Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatusH.T.Tsai et K.M. Feng) trồng tại Sapa - Lào Cai

Header Page 1 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ HUẾ

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ
DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng)
TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2017

Footer Page 1 of 116.


Header Page 2 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HUẾ

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ
DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatusH.T.Tsai et K.M.
Feng)TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y
Người hướng dẫn:
1.

PGS.TS. ĐỖ THỊ HÀ

2.

PGS.TS. DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG

Hà Nội – 2017

Footer Page 2 of 116.


Header Page 3 of 116.

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược,
Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho
tôi được làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm
qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến PGS.TS. Đỗ Thị Hà,
PGS.TS. Dương Thị Ly Hương, DS. Phạm Thị Thúy, những người đã luôn tận
tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu Khoa Hoá Thực vật - Viện
Dược liệu, các thầy cô ở Bộ môn Thực Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng các giải pháp khoa
học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây
thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCN-TB.07C/13-18, 20152017 (Chương trình Tây Bắc) đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện nội dung nghiên
cứu này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu tôi khó tránh khỏi những
thiếu sót. Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận
thêm hoàn thiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Huế

Footer Page 3 of 116.


Header Page 4 of 116.

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Giải nghĩa

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam 4

HCT-116

Dòng tế bào ung thư ruột kết người 116

HepG2
HL-60

Tế bà ung thư gan HepG2
Dòng tế bào ung thư bạch cầu người 60

HPLC-MS/MS
IC50

Nồng độ ức chế 50%

LD50

Liều gây chết 50%

NF-κB
P.
Rf
RSD
SD
SKLM

Yếu tố nhân kappa B
Panax
Hệ số di chuyển

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
Sắc ký lớp mỏng

STT

Số thứ tự

TT

Thuốc thử

TTH

Footer Page 4 of 116.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao – phổ khối/ phổ khối

Tam thất hoang


Header Page 5 of 116.

DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Bảng

Trang

Bảng 1

Phân bố của các loài thuộc chi Panax L.

2

Bảng 2

Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)protopanaxatriol

4

Bảng 3

Saponin khung dammaran khác

5

Bảng 4

Saponin dẫn chất ocotillol

5

Bảng 5

Saponin dẫn chất acid oleanolic

6

Bảng 6

Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L.

6

Bảng 7

Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang

10

Bảng 8

Độ ẩm của dược liệu tam thất hoang

27

Bảng 9

Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu tam thất hoang

28

Bảng 10

Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu tam thất hoang

28

Bảng 11

Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu tam thất hoang

30

Bảng 12

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng tới mật độ quang

32

Bảng 13

Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang

32

Bảng 14

Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin

33

Bảng 15

Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloeric

34

Bảng 16

Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn

36

Bảng 17

Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang

37

Bảng 18

Kết quả xác định độ đúng của phương pháp

38

Bảng 19

Kết quả định lượng saponin tổng trong một số mẫu tam thất
hoang

38

Footer Page 5 of 116.


Header Page 6 of 116.

DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1

Tam thất hoang

9

Hình 2

Saponin dẫn chất acid oleanolic

10

Hình 3

Nguyên liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatusH.T. Tsai
etK.M. Feng) tươi

16

Hình 4

Vi phẫu lá

23

Hình 5

Vi phẫu thân

24

Hình 6

Vi phẫu thân rễ

25

Hình 7

Bột lá

26

Hình 8

Bột thân

26

Hình 9

Bột thân rễ

27

Hình 10

Sắc ký đồ của dịch chiết tam thất hoang (B) và chất chuẩn
stipuleanosid R1(06) và stipuleanosid R2 (05)

29

Hình 11

Phổ hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng từ
300 – 800nm

31

Hình 12

Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang

32

Hình 13

Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang

33

Hình 14

Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin

34

Hình 15

Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric

35

Hình 16

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ
chất chuẩn tại bước sóng 550 nm

36

Footer Page 6 of 116.


Header Page 7 of 116.

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Panax............................................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 2
1.1.2. Thành phần hóa học.......................................................................................... 4
1.1.3. Tác dụng dược lý .............................................................................................. 8
1.2. Tổng quan về dược liệu tam thất hoang ..................................................................... 9

1.2.1. Thực vật học ..................................................................................................... 9
1.2.2. Thành phần hóa học........................................................................................ 10
1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng ..................................................................... 12
1.3. Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu .......................................................................... 13

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị ............................................................. 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 17
2.2.1. Mô tả ............................................................................................................... 17
2.2.2. Vi phẫu ........................................................................................................... 17
2.2.3. Soi bột ............................................................................................................. 17
2.2.4. Độ ẩm ............................................................................................................. 17
2.2.5. Tro toàn phần .................................................................................................. 17
2.2.6. Tro không tan trong acid ................................................................................ 17
2.2.7. Định tính ......................................................................................................... 18
2.2.8. Định lượng ...................................................................................................... 19

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................... 22
3.1.

Đặc điểm vi phẫu và bột........................................................................................ 22

3.1.1. Đặc điểm vi phẫu ............................................................................................ 22
3.1.2. Đặc điểm bột dược liệu................................................................................... 25
3.2. Độ ẩm ....................................................................................................................... 27
3.3. Tro toàn phần ........................................................................................................... 28

Footer Page 7 of 116.

Header Page 8 of 116.
3.4. Tro không tan trong acid .......................................................................................... 28
3.5. Định tính .................................................................................................................. 29
3.6. Định lượng ............................................................................................................... 30
3.6.1. Định lượng theo phương pháp cân ................................................................. 30
3.6.2. Định lượng theo phương pháp đo quang ........................................................ 30
3.7. Bàn luận ................................................................................................................... 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 41
Kết luận ........................................................................................................................... 41
Kiến nghị ......................................................................................................................... 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 42
PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC ..........................................i
PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU ............................
TAM THẤT HOANG .............................................................................................. ii

Footer Page 8 of 116.


Header Page 9 of 116.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhắc đến thảo dược, người ta không thể không nhắc đến “Sâm”. Ngày nay,
thuật ngữ“Sâm” không chỉ dùng để chỉ cây nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer),
mà còn để gọi chung cho rất nhiều loài thuộc chi Panax L. bởi chúng có những tác
dụng quý tương tự. Nhiều loài trong chi Sâm (Panax), đặc biệt là các loài nhân sâm
(Panax ginseng C.A. Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.),
tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng; syn.: P.
pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax

quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms;
syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.)..., là những cây thuốc quý, được ưa
chuộng, rất nổi tiếng và có giá trị cao[14].
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng) đã được ghi
nhận trong các tài liệu cây thuốc và được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian,
đặc biệt là các dân tộc miền núi Tây Bắc. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, ở nước
ta và cả trên thế giới những nghiên cứu về loại sâm này là rất ít và tản mạn.Tam thất
hoang được sử dụng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress,
kích thích tiêu hóa, an thần...[3] nhưng lại là loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng
cao ở Việt Nam[15]. Ngày nay, các nguyên liệu dược liệu đang bị làm giả làm nhái
rất nhiều và nhiều chế phẩm từ dược liệu còn kém chất lượng, tam thất hoang càng
không phải một ngoại lệ. Điều này có thể làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người,
cũng như gây mất lòng tin của người sử dụng với thuốc và chế phẩm từ dược liệu.
Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu là hết sức cần thiết.
Cho đến nay, dược liệu tam thất hoang vẫn chưa được đưa vào dược điển
Việt Nam, các dược điển Trung Quốc, Ấn Độ cũng chưa có chuyên luận cho dược
liệu này. Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài : “Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ
sở dược liệu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng)trồng tại
Sapa – Lào Cai” với mục tiêu: Xây dựngđược các tiêu chuẩn cho dược liệu tam thất
hoang trồng tại Sa Pa– Lào Cai.
Để đạt được mục tiêu trên đề tài thực hiện các nội dung sau:
- Phân tích đặc điểm vi học dược liệu.
- Xây dựng phương pháp định lượng dược liệu.
- Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu với một số tiêu chí chung trong Dược điển
Việt Nam IV.
1
Footer Page 9 of 116.


Header Page 10 of 116.

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về chi Panax

1.1.1. Đặc điểm thực vật
a) Phân loại và phân bố:
Vị trí phân loại của chi PanaxL. theo Takhtajan[72]:
Giới: Thực vật - Plantae
Ngành: Ngọc lan- Magnoliophyta.
Lớp: Ngọc lan- Magnoliopsida.
Bộ: Hoa tán Apiales.
Họ: Ngũ gia bì(nhân sâm) Araliaceae
Chi: Sâm Panax L.
Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về các loài
thuộc chi Panax. Theo Flora of China (2007)[81], ở Trung Quốc chi Panax có 7
loài.
Theo trang The plant list, chi Panax bao gồm 47 tên khoa học của thực vật,
trong đó có 12 loài và 1 thứ được chấp nhận với mức độ tin cậy cao. Phân bố của 12
loài như trong bảng sau:
Bảng 1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L.
Loài

STT

Phân bố

1

Panax bipinnatifidus Seem.

Từ dãy Himalaya đến miền trung
Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt
Nam.

2

Panax ginseng C.A.Mey

Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc,
Đông bắc Trung Quốc.

3

Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey

Nhật Bản, Hàn Quốc.

4

Panax notoginseng (Burkill)
F.H.Chen

Miền nam Trung Quốc và một số
nơi ở Việt Nam.

5

Panax pseudoginseng Wall.

Nê-pan.

6

Panax quinquefolius L.

Canada, Mỹ.
2

Footer Page 10 of 116.


Header Page 11 of 116.

7

Panax sokpayensis Shiva K.Sharma

Vùng Sikkim - Ấn Độ.

& Pandit

8

Panax stipuleanatus Tsai & Feng

Trung Quốc, Việt Nam.

9

Panax trifolius L.

Bắc Mỹ.

10

Panax vietnamensis Ha & Grushv.

Trung Quốc, Việt Nam.

11

Panax wangianus S.C.Sun

Miền trung, nam Trung Quốc.

12

Panax zingiberensis C.Y.Wu &
Feng

Vân Nam - Trung Quốc.

Ở Việt Nam, chi PanaxL. có 5 loài gồm cây mọc tự nhiên cũng như được
nuôi trồng, với phân bố như sau[3]:
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): ở Quảng Nam, Kon
Tum, Gia Lai, Lâm Đồng.
Sâm vũ diệp (Panax bipinatifidus Seem.): ở Lào Cai trên dãy Hoàng Liên
Sơn, Sa Pa.

Tam thất (Panax pseudoginseng Wall.): ở Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn,
Phó Bảng, Hà Giang, Lai Châu.
Nhân sâm (Panax ginseng Meyer.): phân bố rải rác ở các khu vực rừng núi
trong cả nước, mọc tập trung nhiều tại các khu vực vùng núi cao, có khí hậu mát
lạnh.
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng): có ở Lai
Châu, Lào Cai.
b) Đặc điểm thực vật
Theo Seemann (1868), chi Panaxlà nhóm thảo mộc có lá kép hình chân vịt
có răng cưa, mọc ở đỉnh thân, cụm hoa mang một tán đơn ở tận cùng, hoa nhỏ có 5
cánh, bầu nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2 – 5
hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tùy theo số năm sinh
trưởng[68]. Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn[81].

3
Footer Page 11 of 116.


Header Page 12 of 116.

1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học trong các loài thuộc chi Panax rất phong phú[13]:
saponin, polyacetylen, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử và một số
hợp chất mới được phát hiện như glycosphingolipid, saccharose [6] …Trong đó
saponin và polyacetylen là hai thành phần chính.
a) Hợp chất saponin
Saponin được xem là thành phần chính quyết định hoạt tính của các loài
thuộc chi Panax. Đến cuối năm 2012, ít nhất 289 saponin đã được báo cáo từ mười
một loài Panax khác nhau[79]. Các saponin thuộc 4 phân nhóm phổ biến nhất là
protopanaxadiol, protopanaxatriol, acid oleanolic, octrilol. Các loại saponin được

trình bày trong các bảng dưới đây:
Bảng 2. Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và
20(S)-protopanaxatriol
A

B

R2O
OH

R2O
OH

HO

R1O

OR1

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol

STT

Tên

Kiểu

R1

R2

Loài

1

Ginsenosid Rb1

(A)

G1C2-G1C

G1C6-G1C

P. ginseng [60];
P. notoginseng [82]

2

Ginsenosid Rb2

(A)

G1C2-G1C

Glc6-Ara(p)

P. ginseng [84];
P. notoginseng [62]

2

G1C6-G1C6P. notoginseng [55]
Xyl

3

Notoginsenosid R4

(A)

G1C -G1C

4

Notoginsenosid Fa

(A)

Glc2-Glc2Xyl

Glc6- Glc

P. notoginseng [55]

5

Ginsenosid Rgl

(B)

Glc

Glc

P. ginseng[79]

6

Notoginsenosid R1

(B)

Xyl

Glc

P. notoginseng [42]

Glc

6

P. notoginseng [55]

7

Notoginsenosid R3

(B)

G1C -G1C

4
Footer Page 12 of 116.


Header Page 13 of 116.

Bảng 3. Saponin khung dammaran khác
A

OH

B

R4O
OR3

R1O

R4O
OR3

R1O
R2

R2
OH

C

D

R4O
OR3

R1O

O

R4O

R1O
R2

STT

Tên

1

Majonosid F4

(A)

Glc

H

H

Glc

P. vietnamensis [45]

2

Chikusetsusaponin L9a

(A)

H

OH

H

H

P. japonicus [70]

5

Chikusetsusaponin L9bc (C)

H

OH Glc

H

P. vietnamensis [56]

H

OH

H

Glc

P. vietnamensis [56]

Glc

-

-

Glc

P. japonicus [48]

6
7

Loại R1 R2 R3 R4

Ginsenosid M7cd

(C)

Chikusetsusaponin LT8 (D)

Loài

Bảng 4. Saponin dẫn chất ocotillol
OH

A

OH

B

O

O

OH

OH

HO

HO

OR

OR

STT

Tên

Kiểu

R
5

Footer Page 13 of 116.

Loài


Header Page 14 of 116.

1

PseudoginsenosidF11

(A)

Glc2-Rha

P. quinquefolius [78]

2

Pseudoginsenosid RT4

(B)

Glc

P. japonicus [49]

3

Majonosid-R1

(B)

Glc2-Glc

P. japonicus [45]

4

Majonosid-R2

(B)

Glc2-Xyl

P. japonicus [45]

Bảng 5. Saponin dẫn chất acid oleanolic

COOR2

R1O
OR

Tên
Zingibrosid R1

R1
Glc A2- Glc

Stipuleanosid R1

Glc A3- Glc
\

STT
1
2

4

H

Loài
P. zingiberensis [37]

H

P. stipuleanatus [83]

Glc

P. stipuleanatus [83]

R2

-Ara(f)

Glc A3- Glc
3

Stipuleanosid R2

\
4

-Ara(f)

b) Hợp chất polyacetylen
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với
những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là
nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là
chuỗi C7H15[25,52,66].
Bảng 6. Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L.
STT

Loài

Hợp chất

6
Footer Page 14 of 116.

TLTK


Header Page 15 of 116.

- Panaxynol
- Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol
1

P.
- Heptadeca-l-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol
quinquefolium - 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1 -en-4,6-diyn

[33]

- 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn
- 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on
- stipudiol
2 P.stipuleanatus - stipuol

[23]

- (3R,9R,10R)- Panaxytriol
- Panaxynol (falcarinol)
- Panaxytriol

- Panaxydol
- Heptadeca-1 -en-4,6-diyn-3,9-diol
- Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol

3

P. ginseng

- Heptadeco-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol
- Panaxacol
- 9,10- epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3ol
[34,38,67]
- 10-cloro-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol
- 9,10- epoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on
- 9,10-epoxy-1 -heptadecen-4,6-diyn-3-on
3-acetoxy-9,10-epoxy-l,16-heptadecadien-4,6diyn
- 3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn
- 3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn

4

- Panaxatriol
- Panaxynol
- Panaxydol
P. notoginseng
- notoginsenic acid β-sophoroside
- 10-hydroxydeca- 4,6-diynoic acid 10-O-β-Dglucopyranosyl (1 -> 2)-β-Dglucopyranoside

7
Footer Page 15 of 116.

[77]


Header Page 16 of 116.

- Panaxynol
5

P.
vietnamensis

- 10-acetoxy-hetadeca-8 (E) -en-4,6-diyn-3-ol
- Heptadeca-1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol

[12]

- Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol
- Heptadeca-1,8(E), 10 (Z)-trien-4,6-diyn-3,12-diol

1.1.3. Tác dụng dược lý
Trong chi PanaxL., có một số loài đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng
dược lý như: nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng), sâm Mỹ
(Panax quinquefolius), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis).
a) Nhân sâm
Nhân sâm đã được nghiên cứu và chứng minh có các tác dụng: tăng lực, hồi
phục sức khỏe [76]; cải thiện trí nhớ [59,85]; chống stress, giải lo âu và chống trầm
cảm [46,65,76,80]; chống oxy hoá và chống lão hoá [39,54]; bảo vệ gan [35,36,47];
điều hòa miễn dịch[40,41]; chống ung thư [57,69]; hạ cholesterol và lipid máu
[23,61]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [29-31]; hạ glucose huyết [44].

b) Tam thất
Tam thất cũng thể hiện các tác dụng dược lý tương tự nhân sâm, như: tác
dụng chống oxy hóa [75]; tác dụng điều hòa miễn dịch [51]; tác dụng bảo vệ tế bào
não trong trường hợp thiểu năng tuần hoàn não [43]; hạ lipid máu và phòng chống
huyết khối [32]; tác dụng bảo vệ gan [24,53]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [63].
c) Sâm Mỹ
Sâm Mỹ có tác dụng chống oxy hoá, chống stress[50]; tăng cường miễn dịch
[28]; gây độc tế bào ung thư [22,64]; chống đái tháo đường [21].
d) Sâm Việt Nam
Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy sâm Việt Nam có
những tác dụng tương tự nhân sâm. Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâm Việt Nam có
tác dụng cải thiện trí nhớ [8,18]; chống stress và trầm cảm [9,19,58]; chống oxy hóa
[19]; tác dụng bảo vệ gan [7,73,74]; kháng khuẩn trên các chủng Streptococcus,
Staphylococcus[4,52]; kích thích miễn dịch [10]; gây độc tế bào ung thư [71]; tác
dụng kiểu nội tiết tố sinh dục, chống đái tháo đường, giảm đau chống viêm [4].

8
Footer Page 16 of 116.


Header Page 17 of 116.

1.2.

Tổng quan về dược liệu tam thất hoang

1.2.1. Thực vật học
Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất, Tam thất rừng, Sâm tam thất, Bình
biên tam thất.
Tên khoa học: Panax stipuleanatusH.T. Tsai et K.M. Feng, thuộc họ Ngũ gia

bì (Nhân sâm) Araliaceae.
Đặc điểm thực vật [3]:
Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25-75 cm; thân rễ mập,
nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có
1 thân mang lá, ít khi 2-3. Lá kép chân vịt, gồm 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống
dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm,
rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5
lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính
0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ. Quả gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng.

Hình 1. Tam thất hoang
Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9 (10). Nhân giống tự
nhiên chủ yếu bằng hạt. Quả chín thường bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại
sóc nhỏ ăn nhân hạt. Cá biệt trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng
10. Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh
gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau [16]. Phần
thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu
mùa xuân năm sau. Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục
tái sinh. Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán

9
Footer Page 17 of 116.


Header Page 18 of 116.

rừng kín thường xanh ẩm, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao từ 16002300m[3].
Phân bố:Cho đến nay, loài này mới chỉ tìm thấy ở Đông-Nam tỉnh Vân Nam
(Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc Gia Hoàng Liên thuộc tỉnh Lào Cai,
Việt Nam(Sa Pa và Bát Xát: núi Hoàng Liên Sơn)[16].

1.2.2. Thành phần hóa học
Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH.
Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ ra rằng phần thân rễ
TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid
oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với
hàm lượng thấp. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2
saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là stipuleanosid R1 và stipuleanosid
R2 từ thân rễ TTH [83].

COOR2

R1O
OR

Hình 2. Saponin dẫn chất acid oleanolic
Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở
Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran
gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol
của TTH được thu hái ở Trung Quốc [86].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun L. đã phân lập được 11 hợp chất
saponin từ mẫu TTH thu hái ở Việt Nam [26]. Năm 2013, nhóm tiếp tục phân lập
được 4 hợp chất saponin khác nữa [27]. Các saponin mà nhóm tác giả trên phân lập
được từ TTH đều là các saponin dẫn chất của acid oleanolic.
Bảng 7. Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang
STT
1

Hợp chất
Stipuleanosid R1 (1)

[83]
10

Footer Page 18 of 116.

TLTK


Header Page 19 of 116.

2

Stipuleanosid R2 (2)

[83]

3

Aralosid A methyl este (3)

[26]

4

Chikusetsusaponin IVa (4)

[26]

5

Pseudoginsenosid Rp1 methyl este (5)

[26]

6

Pseudoginsenosid Rt1 (6)

[26]

7

Pseudoginsenosid Rt1 methyl este (7)

[26]

8

Acid
oleanolic-3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→3)β-Dglucuronopyranosyl-6'-methyl ester] -28-O-β-D- glucopyranosyl
ester (8)

[26]

Acid

9

oleanolic-3-O-β-D-xylopyranosyl(1→2)-β-D-

glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosid (9)

[26]

10

Spinasaponin A 28-O-glucosid (10)

[26]

11

Spinasaponin A methyl este (11)

[26]

12

Stipuleanosid R2 methyl este (12)

[26]

13

Ginsenosid Rb1 (13)

[86]

14

Ginsenosid Rb3 (14)

[86]

15

Ginsenosid Rc (15)

[86]

16

Ginsenosid Rd (16)

[86]

17

Hemslosid Ma2 (17)

[27]

18

Elatosid A (18)

[27]

19

Stipuleanosid R1 methyl este (19)

[27]

20

Acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl este (20)

[27]

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất khác từ
TTH gồm 3 polyacetylen (trong đó stipudiol và stipuol là 2 chất mới, (3R,9R,10R)panaxytriol là chất đã biết), và các hợp chất khác: spathulenol (serquiterpen) và 9docosenoic acid methyl ester (acid béo) [25].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH vẫn còn mới mẻ.
Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là
polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử
định tính hóa học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng[11]. Đồng thời bằng cách
thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic[13].

11
Footer Page 19 of 116.


Header Page 20 of 116.

1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng
a) Tác dụng dược lý
Năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ củ
TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg. Cao TTH có tác
dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng thái bình thường ở
các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng

chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd ở nồng độ 25, 50, 100
μg/ml [11].
Nhóm nghiên cứu của Chun L. (2010) [26] đã thử tác dụng gây độc tế bào
trên các dòng tế bào HL-60 (bệnh bạch cầu) và HCT-116 (ung thư ruột kết) của các
hợp chất saponin từ 2 đến 12 (theo bảng 7), thấy rằng các chất đều có tác dụng gây
độc tế bào ở mức độ khác nhau. Chất 11biểu hiện rõ ràng tác dụng gây độc tế bào
HL-60 và HCT-116 với giá trị IC50 là 4,44 và 0,63 µM tương ứng; chất 5 có tác
dụng gây độc tế bàotrung bình với giá trị IC50 là 41,45 và 6,50 µM. Sau khi các
dòng tế bào HL-60 và HCT-116 được xử lý với các chất 11 và 5, thấy có sự chết tế
bào theo chu trình. Chất 4, 8 có tác dụng gây độc tế bào với giá trị IC50 là 75,94 và
78,11 µM lên tế bào HCT-116. Các chất 3, 6, 9, 10, 12 đều có tác dụng gây độc tế
bào với các giá trị IC50 lần lượt là 63,44; 67,08; 72,99; 76,23; 83,90; 91,16 µM lên
dòng tế bào HL-60 và có tác dụng lên dòng HCT-116 với các giá trị IC50 lớn hơn
100 µM.
Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục thử tác dụng gây độc tế bào ung thư
máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất polyacetylen là stipudiol và
stipuol. Kết quả cho thấy cả 2 chất đều ức chế sự tăng sinh tế bào HL-60 và HCT116 với giá trị IC50tương ứng là 0,13 và 0,28 μM ;0,5 và 0,8 μM [25].
Trong một công bố khác năm 2013, nhóm nghiên cứu của Chun L. chỉ ra
rằng các saponin 2, 3, 4, 8, 9, 12 (theo bảng 7) có tác dụng ức chế NF-κB với giá trị
IC50 từ 3,1 đến 18,9 μM. Ba hợp chất 3,4,9 ức chế hoạt động của NF-κBbằng cách
giảm nồng độ của tác nhân gây viêm trên tế bào HepG2 [27].
b) Công dụng
Tam thất hoang có tác dụng tán ứ, định thống.
Sách đỏ Việt Nam (2007) ghi: “tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng
làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục,

12
Footer Page 20 of 116.

Header Page 21 of 116.

chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an
thần”[3].
Theo Đông y: tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Có tác dụng tư
bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu.
Theo sách "Trung Quốc dược thực chí": tam thất hoang có tác dụng chữa
thương tổn, cầm máu, có thể sử dụng để thay thế tam thất.Trên lâm sàng rễ củ tam
thất hoang dược dùng để cầm máu các loại vết thương và xuất huyết. Cũng được
dùng như tam thất làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm, nhất là đối với
phụ nữ sau khi sinh đẻ, còn có tác dụng kích thích sinh dục và được dùng trong điều
trị vô sinh. Liều dùng 4-8g thuốc bột hoặc rượu thuốc.
Một số bài thuốc có tam thất hoang:
- Chữa thống kinh (đau bụng trước kỳ kinh): Ngày uống 5 g bột TTH, uống 1
lần, chiêu với cháo loãng hoặc nước ấm.
- Phòng và chữa đau thắt ngực: Ngày uống 3-6 g bột TTH (1 lần), chiêu với
nước ấm.
- Chữa thấp tim: Ngày uống 3 g bột TTH, chia 3 lần (cách nhau 6-8 giờ),
chiêu với nước ấm. Dùng trong 30 ngày.
- Chữa các vết bầm tím do ứ máu (kể cả ứ máu trong mắt): Ngày uống 3 lần
bột TTH, mỗi lần từ 2-3 g, cách nhau 6-8 giờ, chiêu với nước ấm.
- Chữa đau thắt lưng: Bột TTH và bột hồng nhân sâm lượng bằng nhau trộn
đều, ngày uống 4 g, chia 2 lần (cách nhau 12 giờ), chiêu với nước ấm. Thuốc cũng
có tác dụng bồi bổ sức khỏe cho người suy nhược thần kinh, phụ nữ sau sinh, người
mới ốm dậy.
1.3.

Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu

Hiện tại, các nghiên cứu về tiêu chuẩn chất lượng của tam thất hoang còn rất

hạn chế, chưa có tiêu chuẩn chất lượng cụ thể.
Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu[5]:
 Mô tả: bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi
vị,cácđặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệuhoặc đặc điểm thể
chất của dược liệu.

13
Footer Page 21 of 116.


Header Page 22 of 116.

 Định tính: là những phương pháp dùng để nhận biết dược liệu bao
gồmcáckinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa.
 Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và
truyền thốngnhư sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay
khói và mùi khi đốt cháy dược liệu…
 Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học, bao gồm:
- Vi phẫu: Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan
trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Trong phần lớn các trường hợp, hình dạng và
cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học. Vì vậy,
khi quan sát các mẫu người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào
để việc quan sát dễ dàng hơn.
- Soi bột: mỗi một dược liệu đều có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được
thể hiện một phần qua bột dược liệu. Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi để
tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, có vai trò trong việc
địnhdanh, xác định độ tinh khiết, phân biệt dược liệu này với dược liệu dễ nhầm lẫn,
phát hiện giả mạo nếu có và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu.
 Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất,
năng suất quay cực… của các dược liệu.

 Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các
phản ứng hóa học. Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược
liệu cụ thể.
 Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp
mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao… để phát hiện một số thành phần có
trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn.
 Định tính hu nh quang là quan sát sự phát hu nh quang của bề mặt hay
mặt cắt dược liệu hoặc của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thườnghay sau khi cho
tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử. Trừ khi có quyđịnh riêng trong chuyên luận,
mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn
sáng khoảng 10 cm.
 Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim
loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại mỏng có kích
thước hơi lớn hơn. Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín
14
Footer Page 22 of 116.


Header Page 23 of 116.

bằngmột phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh. Đặt tấm kim
loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm
sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này. Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho
đến khi bột dược liệu bị cháy xém. Nhấc phiến kính ra và để nguội. Quan sát hình
dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng
kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được
thăng hoa.
 Thử tinh khiết: là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, có thể bao gồm
một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:
 Mất khối lượng do làm khô.

 Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric.
 Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến
màu, hư thối.
 Tỉ lệ vụn nát của dược liệu.
 Hàm lượng kim loại nặng.
 Dư lượng các chất bảo vệ thực vật.
 Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có
thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác).
 Định lượng: là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trongdược
liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. Định lượngbao gồm cả việc
xác định hàmlượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh
học.

15
Footer Page 23 of 116.


Header Page 24 of 116.

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị
Mẫu tam thất hoang được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai cóđộ tuổi 4-6 năm đã

được xác định tên khoa học, được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên
Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DL-020816 (Phụ lục 1) .
Xử lý nguyên liệu: sau khi thu hái, nguyên liệu được rửa sạch, sấy khô ở
50ºC đến khi đạt độ ẩm dưới 10%. Sau đó được cắt miếng mỏng, xay nhỏ làm mẫu
nghiên cứuvà được bảo quản trong túi kín.

Hình 3. Nguyên liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatus
H.T. Tsaiet K.M. Feng) tươi
Chất đối chiếu: stipuleanosid R1, stipuleanosid R2, acid oleanolic được cung
cấp bởi nhóm nghiên cứu Viện dược liệu.
Dung môi hoá chất:methanol, ethanol, n-hexan,n-butanol, acid acetic băng,
acid perchloric, vanillin,nước cất hai lần…dùng cho phân tích.
Máy móc, thiết bị: máy siêu âm Power sonic 405; máy cất quay Rotavapor
R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI); tủ sấy Memmert, Binder-FD115; bếp điện, bếp
đun cách thủy; tủ sấy chân không Heraeus VT6025, Châu Âu; cân kĩ thuật Precisa
BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60;
máy đo quang Shimadzu UV-1800 UV-Vis Spectrophotometer.

16
Footer Page 24 of 116.


Header Page 25 of 116.

2.2.

Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Tam thất hoang dựa trên các chỉ tiêu chung
được qui định tại phụ lục 12.2 DĐVN IV[5]gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm
dược liệu, tro toàn phần, định tính, định lượng,…
2.2.1. Mô tả
Tiến hành trên mẫu dược liệu là thân rễ đã sấy khô. Kiểm tra hình thái, màu
sắc, mùi vị bằng cảm quan, kiểm tra kích thước bằng cách đo.
2.2.2. Vi phẫu

Mẫu dược liệu TTH tươi cả 3 phần lá, thân, thân rễ được tiến hành cắt vi
phẫu, tẩy sáng trong dung dịch javel, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép
với đỏ son phèn và xanh metylen. Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để soi các đặc
điểm vi phẫu của dược liệu[17].
2.2.3. Soi bột
Phần thân rễ TTH được làm khô rồi nghiền thành bột, lên tiêu bản bằng một
giọt dung dịch glycerin, quan sát các đặc điểm của bột bằng kính hiển vi[17].
2.2.4. Độ ẩm
Sử dụng cân xác định độ ẩm Precisa HA 60 (cân chính xác khoảng 1 g phần
thân rễ đã cắt nhỏ, khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng).
2.2.5. Tro toàn phần
Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.8. Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã
được sấy khô.
Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó:m: khối lượng tro (g);
M: khối lượng mẫu thử (g);
A: độ ẩm của mẫu thử (%).
2.2.6. Tro không tan trong acid
Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.7.Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã được
sấy khô.
17
Footer Page 25 of 116.