Biểu hiện beta xylosidase trên e coli

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
NĂM 2016

Biểu hiện
xylan 1,4-beta-xylosidase có nguồn gốc từ vi sinh ruột
mối trong Escherichia coli
Sinh viên: Phạm Hải Như
Giáo viên hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Huyền
TS. Đinh Nho Thái

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


NỘI DUNG

I/ TỔNG QUAN
Tầm quan trọng của xylan 1,4-β-xylosidase

II/ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chọn giữa các chủng biểu hiện E. coli Rosetta, BL21, JM109 và SoluBL21; tối ưu điều kiện IPTG, nhiệt
độ, thời gian thu mẫu.

III/ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Biểu hiện thành công xylan 1,4-β-xylosidase ở dạng tan, có hoạt tính. Điều kiện tối ưu cho thí nghiệm: IPTG
o
0,6mM; 16 C; 2 ngày

IV/ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU
Tối ưu thêm các điều kiện biểu hiện để đat được lượng protein tan lớn hơn.

1

TỔNG QUAN
Lignocellulose

nguồn nguyên liệu tái
tạo

có nhiều ứng
dụng

phổ biến
đặc biệt ở các nước nông nghiệp như
SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

Việt Nam


VIỆC SỬ DỤNG HỮU HIỆU

SINH KHỐI THỰC VẬT PHỤ THUỘC VÀO

Sinh khối thực vật cấu tạo từ

Monome

nhiều loại polyme

Để giải quyết bài toán này, nhiều phương pháp phân giải vật lý, hóa học đã được đề ra. Song, giá thành của các phương pháp này còn cao, quy

trình phức tạp, yêu cầu hóa chất gây ô nhiêm môi trường.

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


Trong tình hình đó, công nghệ enzyme tái tổ hợp đã
trở thành một trong những hướng phát triển ổn định
và tiềm năng nhất cho việc phân giải sinh khối thực
vật.

Thực tế này đã thúc đẩy phòng Kỹ thuật di truyền – Viện công nghệ sinh học nghiên cứu các gen thủy phân

sinh khối thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Coptotermes gestroi.

Khóa luận tốt nghiệp “Biểu hiện gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase trong chủng Escherichia coli” là một phần nhỏ trong nghiên cứu này. Dùng
plasmid tái tổ hợp pET22xbx đã được thiết kế từ giai đoạn trước của nghiên cứu, xylan 1,4-β-xylosidase được tiến hành biểu hiện trong chủng
Escherichia coli.

* xbx: gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Coptotermes gestroi.

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


Xylan 1,4-β-xylosidase là một trong những enzyme chìa khóa tham gia thủy
phân lignocellulose.

Có khả năng cắt (1,4)-β-D-xylan từ đầu không khử để giải phóng các gốc đường
D-xylose

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

Giảm nhớt khi ủ bia, rượu
Sản xuất xylitol

Sản xuất xăng sinh học

Xylan 1,4-βxylosidase
….

Chuyển hóa bột giấy

được ứng dụng trong nhiều ngành

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dựa trên các xylan1,4-β-xylosidase đã được nghiên cứu đặc tính
trên dữ liệu CAZy
Mẫu dò
(probe)

ORF GL0112518
(từ 12 ORF đã chọn được)

+

“Blast” với kho dữ liệu metagenome từ
ruột mối

Đưa vào bằng enzyme XhoI + NcoI


iệ
uh
ể
i
B

n

n ạp
Biến

E. Coli BL21 (DE3)
Tốc độ sinh trưởng mạnh đặc trưng cho dòng B. Có đột biến DE3 (thêm gen mã hóa T7 polymerase)
giúp tăng khả năng biểu hiện trình tự gen ngoại lai trong vector chứa T7 promoter như pET22b(+);
đột biến protease lon và ompT giúpbảo vệ protein ngoại lai.

E. Coli JM109 (DE3)
Thuộc dòng K, có tốc độ sinh trưởng chậm hơn dòng B; giúp
protein có đủ thời gian hoàn thiện cải biến sau dịch mã.

E. Coli Rosetta (DE3)
Biến thể từ E. coli BL21, vẫn giữ được các ưu điểm của BL21 nhưng đã tối ưu hóa codon hiếm. Có

E. Coli SoluBL21 (DE3)

thêm vector pRARE chứa tRNA mang argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT, tyrU, và thrU.

Biến thể từ E. coli BL21, đã cải thiện quá trình gấp xoắn protein


Protein tái tổ hợp thu được ở thí nghiệm trên sẽ được

thử hoạt tính với cơ chất p-nitropheny-β-xylopyranoside (pNPX)

Xylan-1,4-β-xylosidase
Xylan-1,4-β-xylosidase
Màu vàng đặc trưng của nitropheny

Sử dụng chủng biểu hiện đã chọn để

khảo sát các điều kiện biểu hiện là
IPTG, nhiệt độ và thời gian thu mẫu

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


3

KẾT QUẢ
VÀ THẢO LUẬN

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

1

2

3

4

Kiểm tra pET22xbx bằng emzyme giới hạn

≈ 1,1kb
≈ 0,6kb

≈ 1,8kb

≈ 5,5kb
≈ 4,2kb

Gen xbx hiện diện trong vector tái tổ hợp
pET22xbx

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

5

6


1

2

3

4

5

6

Khảo sát chủng biểu hiện

o
Biểu hiện ở 37 C, với 1mM IPTG, trong 4h.

Kiểm tra 3 dòng ngẫu nhiên với mỗi chủng
E.coli đã biến nạp pET22xbx.

Rosetta, JM109, BL21 có cảm ứng IPTG: xuất
hiện băng có kích thước tương đương kích
thước lý thuyết của xylan-1,4-β-xylosidase
(≈40kDa), khác với dòng đối chứng.

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Khảo sát chủng biểu hiện

Hai chủng cho hàm lượng protein
tái tổ hợp lớn nhất là Rosetta và
BL21

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Khảo sát chủng biểu hiện

Đường
Đường chạy
chạy Tan
Tan của
của BL21
BL21 và
và Rosetta
Rosetta đều
đều xuất
xuất hiện
hiện
băng
băng có
có kích
kích thước
thước (≈40kDa)
(≈40kDa) tương
tương ứng
ứng với
với kích
kích thước
thước
lý
lý thuyết
thuyết của
của xbx,
xbx, khác
khác với
với đối

đối chứng.
chứng.
Băng
Băng Tan
Tan của
của Rosetta
Rosetta rõ
rõ ràng
ràng hơn
hơn BL21.
BL21. Nên
Nên có
có thể
thể đưa
đưa ra
ra nhận
nhận xét:
xét:
xbx
xbx biểu
biểu hiện
hiện ởở dạng
dạng tan
tan (dạng
(dạng mong
mong muốn,
muốn, có
có thể
thể có
có hoạt

hoạt tính)
tính) ởở
Rosetta
Rosetta tốt
tốt hơn.
hơn.

Chọn chủng E. coli Rosetta để thực
hiện các thí nghiệm sau

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Thử hoạt tính của xylan-1,4-β-xylosidase đã thu được

Có hoạt tính

Kết luận: hỗn hợp trong dung dịch thử hoạt tính không tạo ra màu vàng nhạt của dung dịch. Sự đổi màu từ trắng sang vàng nhạt của dung dịch

là do enzyme xylan 1,4-β-xylosidase cắt liên kết β(1→4), giải phóng nitropheny

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Khảo sát nhiệt độ cảm ứng

o
o
Chỉ có Tan ở nhiệt độ 16 C và 20 C xuất hiện băng
xbx (≈40kDa).
o
o
Do đó, chúng tôi kết luận, ở 28 C và 37 C, xbx biểu hiện ở dạng
o
không tan. Dạng tan của xbx chỉ được biểu hiện thành công ở 16 C
o
và 20 C, với mức tan khoảng 30%.

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Khảo sát nhiệt độ cảm ứng

Nhiệt độ
thích hợp
o
là 20 C

o
Mà sinh khối thu được ở 20 C lớn hơn sinh khối ở
o
16 C

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

1

2

3

4

5

6

Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG

IPTG là chất cảm ứng cho hoạt động của gen
xbx dưới sự điều khiển của promoter T7 trong
vector pET22xbx. Đây là chất cảm ứng khá đắt
tiền và ảnh hướng lớn đến mức độ biểu hiện
của gen xbx

Băng protein xbx (≈40kDa) ở các dòng có cảm
ứng IPTG khác so với dòng đối chứng

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG

Nồng độ thích hợp

OD t hu mẫu

là 0,6mM

3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

3
1.71 1.76 1.77 1.72

1.8

1.81 1.77

1.7

1.69

1.9

Sinh khối thu được khi cảm ứng ở các
1.82

1.61 1.69

nồng độ IPTG khác nhau là tương
đương nhau.

0

0.05

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Nồng độ IPTG (mM)

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

1.4

1.6

1.8

2

2.5

3


1

2

3

4

5

6

Khảo sát thời gian thu mẫu

Đường chạy Tan ở tất cả các giờ thu mẫu, đều
xuất hiện băng protein xylan-1,4-β-xylosidase
(≈40kDa) khác với dòng đối chứng.
o
Chứng tỏ xbx dạng tan được biểu hiện thành công trong 12-48h nuôi cấy ở 20 C, cảm ứng IPTG 0,6mM..

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

5

6

Khảo sát thời gian thu mẫu

Thời gian thu mẫu thích
hợp là 48h

Sinh khối thu được ở 48h là lớn
nhất

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


1

2

3

4

Đã biểu hiện thành công xylan 1,4-β-xylosidase
ở dạng tan trong E. coli Rosetta
o
với điều kiện biểu hiện thích hợp là nhiệt độ 20 C,
cảm ứng với IPTG 0,6mM, thu mẫu sau 48h

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH

5

6


4

ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Tối ưu thêm các điều kiện có thể ảnh hưởng đến biểu hiện:
_ Môi trường (TB, TB cải biến, LB ở các pH khác nhau,…)
_ Cảm ứng ở các nồng độ khác nhau
Tiến hành phá tế bào trong các đệm khác nhau (Tris-HCl, PBS,…)
Tiến hành “Heat-shock” trước khi cảm ứng

SV Phạm Hải Như - K57 CNSH


Em xin chân thành
cảm ơn!