Nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ lò graphit (GHA AAS) để định lượng chì (pb) trong máu và nước tiểu 2008 (tt)

Đặt vấn đề
Ngày nay, con ngời ngày càng nhận thức đợc ảnh hởng to lớn của sự ô
nhiễm các kim loại nặng mặc dù ở lợng rất nhỏ. Đó là một trong những mối nguy
hiểm tiềm tàng trong môi trờng sống.
Mức độ sử dụng các hoá chất nói chung và các kim loại nặng nh chì (Pb)
ngày càng tăng là điều không thể tránh khỏi trong thời kỳ công nghiệp hoá hiện đại
hoá đất nớc. Tuy nhiên, trong quá trình khai thác, chế biến, sử dụng các kim loại
ngoài giá trị to lớn về kinh tế đồng thời cũng gây ra những tác hại đáng kể đối với
sức khoẻ con ngời. Những ngành sản xuất sử dụng chì nh khai khoáng, luyện
kim, đúc, chất dẻo, sản xuất ắc quy chì, hàn điện cực, pha chế sơn vecni, mực in, đồ
gốm[10] đã dẫn đến ô nhiễm trầm trọng môi trờng lao động và môi trờng sống,
làm ảnh hởng sâu sắc đến sức khoẻ công nhân cũng nh ngời dân sống ở các khu
vực quanh các cơ sở sản xuất.
Tỷ lệ ngời bị nhiễm độc chì ngày càng gia tăng đòi hỏi phải có những
phơng pháp xét nghiệm chính xác, với độ nhạy cao, thời gian phân tích nhanh và có
thể phân tích hàng loạt để giúp cho việc theo dõi chẩn đoán sớm các trờng hợp
nhiễm độc. Việc định lợng Pb đợc thực hiện trớc đây tại Phòng TN Sinh hoá Huyết học BNN chủ yếu là sử dụng máy cực phổ xung vi phân. Phơng pháp này có
u điểm là giới hạn phát hiện thấp, độ nhạy cao, độ chọn lọc cao và lợng mẫu cần
dùng để phân tích nhỏ. Tuy vậy, sử dụng phơng pháp này, ngời phân tích phải tiếp
xúc với thuỷ ngân, nguyên tố có khả năng bay hơi ngay cả ở nhiệt độ phòng. Đồng
thời, việc loại các yếu tố nhiễu còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là đối với các mẫu
có thành phần phức tạp nh mẫu máu và nớc tiểu.
ở Việt nam, việc nghiên cứu bệnh nhiễm độc chì đã đợc tiến hành từ những
năm 1960. Từ trớc tới nay trong các phòng thí nghiệm ở Việt nam thờng định lợng
chì trong máu và nớc tiểu bằng phơng pháp trắc quang, cực phổ sóng vuông, cực phổ
xung vi phân.
Trong đề tài này, chúng tôi chọn nghiên cứu ứng dụng QPHTNT tử kỹ thuật lò

graphit để định lợng một số kim loại nặng bớc đầu là Pb. Do những u điểm đáng
kể của phơng pháp có độ nhạy, độ chính xác, độ chọn lọc, ít bị ảnh hởng bởi các

1


yếu tố gây nhiễu nh Zn, Cu, Cd lợng mẫu sử dụng ít, thời gian phân tích nhanh,
phân tích hàng loạt rất thuận lợi để đa phơng pháp này vào ứng dụng thực tế là bảo
vệ, chăm sóc sức khoẻ ngời lao động cũng nh cộng đồng.
Mục tiêu nghiên cứu
1. Xác định các điều kiện xử lý mẫu máu, nớc tiểu và quy trình phân tích Pb
trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử lò Graphit
2. Khảo sát hàm lợng Pb trong máu và nớc tiểu của ngời bình thờng bằng
Quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật lò Graphit để lấy giá trị tham khảo.

2


Phần 1
Tổng quan ti liệu
1.1.

Đại cơng về tính chất hoá lý của chì
Chì là kim loại có trong tự nhiên, màu xám xanh đợc tìm thấy một lợng

nhỏ (1. 10-4%) trong vỏ của trái đất. Chì không mùi, không vị, không tan trong nớc,
không đốt cháy đợc. Chì nóng chảy ở 3270C, sôi ở 15150C, nhng từ khoảng 550
600 0C chì đã bay hơi [7]. Chì có thể kết hợp với một số chất hoá học khác để tạo
thành muối chì. Một số muối chì hoà tan đợc trong nớc. Càng dễ hoà tan bao
nhiêu, chì càng độc bấy nhiêu [9].

1.2. ảnh hởng của chì tới sức khoẻ
Chì có tự nhiên trong môi trờng, tuy nhiên ô nhiễm chì đợc tìm thấy đều
xuất phát từ các hoạt động của con ngời. Chì đợc sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp, khai khoáng, luyện kim, đúc, chất dẻo, sản xuất ắc quy chì, hàn điện cực,
pha chế sơn vecni, mực in, đồ gốm, sản xuất vũ khí và các vật liệu tấm lợp... Chì còn
đợc sử dụng rộng rãi trong các thiết bị Y học (tấm chắn phóng xạ, bộ phận cách
điện, máy bơm tĩnh mạch, một số dụng cụ trong phẫu thuật), các thiết bị điện tử, và
thiết bị quân sự. Trớc khi việc sử dụng xăng pha chì (chì hữu cơ) bị cấm thì một
lợng lớn chì đợc giải phóng vào không khí là từ khí thải ô tô. Ngoài ra còn có
những nguyên nhân khác dẫn tới sự có mặt của chì trong không khí: đốt nhiên liệu
(dầu, than), các chất thải rắn...
Năm 1976, nhiễm độc chì đã đợc đa vào danh mục 8 bệnh nghề nghiệp
đợc bảo hiểm đầu tiên của Việt Nam và tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm độc chì nghề
nghiệp đã đợc đa thành tiêu chuẩn chẩn đoán ngành, ban hành theo quyết định
424-BYT/QĐ - 16/5/1985 [11].
Các đờng xâm nhập: Chì xâm nhập vào cơ thể qua 3 con đờng: đờng tiêu
hoá, hô hấp, qua da.
Độc hại cấp tính: Nhiễm độc chì vô cơ cấp tính xảy ra khi hấp thu vài mililit
axetat chì. Tử vong trớc ngày thứ t hoặc nếu khỏi thì thời gian hồi phục kéo dài.
Đối với chì hữu cơ thờng gặp các biểu hiện nhiễm độc kiểu viêm não. Bệnh não do
chì hữu cơ tiên lợng xấu, phần lớn tử vong. Một số trờng hợp khỏi thì tiên lợng
rất xấu[ 6].
3


Sự tích luỹ chì trong cơ thể:
Sự phân bố chì trong cơ thể không đồng đều. Sau khi đợc hấp thu vào máu
chì đợc vận chuyển tới các mô nh gan, thận, não, lách, xơng. Chỉ 20 giờ sau khi
xâm nhập vào cơ thể 70 - 90% lợng chì đợc tích luỹ vào xơng, xơng là kho dự
trữ và từ các kho tích luỹ này, chì có thể bài tiết ngợc vào máu [32]

Tác động đặc hiệu của chì vô cơ trong cơ thể là lên cơ quan tạo máu. ở tuỷ
xơng chì gây ảnh hởng rất lớn đến chức năng tạo máu của tuỷ xơng cụ thể là quá
trình tổng hợp Hemoglobin, biểu hiện rất sớm [17, 22]. Vì vậy, ở những ngời thấm
nhiễm chì có thể tìm thấy những tổn thơng sinh học trong quá trình tạo máu khá
sớm.
Chì gây rối loạn sinh tổng hợp Hem do tác động vào các phản ứng bằng cách
ức chế hoạt động các enzym. -ALA dehydrase là enzym nhạy cảm nhất và bị ức chế
sớm nhất, đồng thời ức chế luôn cả Hem syntetase làm cho lợng protoporphyrin
IX tăng lên và chính chất này có tác dụng ức chế lại -ALA dehydrase theo cơ chế
ngợc chiều.
Hiện tợng giảm Hemoglobin và gây thiếu máu xuất hiện khi hàm lợng chì
máu ở giới hạn cao (50 80 g/dl) [10, 21]
Hậu quả của sự tác động của chì lên cơ quan tạo máu sẽ dẫn đến
-

Tăng -ALA trong máu và nớc tiểu

-

Tăng Copropophyrin trong máu và nớc tiểu

-

Tăng Protoporphyrin IX trong hồng cầu

-

Hồng cầu non, hồng cầu hạt kiềm xuất hiện

Các triệu chứng lâm sàng

Chì gây suy nhợc thần kinh, viêm não dới dạng động kinh, tổn thơng tiểu
não, rối loạn vận động do viêm đa dây thần kinh vận động. Chì gây tổn thơng các
ống thận, sơ hoá kẽ và lan toả quanh ống thận, gây táo bón, cơn đau bụng chì.
Chì gây rối loạn điều hoà ngoài tim, tăng trơng lực mạch, nhất là mạch não,
tăng huyết áp, gây tổn thơng thần kinh vận mạch, rối loạn tuần hoàn ngoại vi

4


Macur.
ở phụ nữ tiếp xúc với chì có hiện tợng đẻ non, rối loạn chu kỳ kinh nguyệt,
chu kỳ rụng trứng. Đối với nam, chì làm giảm khả năng sinh sản ở nam giới: tinh
trùng yếu, số lợng ít và biến đổi hình dạng. Ngời ta cho rằng chì có khả năng gây
tác hại cả trên bộ máy di truyền, gây rối loạn tổng hợp ADN, sai lạc nhiễm sắc thể
[10, 17, 26]
Đào thải chì ra khỏi cơ thể: Chì đào thải ra khỏi cơ thể bằng nhiều con
đờng khác nhau.
Qua nớc tiểu: Là đờng đào thải chủ yếu, nó cho biết độ lớn của dòng chì
tuần hoàn nếu thận hoạt động bình thờng. Mọi nguyên nhân làm tăng chì máu sẽ
làm tăng thứ phát chì trong nớc tiểu. Ngời ta thấy rằng, mỗi ngày chúng ta chỉ thải
khoảng 0,02% tổng lợng chì có trong cơ thể [10,15].
Qua phân: Một lợng nhỏ chì đào thải ra phân do mật bài tiết ra.
Tóc có thể xem là đờng đào thải chì tự nhiên của cơ thể. Ngoài ra, chì còn
đợc đào thải qua mồ hôi, niêm mạc, sữa và nớc bọt.
Các xét nghiệm đặc trng cho nhiễm độc chì:
Dựa vào các cơ chế tích luỹ, đào thải và gây bệnh của chì, ngời ta đã xây
dựng các phơng pháp chẩn đoán nhiễm độc chì từ những giai đoạn sớm nhằm kịp
thời phát hiện, chẩn đoán, điều trị và giám định bệnh nghề nghiệp
Nghiệm pháp tiếp xúc (xét nghiệm đánh giá sự tiếp xúc)
1. Định lợng chì máu và chì niệu

Nghiệm pháp thấm nhiễm (xét nghiệm đánh giá sự thấm nhiễm)
2. Định lợng acid - aminolevulinic niệu ( - ALA)
3. Xét nghiệm hồng cầu hạt a kiềm
Chỉ điểm sinh học: Các mẫu sinh học hiện đang đợc lựa chọn để xét nghiệm
đánh giá sự tiếp xúc, theo dõi và chẩn đoán nhiễm độc chì là nớc tiểu, máu, tóc,
móng [14]. Việc phát hiện sớm bệnh nhiễm độc chì chủ yếu dựa vào các nghiệm
pháp tiếp xúc. Định lợng chì trong máu và nớc tiểu là nghiệm pháp tiếp xúc trực
tiếp.

5


Mẫu máu
Máu l một tổ chức liên kết đặc biệt gồm hai phần l huyết tơng v các
thnh phần hữu hình. Huyết tơng gồm nớc v các chất ho tan, trong đó chủ yếu l
các loại protein, ngoi ra còn có các chất điện giải, chất dinh dỡng, enzym, hormon,
khí v các chất thải. Thnh phần hữu hình là các tế bào, bao gồm tế bào hồng cầu,
bạch cầu và tiểu cầu. Khối lợng máu trong cơ thể chiếm từ 7 đến 9% khối lợng cơ
thể (khoảng 1/13 thể trọng). Trung bình ngời trởng thành có khoảng 4 đến 5 lít
máu. ở nam giới lợng máu nhiều hơn ở nữ giới [5].
Lợng máu thay đổi theo trạng thái sinh lý của cơ thể: Lợng máu tăng sau
bữa ăn và khi mang thai, lợng máu giảm khi đói và khi cơ thể mất nớc. Trạng thái
sinh lý bệnh thờng có khoảng 1/2 lợng máu lu thông trong mạch , còn 1/2 dự trữ
trong các kho chứa (lách: 16%, gan 20%, dới da 10%). Khối lợng máu giảm đột
ngột sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng vì lm cho huyết áp giảm nhanh.
Việc phân tích hàm lợng chì trong mẫu máu có vai trò rất quan trọng trong
chẩn đoán lâm sàng, hàm lợng chì trong mẫu máu phản ánh một cách trực tiếp
lợng chì đa vào cơ thể.
Năm 1975, Grinffin đã nghiên cứu trên các nữ thanh niên tình nguyện tiếp
xúc với chì trong không khí 23 giờ/ngày trong vòng 3-4 tháng, kết quả cho thấy

lợng chì trong máu là 20g/dl, 27g/dl và 37g/dl tơng ứng với mức tiếp xúc ở
ngỡng 3,2g/m3, 10,9g/m3 chỉ sau 5 tuần tiếp xúc [27].
Theo báo cáo của Cools (1976) thì ngỡng chì máu trung bình của ngời
không có tiếp xúc nghề nghiệp là 17,2g/dl [20].
Năm 1988, Nguyễn Thị Xuân Thuỷ đã tiến hành định lợng chì trong máu
của 30 ngời khoẻ mạnh trên máy cực phổ sóng vuông cho kết quả: hàm lợng chì
dao động từ 9,76 - 37,76g/dl. Hàm lợng chì máu trung bình : 18,64g/dl [8]. Tất
cả số mẫu đều chứa hàm lợng chì dới 40 g/dl.
Vũ Khánh Vân đã xác định hàm lợng chì huyết trung bình của 200 ngời
không tiếp xúc với chì bằng phơng pháp cực phổ xung vi phân cho kết quả hàm
lợng chì trung bình là 2,06 1,05 g/dl [13].

6


Mẫu nớc tiểu
Nớc tiểu là một thành phần đợc tạo ra bởi quá trình bài tiết với mục đích
đào thải các chất cặn bã, các chất thừa.. ra khỏi cơ thể, giúp cho cơ thể đào thải các
chất độc và cân bằng nội môi. Nớc tiểu đợc tạo thành ở nephron - đơn vị chức
năng của thận. Quá trình này bao gồm giai đoạn lọc máu ở cầu thận (nang Bowman)
tạo thnh nớc tiểu đầu. Tiếp theo là quá trình hấp thu lại các chất cần thiết v bi
tiết các chất không cần thiết, tạo thành thnh nớc tiểu chính thức. Nớc tiểu chính
thức đợc đổ vo bể thận, theo ống dẫn nớc tiểu và tích trữ ở bàng quang. Khi đủ
một lợng nhất định nớc tiểu sẽ đợc thải ra ngoi. Mỗi ngày có thể loại ra khoảng
từ 1 đến 2 lít nớc tiểu [5].
Hàm lợng chì trong nớc tiểu phản ánh khả năng tự đào thải chì của cơ thể
và là chỉ số phân tích cận lâm sàng rất quan trọng để theo dõi hiệu quả gây thải chì
trong điều trị nhiễm độc chì.
Theo tiêu chuẩn chẩn đoán năm 1985, giới hạn chì niệu là 80g/24 giờ (phân
tích theo phơng pháp dithizon), trên 80g/24 giờ là có thẫm nhiễm bệnh lý, trên

150g/24 giờ có thể có biểu hiện lâm sàng [10].
1.3. Một số phơng pháp xử lý mẫu trớc khi phân tích
Đối tợng chính của phép đo Quang phổ hấp thụ nguyên tử là phân tích vi
lợng các nguyên tố trong mẫu vô cơ hoặc mẫu hữu cơ. Bất kỳ phơng pháp phân
tích nào cũng cần qua 2 giai đoạn
- Giai đoạn 1: Xử lý mẫu để đa nguyên tố kim loại cần xác định về trạng thái
dung dịch theo kỹ thuật phù hợp để chuyển đợc hoàn toàn nguyên tố đó vào dung
dịch đo phổ
- Giai đoạn 2: Phân tích các nguyên tố dựa trên phổ hấp thụ nguyên tử của
nguyên tố đó trong những điều kiện thích hợp
Trong đó giai đoạn một là rất quan trọng vì xử lý mẫu không tốt có thể dẫn
đến mất nguyên tố phân tích (sai số âm) hoặc nhiễm bẩn mẫu (sai số dơng) làm ảnh
hởng đến kết quả phân tích.

7


Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm ngời ta đã sử dụng các phơng pháp
vô cơ hoá mẫu khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đối tợng mẫu,
điều kiện trang thiết bị... mà lựa chọn phơng pháp xử lý mẫu.
Phơng pháp vô cơ hoá khô
Nguyên tắc: Đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong mẫu bằng nhiệt để giải
phóng kim loại dới dạng oxit hoặc muối của chúng. Sau đó hoà tan bằng axit thích
hợp
Phơng pháp này có u điểm: đơn giản, triệt để nhng lại có nhợc điểm
chính là làm mất mẫu của nguyên tố dễ bay hơi và không áp dụng cho các nguyên tố
có áp xuất hơi cao nh: Cd, As, Hg... thời gian xử lý mẫu kéo dài. Để khắc phục
nhợc điểm này ngời ta thờng cho thêm các hợp chất bảo vệ nh: Mg(NO3)2,
MgO, KNO3, và chọn nhiệt độ thích hợp.
Phơng pháp vô cơ hoá ớt

Nguyên tắc: Dùng axit mạnh (ví dụ HCl, H2SO4 ), hay axit mạnh có tính oxy
hoá (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3, H2SO4), 3 axit (H2SO4, HNO3,
HClO4) để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kjeldahl, trong các
cốc thuỷ tinh (hệ hở). Thời gian xử lý mẫu thờng từ vài giờ đến vài chục giờ [3].
Axit nitric thờng đợc sử dụng nhiều nhất vì nó không tạo thành các muối không
tan trong quá trình vô cơ hoá mẫu nh HCl và H2SO4. Hydroperoxit (H2O2) cũng có
thể đợc thêm vào để tăng khả năng oxy hoá [19]
Đối với mẫu máu, các tác nhân phân huỷ mẫu trong quá trình này gồm: tác
dụng phá huỷ các hạt mẫu của axit đặc và tác nhân phá huỷ mẫu của năng lợng
nhiệt khi đun sôi mẫu. Các tác nhân này bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm
cho các hạt mẫu bị mòn dần rồi tan hết.
Phơng pháp này đơn giản, không đắt tiền, dễ thực hiện, bảo toàn đợc chất
phân tích nhng phải dùng một lợng axit khá nhiều, do vậy yêu cầu các axit phải có
độ tinh khiết cao.
Phơng pháp xử lý mẫu trong lò vi sóng
Nguyên tắc: Đây cũng là kỹ thuật vô cơ hoá ớt, chỉ khác là dùng thêm năng
lợng của vi sóng để xử lý mẫu, thay cho cách đun nóng bình thờng. Hơn nữa, việc
8


vô cơ hoá đợc thể hiện trong bình kín, áp suất cao nên nhiệt độ sôi cao hơn thúc
đẩy quá trình phá huỷ mẫu rất nhanh và đây là tác nhân phá huỷ mạnh nhất. Vì thế
việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (50 70 phút) mà rất triệt để
[3]
Đây là phơng pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, làm giảm đáng kể thời
gian xử lí mẫu, không làm mất mẫu và vô cơ hoá một cách triệt để, đợc thực hiện
trong bình kín và có thể vô cơ hoá đợc nhiều mẫu trong một lần. Tuy nhiên phơng
pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không đủ điều kiện trang
bị.
1.4. Phơng pháp định lợng chì

Trên thế giới đã sử dụng nhiều phơng pháp để xác định chì, tuy nhiên tuỳ
thuộc mục đích, yêu cầu của việc phân tích hàm lợng của chì trong môi trờng mẫu
nào mà lựa chọn phơng pháp phân tích cho thích hợp: Phơng pháp trắc quang,
phơng pháp von-ampe hoà tan, phơng pháp phổ phát xạ nguyên tử hay phổ hấp thụ
nguyên tử (dùng ngọn lửa đèn khí F-AAS hay năng lợng nhiệt của dòng điện ETA
AAS còn gọi kỹ thuật lò Graphit)
Phơng pháp đo màu: Dựa vào khả năng tạo phức màu của nguyên tố cần xác
định với thuốc thử thích hợp và đo màu các phức này trên máy trắc quang, mỗi
nguyên tố ứng với với một bớc sóng nhất định. Phơng pháp này tuy kỹ thuật đơn
giản nhng độ nhạy không cao nên thờng sử dụng khi hàm lợng các kim loại khá
lớn hoặc phải đợc làm giàu trớc.
Đối với định lợng chì, sau khi vô cơ hoá nớc tiểu bằng axit, chì đợc tạo
phức với dithizon để cho dithizonatchì màu đỏ. Chì dithizonat đợc chiết bằng
cloroform ở pH 9 11. Đo màu ở bớc sóng 520nm, độ nhạy của phơng pháp
0,2g/8ml [12]
Phơng pháp cực phổ:
Cực phổ cổ điển: Dựa vào khả năng bị khử của ion Pb2+ trên bề mặt catot giọt
thuỷ ngân ở thế từ -0,45V đến 0,6V. Cờng độ dòng khuếch tán tỉ lệ với nồng độ
ion chì trong dung dịch. Dựa vào đờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ
ion chì và chiều cao sóng cực phổ để tính đợc nồng độ Pb trong mẫu cần đo.

9


Phơng pháp cực phổ xung vi phân: để loại trừ đợc ảnh hởng của dòng tụ
điện, ngời ta phân cực điện cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính và
vào cuối mỗi chu kỳ giọt. Trên khung điện áp biến đổi một chiều, đặt thêm một
xung vuông góc thờng có độ nhạy 10-6 10-7M. Phơng pháp này có u điểm là
giới hạn phát hiện của phơng pháp thấp, độ nhạy cao 10-7 10-8M , độ chọn lọc cao
và lợng mẫu cần dùng để phân tích nhỏ. Tuy vậy, sử dụng phơng pháp này, ngời

phân tích phải tiếp xúc với thuỷ ngân, nguyên tố có khả năng bay hơi ngay cả ở nhiệt
độ phòng. Đồng thời, việc loại các yếu tố nhiễu còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là
đối với các mẫu có thành phần phức tạp nh mẫu máu và nớc tiểu.
Phơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử
Nguyên tắc: Khi chiếu chùm bức xạ có bớc sóng thích hợp vào đám hơi
nguyên tử chứa nguyên tố cần đo thì các nguyên tử tự do của nguyên tố này sẽ hấp
thụ bức xạ để đa nguyên tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. Cờng
độ vạch hấp thụ và nồng độ nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi
tuân theo định luật Lamber Beer.
Kỹ thuật nguyên tử hoá: Để tạo đợc đám hơi nguyên tử tự do từ mẫu phân
tích, ngời ta sử dụng hai kỹ thuật:
- Kỹ thuật nguyên tử hoá bằng ngọn lửa (Flame AAS, F- AAS) sử dụng
nhiệt của ngọn lửa đèn khí để nguyên tử hoá mẫu
- Kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa (Flameless AAS, ETA AAS)
dùng năng lợng của dòng điện công suất lớn và trong môi trờng khí trơ để nung đỏ
tức khắc cuvet làm bằng graphit

10


Phần 2
Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
2.1.

Đối tợng nghiên cứu
Máu và nớc tiểu của 92 ngời khoẻ mạnh sống ở 2 xã Hng Công và Công

Lý Tỉnh Hà Nam với tiêu chuẩn lựa chọn thông qua thăm khám nh sau:
Những ngời khoẻ mạnh, không bị mắc các bệnh mạn tính về gan, thận.
Không sống và làm việc gần nơi khai thác, chế biến, tái sử dụng chì.

Không điều trị bằng các thuốc có chì.
2.2.

Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm
- Nghiên cứu cắt ngang
2.2.2. Phơng pháp nghiên cứu: Thử nghiệm ứng dụng QPHTNT lò graphit
Hoá chất và trang thiết bị
Hoá chất:
- Axit nitric đậm đặc loại PA (HNO3) 65%
- Hydroperoxyt (H2O2) 30% tinh khiết, dùng cho phân tích lợng vết
- Cloroform, Dithizon tiêu chuẩn cho phân tích
- Mẫu chuẩn Pb 1000mg/l của Merck
- Bom khí Argon (Ar) tinh khiết 99,995%
- Dung dịch Modifier
NH4H2PO4

4g

Mg(NO3)2

0,35g

Hoà tan trong 100ml nớc cất
Thiết bị, dụng cụ:
- Bình phá mẫu lò vi sóng loại DAP- 60+ (60ml) bằng Teflon đợc ngâm
trong dung dịch axit HNO310% một ngày, sau đó tráng rửa sạch bằng nớc cất 2
lần.

- Chai, lọ đựng thuốc thử, pipet các loại ợc ngâm rửa bằng dung dịch axit
HNO3 10%.
- Tuýp thuỷ tinh Schott Duran đợc ngâm qua đêm bằng dung dịch axit HNO3
11


10% rồi rửa bằng nớc cất 1 lần, sau đó đổ tiếp dung dịch axit HNO3 10% sạch tói
khoảng 2/3 ồng nghiệm đem đun cách thuỷ sôi trong 5 giờ. Để nguội, xúc rửa ổng
nghiệm bằng nớc cất 1 lần cho tới hết axit rồi tráng rửa lại bằng dung dịch
dithizon cloroform 2 3 lần, sau đó tráng bằng cloroform sạch.
Thiết bị
- Máy Quang phổ hấp thụ nguyên tử HGA Graphite Furnace - AAnalyst
700 của PerkinElmer - USA
- Lò vi sóng Speedwave MWS-3+ của Berghof - Đức
- Lò vi sóng MS 500 Canada
- Bếp ủ phá mẫu LAB-LINE
- Tủ hút
- Cân phân tích điện tử
- Tủ sấy
- Cuvet graphit hoạt hoá 100%
Lấy mẫu, bảo quản mẫu:
- Thu nớc tiểu bãi buổi sáng vào lọ nhựa sạch (100ml), bảo quản nớc tiểu
bằng 3- 5 giọt HNO3 đặc
- Lấy máu tĩnh mạch: 2ml máu đợc đựng trong tuýp nhựa đã đợc làm sạch
và khử trùng có chứa sẵn chất chống đông (EDTA hoặc heparin). Lắc nhẹ nhàng để
trộn đều máu và chất chống đông.
- Bảo quản mẫu máu ở 4oC. Mẫu ổn định trong vòng 3 tuần khi đợc bảo
quản lạnh.
Phơng pháp xử lý mẫu
Xử lý mẫu máu:

Quy trình xử lý mẫu máu đợc đợc tiến hành nh sau: Lấy 1ml mẫu máu
vào bình Teflon, thêm 9 ml axit HNO3 đặc, lắc nhẹ và đun trên bếp điều nhiệt ở nhiệt
độ 100oC -150oC trong 10 phút, sau đó để nguội, lắp màng và nắp bảo vệ, bình phá
mẫu đợc đa vào lò vi sóng với chơng trình nhiệt độ sau:

12


Chơng trình nhiệt độ của lò vi sóng xử lý mẫu máu
100
135
185
100

Nhiệt độ (0C)

Thời gian gia nhiệt (phút)

5

1

1

1

Thời gian duy trì nhiệt (phút)

5

5

5

5

Sau khi xử lý mẫu bằng lò vi sóng, mẫu đợc để nguội đến nhiệt độ phòng,
thêm 5 ml H2O2 và đun trên bếp điều nhiệt ở 100 - 150oC trong 30 phút sau đó để
nguội và định mức đến 25 ml bằng axit HNO3 0,2 %.
Xử lý mẫu nớc tiểu:
Lấy 3ml nớc tiểu vào bình xử lý mẫu (Teflon 40 bar, 60ml). Thêm 7 ml
HNO3 đặc, sau 10 phút thêm 1ml H2O2. Để yên ít nhất 30 phút, lắc nhẹ nhàng, đậy
các nắp của bình xử lý mẫu. Lắp các bình trên vào lò vi sóng, xử lý mẫu theo chơng
trình nhiệt độ sau:
Chơng trình nhiệt độ của lò vi sóng xử lý nớc tiểu
Nhiệt độ (0C)

120

150

180

100

Thời gian gia nhiệt (phút)

5

1

1

1

Thời gian duy trì nhiệt (phút)

5

10

10

5

Sau khi xử lý mẫu bằng lò vi sóng, mẫu đợc để nguội đến nhiệt độ phòng.
Chuyển mẫu sang tuýp đã đợc xử lý, tráng bình phá mẫu bằng 3 ml H2O2, đun nhẹ
trên bếp điều nhiệt ở từ 100 - 150oC trong 30 phút trong tủ hốt. Định mức đến 20ml
bằng nớc cất 2 lần và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật lò Graphit.
Chế độ đo mẫu trên máy Quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật lò Graphit
Nguồn đèn: HCL
Cờng độ dòng đèn: 4mA
Bớc sóng: 283,3 nm
Khe đo : 0,7nm
Khí môi trờng: Argon
Số lần lặp lại trong một phép đo: 3
Cuvet graphit: hoạt hoá 100%
Thể tích mẫu đo: 50 àl
Thể tích Modifier: 5 àl

13


Chơng trình nguyên tử hoá đo mẫu máu
Nhiệt độ (0C)

Thời gian (giây)

Sấy mẫu

120

50

Tốc độ dẫn khí
(ml/phút)
250

Tro hoá

750

30

250

Nguyên tử hoá

1800

3

0

Làm sạch

2600

7

250

Giai đoạn

Chơng trình nguyên tử hoá đo mẫu nớc tiểu
Nhiệt độ (0C)

Thời gian (giây)

Sấy mẫu

120

90

Tốc độ dẫn khí
(ml/phút)
250

Tro hoá

750

30

250

Nguyên tử hoá

1800

3

0

Làm sạch

2600

7

250

Giai đoạn

2.3. Xử lý số liệu: Các số liệu thu đợc đợc xử lý theo phơng pháp thống kê y sinh
học
2.4. Những vấn đề về y đức trong nghiên cứu
- Các đối tợng nghiên cứu đợc hỏi ý kiến, tự nguyện cộng tác nghiên cứu
- Giải thích cho đối tợng mục đích yêu cầu của nghiên cứu

- Lấy máu bảo đảm an toàn

14


Phần 3
Kết quả
3.1. Xác định điều kiện xử lý mẫu máu, nớc tiểu và quy trình phân tích Pb trên
máy QPHTNT lò Graphit
3.1.1. Xác định điều kiện xử lý mẫu máu, nớc tiểu
Qui trình phá mẫu máu và nớc tiểu đã đợc chúng tôi trình bày phần phơng
pháp nguyên cứu trên đợc kiểm chứng bằng cách: Thêm vào cùng một mẫu máu các
nồng độ chuẩn 40g/dl, 80g/dl. Tơng tự, thêm vào cùng một mẫu nớc tiểu các
nồng độ chuẩn 25 g/l, 50g/l. Kết quả kiểm định phơng pháp phá mẫu chì máu,
chì niệu đợc thể hiện theo bảng 1:
Bảng 1: Kết quả kiểm chứng phơng pháp phá mẫu máu, nớc tiểu
Nồng độ Pb ngoại
Hiệu suất
suy tơng đơng với
(%)
nồng độ Pb chuẩn
-

Diện tích
pic

Nồng độ Pb
ngoại suy

Mẫu máu

0,021

13,13 g/dl

Mẫu máu + 40g/dl

0,08

50,00 g/dl

36,87 g/dl

92,17

Mẫu máu + 40g/dl

0,14

87,50 g/dl

74,37 g/dl

92,96

Nớc tiểu

0,012

25,83 g/l

-

-

Mẫu tiểu + 25g/l

0,023

47,92 g/l

22,09 g/l

88,35

Mẫu tiểu + 25g/l

0,034

70,83 g/l

45,00 g/l

90,00

Mẫu phân tích

Kết quả trên cho thấy, khi thêm 40g/dl, 80g/dl chuẩn chì vào mẫu máu, xử lý
mẫu theo qui trình phá mẫu máu thu đợc nồng độ chì ngoại suy tơng đơng với
nồng độ chì chuẩn thêm vào mẫu là 36,87 g/dl và 74,37 g/dl đạt hiệu xuất 92,17 %

và 92,96%. Đối với mẫu nớc tiểu, nồng độ chì ngoại suy tơng đơng với nồng độ
chì chuẩn là 22,09 g/l và 45,00 g/l đạt hiệu suất 88,35% và 90,0%. Độ thu hồi của
các mẫu kiểm chứng đạt giới hạn sai số cho phép của phép phân tích. Qui trình phá
mẫu máu và nớc tiểu là đáng tin cậy.

15


3.1.2. Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Pb
3.1.2.1. Xác định khe đo
Trong phép đo phổ của Pb, tiến hành khảo sát các khe đo 0,2nm; 0,7nm; 2nm,
đây là 3 giá trị khe đo mà hãng sản xuất, chế tạo đã thiết kế cho thiết bị AAS. Kết
quả khảo sát đợc ở bảng 2
Bảng2: Khảo sát khe đo của chì
Khe đo (nm)

0,2

0,7

2

Lần 1

0,095

0,096

0,082

Lần 2

0,093

0,096

0,085

Lần 3

0,093

0,096

0,081

Trung bình

0,094

0,096

0,083

Diện tích pic

Trên cùng một mẫu phân tích, chúng tôi đo ở mỗi khe đo 3 lần và lấy giá trị
trung bình. Kết quả cho thấy thấy, tại khe có kích thớc 0,7nm diện tích pic thu đợc
là ổn định và lớn nhất.
3.1.2.2. Khảo sát thể tích chất bổ trợ (Modifier)

Tiến hành phân tích mẫu máu và nớc tiểu trên QPHTNT bằng chất bổ trợ
NH4H2PO4/Mg(NO3)2. Khảo sát thể tích chất bổ trợ trên cùng một mẫu máu và nớc
tiểu. Mẫu đợc phá bằng qui trình phá mẫu trên. Kết quả cho thấy ở hình 1.
0,07

Din tớch Pic

0,06
0,05
0,04

Mỏu

0,03

Nc tiu

0,02
0,01
0
2

4

5

6

8

10

Th tớch (microlớt)

Hình 1: Khảo sát thể tích chất bổ trợ
Qua kết quả thể hiện trên hình 1, chúng tôi nhận thấy khi khảo sát chất bổ trợ

16


với nhiều thể tích khác nhau (2, 4, 5, 6, 8, 10l), sử dụng thể tích chất bổ trợ là 5 l
diện tích pic thu đợc là cao nhất trên cả mẫu máu và nớc tiểu.
3.1.2.3. Khảo sát thể tích mẫu đo:
Sau khi mẫu đợc sử lý bằng lò vi sóng, lấy mẫu vào cóng nhựa thể tích 3ml đặt
vào vị trí của khay đựng mẫu của bộ lấy mẫu tự động máy QPHTNT. Tiến hành khảo
sát thể tích mẫu đo 30, 40, 50, 60l bằng cách thay đổi chơng trình hút mẫu của
máy, giữ nguyên thể tích chất bổ trợ là 5 l.
3.1.2.3.1. Thể tích mẫu máu

0.04
0.035
Din tớch Pic

0.03
V-30/5

0.025

V-40/5
V-50/5

0.02
0.015

V-60/5

0.01
0.005
0
M1

M2

M3

M4

M5

Mu o

Hình 2: Khảo sát thể tích mẫu máu
5 mẫu máu (M1, M2, M3, M4, M5) sau khi sử lý bằng lò vi sóng đặt các chế độ
lấy mẫu với thể tích nh đã nêu trên. Kết quả ở hình 2 cho thấy, thể tích mẫu càng
tăng thì diện tích pic của mẫu càng tăng. Với thể tích mẫu là 60l diện tích pic không
ổn định và không còn tăng tuyến tính nữa. Chúng tôi nhận thấy rằng, với cả 5 mẫu
máu khảo sát, thể tích mẫu là 50l cho kết quả đo chì tốt nhất.
3.1.2.3.2. Thể tích mẫu nớc tiểu

17

0,09
0,08

Din tớch Pic

0,07
0,06

V-30/5

0,05

V-40/5

0,04

V-50/5

0,03

V-60/5

0,02
0,01
0
M1

M2

M3

M4

M5

Mu o

Hình 3: Khảo sát thể tích mẫu nớc tiểu
5 mẫu nớc tiểu (M1, M2, M3, M4, M5) sau khi sử lý bằng lò vi sóng đặt các
chế độ lấy mẫu với thể tích 30, 40, 50, 60l, thể tích chất bổ trợ là 5 l. Kết quả hình
3 cho thấy, thể tích mẫu tăng đến 50 l thì diện tích pic của mẫu tăng tơng ứng. Với
thể tích mẫu là 60 l diện tích pic không tăng nữa mà còn giảm. Chúng tôi nhận thấy
rằng, với cả 5 mẫu nớc tiểu khảo sát, thể tích mẫu là 50l cho kết quả đo chì tốt
nhất
3.1.2.4. Khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá
Tiến hành khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá của phép đo ở 16000C, 17000C,
18000C, 19000C. Kết quả thu đợc ở hình 4.

18


0.16
0.14

Din tớch Pic

0.12
1600

0.10

1700

0.08

1800

0.06

1900

0.04
0.02
0.00
M1

M2

M3

M4

M5

Mu o

Hình 4: Khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá
Khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá trên 5 mẫu phân tích Pb (M1, M2, M3, M4,

M5) cho thấy ở nhiệt độ nguyên tử hoá 19000C các mẫu có diện tích pic cao nhất
nhng cũng xấp xỉ với nhiệt độ 18000C. Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ nguyên tử
hoá của phép đo là 18000C.
3.1.2.5. Khảo sát thời gian sấy đối với mẫu nớc tiểu
5 mẫu nớc tiểu (M1, M2, M3, M4, M5) đợc tiến hành khảo sát thời gian sấy
là 50s, 70s, 90s, 100s, kết quả thể hiện ở hình 5.
0,09
0,08
DIn tớch Pic

0,07
0,06

50 giõy

0,05

70 giõy

0,04

90 giõy

0,03
0,02

100 giõy

0,01
0

M1

M2

M3

M4

M5

Mu o

Hình 5: Khảo sát thời gian sấy mẫu nớc tiểu
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng ở thời gian 90s thì diện tích pic của 5 mẫu

19


phân tích là cao nhất, tăng thời gian sấy lên 100s thì diện tích píc của các mẫu không
tăng nữa. Chúng tôi chọn thời gian sấy cho phép đo chì niệu là 90s.
3.1.3. Xác định ngỡng phân tích, khoảng tuyến tính của phép đo, độ chính xác
của phơng pháp
3.1.3.1. Xác định giới hạn phát hiện của phép đo.
Đa các dung dịch chuẩn vào mẫu máu và mẫu nớc tiểu theo nồng độ giảm
dần. Phân tích lặp lại 3 lần chúng tôi thu đợc kết quả theo bảng 3.
Bảng 3 : Giới hạn phát hiện của phơng pháp
Mẫu phân tích

Diện tích pic

Mẫu máu
0

0,005

0,6 g/dl

0,024

0,4 g/dl

0,016

0,2 g/dl

0,007

Mẫu nớc tiểu
0

0,005

3,73g/l

0,011

2,98 g/l

0,009

2,24l/dl

0,006

Với nồng độ chì máu là 0,2g/dl và chì niệu 2,24g/l là nồng độ thấp nhất khi
đo cho diện tích pic lớn hơn tín hiệu đo ống trắng. Theo bảng trên, ngỡng phát hiện
của phơng pháp đo chì máu là 0,2g/dl, chì niệu là 2,24g/l.
3.1.3.2. Xác định khoảng tuyến tính của phép đo
Đối với chuẩn Pb ở chơng trình đo máu
Từ dung dịch chuẩn gốc Pb 1000mg/l (Merck) pha ra các nồng độ 10.000g/l,
1000g/l (dung dịch chuẩn sử dụng). Chúng tôi pha các nồng độ 2ppb, 5ppb, 10ppb,
15ppb, 20ppb, 30ppb, 40ppb. Khoảng tuyến tính của phép đo Pb trong máu qua khảo
sát diện tích pic tơng quan tuyến tính với nồng độ Pb đợc thể hiện ở bảng 3, hình6.

20


Bảng 4: Khảo sát sự tơng quan tuyến tính giữa nồng độ Pb và diện tích pic (máu)
Nồng độ (ppb)
Diện tích pic

0

2

0,004 0,015

5

10

15

20

30

40

0,028

0,054

0,072

0,093

0,131

0,173

y = 0,0042x + 0,0077
r = 0,998
Hình 6: Đờng chuẩn Pb đo mẫu máu
Khoảng tuyến tính của phép đo có phơng trình hồi quy y = 0,0042x + 0,0077
với hệ số tơng quan r = 0,998
Đối với chuẩn Pb ở chơng trình đo nớc tiểu
Từ dung dịch chuẩn gốc Pb 1000mg/l (Merck) pha ra các nồng độ 10.000g/l,
1000g/l (dung dịch chuẩn sử dụng). Chúng tôi pha các nồng độ 2ppb, 5ppb, 7ppb,
10ppb, 20ppb, 30ppb, 40ppb. Khoảng tuyến tính của phép đo Pb trong nớc tiểu qua

khảo sát diện tích pic tơng quan tuyến tính với nồng độ Pb đợc thể hiện ở bảng 4,
hình7

21