Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (cymbidium mosaic virus CyMV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi
ĐỂ TẠO D NG
VI U

HẢ

N Dendrobium CÓ KHẢ N NG

HÁNG

VÀNG Cymbidium mosaic virus)

LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

TP. HỒ CHÍ MINH- 2017
i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi
ĐỂ TẠO D NG
VI U

N Dendrobium CÓ KHẢ N NG

HẢ

HÁNG

VÀNG Cymbidium mosaic virus)

Chuyên ngành: D
Mã số: 62.62.01.11

LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Dươ
2. PGS. TS. C

Hoa Xô
H

H

TP. HỒ CHÍ MINH- 2017
ii

LỜI C

ĐO N

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Kết quả nghiên cứu hoàn
toàn trung thực, khách quan. Các số liệu được trình bày trong công trình này một
phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học-công nghệ cùng các đồng tác giả,
phần còn lại chưa được công bố bởi bất kỳ ai trong bất kỳ công trình nào.
TP. Hồ Chí Minh, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Xuân Dũng

i


LỜI CẢ

ƠN

Để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được
nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và sự ủng hộ, tạo điều
kiện của các cơ quan và tổ chức.

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Hoa Xô - Giám
đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, là người hướng dẫn chính
cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu,
cũng như kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và
thực hiện luận án. Ngoài ra, với tư cách là thủ trưởng đơn vị, thầy đã chấp thuận và
tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được tham gia chương trình đào tạo nghiên cứu
sinh.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người
hướng dẫn thứ hai cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã hướng dẫn, truyền đạt
kiến thức, tạo điều kiện hỗ trợ về mặt kỹ thuật cũng như đã đóng góp nhiều ý kiến
quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến:
- Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã chấp
thuận, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
- Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông nghiệp Miền Nam đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình học tập.
- Ban lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một
phần kinh phí cho tôi để thực hiện công trình nghiên cứu này.
- PGS.TS. Phạm Văn Toản và tất cả cán bộ thuộc Ban Đào tạo sau đại học Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác
Quốc tế- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, đã tận tình giúp đỡ,
động viên tôi trong quá trình học tập.

ii


- GS. TS. Bùi Chí Bửu và tất cả quý thầy cô (đã giảng dạy và tham gia Hội
đồng đánh giá đề cương, chuyên đề nghiên cứu của nghiên cứu sinh) đã truyền đạt
kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học

tập và nghiên cứu.
Những lời cảm ơn chân thành của tôi cũng xin được gởi đến:
- Các cán bộ, sinh viên đã và đang làm việc trong nhóm nghiên cứu chuyển
gen thực vật thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ
Sinh học TP. Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình tham gia, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt
quá trình làm việc và thực hiện luận án.
- Các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình
giúp đỡ và hỗ trợ về mặt kỹ thuật trong quá trình thực hiện luận án.
- Quý thầy cô giáo đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi qua các giai
đoạn học tập, các anh chị em đồng nghiệp và bạn bè thân hữu đã cùng cộng tác và
hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu.
Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc và những tình cảm ấm áp nhất đến Ba,
Mạ (người mẹ đã khuất) và tất cả những người thân yêu trong gia đình đã hết lòng
động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình trưởng
thành, học tập và nghiên cứu.
TP. Hồ Chí Minh, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Xuân Dũng

iii


MỤC LỤC

Trang
LỜI C

ĐO N ...................................................................................................... i

LỜI CẢ

ƠN ........................................................................................................... ii

MỤC LỤC ................................................................................................................ iv
DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. xi
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................. xiii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết ............................................................................................................... 1
2. Mục tiêu và yêu cầu .................................................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................................... 3
5. Đóng góp mới của luận án .......................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................5
1.1. Sơ lược về hoa lan .................................................................................................... 5
1.1.1. Giới thiệu về họ hoa lan ....................................................................................5
1.1.2. Giống lan Dendrobium ......................................................................................5
1.1.3. Sơ lược về PLBs (Protocorm like bodies) ........................................................6
1.2. Sơ lược về Cymbidium mosaic virus ....................................................................... 7
1.2.1. Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen ..............................................7
1.2.2. Sự lây nhiễm và di chuyển của virus CyMV trong cây ....................................9
1.2.3. Triệu chứng bệnh do virus CyMV gây ra .........................................................9
1.2.4. Tình hình bệnh do virus CyMV gây ra trên các giống lan ở Việt Nam ..........10
1.3. Phương pháp chọn giống hoa lan........................................................................... 11
1.3.1. Chọn giống bằng phương pháp cổ điển ..........................................................11

1.3.2. Chọn giống bằng phương pháp chuyển gen ....................................................11
1.3.3. Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ..........11
1.3.3.1. Sơ lược về phương pháp ..............................................................................11
1.3.3.2. Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen ......................13

iv


1.3.3.3. Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ................13
1.3.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens ở hoa lan ..........................................................14
1.4. Sự can thiệp RNA (RNAi) và vai trò của nó trong chọn giống cây trồng ........... 19
1.4.1. Lịch sử phát hiện RNAi ..................................................................................20
1.4.2. Cơ chế của RNAi ............................................................................................23
1.4.3. Sự khởi đầu và khuếch đại tín hiệu RNAi ......................................................25
1.4.4. Sự di chuyển của các tín hiệu RNAi ...............................................................27
1.4.5. Mối liên hệ giữa virus gây bệnh cây trồng và RNAi ......................................29
1.4.6. Vai trò của RNAi trong chọn giống cây trồng kháng virus ............................30
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................36
2.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 36
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................36
2.1.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................39
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 40
2.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia ..........................40
2.2.1.1. Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ....40
2.2.1.2. Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi
cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs ................41
2.2.1.3. Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen....42
2.2.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV ..................................43
2.2.2.1. Thu thập mẫu lan nhiễm virus......................................................................43

2.2.2.2. Phân lập gen CP ...........................................................................................44
2.2.2.3. Nhân dòng gen CP .......................................................................................44
2.2.2.4. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự ...............46
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi và biến nạp vào A. tumefaciens ................46
2.2.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP ..........46
2.2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và ORF2-4+CP bằng
hệ thống Gateway .........................................................................................47

v


2.2.3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi
pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP........................48
2.2.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP .......48
2.2.4.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn .........................................................................48
2.2.4.2. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua
trung gian vi khuẩn A. tumefaciens ...............................................................49
2.2.4.3. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển ...................................................49
2.2.4.4. Kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen ....50
2.2.4.5. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển và kiểm tra sự hiện
diện của gen mục tiêu trong cây ...................................................................50
2.2.5. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen bằng lây
nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro ..............................................51
2.2.5.1. Lây nhiễm virus CyMV vào cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro ...51
2.2.5.2. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen .................52
2.2.6. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................................52
2.2.7. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................53
2.2.8. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................53
CHƯƠNG 3.

ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................54

3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs............................................................ 54
3.1.1. Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ......................54
3.1.1.1. Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro..........................54
3.1.1.2. Môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro .................................55
3.1.1.3. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs .........................57
3.1.2. Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích
hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .............................................................58
3.1.2.1. Trường hợp chủng C58 ................................................................................58
3.1.2.2. Trường hợp chủng EHA105.........................................................................59
3.1.2.3. Trường hợp chủng LBA4404 .......................................................................60
3.1.2.4. Về mức độ biểu hiện gen GUS ....................................................................61

vi


3.1.3. Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen........62
3.1.3.1. Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs ............................62
3.1.3.2. Nồng độ hygromycin và kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen ...63
3.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV ........................................ 66
3.2.1. Phân lập gen CP ..............................................................................................66
3.2.2. Tạo dòng gen CP .............................................................................................67
3.2.3. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự ..................69
3.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và CP + ORF2-4 ............ 71
3.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP .....................72
3.3.1.1. Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng và gen ORF2-4+CP từ vector
pBSK/ORF2-4+CP .......................................................................................72
3.3.1.2. Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR ................................72
3.3.1.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi bằng kỹ thuật Gatewway.......................76

3.3.1.4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi ..........78
3.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP........... 79
3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua
trung gian vi khuẩn A. tumefaciens ..............................................................79
3.4.1.1. Giai đoạn đồng nuôi cấy ..............................................................................79
3.4.1.2. Giai đoạn khử khuẩn ....................................................................................81
3.4.2. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển ......................................................82
3.4.3. Kiểm tra sự hiện diện gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen ..............83
3.4.4. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển ...............................85
3.5. Khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro ........... 90
3.5.1. Về biểu hiện triệu chứng nhiễm virus CyMV .................................................90
3.5.2. Về sự hiện diện của virus trong cây lan ..........................................................92
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................95
1. Kết luận ...................................................................................................................... 95
2. Đề nghị ...................................................................................................................... 96
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ...................................................97

vii


TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................98
Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................................... 98
Tài liệu tiếng Anh .......................................................................................................... 99
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Môi trường nuôi cấy thực vật và vi khuẩn
Phụ lục 2. Một số triệu chứng nghi nhiễm virus trên các mẫu lan thu thập
Phụ lục 3. Quy trình chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia qua trung gian
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Phụ lục 4. Kết quả so sánh trình tự gen CP và gen ORF2-4 của CyMV
Phụ lục 5. Kết quả xử lý thống kê

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BA

Benzyladenine

BGMV

Bean golden mosaic virus

BYMV

Bean yellow mosaic virus

CBP

Cap binding protein

CGMMV

Cucumber green mottle mosaic virus

CMV

Cucumber mosaic virus

CP

Coat protein gene

CPMR

Coat protein-mediated resistance

CyMV

Cymbidium mosaic virus

2,4-D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

DCL

Dicer like protein

DNA

Deoxyribo nucleic acid

dsRBD

Double-stranded RNA binding domain

GFP

Green fluorescent protein

HCPro

Helper component-proteinase

hpRNA

Hairpin RNA

ihpRNA

Intron hairpin RNA

LB

Lysogeny broth

MCS

Multi cloning site

miRNA

MicroRNA

mRNA

Messenger RNA

MS

Murashige and Skoog

LS

Linsmaier and Skoog

NAA

Naphthaleneacetic acid

NCR

Noncoding region

NMV

Narcissus mosaic virus

ORF

Open reading frame
ix


ORSV

Odontoglossum ringspot virus

PAMV

Potato aucuba mosaic virus

RdRp

RNA-dependent RNA polymerase

RISC

RNA-induced silencing complex

RNA

Ribonucleic acid

RNAi

RNA interference

siRNA

Small interfering RNA

SMYEaV

Strawberry mild yellow edge-associated virus

SMV

Soybean mosaic virus

sRNA

Small RNA

TGB

Triple-gene-block

TMV

Tobacco mosaic virus

TRV

Tobacco rattle virus

TRSV

Tobacco ringspot virus

TYLCV

Tomato yellow leaf curl virus

WCMV

White clover mosaic virus

x

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Kết quả ứng dụng RNAi trên nhiều loại virus thực vật khác nhau ................31
Bả

3.1. Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ lan Dendrobium Sonia sống vô trùng
sau 14 ngày nuôi cấy.........................................................................................54

Bả

3.2. Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cây lan Dendrobium Sonia in vitro
cảm ứng với môi trường sau 4 tuần nuôi cấy. .................................................55

Bả

3.3. Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường ........................................57

Bả

3.4. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo
thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58. ................59

Bả

3.5. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo
thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105. ........60

Bả

3.6. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo
thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404........61

Bả

3.7. Khả năng diệt khuẩn của cefotaxime ở các nồng độ khác nhau trên PLBs ..63

Bả

3.8. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của hygromycin ở các nồng độ khác nhau
theo thời gian nuôi cấy......................................................................................64

Bả

3.9. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của kanamycin ở các nồng độ khác nhau,
theo thời gian nuôi cấy......................................................................................65

Bả

3.10. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập
ở các khu vực khác nhau tại Việt Nam ............................................................70

Bả

3.11. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập
ở các khu vực tại Việt Nam và một số khu vực trên thế giới .........................71

Bả

3.12. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt vector tái tổ hợp
pK7GWIWG2(II)/CP; pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng XbaI
và HindIII .............................................................................................................. 77

xi


Bả

3.13. Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen thu được sau giai đoạn sàng lọc với
kanamycin. ........................................................................................................82

Bả

3.14. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong PLBs chuyển gen...85

Bả

3.15. Tần suất xuất hiện của các dạng kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu
được từ cụm PLBs chuyển gen. .......................................................................87

Bả

3.16. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong cây lan phát triển từ
PLBs chuyển gen. .............................................................................................89

Bả

3.17. Kết quả đánh giá khả năng kháng virus của cây lan phát triển từ PLBs
chuyển gen sau 4 tuần lây nhiễm virus. ...........................................................93

xii


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hoa lan Dendrobium Sonia ................................................................................ 6
Hình 1.2. Hình dạng của CyMV ......................................................................................... 7
Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen của virus CyMV....................................................................... 8
Hình 1.4. Triệu chứng khảm vàng lá và khảm màu hoa lan Dendrobium .....................10
Hình 1.5. Sự phục hồi (kháng lại virus) ở cây thuốc lá bị nhiễm virus TRSV. .............20
Hình 1.6. Hoa dã yên thảo với các gen quy định sắc tố hoa đã bị im lặng bởi RNAi ...22
Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của RNAi.............................................................................24
Hình 1.8. Hoạt động của protein RdRp trong việc khuếch đại tín hiệu RNAi [20]. .....26
Hình 1.9. Ảnh hưởng của đột biến RdRp lên sự truyền tín hiệu RNAi

ở cây

A. thaliana . ......................................................................................................29
Hình 3.1. Chồi ngủ lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường MS
sau 4 (A) và 8 (B) tuần nuôi cấy. .....................................................................54
Hình 3.2. Sự hình thành PLBs từ lát cắt mỏng thân Dendrobium Sonia trên môi trường
MS bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy ......56
Hình 3.3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung
BA và NAA ở các nồng độ khác nhau, sau 10 tuần nuôi cấy ........................57
Hình 3.4. Các mức độ biểu hiện gen GUS của PLBs chuyển gen .................................61
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP ..................................66
Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi
F-CCP và R-CCP định vị trên gen ...................................................................67
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi

pJET1.2 định vị trên vector ..............................................................................68
Hình 3.8. Kết quả điện di sự kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn bằng phản ứng
cắt với enzyme BamHI và EcoRI.....................................................................68

xiii


Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự gen CP với các trình tự được công bố trên ngân
hàng gen NCBI..................................................................................................69
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP (A) và ORF2-4+CP (B). ...72
Hình 3.11. Sơ đồ tạo vector tái tổ hợp pENTR/CP và pENTR/ORF2-4+CP ................73
Hình 3.12. Kết quả kiểm tra phân đoạn gen CP trong các dòng vi khuẩn biến nạp
vector pENTR/CP với cặp mồi M13 ...............................................................74
Hình 3.13. Kết quả kiểm tra phân đoạn gen ORF2-4+CP trong các dòng vi khuẩn biến
nạp vector pENTR/ORF2-4+CP với mồi M13. ..............................................74
Hình 3.14. Sơ đồ vector pENTR/CP và pENTR/ORF2-4+CP với vị trí cắt
của enzyme NotI và SalI ..................................................................................75
Hình 3.15. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của phân đoạn gen CP (A) và ORF2-4+CP
(B) trong các dòng vi khuẩn bằng enzyme SalI và NotI.................................75
Hình 3.16. Kết quả kiểm tra gen CP (A) và gen ORF2-4+CP (B) trong các dòng khuẩn
lạc với cặp mồi của đoạn gen. .........................................................................76
Hình 3.18. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pK7GWIWG2(II)/CP và
pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng enzyme XbaI và HindIII ....................78
Hình 3.19. Khuẩn lạc A. tumefaciens C58 phát triển trên môi trường chứa 50mg/l
ampicilin, 100mg/l spectinomycin và 50mg/l rifamycin sau khi được biến
nạp với vector pK7WIWG2(II)/CP/ORF2-4+CP. ..........................................79
Hình 3.20. PLBs của lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường đồng nuôi
cấy sau 3 ngày lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens. .......................................80
Hình 3.21. PLBs của Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường khử khuẩn sau
7 ngày (A) và 14 (B) ngày nuôi cấy.................................................................81

Hình 3.22. PLBs lan Dendrobium Sonia nuôi cấy trên môi trường sàng lọc sau
60 ngày...............................................................................................................82
Hình 3.23. Kết quả kiểm tra gen CP trong cụm PLBs giả định chuyển gen..................84

xiv


Hình 3.24. Kết quả kiểm tra gen ORF2-4+CP trong cụm PLBs giả định
chuyển gen .........................................................................................................84
Hình 3.25. Sự tăng trưởng của PLBs lan Dendrobium Sonia chuyển gen trên
môi trường ½ MS. (A). Tăng sinh PLBs, (B). Tăng trưởng chồi. .................86
Hình 3.26. Kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu được từ PLBs chuyển gen sau 6
tháng nuôi cấy trên môi trường ½ MS. ..........................................................87
Hình 3.27. Kết quả kiểm tra gen CP trong cây lan chuyển gen. .....................................88
Hình 3.28. Kết quả kiểm tra gen ORF2-4+CP trong cây lan chuyển gen......................89
Hình 3.29. Các triệu chứng nhiễm virus trên cây lan in vitro sau 3 tuần lây nhiễm nhân
tạo với virus CyMV ..........................................................................................91
Hình 3.30. Cây lan in vitro sau 4 tuần lây nhiễm nhân tạo với virus CyMV ................91
Hình 3.31. Kết quả kiểm tra virus CyMV trong các cây lan giả định chuyển gen được
lây nhiễm virus trong điều kiện in vitro sau 4 tuần.........................................92
Hình 3.32. Cây lan Dendrobium Sonia chuyển gen (dòng 36-176) tăng trưởng trong
điều kiện nhà kính. ............................................................................................94

xv


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam. Đây là một giống
chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử dụng cho

mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. Dendrobium đã thực sự trở thành một
giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam trong nhiều năm qua.
Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm sản xuất hoa lan lớn nhất
cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một trong hai giống lan đóng góp
chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt
giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa lan thành phố trong năm 2015 [10].
Tuy nhiên, hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại
Thành phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong
nước. Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung
Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước. Nghiên cứu nâng cao năng suất và sản
lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành sản
xuất hoa lan Việt Nam.
Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan,
trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất.
Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói
chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra. Hiện có hai
loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng (Cymbidium mosaic
virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) [88].
Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở
Việt Nam [2], [5], [7], và đặc biệt là lan Dendrobium được trồng ở một số khu vực
thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%,
mà không bị nhiễm virus ORSV [2]. Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang
lây nhiễm rất nghiêm trọng trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam.

1


Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng
hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch. Quan
trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh chóng qua

các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn với mức độ rất
nghiêm trọng. Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh virus vẫn là phòng
tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá trình sản xuất giống và
canh tác. Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian,
chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu quả như mong muốn. Do vậy, các
biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo ra khả
năng kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA
(RNAi).
Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ
thuật chuyển gen RNAi trên thế giới [34]. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai
ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các loại virus
khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV [12], virus CMV [11] và kháng đồng thời
cả hai loại virus TMV và CMV [3]; cà chua kháng virus TYLCV [13]; đu đủ kháng
virus PRSV [4], đậu tương kháng virus SMV và BYMV [9]. Tuy nhiên, hiện vẫn
chưa có nghiên cứu nào được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng
kháng với virus CyMV, trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất
nghiêm trọng trên giống lan này.
Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi
để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu
quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để tạo ra
khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan Dendrobium có
khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan.

2


2. Mục tiêu và yêu cầu
Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi

trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho cây lan Dendrobium Sonia trong
điều kiện nuôi cấy in vitro:
- Nghiên cứu chọn được vùng trình tự bảo thủ của gen CP và ORF2-4 từ
virus CyMV phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen RNAi.
- Nghiên cứu xây dựng được quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium để
tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP.
- Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen
trong điều kiện in vitro.
3. Đ

ượng và phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây

bệnh trên lan. Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc RNAi
của gen CP hoặc ORF2-4+CP của virus CyMV vào PLBs lan bằng kỹ thuật chuyển
gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
- Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu, bao gồm việc đánh giá
khả năng kháng virus của cây chuyển gen, được giới hạn trong điều kiện in vitro.
4. Ý

ĩa k
*Ý

a
ĩa k

c và thực tiễn
a

- Góp phần làm sáng tỏ vấn đề về mức độ bảo thủ của trình tự gen CP phân

lập từ virus CyMV tại Việt Nam.
- Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens trên đối tượng lan Dendrobium.
- Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo
ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung.

3


*Ý

ĩa

ự

ễ

Tạo ra được các dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả năng kháng virus
CyMV trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo
giống lan kháng virus thông qua lai tạo.
5. Đóng góp mới của luận án
- Chứng minh được tính bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV
tại Việt Nam.
- Khẳng định được tính khả thi của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc tạo
khả năng kháng virus cho lan Dendrobium.
- Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả năng kháng virus của cây
lan chuyển gen trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
- Tạo ra được các dòng lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng virus trong
điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống lan kháng
virus.

4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược v hoa lan
1.1.1. Giới thiệu v h hoa lan
Họ hoa lan (Orchidaceae) bao gồm khoảng 900 giống và 2500-3500 loài.
Đây là một trong những họ thực vật lớn nhất và nhận được sự quan tâm đặc biệt do
có hoa đẹp, lâu tàn cũng như rất đa dạng về màu sắc, hình dạng và kích thước.
Chúng được xem là các loại hoa cắt cành và hoa chậu phổ biến về mặt kinh tế trên
toàn thế giới. Nhiều loài mới mang những tính trạng cải tiến của họ này vẫn đang
tiếp tục được tạo ra để đáp ứng cho nhu cầu của thị trường [46].
1.1.2. Gi ng lan Dendrobium
Giống lan Dendrobium được Olof Swartz đặt tên vào năm 1799. Chữ
Dendrobium có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp. Dendro có nghĩa là cây lớn, bio là sống,
vì tất cả các loài của Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ.
Dendrobium rất phong phú về chủng loại, là giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan,
với khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều
nhất ở Đông Nam Á và châu Úc [8]. Trong đó, Dendrobium Sonia là dòng lan lai
được tạo ra từ tổ hợp lai Dendrobium Caesar x Dendrobium Tomie Drake bởi tác
giả Chittraphong và được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1984 [29].
Về hình thái, đây là loài lan đa thân, bao gồm nhiều giả hành, mỗi giả hành
có nhiều lóng, thường có 2-3 lá dai, bền, không rụng ở đỉnh. Hoa màu tím (gồm 3
cánh hoa màu tím pha trắng ở phần gốc cách hoa, 3 lá đài có màu tương tự như cánh
hoa nhưng phần màu tím nhạt hơn và môi màu tím đậm), họng trắng (Hình 1.1).

5

Hình 1.1. Hoa lan Dendrobium Sonia
Phát hoa phát sinh ở cả giả hành cũ và mới. Ở giả hành mới, chồi non nhất ở
gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành phát hoa, những chồi già bên dưới phát
triển sau. Nói cách khác, sự phát triển phát hoa từ chồi xảy ra theo thứ tự từ ngọn
đến gốc, và thường có 1-4 chồi phát triển thành phát hoa cùng lúc (mô tả theo [8]).
Về sinh trưởng, đây là loài lan có đặc điểm sinh trưởng liên tục, không có
thời gian nghỉ hay thời gian nghỉ rất ngắn. Tương tự như hầu hết các loài trong
giống lan Dendrobium, Dendrobium Sonia thích nghi với ánh sáng từ 70-80% ánh
sáng tự nhiên. Ánh sáng quá mức có thể gây ra hiện tượng vàng lá, cháy lá; ngược
lại thiếu sáng cây sẽ phát triển kém, ít ra hoa, số hoa trên phát hoa ít. Nhiệt độ thích
nghi cho sự phát triển của lan Dendrobium Sonia khoảng 25oC [8].
Lan Dendrobium Sonia là một loại hoa phù hợp cho cả mục đích sản xuất
hoa cắt cành và hoa chậu. So với nhiều loại lan khác, nhu cầu của thị trường đối với
hoa lan Dendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng trong nhiều năm qua. Do vậy,
việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cải thiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có
ý nghĩa quan trọng.
1.1.3. ơ lược v PLBs (Protocorm like bodies)
Sự hình thành protocorm là một đặc tính riêng của sự phát triển ở họ hoa lan.
Trong đó, thuật ngữ “protocorm” được Treub sử dụng lần đầu tiên vào năm 1980,
để thay cho thuật ngữ “embryonic tuber” (củ phôi), đã được sử dụng trước đó để mô
tả một cấu trúc dạng củ (tuberidiform), có lông ở phần bên dưới, được hình thành
trong quá trình nẩy mầm của phôi ở cây thạch tùng. Thuật ngữ này cũng được

6


Balfour (1905) sử dụng để chỉ dạng cây mầm (seeding) của hoa lan. Trước đây, việc
xác định protocorm là cây mầm hay phôi vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau từ các nhà
nghiên cứu [19]. Tương tự với protocorm, PLBs (protocorm like bodies) được
Morel sử dụng lần đầu tiên vào năm 1960 trong thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi

(shoot-tip) của lan Cymbidium do có các đặc điểm về phát triển và cấu trúc giống
với protocorm. Ở các giai đoạn phát triển sớm, PLBs có đặc điểm phân chia tế bào
tương tự với sự phát triển phôi hợp tử, và vì vậy có thể kết luận PLBs thực sự là
phôi vô tính của họ lan [48]. Như vậy, với bản chất là một phôi vô tính, việc nuôi
cấy PLBs có thể dẫn đến hai trường hợp đó là PLBs có thể tăng trưởng thành cây
hoàn chỉnh hoặc có thể tiếp tục phân chia để hình thành các PLBs thứ cấp. Việc tạo
các PLBs thứ cấp chỉ có thể xuất phát từ một tế bào ban đầu, trãi qua các giai đoạn
hình thành phôi và cuối cùng tạo thành một PLBs (phôi) hoàn chỉnh.
1.2. Sơ lược v Cymbidium mosaic virus
1.2.1. Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen
Cymbidium mosaic virus (CyMV) (giống Potexvirus, họ Flexiviridae) hay còn
gọi là virus khảm vàng, được mô tả lần đầu tiên bởi Jensen (1951). Đây là một trong
những virus quan trọng và phổ biến nhất gây nhiễm các loại lan trên thế giới [83].
Phần tử virus có dạng sợi (Hình 1.2), không màng bao, dài 480 nm, rộng 13 nm [59].

Hình 1.2. Hình dạng của CyMV [59]
Bộ gen chứa RNA mạch đơn, sợi dương, có mũ chụp ở đầu 5’ và đuôi
polyA ở đầu 3’. Tổ chức bộ gen được bảo tồn cao, bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA-

7


dependent RNA polymerase - RNA polymerase phụ thuộc RNA), TGB (triplegene-block - bộ ba gen ức chế) và CP (coat protein - protein vỏ) (Hình 1.3). RNA
bộ gen có chiều dài 6227 nucleotide không tính đuôi poly A ở đầu tận cùng 3’.
Tương tự như các virus khác trong nhóm Potexvirus, bộ gen của CyMV có 5 khung
đọc mở (ORF1-5) [83]. ORF1 mã hóa cho protein sao chép kích thước 160 kDa,
protein này bao gồm ba vùng bảo thủ được công nhận, cụ thể là, protein methyl
transferase ở đầu N, RNA helicase và RNA phụ thuộc RNA polymerase (RdRp) ở
đầu C. Các ORF2-4 thường mã hóa cho bộ ba protein ức chế gen (TGB), có kích
thước tương ứng là 26, 13 và 28 kDa, tham gia vào quá trình di chuyển của virus

giữa các tế bào và ức chế sự bất hoạt RNA. ORF5 mã hóa cho protein vỏ (CP) (24
kDa), cần thiết cho sự tạo vỏ capsid và quá trình di chuyển của virus giữa các tế
bào [45], [77]. Ngoại trừ khung đọc mở ORF4, tất cả các khung đọc mở của các
protein mã hóa ở giống Potexvirus đều chứa các motif bảo tồn. Các protein được
mã hóa bởi virus CyMV có mức độ tương đồng cao với các protein tương ứng của
các thành viên khác trong giống Potexvirus. Trình tự nucleotide vùng 5’ không mã
hóa (noncoding region - NCR) của virus CyMV và tất cả các thành viên khác của
giống đều khởi đầu bằng GAAAA và CyMV là virus có vùng 5’ NCR ngắn nhất
trong tất cả các Potexvirus. Dựa trên sự so sánh về phát sinh loài của protein sao
chép và protein vỏ cho thấy virus CyMV có mối liên hệ gần với các virus như
PAMV, NMV, WC1MV và SMYEaV [83].

Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen của virus CyMV [83]

8