Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)

B GIO DC V O TO

VIN HN LM KHOA HC
V CễNG NGH VIT NAM

HC VIN KHOA HC V CễNG NGH

HONG TH BCH

Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách
và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên

Chuyờn ngnh: Húa hc cỏc hp cht t nhiờn
Mó s: 62.44.01.17

LUN N TIN S HO HC

H NI - 2017


Công trình được hoàn thành tại
Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Lê Mai Hương
2. PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến

Phản biện 1: ................................................................
...............................................................
Phản biện 2:.................................................................
................................................................
Phản biện 3:.................................................................

................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ
cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Vào hồi...... giờ.....’, ngày..... tháng..... năm 201.....

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe người tiêu dùng đã
dẫn đến nhu cầu cấp thiết là tìm ra các phương pháp thu nhận các sản
phẩm có nguồn gốc thiên nhiên theo hướng “Xanh” nhằm tăng năng
suất, giảm thời gian, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu và giảm ô
nhiễm môi trường.
Nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam vô cùng phong
phú với hệ thực vật đặc trưng và nguồn sinh vật biển đa dạng, trong
đó phải kể đến cây Quế (nguồn dược liệu) và cá ngừ (nguồn lợi thủy
sản) là những mặt hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng và giá trị
xuất khẩu đầy tiềm năng. Sản phẩm dầu từ quế và cá ngừ ngày càng
được chú trọng bởi chúng có giá trị cao. Tuy nhiên trong công
nghiệp, quá trình sản xuất hai loại dầu này vẫn sử dụng các phương
pháp truyền thống (cất cuốn hơi nước, ép nhiệt) chưa phát huy được
hết hiệu quả chiết xuất, gây lãng phí nguồn nguyên liệu.
Ngày nay, những tiến bộ trong công nghệ sinh học, công nghệ
enzyme có khả năng sản xuất một lượng lớn enzyme có hoạt lực cao,

phổ cơ chất rộng... thì công nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ
quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên (enzyme assisted
extract- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay thế dung môi hữu cơ là vấn
đề cấp thiết. Nhằm mục đích phát triển hướng nghiên cứu mới- phân
lập và làm giàu các HCTN bằng enzyme hỗ trợ, chúng tôi lựa chọn
đề tài luận án:
“Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme trong chiết tách và
làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên”.


2
Mục đích
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme vào quá trình chiết
xuất và làm giàu các sản phẩm tinh dầu (từ lá và cành quế, vỏ quế
Cinnamomum cassia) và các axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá
ngừ nhằm làm tăng hiệu quả và phát triển hướng nghiên cứu
“XANH” trong khai thác các SPTN.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh
dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia: tác
động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme được đánh giá qua hiệu
suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản phẩm tinh dầu (thành phần
hóa học, hoạt tính sinh học).
- Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp LaccaseHtec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu
Aquilaria crassna
- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid
và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus
albarcares: tác động của enzyme lên quá trình được đánh giá qua
thành phần axit béo n-3 PUFA
Những đóng góp mới của luận án

Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ enzyme hỗ trợ quá trình
chưng cất tinh dầu từ cảnh lá quế, vỏ quế C. cassia và gỗ gió bầu A.
crassna. Sự kết hợp enzyme laccase từ G. lucidum và enzyme Cellic
Htec2 cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn khi sử dụng riêng rẽ. Kết
quả đã làm gia tăng hiệu suất, nâng cao chất lượng tinh dầu, giảm
thời gian chưng cất.
Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ hỗ trợ quá trình phân lập
dầu và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ bằng


3
hệ enzyme kép Bromelain và Lipase CRL. Kết quả phân lập cho hiệu
suất 70% so với phương án dung môi song quá trình đã tạo ra sản
phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng
thời giảm thiểu dung môi hóa chất và ô nhiễm môi trường.
Bố cục của luận văn:
Luận án gồm có 153 trang (không kể phụ lục), gồm 55 hình,
32 bảng.
Nội dung chính của luận án được trình bày gồm 4 chương
chính (ngoài Mở đầu-2 trang, kết luận- 2 trang và kiến nghị-1 trang);
các chương chính bao gồm: Tổng quan tài liệu -38 trang, Nguyên vật
liệu và phương pháp nghiên cứu -11 trang, Thực nghiệm -11 trang và
Kết quả và thảo luận -63 trang.
PHẦN 1 - TỔNG QUAN
Trong phần này, đã tổng hợp tài liệu, chia làm 5 mục.
1.1. Tổng quan giới thiệu về ứng dụng công nghệ enzyme giải pháp “hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các hợp chất
thiên nhiên
1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ EAE để trích ly dầu
và làm giàu các axit béo n-3 PUFA
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong

chiết xuất và làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước.
1.4. Giới thiệu về nguyên liệu sản xuất tinh dầu quế
1.5. Giới thiệu về nguyên liệu phụ phẩm cá ngừ sản xuất n-3
PUFA


4
PHẦN 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
- Cành lá quế, vỏ quế Cinnamomum cassiathu tại xã Tân
Đồng, huyện Trấn Yên, tỉnh Yên Bái.
- Phụ phẩm đầu cá ngừ:08 mẫu đầu cá ngừ (đã bỏ mắt và
mang) của 08 loài cá ngừ thu tại Nha Trang- Khánh Hòa và Tuy HòaPhú Yên
- Enzyme sử dụng trong nghiên cứu
+ Enzyme Cellic Htec2 (Novozyme-Đan Mạch) là hỗn hợp đa
enzyme bao gồm cellulase và xylanase.
+ Enzyme laccase là enzyme thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm
Ganoderma lucidum (được cung cấp bởi Viện Di truyền nông nghiệp).
+ Nhóm enzyme protease từ vi sinh vật sử dụng hai enzyme
Protamex và Alcalase (Novozyme- Đan Mạch).
+ Nhóm enzyme Protease từ thực vật sử dụng hai enzyme
Bromelain và Papain, là enzyme trong nước, cung cấp bởi công ty
Biogreen.
+ Enzyme Lipase CRL (Novozyme- Đan Mạch) được sản xuất
từ quá trình lên men của nấm men Candida rugosa.
2.3. Phương pháp nghiên cứu: trong phần này NCS trình
bày các phương pháp xác định
- Các phương pháp phân tích hóa sinh
+ Nguyên liệu thực vật: phân tích hàm ẩm, cellulose,
hemicellulose, lignin, hàm lượng tinh dầu,...

+ Nguyên liệu sinh vật biển: xác định hàm lượng nước, hàm
lượng protein, hàm lượng tro, hàm lượng lipid, chỉ số axit, chỉ số xà
phòng hóa,...


5
- Phương pháp phân tích thành phần hợp chất bằng GC-MS.
+ Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng tinh dầu.
+ Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng axit béo.
- Phương pháp xác định sản phẩm quá trình thủy phân
+ Phương pháp định lượng đường khử bằng DNS (Miler, 1959).
+ Phương pháp định lượng protein- axitamin (Bradford, 1976).
- Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme
+ Xác định hoạt độ enzyme Cellulase (Wood, 1987).
+ Xác định hoạt độ enzyme Xylanse (Bailey, 1992).
+ Xác định hoạt độ enzyme Laccase (Dinh, 2012).
- Các phương pháp thủy phân
+ Phương pháp thủy phân với dung môi là nước (áp dụng cho
enzyme cellulase, hemicellulase, protease...).
+ Phương pháp thủy phân trong hệ dung môi hai pha (áp dụng
cho enzyme lipase) theo (Fernádez Lorente G. và cs.;2011).
- Phương pháp xác định điều kiện tối ưu cho quá trình
thủy phân
+ Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân.
+ Xử lý số liệu thực nghiệm bằng phương pháp bình phương
tối thiểu.
+ Tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng bằng phương pháp qui
hoạch hóa thực nghiệm.
- Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học
+ Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định

(Vander Bergher & Vlietlinck, 1991).
+ Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào
(cytotoxicity) (Likhitayawuid, 1991) đang triển khai tại Viện nghiên
cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI).


6
+ Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm: thông qua khả
năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 (Lee et
al., (2009)).
+ Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóatrên hệ DPPH
theo phương pháp P. Yuvaraj et al., (2013).
PHẦN 3 - THỰC NGHIỆM
3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất
tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia
3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp
Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió
bầu Aquilaria crassna
3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất
lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng
Thunnus albarcares
PHẦN 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong
chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế
Cinnamomum cassia

4.1.1. Kết quả phân tích chất nền và tinh dầu cành lá, vỏ
quế C. cassia
Hàm lượng các chất nền của cành lá và vỏ quế C. cassia
Kết quả phân tích cho thấy mẫu cành, lá và mẫu vỏ quế mang

đặc trưng của nhóm cây thân gỗ với thành phần chủ yếu là
lignocellulose, chiếm hơn 60% khối lượng nguyên liệu. Hàm lượng
các thành phần cấu trúc gồm cellulose, hemicellulose và lignin xác
định được ở mẫu cành, lá có các giá trị tương ứng là 24,74%; 25,50%
và 16,28%; ở mẫu vỏ quế là 20,36%, 14,02% và 25,78%.


7
Hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu từ cành lá, vỏ
quế C. cassia
Hàm lượng tinh dầu cành lá quế, vỏ quế thu được bằng chưng
cất hơi nước tương ứn là 0,69 ± 0,02%, 2,87 ± 0,04% tinh dầu (tính
theo nguyên liệu khô gió).
Thành phần hóa học của tinh dầu cành lá quế và vỏ quế xác
định bằng GC-MS chỉ ra ở Bảng 4.2:
Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu cành lá
và tinh dầu vỏ quế C. cassia
Chất
Nhóm các hidrocarbon
Nhóm các HC chứa oxy
Tổng Phenylpropannoid
trans- Cinnamaldehyde
Tổng Sesquiterpenoid
Sesquiterpen hidrocarbon
Sesquiterpen chứa oxy

% trong
TD cành, lá
3,87
95,54

88,73
67,74
2,42
1,99
0,43

% trong
TD vỏ
38,26
60,85
58,83
53,99
40,38
35,87
4,51

Một số thành phần trong tinh dầu quế C. cassia thu thập ở Văn
Yên, Yên Bái (hình 4.1a và 4.1b).

Benzenepropanal
(C9H10O)

trans-Cinnamaldehyde
(C9H8O)

Cinnamyl alcohol
(C9H10O)

Coumarin
(C9H6O2)

cis-Cinnamaldehyde
(C9H8O)

o-Methoxy
cinamaldehyde

Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid


8

Copaene
(C15H24)

Muurolene
(C15H24)

Calamenene
(C15H22)

Cadinene
(C15H24)

Caryophyllene oxide
( C15H24O)

Bisabolol
(C15H26O)

Bisabolene
( C15H24)

Nerolidol
(C15H26O)

Hình 4.1b. Một số thành phần sesquiterpen và sesquiterpenoid
Kết quả GC- MS phân tích thành phần hóa học của tinh dầu
cành lá quế và vỏ quế C. cassia cho thấy:
- Khoảng 28 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu cành lá quế C.
cassia, trong đó trans-cinnamaldehyde là hợp chất chính (69,74%), theo
sau là Cinnamyl acetate (17,2%), Benzofuran (5,9%), Benzaldehyde
(1,62%), Benzenepropanal (1,59%). Ngoài ra, một số các thành phần
khác cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1,00%.
- Khoảng 38 hợp chất được phát hiện trong tinh dầu vỏ quế C.
cassia, trong đó trans- cinnamaldehyde là hợp chất chính (53,99%),
theo sau là Copaene (13,86%), Cadinene (7,69%), Benzenpropanal
(2,39%). Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định
với hàm lượng nhỏ hơn 1,00%.
- Phenylpropanoid là nhóm hợp chất chủ yếu trong tinh dầu
cành lá quế và vỏ quế C. cassia thu từ Văn Yên, Yên Bái, trong đó
trans-cinnamaldehyde là thành phần chính. Tổng của các hợp chất
hydrocarbon, của các hợp chất chứa oxy, của các phenylpropanoid và
của các sesquiterpenoid có sự khác nhau rõ rệt giữa nguyên liệu cành
lá quế và vỏ quế.


9
4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên
quá trình chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất
thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của cành lá quế

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân và
tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành lá quế
Sự gia tăng của hiệu suất tinh dầu có tương quan tỉ lệ thuận với
sự gia tăng của hàm lượng đường khử (0-78,14 μg/ml) trong dung
dịch phản ứng cũng như sự giảm thiểu của hàm lượng lignin trong
nguyên liệu (17,43-13,01%).Kết quả cũng chỉ ra hệ enzyme Laccase
thô và Htec2 cho hiệu quả cao hơn khi sử dụng riêng rẽ từng enzyme
lên cành lá quế.
Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian
chưng cất tinh dầu cành lá quế

Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu lá quế


10
Quá trình xử lý cành lá quế bằng hỗn hợp enzyme Laccase và
Htec2 đã làm giảm đáng kể thời gian cất tinh dầu so với đối chứng
không sử dụng enzyme. Tại các thời điểm khác nhau của quá trình
chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh dầu thu từ mẫu cành lá quế xử lý
bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme. Tinh dầu cất
bằng EAD, sau 2 h đầu đã thu được hơn 50% lượng tinh dầu, sau 5 h
lượng tinh dầu đạt đến cực đại (0,98%). Trong khi đó, đối với
phương pháp không sử dụng enzyme sau 2h đầu mẫu đối chứng chỉ
đạt 9 - 10%, sau 6 h lượng tinh dầu mới đạt đến cực đại (0,69%).
Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thành
phần hóa học của tinh dầu cành lá quế
Thành phần hóa học tinh dầu cành lá quế C. cassia được phân

tích bằng GC-MS, được tổng hợp ở bảng 4.5
Bảng 4.5. Thành phần hóa học của các tinh dầu cành lá quế thu nhận
từ phương pháp enzyme kết hợp
Không
enzyme

Laccase

Htec2

Laccase
+Htec2

Nhóm hidrocarbon

3,58

5,13

1,75

4,04

Nhóm HC chứa oxy

95,54

94,17

97,39

94,85

Nhóm Phenylpropanoid

88,73

88,38

94,03

91,25

trans-cinnamaldehyde

69,74

68,96

70,54

85,60

Nhóm Sesquiterpenoid

2,42

3,83

0,83

3,9

Sesquiterpen hidrocarbon

1,99

3,36

0,61

3,26

Sesquiterpen chứa oxy

0,43

0,47

0,22

0,64

Chất


11
So sánh kết quả phân tích GC-MS của cả 4 phương án xử lý
cho thấy, quá trình tiền xử lý cành lá quế bằng enzyme đã không làm
thay đổi bản chất của tinh dầu vỏ quế, các mẫu tinh dầu đều có thành

phần chính là cinnamaldehyde và có cùng số lượng các thành phần
quan trọng khác.
Nhóm phenylpropanoid (C6- C3) vẫn là nhóm chất chính trong
cả 4 phương án xử lý, trong đó trans-cinnamaldehyde là thành phần
chính có hàm lượng đạt từ 68,49% đến 86,83%.
Tinh dầu thu được bằng cách xử lý nguyên liệu với các
enzyme Laccase và HTec2 riêng rẽ không gây ra biến động lớn về
thành phần hóa học, nhưng việc xử lý nguyên liệu với hệ enzyme kết
hợp Laccase-Htec2 đã làm thay đổi rõ rệt nhất thành phần % của một
số chất quan trọng trong tinh dầu. Cụ thể như sau:
- Làm giàu một số chất mong muốn trong tinh dầu quế C.
cassia như: hàm lượngcinnamaldehyde tăng từ 69,74% lên 85,60%,
o-methoxy-cinnamaldehyde từ 0% lên 0,23%.
- Làm giảm hàm lượng một số chất khác, đặc biệt cinnamyl
acetat giảm từ 17,2% xuống 1,34%, cinnamyl alcohol giảm từ 0,57%
xuống 0,29%. Sự tăng và giảm của cinnamaldehyde và cinnamyl
acetat có thể có mối liên hệ mật thiết với nhau.
Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hoạt tính
sinh học của tinh dầu cành lá quế
- Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Mẫu tinh dầu có sử dụng enzyme hỗ trợ (Tinh dầu EAD)
không có sự sai khác về hoạt tính kháng khuẩn so với mẫu chiết
thông thường. Các mẫu tinh dầu quế đều không có hoạt tính kháng
P.aeruginosa và F. oxysporum., có hoạt tính kháng S. aureus với


12
MIC = 100 μg/ml, A. niger với MIC = 200 μg/ml trong khi E. coli, B.
subtilis, S. cerevisiae, C. albicans là MIC = 400 μg/ml. Trong số các
vi sinh vật kiểm định, tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối

với S. aureus với MIC 100 µg/ml.
- Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào
Hai mẫu tinh dầuđều có hoạt tính gây độc tế bào với nồng độ
thử nghiệm ban đầu (40 g/ml). Ở các nồng độ thử nghiệm tiếp theo,
tinh dầu HD biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào với 02 dòng tế bào
ung thư gan và ung thư biểu mô liên kết (Hep-G2 và RD) với giá trị
IC50 lần lượt là 29,25 và 6,01 g/ml, trong khi tinh dầu EAD biểu
hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng tế bào ung thư (Hep-G2,
LU-1 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 12,89, 25,95 và 2,34 g/ml.
Đặc biệt, EAD có hoạt tính khá mạnh trên dòng ung thư biểu mô phổi
với giá trị IC50 2,34(g/ml).
- Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm
Cả hai mẫu tinh dầu đều thể hiện hoạt tính ức chế đại thực bào
sản sinh NO ở các khoảng nồng độ từ 6,25 đến 100 μg/ml (P < 0.05
với LPS đối chứng âm), tinh dầu EAD có biểu hiện hoạt tính kháng
viêm mạnh hơn tinh dầu HD.
- Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa
Hai mẫu tinh dầu thử nghiệm chưa thể hiện khả năng trung hòa
gốc tự do của DPPH ở nồng độ nghiên cứu.
4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên
quá trình chưng cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia
Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất
thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của vỏ quế


13

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân và
tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế
Kết quả cho thấy mối tương quan rõ rệt giữa mức độ thủy phân

thành tế bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế C. cassia. Lần lượt từ
phương án 01 đến 04, hàm lượng đường khử gia tăng từ 0 lên đến
38,34 µg/ml, còn hàm lượng lignin giảm từ 25,78 xuống còn 20,34%.
Phương án 04, kết hợp 2 enzyme Laccase và Htec2 cho hiệu quả thủy
phân cao nhất với hàm lượng đường khử là 38,34 µg/ml và tỷ lệ gia
tăng hiệu suất tinh dầu đạt 14,57%.
Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian
chưng cất tinh dầu vỏ quế

Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu vỏ quế


14
Cũng tương tự như cành lá quế, kết quả khảo sát trên vỏ quế
cho thấy hệ enzyme Laccase + Htec2 có vai trò tích cực trong việc
giảm thời gian chưng cất tinh dầu quế. Tại các thời điểm khác nhau
của quá trình chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh dầu thu từ mẫu vỏ
quế xử lý bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme. Sau
6h chưng cất, lượng tinh dầu đạt cực đại (3,28%) trong khi đó sau 8h
mẫu không xử lý enzyme mới đạt cực đại (2,87%).
Kết quả đánh giá tác động của các hệ enzyme lên thành phần
hóa học tinh dầu vỏ quế
Bảng 4.9. Thành phần hóa học của các tinh dầu vỏ quế thu được từ
các nguyên liệu được xử lý với các hệ enzyme khác nhau
Không
enzyme

Laccase

Htec2

Laccase
+Htec2

Nhóm hidrocarbon

38,26

26,52

26,29

27,26

Nhóm HC chứa oxy

60,85

71,47

70,35

72,02

Tổng Phenyl propanoid

58,83

65,97

65,73

70,98

trans-cinnamaldehyde

53,99

59,22

58,36

67,6

Tổng sesquiterpen

39,29

30,98

29,85

27,44

Sesquiterpen hidrocarbon

35,87

24,64

24,28

25,08

Sesquiterpen chứa oxy

3,42

6,34

5,57

2,36

Chất

So sánh thành phần GC-MS của cả 4 phương án xử lý cho thấy
quá trình tiền xử lý vỏ quế bằng enzyme đã không làm thay đổi bản
chất của tinh dầu quế, các mẫu nghiên cứu đều có thành phần chính
là cinnamic aldehyde và có cùng số lượng các thành phần quan trọng
khác, ít có sự biến động về tỷ lệ nhóm các hidrocarbon và các hợp
chất chứa oxy, tỷ lệ phenylpropanoid và sesquiterpen. Đặc biệt, quá
trình (Laccase + Htec2)- EAD có sự gia tăng của hàm lượng chất
chínhcinnamic aldehyde tăng từ 54,63% % lên 68,37%.


15
4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng
hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ
cành lá quế

Qua phân tích các yếu tố ảnh hưởng, chọn 5 yếu tố ảnh hưởng
gồm: pH, nhiệt độ T, thời gian t, tỷ lệ enzyme laccase/cơ chất, tỷ lệ
enzyme Htec2/cơ chất. Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 để xử
lý số liệu ta nhận được kết quả phương trình hồi qui:
= 79,73 + 0,48 x1 + 0,56x2 + 1,66 x3 + 2,19 x4 + 0,44 x1x5 0,44 x2x3 - 0,44 x2x4 - 0,69 x3x4 - 1,98 x12 - 1,84 x22 - 1,83 x32 - 1,26
x42 -1,29 x52
Bằng phần mềm trên đã tiến hành xem xét mô tả ảnh hưởng
của từng cặp tương tác, đều được mô tả dạng paraboloid tức có điểm
cực trị.

Hình 4.9. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của từng cặp yếu tố
Như vậy, điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân cành lá quế
bằng hệ enzyme Laccase + Htec2 là pH 5,2, nhiệt độ 440C,
Laccases/S = 0,42ml/g, Htec2/S= 1,15%, thời gian 5h30 phút
Đề xuất quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp
Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia
(hình 4.10)


16
Cành lá quế
Xay, nghiền
Tiền xử lý
H2O/24h
Ủ
Laccase/S 0,42 ml/g, Htec2/S
1,15%, nhiệt độ 440C, pH 5.2,
thời gian 5h30’, tốc độ 200 rpm,

Thủy phân

Chưng cất tinh dầu

Tinh dầu+ Nước

Bã nguyên liệu

Na2SO4
Tinh dầu Cassia

Phân bón

Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp
Laccase-Htec trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia
4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp
Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây
gió bầu Aquilaria crassna
Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu
A. crassna
Kết quả xác định các thành phần kiến tạo nên khung cấu trúc
của gỗ gió bầu cho thấy gỗ gió bầu mang các đặc trưng của nguyên
liệu chứa lignocellulose bao gồm cellulose 34,75%, hemicellulose
15,27% và lignin 29,10%.


17
Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên
hàm lượng và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu
Aquilaria crassna
Dựa trên các kết quả thu được khi nghiên cứu ứng dụng enzyme
trong chưng cất tinh dầu quế, chúng tôi đã chọn hệ enzyme LaccaseHtec2 để áp dụng cho việc chưng cất tinh dầu trầm hương. Kết quả sau

3 ngày chưng cất, mẫu đối chứng (mẫu không có enzyme) cho 0,024%
tinh dầu (tính theo khối lượng mẫu khô gió), mẫu nghiên cứu (mẫu có
enzyme) cho 0,032% tinh dầu, tỷ lệ gia tăng tinh dầu
Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu được xác định
bằng phương pháp GC-MS. Một số thành phần đặc trưng của tinh
dầu trầm hương.

Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương
- Hàm lượng của các thành phần có giá trị, mang mùi trầm
hương đặc trưng (Hình 4.11b) cũng tăng lên rõ rệt, cụ thể cisdihydroagarofuran (0,11%, đối chứng 0%), α-agarofuran (0,17%, đối
chứng 0%), agarospirol (0,72%, đối chứng 0,23%), hinesol (0,56%,
đối chứng 0,16%), valerianol (2,59%, đối chứng 0,89%),
neopetasone (0,76%, đối chứng 0,11%), tổng các terpen hydrocarbon
(3,70%, đối chứng 0%), tổng các terpen chứa oxy (24,76%, đối
chứng 8,78%).


18
- Các axit béo và dẫn xuất của chúng là các thành phần không
mong muốn trong tinh dầu trầm hương. Trong mẫu nghiên cứu, hàm
lượng của chúng chỉ còn 22,89%, ít hơn hẳn so với đối chứng là 59,85%.
- Tổng số các chất chưa được xác định (unknown) trong kết
quả phân tích tinh dầu trầm hương là rất cao, vì thế cần có các nghiên
cứu hóa học tiếp theo để làm rõ.
4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong
chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ
vây vàng Thunnus albarcares
4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit
béo của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam
Kết quả nghiên cứu các chất nền

Hàm lượng protein của các mẫu đầu cá ngừ dao động trong
khoảng 17 - 20%, tương ứng với 40 - 50% protein tính theo lượng
chất khô. Hàm lượng lipid của các mẫu dao động trong khoảng 4,5 14,8%, cao nhất là nhóm cá ngừ đại dương có kích thước lớn (500 2.000 mm) như cá ngừ vây vàng (14,8%), cá ngừ mắt to (14,2%).
Kết quả phân tích thành phần axit béo
Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu
một số loài cá ngừ của Việt Nam
Ngừ ồ

Ngừ
chù

Ngừ
chấm

Ngừ
vằn

Ngừ
bò

Sọc
dưa

Vây
vàng

Mắt
to

Tổng SFA

33,44

39,59

39,04

33,76

35,45

38,59

22,74

37,43

Tổng MUFA

35,05

24,78

25,97

29,65

24,21

22,63

28,86

19,33

Tổng PUFA

31,49

35,63

34,77

36,34

39,94

38,28

48,36

40,5

n-3PUFA

25,35

26,86

24,28

29,4

32,89

30,18

37,82

34,84

EPA+DHA+DPA

25,35

26,55

24,28

28,27

31,79

29,83

39,15

34,84

Hệ số đánh giá

114,08

136,99

133,54

217,30

343,98

263,12

559,74

494,73

Axit béo
(% / lipid tổng)

*

Qua hệ số đánh giá cho thấy 03 loài cá ngừ có triển vọng trong
việc sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất dầu cá chất lượng cao giàu n-3


19
PUFA: cá ngừ bò, cángừ vây vàng và cá ngừ mắt to có hệ số đánh giá
cao tương ứng là 343,98;559,74và 494,73; trong đó cao nhất là cá ngừ
vây vàng Thunnus albarcares được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

4.3.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất
lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T. albarcares
Tác động của việc xử lý enzyme lên hiệu suất phân lập lipid và
mức độ thủy phân nguyên liệu
Bảng 4.14. Sản phẩm của quá trình phân lập lipid
Sản phẩm
Lipid (%)
Protein hòa tan (%)
Ép nhiệt
3,22 ± 0,34
Dạng thô
Blight& Dyer
14,80 ± 0,28
Loại bỏ
Protamex
9,19 ± 0,14
3,71 ± 0,14
Alcalase
7,84 ± 0,33
3,63 ± 0,26
Bromelain
10,23 ± 0,42
4,12 ± 0,15
Papain
6,71 ± 0,43
3,14 ± 0,34
Kết quả đánh giá bằng phương pháp sử dụng enzyme trên
Bảng 4.14:
- So với phương pháp truyền thống (ép nhiệt), phương pháp
thủy phân bằng enzyme protease đã cải thiện đáng kể quá trình tách

dầu từ 3,22% lên 6,71 - 10,23% (tăng 2 - 3 lần), đồng thời thu được
sản phẩm protein hòa tan giàu axit amin tự do có giá trị dinh dưỡng
cao hơn khi sử dụng phương pháp ép nhiệt.
- So sánh với phương pháp sử dụng dung môi (phương pháp
Blight & Dyer), phương pháp thủy phân bằng enzyme protease có
hiệu suất phân lập khoảng 45-70%, phụ thuộc vào từng loại
enzyme. Tuy nhiên, phương pháp enzyme tận thu được triệt để
nguồn nguyên liệu protein có giá trị cao trong khi phương pháp sử
dụng dung môi hữu cơ, protein bị loại bỏ trong quá trình chiết lipid.
Đặc biệt, về mặt cảm quan, dầu cá thu được bằng phương pháp thủy
Phương pháp


20
phân enzyme có màu sắc (màu vàng sáng) đẹp hơn so với phương
pháp chiết xuất bằng dung môi (màu vàng nâu) và không có dư
lượng dung môi hữu cơ.
- So sánh 4 loại enzyme protease sử dụng trong nghiên cứu,
enzyme Bromelain cho hiệu suất phân lập cao hơn các enzyme còn lại.
Thành phần axit béo của lipid tách từ đầu cá ngừ vây vàng
Thunnus albacare bằng các phương pháp
Thành phần axit béo của lipid tổng chiết bằng phương pháp
khác nhau được xác định bằng GC-MS (Bảng 4.15).
Bảng 4.15. Thành phần axit béo bằng các phương pháp khác nhau
Axit béo
Tổng SFA
Tổng MUFA
Tổng PUFA
n-3PUFA
EPA+DHA+DPA

Hệ số đánh giá

Ép
nhiệt
51,35
35,84
12,80
10,82
10,82
24,06

B&D

Protamex

Alcalase

Bromelain

Papain

22,69
28,96
48,35
40,98
39,22
606,5

33,54
33,01

32,20
27,15
25,51
247,61

40,39
26,48
32,10
21,86
21,86
137,06

36,56
21,77
40,11
31,42
30,20
294,72

47,19
21,93
30,88
19,56
19,56
105,23

Kết quả phân tích nêu trên Bảng 4.15 cho thấy:
So với phương pháp chiết xuất truyền thống (ép nhiệt), phương
pháp tách dầu bằng enzyme đã làm tăng chất lượng dầu khi cho tỷ lệ
các axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA cao hơn gấp 2 - 3 lần (đạt

20 - 30%), trong khi phương pháp ép nhiệt chỉ đạt 12,82%. Có thể
thấy rằng, các axit béo không no đa nối đôi rất nhạy cảm với nhiệt
độ. Phương pháp ép nhiệt diễn ra ở nhiệt độ cao (trên 1000C) đã làm
biến đổi chất lượng của lipid, các axit béo no (SFA) chiếm 51,35%,
trong khi phương pháp thủy phân thực hiện ở nhiệt độ 500C nên ít
ảnh hưởng đến chất lượng của dầu. So với 3 enzyme còn lại,
Bromelain cho hệ số đánh giá cao nhất và được lựa chọn cho các
nghiên cứu tiếp theo.


21
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL
trong quá trình làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá
ngừ vây vàng T. albacares bằng phương pháp ure
Khảo sát điều kiện thủy phân lipid thành các axit béo tự do
bằng enzyme lipase CRL
Dầu dầu cá ngừ trước kết tinh ure được thủy phân bằng enzyme
lipase CRL từ nấm men Candida rugosa trong hệ dung môi hai pha: nhexan và nước. Sau quá trình thủy phân ở 400C, pH 7,5, tỷ lệ
enzyme/cơ chất là 0,8% và thời gian thủy phân là 10 giờ, chỉ số axit đo
được là 149,8 mgKOH/g, tỷ lệ % axit béo đã bị thủy phân là
77,42%.Số liệu thực nghiệm được đánh giá dựa trên phương pháp bình
phương tối thiểu. Kết quả tính hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm.
Thành phần axit béo sau làm giàu bằng kết tinh ure

Hình 4.13. Sắc ký đồ các axit béo giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây
Phương pháp kết tinh bằng ure nhờ enzyme lipase hỗ trợ đã
làm giàu n-3 PUFA từ 31,13% lên 58,30% (Hình 4.13)
Thay vì sử dụng kiềm (NaOH) để thủy phân lipid tổng thành
các axit béo tự do trước khi kết tinh ure, quá trình thủy phân lipid
tổng bằng enzyme Lipase CRL có lợi thế hơn phương pháp hóa học

là nhiệt độ thủy phân thấp (40oC), tốn ít dung môi hóa chất và giảm
thiểu sự nguy hại đối với môi trường. Quá trình kết tinh bằng ure sau


22
khi thủy phân bằng lipase CRL đã làm giảm các axit béo no (SFA) từ
36,56% xuống 5,5% và làm giàu n-3 PUFA từ 31,13% lên 58,3%,
trong đó EPA từ 5,47 lên 8,59%, DHA từ 22,9 lên 46,70% và DPA từ
1,83 lên 2,68%.
Đề xuất qui trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết
xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T. albacares

Hình 4.14. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong
chiết xuất lipid và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng


23
KẾT LUẬN
Trong luận án này, một số enzyme đã được nghiên cứu ứng
dụng nhằm hỗ trợ cho quá trình chiết xuất tinh dầu từ cành lá, từ vỏ
quế Cinnamomum cassia và từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna cũng
như quá trình chiết xuất dầu béo và làm giàu các axit n-3 PUFA từ
đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares. Các nội dung nghiên cứu và
kết quả thu được cụ thể như sau:
1. Luận án đã thành công khi sử dụng hệ enzyme Laccase-Htec2
để xử lý các nguyên liệu cành lá và vỏ quế trước khi chưng cất cho
hiệu suất thu hồi tinh dầu tăng lên rõ rệt, tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành lá
quế đạt 41,7%, vỏ quế đạt 14,57%, thời gian chưng cất tinh dầu được
rút ngắn. Đặc biệt, quá trình xử lý bằng hệ enzyme Laccase-Htec2 đã
làm gia tăng hàm lượng chất chính cinnamaldehyde trong tinh dầu

cành lá quế từ 69,74% lên 85,60%, tinh dầu vỏ quế từ 54,63% lên
68,37% và không làm thay đổi một số hoạt tính sinh học của tinh dầu
cành lá quế C. cassia so với đối chứng.
2. Luận án đã sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm để
tính toán điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân cành lá quế trước
khi chưng cất ở pH 5,2, nhiệt độ 44oC, tỷ lệ Laccase/cơ chất 0,42
ml/g, tỷ lệ Htec2/cơ chất 1,15%, thời gian thủy phân 5 giờ 30 phút.
Trên cơ sở các kết quả thu được, một qui trình công nghệ chưng cất
tinh dầu cành lá quế có enzyme hỗ trợ đã được đề xuất.
3. Luận án đã thử nghiệm thăm dò ứng dụng của hệ enzyme
Laccase-Htec2 hỗ trợ quá trình chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ
cây gió bầu Aquilaria crassna cho tỷ lệ gia tăng tinh dầu là 33,33%,
các thành phần có giá trị của tinh dầu (cis-dihydroagarofuran, αagarofuran, agarospirol, hinesol, và neopetasone) tăng lên, các thành
phần axit béo gây cản trở giảm đi rõ rệt.
4. Luận án đã thành công khi chiết xuất lipid và làm giàu n-3
PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares bằng hệ enzyme
kép Bromelain và Lipase CRL. Qui trình chiết xuất lipid bằng enzyme