng đường khử ......................................................................... 97

Hình 4.8d. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Htec2/cơ chất lên hàm
lượng đường khử ......................................................................... 98
Hình 4.8e. Bảng và đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên hàm lượng
đường khử ................................................................................... 99
Hình 4.9a. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x1x2 .......................... 104
Hình 4.9b. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x2x4 .......................... 104
Hình 4.9c. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x3x5 .......................... 104
Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp LaccaseHtec trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia ............ 105
Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương ............ 110
Hình 4.12. Tinh thể ure kết hợp với axit béo bão hòa................................. 123
Hình 4.13. Sắc ký đồ các axit béo sau khi làm giàu ................................... 124
Hình 4.14. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết
xuất lipid và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng. 126


1
MỞ ĐẦU
Ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe người tiêu dùng đã dẫn đến nhu cầu
cấp thiết là tìm ra các phương pháp thu nhận các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên
theo hướng “Xanh” nhằm tăng năng suất, giảm thời gian, tận dụng hiệu quả nguồn
nguyên liệu và giảm ô nhiễm môi trường. Rất nhiều các nỗ lực nghiên cứu để cải
thiện năng suất cũng như chất lượng các hoạt chất, trong đó ứng dụng công nghệ
enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên đang phát triển mạnh mẽ
trong vài chục năm trở lại đây và bước đầu đưa ra tính khả thi trong công nghiệp. Đây
được coi là một trong những giải pháp “Xanh” trong chiết xuất các HCTN do giảm
lượng dung môi, sử dụng các dung môi thay thế, tạo ra các sản phẩm sạch “organic”
và phế liệu của quá trình cũng ở dạng dễ phân hủy, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi
trường.
Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm cộng với đường bờ biển trải dài
qua nhiều vĩ tuyến khác nhau nên nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam vô

cùng phong phú với hệ thực vật đặc trưng và nguồn sinh vật biển đa dạng. Trong đó
phải kể đến cây Quế (nguồn dược liệu) và cá ngừ (nguồn lợi thủy sản) là những mặt
hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng và giá trị xuất khẩu đầy tiềm năng. Sản phẩm
dầu từ quế và cá ngừ ngày càng được chú trọng bởi chúng có giá trị cao. Tinh dầu
quế là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, dầu cá ngừ chứa hàm lượng lớn các acid béo
không no đa nối đôi PUFAs (polyunsaturated fatty acids), đặc biệt là nhóm axit béo
không no đa nối đôi thiết yếu omega 3 như DHA và EPA có vai trò quan trọng trong
các lĩnh vực y, dược và công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên trong công nghiệp, quá
trình sản xuất hai loại dầu này vẫn sử dụng các phương pháp truyền thống (cất cuốn
hơi nước, ép nhiệt) chưa phát huy được hết hiệu quả chiết xuất, gây lãng phí nguồn
nguyên liệu.
Ngày nay, những tiến bộ trong công nghệ sinh học, công nghệ enzyme có khả
năng sản xuất một lượng lớn enzyme có hoạt lực cao, phổ cơ chất rộng... thì công
nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên
(enzyme assisted extraction- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay thế dung môi hữu cơ là


2
vấn đề cấp thiết [134]. Nhằm mục đích tăng hiệu suất chiết tách, phát triển hướng
nghiên cứu mới - chiết xuất và làm giàu các HCTN bằng enzyme hỗ trợ, chúng tôi
lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme trong chiết tách
và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên” với các đối tượng được lựa
chọn là cành lá quế, vỏ quế C. cassia, gỗ gió bầu A. crassna và phụ phẩm đầu cá ngừ.
Trong nghiên cứu này, quá trình chưng cất tinh dầu, quá trình chiết xuất lipid, làm
giàu các n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ được thử nghiệm kết hợp với một số
enzyme có sẵn nhằm đánh giá hiệu quả tác động của enzyme lên chất lượng sản phẩm
tạo thành. Một số thông số tối ưu của quá trình xử lý bằng enzyme được khảo sát và
tối ưu hóa bằng qui hoạch thực nghiệm.
Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme vào quá trình chiết xuất và làm giàu

các sản phẩm tinh dầu (từ lá và cành quế, vỏ quế Cinnamomum cassia, trầm hương
từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna) và các axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ
nhằm làm tăng hiệu quả và phát triển hướng nghiên cứu “XANH” trong khai thác các
SPTN.
Nội dung chính của luận án bao gồm:
- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ
phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia: tác động của việc xử lý nguyên
liệu với enzyme được đánh giá qua hiệu suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản
phẩm tinh dầu (thành phần hóa học, hoạt tính sinh học).
- Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong
chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna.
- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các
axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares: tác động của enzyme
lên quá trình được đánh giá qua thành phần axit béo n-3 PUFA.


3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ứng dụng công nghệ enzyme - giải pháp “Hóa học
xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên
1.1.1. “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn
gốc thiên nhiên
Mọi sinh vật, đặc biệt là thực vật trên cạn và sinh vật biển đều có chứa các
hoạt chất sinh học có khả năng ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm...
Những hợp chất này được gọi là những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.
Phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi hữu cơ (solvent extraction- SE) vẫn
đang được sử dụng rộng rãi trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên từ các nguyên
liệu khác nhau như trầm tích, đất, polymer, vi khuẩn, nấm, tảo, vi tảo và phổ biến
nhất là thực vật. Ưu điểm của phương pháp sử dụng dung môi là dễ thao tác, tuy
nhiên, các dung môi lại độc cho người và nguy hại đến môi trường. Nhận thức này

đã dẫn đến nhu cầu ngày càng tăng cho các sản phẩm được sản xuất thông qua quá
trình thân thiện với môi trường còn được gọi “Hóa học xanh” [121].
Hóa học Xanh, còn gọi là hóa học bền vững là một phần của hóa học và công
nghệ hóa học tập trung vào việc tạo ra những sản phẩm, qui trình giảm thiểu việc sử
dụng hoặc phát sinh các chất độc hại. Hóa học xanh tập trung vào phương pháp tiếp
cận công nghệ để ngăn ngừa ô nhiễm, giảm tiêu thụ nguồn tài nguyên không thể tái
tạo. Trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên, quá trình chiết xuất “Xanh” liên quan
đến việc sử dụng các dung môi thân thiện với môi trường sinh thái, nguyên liệu bền
vững và tái tạo, giảm chất thải gây ô nhiễm môi trường [86].
Rất nhiều phương pháp để “Xanh hóa” những qui trình công nghệ hóa học.
Những phương pháp này có thể thực hiện riêng lẻ hoặc phối hợp với các qui trình của
công nghệ hóa học, nhằm mục tiêu làm tăng hiệu suất và giảm lượng thải độc hại.
Trong báo cáo thường niên (xuất bản năm 2011) của cơ quan quản lý năng lượng và
môi trường Pháp (French Environment and Energy Management Agency) với tựa đề:
“Khó khăn khi thay thế hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong quá trình công nghiệp”
đã trình bày các “giải pháp khắc phục kỹ thuật, hạn chế hoặc thay thế các dung môi


4
truyền thống” [86]. Hai trong số các giải pháp đặt ra đã hướng tới ứng dụng công
nghệ enzyme với tự đề:
+ Giải pháp cơ học kết hợp tiền xử lý enzyme
+ Chiết nước kết hợp tiền xử lý enzyme
Ngày nay, những tiến bộ trong xúc tác enzyme, sự đa dạng và sẵn có của các
enzyme công nghiệp cộng với tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng thì
các giải pháp công nghệ, trong đó có công nghệ chiết xuất có enzyme hỗ trợ
(enzyme assisted extraction, viết tắt là EAE) nhằm thay thế dung môi hữu cơ là vấn
đề cấp thiết [134].
1.1.2. Cơ sở ứng dụng enzyme hỗ trợ chiết xuất các sản phẩm có nguồn gốc
thiên nhiên

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò và chức năng sinh học
quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với
độ đặc hiệu cơ chất lớn, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học khác khó thể thực
hiện [14].
Enzyme có tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học, có hoạt tính xúc
tác lớn. Ở điều kiện thích hợp, hầu hết các enzyme xảy ra với tốc độ nhanh gấp 108 1011 lần so với phản ứng không có chất xúc tác. Bên cạnh đó, enzyme có tính đặc
hiệu cao và tác dụng trong điều kiện êm dịu, nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động
30-50oC, pH trung tính và áp suất thường. Đặc biệt, hầu hết các enzyme có nguồn
gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm
và y học [32].
Sinh vật thường được cấu tạo từ những đại phân tử tương đối trơ (polypeptid,
polysaccharid) không có khả năng hòa tan trong dung môi hữu cơ [25]. Các hợp chất
thiên nhiên có hoạt tính sinh học thường tồn tại ở dạng không tan hoặc lưu giữ trong
các bào quan dự trữ, hoặc tồn tại tại ở dạng keo kết hợp với các thành phần vách tế
bào [108]. Muốn cắt đứt các liên kết và giải phóng chúng ra khỏi tế bào cần năng
lượng hoạt hóa, tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để
cắt đứt các liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Về lý thuyết, tốc độ phản
ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa. Năng lượng hoạt hóa
càng lớn thì tốc độ phản ứng càng nhanh và ngược lại.


5
Bất kỳ enzyme nào cũng xúc tác theo trình tự sau:
E + S  ES  EP E+ P
Trong đó, E là enzyme, S là cơ chất, P là sản phẩm phản ứng. ES và EP là
phức hợp enzyme với cơ chất và sản phẩm.
Sơ đồ trên Hình 1.1 cho thấy đường cong của năng lượng phản ứng có và
không có xúc tác enzyme

Hình 1.1. So sánh năng lượng của phản ứng được và không được xúc tác nhờ enzyme [14]

Ghi chú: TSc1, TSc2 và TSc3 là các trạng thái chuyển (transition state)
[ES]: tổ hợp phức hệ enzyme-cơ chất
[EP]: tổ hợp phức hệ enzyme- sản phẩm
- Con đường không có xúc tác chỉ đi qua trạng thái chuyển tiếp TS* với năng
lượng tự do Gkhông xúc tác cao, cần mức năng lượng hoạt hóa cao hơn.
- Con đường đi qua phản ứng xúc tác enzyme đi qua các trạng thái chuyển tiếp
TSc1, TSc2 và TSc3, với năng lượng tự do Gcó xúc tác thấp. Chất xúc tác làm giảm năng
lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học, nó chỉ tham gia vào các giai đoạn trung gian
mà không tham gia trực tiếp vào phản ứng. Năng lượng liên kết do các tương tác yếu
tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng để làm căng hoặc uốn gấp khúc cơ chất,
tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với cơ chất dễ dàng. Chính vì vậy, enzyme tạo
được thế năng đặc biệt có lợi nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng, tạo ra
vô số sản phẩm trong điều kiện nhiệt độ thấp, áp suất thường.


6
Trái với phương pháp dung môi, tách các HCTN nhờ vào mức độ phân cực của
chúng, phương pháp ứng dụng enzyme sử dụng nước là dung môi đặc biệt để hòa tan,
phá vỡ các rào cản ngăn cản sự giải phóng hoạt chất. Lúc này, các hoạt chất đang bị
lưu giữ trong cấu trúc khép kín được giải phóng một cách tự nhiên (Hình 1.2).

Hình 1.2. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose [91]
Hình 1.2 miêu tả quá trình chiết xuất hoạt chất liên kết với mạng lưới
lignocellulose thành tế bào thực vật (chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose và
lignin). Quá trình phân giải chất nền (matrix, ma trận) của thành tế bào đã thúc đẩy
quá trình giải phóng các hoạt chất được dễ dàng và thuận lợi.
Quá trình chiết xuất lipid dưới tác dụng của enzyme protease cũng được áp
dụng nhiều trên nhiều đối tượng sinh vật biển và các hạt có dầu (cấu trúc nguyên liệu
chủ yếu là protein và lipid). Các phân tử lipid thường bị lưu giữ trong chất nền protein
của nguyên liệu. Các enzyme protease thủy phân protein màng tế bào cũng như bên

trong tế bào chất thành các peptid nhỏ hơn và các axit amin, từ đó nới lỏng sự toàn
vẹn của cấu trúc, thúc đẩy quá trình giải phóng dầu khỏi chất nền protein khi kết hợp
với các phương pháp ly tâm hoặc gia nhiệt [128]. Toàn bộ quá trình thủy phân diễn
ra trong điều kiện nhẹ nhàng ở nhiệt độ thấp (40-60oC) làm cho các chất có hoạt tính
sinh học gần như không bị thay đổi


7
Do tính chất kỵ nước của các cấu tử không hòa tan vào trong nước nên sau xử
lý enzyme, biện pháp cơ học hoặc vật lý được sử dụng để phân tách các hoạt chất ra
khỏi hỗn hợp. Ngày nay, các ứng dụng của công nghệ enzyme trong chiết xuất các
HCTN rất đa dạng, sự kết hợp enzyme với các dung môi sinh học thay thế dung môi
độc hại đã khiến cho EAE thực hiện trên cả các nguyên liệu không phải cây chứa dầu
đã mang đến sự đa dạng cho các sản phẩm được hình thành (Hình 1.3).

Hình 1.3. Công nghệ enzyme kết hợp dung môi sinh học chiết xuất các hợp chất
thiên nhiên
1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bởi enzyme
Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố [32]:
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất
lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ
enzyme tăng, tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn V = Vmax thì
nếu nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ phản ứng thủy phân bởi enzyme tăng không
đáng kể, thậm chí không tăng.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn tới tốc
độ thủy phân, khi càng tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng tăng,
nhưng khi tốc độ phản ứng thủy phân đạt đến giới hạn V = Vmax, nếu tiếp tục tăng
nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng hầu như không tăng nữa.
Khi nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động tự do
và sự cung cấp hạn chế cơ chất sẽ xác định tốc độ phản ứng. Ngược lại nồng độ cơ

8
chất cao, hầu hết các trung tâm hoạt động bị chiếm lĩnh do đó lúc này số lượng phân
tử enzyme lại là yếu tố quyết định phản ứng.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những
chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc
mất hoạt tính. Với mỗi enzyme ta có các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy, khi sử dụng
enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hàm nó để điều chỉnh phản ứng.
Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: chất hoạt hóa là những chất khi có mặt
trong phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa
học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ. Tuy nhiên, các chất
hoạt hóa chỉ có tác dụng giới hạn nồng độ xác định. Khi dùng quá nồng độ cho phép,
hoạt độ enzyme này sẽ giảm.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay
giảm nhiệt độ thường có thể ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme, enzyme thể
hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất định. Thông thường
đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng từ 40 - 50oC, ở nhiệt
độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy, nhiệt độ 70oC gọi là nhiệt
độ tới hạn của enzyme.
Tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ. Nhưng khi vượt
quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính
của phân tử protein-enzyme. Kết quả này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme,
là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng enzyme đạt cực đại. Mỗi enzyme có nhiệt độ
tối thích khác nhau. Sự khác nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy
theo từng điều kiện từng sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử
protein-enzyme.
Ảnh hưởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme vì
pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất. Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp
trong vùng trung tính từ 5-7, một số enzyme protease, pH thích hợp nằm trong vùng

axit (pepsin,…) hoặc nằm trong vùng kiềm (trypsin, subtilin,...). Với từng enzyme,
giá trị pH thích hợp có thể thay đổi khi nhiệt độ, loại cơ chất,... thay đổi.


9
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: thời gian thủy phân cần thích hợp để
enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá
trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt. Thời
gian thủy phân dài, ngắn khác nhau tùy thuộc vào từng loại enzyme, nồng độ cơ chất,
pH, nhiệt độ, sự có mặt của chất hoạt hóa, ức chế... Trong thực tế, thời gian thủy phân
phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân
cụ thể.
Ngoài ra, còn một số các yếu tố khác ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng như tỷ
lệ nước/cơ chất, tốc độ khuấy,...
1.1.4. Lợi ích và khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE
Lợi ích của công nghệ EAE
- Công nghệ EAE ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm
Trong thực tế, các phương pháp chiết xuất truyền thống thường sử dụng
phương pháp vật lý như ép, cất... chưa cho hiệu quả cao. Công nghệ EAE thường cho
kết quả tăng hiệu suất do tác động phân giải thành tế bào của enzyme đã giải phóng
dễ dàng hơn các hoạt chất vốn bị lưu giữ trong cấu trúc chất nền thành tế bào (thực
vật) hay chất nền protein tăng tính thấm của màng tế bào do đó dẫn đến năng suất cao
hơn khi chưng cất. [65], [81], [94], [161]. Mặt khác, enzyme thường hoạt động trong
điều kiện nhiệt độ thường 40-50oC, pH trung tính 5-7 nên ít ảnh hưởng đến hoạt chất
chiết xuất, cho chất lượng sản phẩm thường cao hơn so với các phương pháp truyền
thống (sử dụng hóa chất, nhiệt độ, áp suất cao...).
- Công nghệ EAE cho các sản phẩm phụ có giá trị gia tăng
Bên cạnh các sản phẩm chính của quá trình, EAE còn có các sản phẩm thủy
phân có giá trị gia tăng như các protein, polysaccharid, polyphenol... Quá trình thu
nhận các sản phẩm này không những không ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm

chính mà còn có tác động có lợi giúp cho quá trình giải phóng hoạt chất thuận lợi
hơn, giảm sự biến chất của sản phẩm.
- Công nghệ EAE tác động lên thời gian chiết
Các phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ cần thời gian ngâm chiết kéo dài
nếu thiếu sự hỗ trợ của siêu âm, vi sóng, soxhlet... Enzyme có cường lực xúc tác lớn,


10
tốc độ phản ứng nhanh, chỉ vài phút (ribonucelase), vài giờ (protease,...). Sau quá
trình thủy phân, các hoạt chất đã được giải phóng ở dạng tự do hoặc liên kết lỏng lẻo
với cơ chất, chỉ cần một tác động nhỏ như năng lượng nhiệt hay ly tâm cũng đủ để
phân tách chúng khỏi hỗn hợp. Do đó, thời gian chiết xuất nhanh hơn so với không
xử lý enzyme.
- Công nghệ EAE thân thiện với môi trường
EAE đã giảm thiểu việc sử dụng dung môi, giảm lượng phế thải, chuyển hóa
phế liệu thành dạng đơn giản, có thể tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu, giảm các
nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.
Khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE
Công nghệ EAE còn hạn chế về khả năng thương mại và công nghệ như:
- Giá các enzyme là tương đối đắt khi xử lý khối lượng lớn nguyên liệu thô;
- Chế phẩm enzyme có sẵn có thể không hoàn toàn thủy phân thành tế bào
thực vật, hạn chế hiệu suất chiết xuất các hợp chất; Vì vậy, tìm được hệ enzyme thích
hợp để phân giải cơ chất là hết sức quan trọng.
- Enzyme dễ chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Ở quy mô khác nhau,
enzyme có sự biến động về điểm hoạt động tối ưu như như tỷ lệ phần trăm oxy hòa
tan, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất là khác nhau. Do đó, ở qui mô công nghiệp,
kiểm soát các yếu tố phản ứng enzyme là yếu tố then chốt quyết định hiệu quả của
quá trình xử lý bằng enzyme.
Hiệu suất chiết của các hợp chất hòa tan trong nước phụ thuộc vào tất cả công
nghệ (enzyme, cơ học,...) để làm tăng khả năng hòa tan vào nước của chúng. Do đó,

sử dụng enzyme hỗ trợ phải hiểu biết đầy đủ về thành phần thành tế bào, hoạt tính
enzyme và ảnh hưởng của điều kiện tiền xử lý và điều kiện thực nghiệm để đảm bảo
việc xử lý bằng enzyme được hiệu quả. Tuy nhiên, nếu những hạn chế trên có thể
được khắc phục, xử lý bằng enzyme dựa trên một qui trình tối ưu sẽ không chỉ làm
tăng năng suất chiết, mà còn tăng chất lượng sản phẩm khi qui trình chiết xuất được
thực hiện ở nhiệt độ thấp, áp suất thường.
1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ enzyme hỗ trợ chưng cất (EAD)
và enzyme hỗ trợ chiết xuất (EAE)
1.2.1. Các enzyme phân giải cấu trúc thành tế bào nguyên liệu lignocellulose