NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO VACXIN CÚM AH1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCUỈUS Swiss)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO
VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus muscuỉus Swiss)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011


NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO
VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus muscuỉus Swiss)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 604230

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

GS TS. Lê Văn Hiệp
PGS TS. Nguyễn Anh Dũng

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và
chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Người cam đoan

Nguyễn Thị Ngọc Hà
Đe hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
GS.TS Lê Văn Hiệp - Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, Người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền đạt
kiến thức cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tại Viện Vacxin Nha Trang.
PGS.TS Nguyễn Anh Dũng - Trường Đại học Tây Nguyên, Người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền đạt kiến
thức và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Lãnh đạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa KHTN và CN.
Các thầy Cô giáo đã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu trong quá trình học tập.
Các cán bộ nhân viên Phòng Nghiên cứu và Phòng Kiểm định Viện Vacxin Nha Trang.
Lãnh đạo và tập thể cán bộ giáo viên trường Trường THPT Trần Phú, TP Buôn Ma Thuột.
Cuối cùng xin gửi những tình cảm thân thương tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi hoàn
thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APC

: Antigen- presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên)

CS

: Chitosan

DNA
FCA

: Deoxyribo nucleic Acid
: Freund’s complete adjuvant

FIA

: Freund’s incomplete adjuvant

HA:

: Haemagglutinin

HAU

: Haemagglutination Unit (Đơn vị kháng nguyên)

HI test

: Haemagglutination Inhibition test (Phản ứng ức chế ngưng
kết hồng cầu)

HIU

: Haemagglutination Inhibition Unit (Đơn vị hiệu giá kháng
thể kháng HA)

IgG
IVAC

: Immunoglobulin

: Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang

kDa

: Kilo Dalton

KN
MIC

: Kháng Nguyên
: Nồng độ ức chế tối thiểu

RNA

: Ribonucleic Acid

TPP

: Tripolyphosphate

WHO

: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


Hình 3.6: Kết quả tăng trọng của chuột ở các nhóm vacxin có tá chất nao
chitosan khác nhau.

55

7

PHẦN MỞ ĐẦU

Những năm 1918-1919, thế giới đã xảy ra đại dịch cúm “Tây Ban Nha” do virus
cúm týp A/H1N1 gây ra. Đây thực sự là cơn ác mộng cho loài người vì chỉ trong vài
tháng đã có hơn 1 tỉ người mắc bệnh (chiếm 1/2 dân số thế giới thời kì bấy giờ) và cướp
đi sinh mạng của hơn 20 triệu người, gấp đôi số tử vong trong chiến tranh thế giới thứ
nhất. Mới đây nhất đại dịch cúm 2009 là dịch cúm do một loại virus thuộc chủng
A/H1N1, lần đầu tiên được các cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009. Sự bùng
phát căn bệnh giống như bệnh cúm đã được phát hiện lần đầu ở ba khu vực thuộc
Mexico và lây lan rất nhanh. Theo tổ chức Y tế thế giới, tính đến ngày 12 tháng 6 năm
2009 đã có 29669 trường hợp được xác định nhiễm cúm A/H1N1 tại 74 quốc gia và đã
có hàng trăm người chết. Tính đến ngày 10/02/2010, Việt Nam cũng đã ghi nhận 11.186
trường hợp dương tính với cúm A/H1N1 và 58 trường hợp tử vong.
Đại dịch cúm xảy ra tác động rất lớn đến nền kinh tế, sức khoẻ, tính mạng của con
người cũng như các hoạt động xã hội khác nên việc nghiên cứu, sản xuất vacxin và
thuốc kháng virus là hai mục tiêu lớn mà nhiều quốc gia đang hướng tới.
Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa, kiểm soát và
đẩy lùi bệnh dịch nói chung và bệnh cúm nói riêng. Hiện nay, trên thế giới năng lực sản
xuất vacxin phòng cúm chỉ đáp ứng 10% dân số khi đại dịch xảy ra. Vì thế mục tiêu
nghiên cứu hiện nay là sản xuất loại vacxin có hiệu giá cao, rẻ và an toàn khi sử dụng.
Hiệu quả miễn dịch và giá thành của vacxin lại phụ thuộc rất lớn vào tá chất. Một số tá
chất thường được sử dụng cho người Al(OH) 3, MF59, chitosan,....Vì vậy, việc nghiên
cứu loại tá chất cho vacxin là rất cần thiết trong sản xuất vacxin.
Hạt nano chitosan an toàn sinh học, tương hợp sinh học, có kích thước nanomet,
mang điện tích dương và dễ dàng đi qua màng tế bào nên có thể mang vacxin, nhất là
vacxin qua niêm mạc mũi với tính an toàn, hiệu quả và đáp ứng miễn dịch cao, kéo dài.

8

Hạt nano chitosan với những đặc tính ưu việt như: khả năng tương hợp sinh học, hỗ trợ
điều hoà miễn dịch, được enzyme trong cơ thể phân hủy... Vì vậy trong y học, hạt nano
chitosan được sử dụng phổ biến để mang thuốc, protein, vacxin, kháng khuẩn, làm
vector chuyển gen...
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi sử dụng hạt nano chitosan làm đối tượng
nghiên cứu với tên đề tài “Nghiên cứu hạt nano chitosan làm tá chất cho vacxin
cúm A/H1N1 và thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng (Mus
musculus Swiss)”
Mục tiêu của đề tài
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan đến khả năng
hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1.
Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng của
vacxin cúm A/H1N1 có tá chất là nano chitosan.


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về chitosan

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của nano chitosan
Chitosan là một biopolymer (polyglucosamine), là sản phẩm deacetyl của chitin,
một polysaccharide có trong thành phần cấu trúc của các loài giáp xác như tôm, cua,
côn trùng và vách tế bào nấm. Chitin có cấu tạo tương tự cellulose, nhưng có sự khác
biệt là đơn vị cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các đơn vị này nối với
nhau bằng liên kết P-1-4-glycoside. Tính chất và hoạt tính sinh học của chitin và

chitosan phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử (Mw) và mức độ deacetyl hóa
(DD: degree of deacetyllation). Mức độ deacetyl hóa dùng để chỉ % số nhóm acetyl
trong phân tử chitin, chitosan bị khử. Mức độ deacetyl hóa tỉ lệ thuận với mật độ của
nhóm NH3+ trong phân tử do đó ảnh hưởng tới tính chất đa điện và độ tan của chitin,
chitosan. Mức độ deacetyl trung bình của chitin nằm trong khoảng 10-15%. Có sản
phẩm chitin deacetyl hóa một phần (partially deacetyl chitin) có mức độ deacetyl hóa


từ 30-40%. Trong khi đó chitosan phải có mức độ deacetyl hóa >50%. Nhờ đó
chitosan mới dễ tan trong một số axit hữu cơ loãng như axit acetic, axit lactic, axit
glutamic, axit chlohydric. Khi hoà tan chitosan trong môi trường axit, nhóm amine của
chuỗi nhận proton và chuyển sang mang điện tích dương.
Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể được xác định bằng HPLC. Tuy
nhiên phương pháp nhanh nhất và đơn giản nhất là đo độ nhớt dựa vào các hằng số và
K trong phương trình Mark- Houwink:
[n] = KM a = 1.81x10-3M0'93
Trong đó: n là độ nhớt biểu kiến của chitin, M là khối lượng phân tử
Chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau từ 50-2000kDa, độ nhớt khác nhau
(1% chitosan trong axit acetic 1% có độ nhớt <2000mPaS) và mức độ khử acetyl khác
nhau (từ 40-98%)
Chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, có khả năng phân hủy sinh học
(biodegradation), có tính tương hợp sinh học cao (biocompatible) nên có nhiều nghiên
cứu, ứng dụng trong sinh y học.
Chitosan có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y
dược, thực phẩm^nhờ vào các đặc tính như:
- Tính chất đa điện li mang điện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho phép
gắn kết với các thành phần sinh học mang điện tích âm.
- Có khả năng phân huỷ sinh học bằng enzyme trong cơ thể.
- Có khả năng tương hợp sinh học với cơ quan, mô và tế bào động, thực vật.
- Có khả năng kích thích quá trình làm lành viết thương và đông máu.

- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các receptor trên màng.
- Giảm chlolesterol do liên kết có chọn lọc với các axit béo.
- Không gây độc do các sản phẩm sau thuỷ phân đều là các chất chuyển hoá tự
nhiên.


- Có tác dụng hỗ trợ trong điều hoà miễn dịch.
- Có thể sử dụng dưới nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt,
màng, tấm xốp (scaffolds), bông, sợi và gel [3], [26].
1.2.

Tổng quan về nano chitosan

Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet. Chitosan
nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng đi qua màng tế bào, có diện tích
bề mặt lớn và mang điện nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc,
mang vacxin, trong công nghệ sinh học được dùng làm vector chuyển gen.
1.2.1

Các phương pháp tạo hạt nano chitosan

Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo chitosan nanoparticles. Theo Sulnin (2004)
có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ
tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt (coacervation) trong NaOHmethanol, phương pháp sấy phun (dry spraying), phương pháp tạo gel ionic (ionic gel)
trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây (sieving method). Trong đó phổ
biến nhất là phương pháp tạo hạt gel trong tripolyphosphate [29].
Quan Gan (2005) nghiên cứu các yếu tố ảnh huởng đến kích thước hạt nano
chitosan như nồng độ chitosan, pH dung dịch, tỷ lệ chitosan: tripolyphosphate,... [25].
Anna Vila (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến kích
thước hạt nano [34].

Ngoài ra, còn nhiều nghiên cứu khác của Ming Lang Tsai (2008), Yavuz (2007),
Jing Mou Ju (2008),...
1.2.1.1.
Phương pháp tạo hạt nano chitosan bằng liên kết cộng hoá trị
Ohya đã nghiên cứu tạo hạt nano chitosan để nhốt thuốc chống ung thư 5- FU
bằng cách cho dung dich chitosan khâu mạch cộng hóa trị với glutaraldehyde. Nhóm
kép -CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm - NH 2 của chitosan để khâu mạch
(cross - linking) tạo hạt nano chitosan. Phương pháp này có ưu điểm là kích thước và
tính chất hạt nano rất ổn định [14].


1.2.1.2.

Phương pháp tạo gel ion

Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan điện tích dương và
TPP, polyacrylic axit, polyaspartic, plasmid DNA (pDNA) mang điện tích âm. Để tạo
hạt nano chitosan - TPP : dung dich chitosan được hỗn hợp với TPP sau đó khuấy từ
10 - 60 phút sẽ thu được hạt nano chitosan. Có thể li tâm 15000 vòng/ phút trong 1 giờ
để thu được hạt nano chitosan nanoparticles.
Quan Gan (2005) nghiên cứu tạo hạt chitosan nanoparticles trong TPP với nồng
độ chitosan khác nhau, khối lượng phân tử chitosan khác nhau và tỉ lệ chitosan/TPP
khác nhau. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử và nồng độ chitosan càng lớn thì kích
thước hạt chitosan nanoparticles cáng lớn. Thí nghiệm cho thấy tỉ lệ chitosan/TPP
càng lớn thì kích thước hạt chitosan nanoparticles càng lớn. pH cũng có những ảnh
hưởng nhất định đến kích thước hạt, pH thích hợp nhất để tạo hạt là 5,5 [25].


Hình 1.2: Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion.
1.2.1.3.

Phương pháp tạo giọt coasecva ( phương pháp kết tủa )

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch có
pH kiềm tính. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva ngay khi dung dịch
chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH Methanol ethanediamine. Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung
dịch kiềm để tạo hạt nano như hình .
Phương pháp này có thể được cải tiến hơn bằng cách nhỏ giọt dung dịch sodium
sulfate vào dung dịch chitosan (pH axit) trong điều kiện khuấy nhẹ có tác động của sóng
siêu âm (ultrasonic). Hạt nano được thu bằng cách li tâm, sau đó tiếp tục bước làm cho
cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde.


Hình 1.3: Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa.
1.2.1.4.

Phương pháp sấy phun (Spray- drying)

Sấy phun là kĩ thuật thường ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm để tạo bột, tạo
hạt thực phẩm như sữa, tạo bột thuốc với tá dược. Kĩ thuật này dựa trên nguyên tắc
huyền phù được làm khô khi được phun trong dòng khí nóng.
Chitosan được hòa tan thành dung dịch, dược phẩm được hòa tan vào dung dịch
chitosan, sau đó được bổ sung hoạt chất khâu mạch và được phun vào dòng khí nóng
như sơ đồ hình 1.4 [25].


Hình 1.4: Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp sấy phun
1.2.1.5.

Phương pháp tạo mixel ngược pha

Trong phương pháp này, các chất hoạt động bề mặt được hòa tan trong dung
môi hữu cơ để tạo hệ mixel ngược pha. Sau đó, dung dịch chitosan được thêm vào và
khuấy đều để tránh bị đục, thêm dung dịch chất khâu mạch. Tiếp tục khuấy đều qua
đêm. Sau đó cho bay hơi dung môi hữu cơ và chất hoạt động bề mặt được kết tủa
bằng muối, cuối cùng hỗn hợp được li tâm và thu được hạt nano như trong hình
1.5[25].


Hình 1.5 : Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp mixel ngược pha
Ngoài ra hạt nano chitosan khi phối hợp với polyethylene glycon (PEG) hoặc
được phủ một lớp alginate sẽ tăng hiệu quả vacxin viêm gan B qua đường uống (Boges,
2007) [11]. Kích thước hạt nano nằm trong khoảng 100nm. Sarmento (2006) cũng sử
dụng phương pháp này để nhốt hormone insulin.
1.3.

Một số ứng dụng của chitosan, nano chitosan trong y học

Chitosan với những đặc tính ưu việt, là sản phẩm tự nhiên, không độc, có khả
năng phân hủy sinh học. Đồng thời Chitosan còn có các hoạt tính sinh học cao như kích
thích hệ thống miễn dịch của tế bào, giảm cholesterol trong máu, ức chế khối u phát
triển, kháng vi sinh vật....Hayashi nghiên cứu sử dụng chitosan khối lượng phân tử thấp
ứng dụng điều trị béo phì và tiểu đường typ 2. [13]. Trong những năm gần đây nhiều
nghiên cứu chế tạo vật liệu chitosan microparticles, nanoparticles, chitosan
microspheres để làm tăng hoạt tính thuốc, ly giải chậm thuốc, mang thuốc đến tế bào
đích, tăng hoạt tính kháng ung thư, tăng hoạt tính kháng khuẩn, làm vật liệu chuyển gen
và làm tá chất vacxin tăng kích thích miễn dịch.


1.3.1.

Ứng dụng trong li giải chậm thuốc

Xinge Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thụ insulin qua niêm mạc
mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-hạt nano chitosan, kích thước hạt nano là 150-300
nm. Hiệu quả hấp thụ insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-hạt nano chitosan cao
hơn so với PEG-chitosan là 30-40%. Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bề mặt
càng lớn và điện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnh hưởng đến khả
năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi [33].
Sedaghi (2008) nghiên cứu chế tạo trimethyl hạt nano chitosan làm vật liệu ly giải
chậm insulin. Kết quả cho thấy động học ly giải của insulin nhốt trong trimethyl hạt
nano chitosan ổn định và kéo dài hơn [28].
1.3.2.

Hoạt tính kháng khuẩn

Chitosan là một polycation (poly - NH4+), tương tác với thành phần polyanion
trên vách tế bào vi sinh vật, dễ hấp thu trên bề mặt màng tế bào làm rối loạn quá trình
trao đổi chất qua màng hoặc đi vào trong tế bào chất liên kết với DNA, ức chế quá trình
phiên mã, sinh tổng hợp protein, đó là cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan. Tuy nhiên,
vật liệu hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan
thông thường nên hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với chitosan oligomer [26].
Lifeng Qi et al (2005) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để tăng hoạt tính
kháng khuẩn. Hạt nano chitosan được chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel trong
tripolyphosphate (TPP), kích thước hạt khoảng 30-50nm. Các thử nghiệm trên 4 loại vi
khuẩn E. coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thấy hoạt tính kháng
khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan polymer. MIC (nồng độ tối thiểu ức chế) của
hạt nano chitosan là 1/8-1/32 microgam/ml so với chitosan polymer là 8-16
microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 1-4 microgam/ml [20].
Tikhonov (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của chitosan

khối lượng phân tử thấp (4,7kDa) và chitosan cải biến. Kết quả cho thấy chitosan có
khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn thấp. Ở nồng độ 1% chitosan
(4,7kDa) tỉ lệ chết của E.coli là 91.6% [32].


Nguyễn Anh Dũng (2004) nghiên cứu khả năng kháng E.coli của chitosan,
chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn salicylic aldehyde đã
làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần. Chỉ số MIC của chitosan đối với
E.coli

khoảng

250ppm,

oligoglucosamine

khoảng

80-100ppm

và

salicyden

oligoglucosamine (SO) chỉ còn 30-40ppm [2].
1.3.3.

Hoạt tính kháng ung thư

Hạt nano chitosan đang được nghiên cứu để chống ung thư hiệu quả hơn. Mitra

(2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine làm giảm tác dụng phụ của
thuốc tăng hiệu quả điều trị để ức chế khối u trên chuột. Kết quả cho thấy nếu tiêm
doxorubicine độc lập thì khối u ở chuột vẫn tăng lên 900 mm 3 sau 50 ngày và chết,
trong khi đó ở thí nghiệm ly giải chậm doxorubicine trong hạt nano chitosan kích thước
khối u giảm chỉ còn 170 mm3 và chuột vẫn sống khi 90 ngày thí nghiệm [22].
Lifeng Qi (2004) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nano
chitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính cảm
ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S180 và hepatoma H22. Kết quả
cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống 2.5 mg/kg hạt nano
chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0.5mg/kg là 43-53%, trong khi đó
chitosan chỉ là 30% [20].
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả
kháng ung thư càng cao. Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano chitosan làm tá
chất cho thuốc chống lại tế bào đích ung thư. Kích thước hạt nano khoảng 350 nm. Hiệu
quả chống ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở
chuột A549 đồng thời làm giảm độc tính của thuốc chống ung thư [3].
1.3.4.

Ứng dụng làm tá chất cho vacxin

Nhờ đặc tính không độc, không gây phản ứng phụ, có khả năng kích thích hệ
thống miễn dịch của tế bào mà chitosan và đặc biệt là hạt nano chitosan được tập trung
nghiên cứu làm tá chất cho vacxin. Shibata (1996) chứng minh các hạt chitin và
chitosan có khả năng cảm ứng tăng tổng hợp interferon và đại thực bào. Nhiều tác giả


đã khẳng định khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể phụ thuộc rất nhiều
vào mức độ deacetyl hóa, khối lượng phân tử và nhóm thế trên chitin, chitosan [3].
Van der Lubben (2001) nghiên cứu sử dụng chitosan và dẫn xuất của nó làm tá
chất cho vacxin qua niêm mạc mũi. Nhờ có kích thước nanomet và tích điện tích dương

nên chitosan dễ dàng đi qua tế bào biểu mô vào trong tế bào và thải chậm vacxin để
kích thích miễn dịch. Do có khả năng thải chậm (slow release) nên đáp ứng miễn dịch
sẽ kéo dài và ổn định hơn [15].

Maletter (1984) đã chứng minh trong invivo một số dẫn xuất của chitin có khả
năng tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch. Nghiên cứu cho thấy chitin có mức
độ deacetyl hóa 70% kích thích miễn dịch trung gian tế bào và tăng cường hình thành
kháng thể đặc hệu ở các thí nghiệm trên chuột nhắt và trên chuột lang [21].
Illum (2001) nghiên cứu cho thấy chitosan như là một tá chất mới cho vacxin. Kết
quả đáp ứng miễn dịch ở lô thí nghiệm kháng nguyên cúm là rất thấp, chỉ số IgG chỉ là
102 trong khi ở tá chất chitosan là 10 3 ở lần chủng thứ nhất. Ở lần nhắc hai, đối chứng
antigen là 102 và tá chất chitosan là 105 [18].
Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan làm tá chất cho vacxin uốn
ván qua niêm mạc mũi. Kích thước hạt nano là 350 nm, điện tích là +40mV, có hiệu
suất mang vacxin là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử dụng hạt nano chitosan
cao gấp 5 lần so với sử dụng kháng nguyên uốn ván tự do sau 2 tuần, tăng gấp 15 lần
sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần. Kháng thể đặc hiệu ở thí nghiệm sử dụng hạt nano


chitosan cao hơn so với đối chứng gấp 2.5 lần và tăng lên theo thời gian từ 2-24 tuần
[34].
Maryan Amadi (2007) nghiên cứu sử dụng Trimethyl hạt nano chitosan làm tá
chất cho vacxin cúm A/H3N2. Kết quả là các chỉ số miễn dịch HI, IgG ở thí nghiệm
Trimethyl hạt nano chitosanlà 103 và 105 cao hơn kháng nguyên trong đệm PBS là
0.8.102 và 103, và chỉ số IgG trong thí nghiệm sử dụng Trimethyl hạt nano chitosan cao
hơn 102 lần so với tá chất là dung dịch Trimethylchitosan [10].
Olga Borges (2007) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan- alginate để bọc vacxin
viêm gan siêu vi B qua đường uống. Đáp ứng miễn dịch trên chuột ở các lô thí nghiệm
sử dụng hạt nano chitosan- alginate thể hiện qua các chỉ tiêu IL2, CD4, CD8, tế bào B
cao hơn so với các nhóm đối chứng [23].

Kapil Khatri (2007) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan làm tá chất hấp phụ
Plasmid DNA gây miễn dịch theo đường niêm mạc mũi chống lại viêm gan siêu vi B.
Kết quả cho thấy vacxin pDNA hấp phụ hạt nano chitosan được bảo vệ chống lại sự
phân hủy của nuclease và tăng hiệu quả truyền nhiễm của nó.
Huyết thanh kháng HbsAg và kháng thể IgA trong các nhóm chuột sử dụng vacxin có tá
chất hạt nano chitosan cao hơn các nhóm chuột không có tá chất và sử dụng tá chất
nhôm [17].
Worawan Boonyo (2007) nghiên cứu sử dụng chiotosan với các khối lượng phân
tử khác nhau và triethyl chitosan chloric (TMC) làm tá chất cho ovalbumin gây đáp ứng
miễn dịch trên chuột theo đường mũi. Kết quả cho thấy ở ngày thứ 13 sau tiêm,
chitosan với khối lượng phân tử lớn có khả năng tạo kháng thể IgG cao hơn chitosan có
khối lượng phân tử nhỏ. Mức độ DQ cũng ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch,
TMC-40 (DQ=40%) tạo IgG cao hơn TMC- 20(DQ=20%) và TMC-60(DQ=60%) [37].
Peter G. Seferian (2000) nghiên cứu các công thức tá chất có chứa chitosan cho
vacxin tái tổ hợp. Kết quả cho thấy gây miễn dịch với các công thức tá chất có chứa
chitosan ( ZCP và ECC) kháng thể IgG tạo thành gấp 10 2 lần so với việc tiêm chủng


không sử dụng tá chất (trong dung dịch PBS). Đồng thời đáp ứng miễn dịch kéo dài tới
181 ngày [24].
S. Rajesh kumar (2007) nghiên cứu hạt nano chitosan mang vacxin DNA theo
đường uống chống lại vi khuẩn V. anguillarum ứng dụng trong ngành nuôi trồng thủy
sản. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng vacxin bao bọc bằng hạt chitosan cho cá ăn thì ở
nhóm này khi thử thách với vi khuẩn V. anguillarum tỉ lệ sống là 46% [30].
Lê Văn Hiệp, Nguyễn Anh Dũng (2008) nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer
(dp=8-16) làm tá chất cho vacxin cúm A/H5N1 kết quả cho thấy rằng chitosan oligomer
đã kích thích đáp ứng miễn dịch sớm và tăng cường kháng thể đặc hiệu cúm A/H5N1
[19].
Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam chưa có các nghiên cứu sử dụng hạt
nano chitosan làm tá chất cho kháng nguyên cúm A/ H1N1.

1.4.

Virus cúm và vacxin [1],[6],[8],[43],[7]


1.4.1.

Bệnh cúm

Bệnh cúm (influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính đường hô hấp gây ra do
các týp của virus cúm. Hàng năm tỉ lệ nhiễm cúm trung bình trên thế giới là 5% - 15%
dân số. Bệnh có thể gây thành đại dịch ảnh hưởng tới 50% dân số trên toàn cầu và mỗi
người trong đời mình có thể mắc đi mắc lại nhiều lần.
Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là tác nhân gây bệnh cúm. Virus cúm gồm
3 týp A, B, C khác nhau ở kháng nguyên bề mặt, trong đó týp A là tác nhân chủ yếu gây
đại dịch cúm. Týp B và C thường gây bệnh nhẹ và lẻ tẻ.
Bệnh cúm A/H1N1 là do virus cúm týp A gây ra.Virus cúm týp A thuộc chi
influenza, V irion có vỏ đa hình thường có hình cầu với cấu trúc xoắn đường kính 80120nm nhưng đôi khi cũng thấy ở dạng sợi dài đến vài ^m. Virus týp A có genom gồm 8
đoạn ARN đơn, (-). Trong virion có chứa enzyme ARN- polymerase phụ thuộc ARN,
enzyme này cần cho quá trình phiên mã genom là ARN chuỗi (-). Protein capsit với
ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn.

Hình 1.6 : Cấu tạo của Virus cúm typ A
Nucleocapsit được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: Matrix). Phía ngoài
màng được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất
của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion,
làm cho pH trong các endosom thay đổi.


Bề mặt virus có 2 loại gai nhô ra: Hemaglutinin (H) và neuraminidase (N). Gọi

là hemaglutinin vì virus gây ngưng kết hồng cầu một số loài động vật máu nóng. Gai H
dài khoảng 10nm gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau gộp lại. Mỗi tiểu đơn vị
cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptit kí hiệu là HA1 và HA2, gắn với nhau bởi cầu nối
disunphua. Trong hạt virus, phân tử hemaglutinin gắn vào màng lipit của vỏ ngoài ở
vùng kị nước, phía đầu -COOH của HA2 epitop của kháng nguyên HA rất dễ bị thay
đổi do luôn có sự thay đổi trong ARN genom, làm thay thế acid amin tại một số vị trí
trên phân tử HA1. Sự thay đổi này nằm ở vị trí gắn hemaglutinin vào thụ thể của tế bào.
HA chứa peptit dung hợp khi ở pH trung tính nó vùi vào trong gai, nhưng ở pH thấp thì
peptit lại nhô ra ngoài. Các peptit dung hợp tại lỗ, lồng vào lớp lipid kép của màng tế
bào chủ và vỏ ngoài của virus dung hợp với nhau.
Xen giữa các gai H là các gai N hình nấm. Đầu gai có hình hộp do 4 tiểu đơn vị
gần như hình cầu giáp nối với nhau mà thành. Đầu được nối với cuống chứa vùng kị
nước, nhờ thế mà gai N cắm sâu vào vỏ ngoài của virus.
Thụ thể của tế bào dành cho hemaglutinin có cấu tạo từ axit sialic (còn gọi là
neuraminic) liên kết với gốc đường trong bằng cầu nối glycozit. Enzym neuraminidaza
(silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhày đường hô hấp bằng cách cắt liên kết glycozit,
giải phóng axit neuraminic. Động tác này cho phép virus đi qua màng nhày và thoát
khỏi các ức chế “không đặc hiệu”. Neuraminidase cũng phá hủy thụ thể dành cho
hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù tế bào này không phải là đối tượng gây
nhiễm. Neuraminidase cũng tham gia vào khâu cuối, giải phóng virus ra khỏi tế bào.
1.4.2.

Đặc điểm lý hóa của virus cúm typ A

Vỏ ngoài virus là một lớp lipid kép nên dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan
lipid (như ete, desoxycholat, formol...) pH thích hợp là 6.5 -7.9. Ở pH acid hay quá
kiềm thì khả năng gây nhiễm giảm.
Ở 56-60oC virus chỉ bị mất độc tính trong vòng mấy phút nhưng khả năng
ngưng kết hồng cầu vẫn còn. Ở nhiệt độ phòng virus có thể tồn tại trong 2 tháng. Khi
nuôi trong túi niệu phôi gà nếu ở 4oC virus có thể tồn tại trong mấy tháng. Khi bảo quản

trong ống nghiệm ở -70 oC thì giữ được hàng năm mà hiệu giá không giảm. Tia tử ngoại
có thể gây bất hoạt virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên.
Sợi ARN của virus cúm A gồm 13500 gốc bazơ và virus cúm B là 6200 bazơ
được chia thành 8 phần và tên của chuỗi polypeptide được tổng hợp nên từ 8 phần đó
được ghi ở bảng sau
Bảng 1.1: Protein của virus cúm[6]
Đoạn
ARN

Protein

trí
Khối Vị
lượng trong
phân Virion

Tỷ lệ % so
Chức năng

cả hạt

tử
PB2

0,87

Giữa Phiên mã ARN

1

16

NP

50-60

Giữa

4

2

PB1

0,96

PA
M1

0,85
0.28

HA1

47.5

7
3

Cấu trúc dưới đơn
vị nucleocapsit

NA

trúc

Dưới lớp Thành phần cấu

38
1

Protein
trúcmãcủa
Kéo dàicấu
phiên

lipid kép
Gai
vỏ ngoài

25

11-15 Xuyên

48-63

Protein
phiên mã cấu

nucleoprotein
Protein gắn mũ

trúc chính

Gai

nucleoprotein
Glycoprotein gai H
xoắn

Gắn vào receptor

chuyển hóa thành

của tế bào. Dung

HA1 và HA2

hợp vỏ ngoài với
Kênh ion
endosom

Protein cấu trúc .

màng
5

Polymer khởi đầu

1

4
M2

Ghi chú

với protein

Thay
Neuraminidaza

30

đổi

pH

endosom
bị phong
Neuraminidaza
bế bởi amantadin

NS1

0,25

Giữa

ức chế vận

Vệt
Proein không cấu

chuyển mARN

trúc với chức năng
8

chưa rõ ràng
NS2

0,13

Chưa rõ

Vệt


1.4.3

Đặc điểm di truyền của virus cúm A/H1N1

Tại phòng thí nghiệm của CDC (Atlanta, Mỹ) các nhà khoa học đã giải trình tự
gen của 49 chủng virus H1N1 đã được phân lập.
Virus có sự đồng nhất các gen cao 99-100%. Điều này chứng tỏ rằng, dịch bùng
phát là do một tác nhân gây bệnh đó là virus H1N1. Kết quả phân tích gen của virus cho
thấy, 6 gen của virus H1N1(PB2, PB1, PA, HA, NP, và NS) tìm thấy ở các chủng phân
lập từ virus cúm lợn ở Bắc Mỹ trong thời gian từ 20052008. các gen mã hóa
Neuraminidase (NA) và M giống với các đoạn trong bộ gen của virus cúm lợn H1N1

dòng châu Âu và châu Á. Virus cúm A/H1N1 chứa các gen HA và NP, NA, M và NS
của virus cúm lợn H1N1 đặc trưng cho vùng Bắc Mỹ, gen PB2 và PA của virus cúm gia
cầm và gen PB1 của virus cúm người.
Ngoài ra, virus mới H1N1 khác về cấu trúc kháng nguyên - hemaglutinin H1. So
sánh trình tự Hemaglutinin của các virus đó cho thấy có sự khác biệt trong sự thay đổi
của 30 axit amin. Sự khác biệt của HA1 và cúm mùa là sự thay đổi của 5 nucleotid và 4
axit amin.
Neuraminidase của virus cúm A/H1N1 đồng nhất với Neuraminidase của virus
cúm lợn dòng châu Âu và dòng châu Á. Ngoài ra virus cúm A/H1N1 chứa
Neuraminidase của virus H1N1 dòng Bắc Mỹ. NA của hai dòng virus H1N1 này khác
nhau về sự phân ly và chứa 77 sự thay đổi axit amin.
Các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu độ nhạy của virus đối với các chất gây ức
chế Neuraminidase. Hai loại virus đầu tiên có độ nhạy cao đối với các chất gây ức chế
Neuraminidase như Ozeltamivir và Relenza. Cả gen NA và gen M của virus cúm
A/California/04/2009 có độ đồng nhất cao so với gen M của virus cúm lợn dòng châu
Âu và châu Á. Như vậy, gen M của virus cúm A/H1N1/2009 cũng thuộc gen virus cúm
lợn. Kết quả phân tích cấu trúc của gen M2 cho thấy trong màng vận chuyển của protein
này có hai đột biến ở vị trí val28lei và ser31Asn. Đột biến này làm tăng tính kháng
thuốc và đột biến ở vị trí 31 không bền vững nên có thể quay lại týp hoang dại.