Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm cercodemas anceps

Luận văn cao học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN KHẮC SINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP
CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG
TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM
CERCODEMAS ANCEPS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, 2016

i
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN KHẮC SINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP
CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG
TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM

CERCODEMAS ANCEPS

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60.42.0114

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

TS. NGUYỄN XUÂN CƢỜNG
PGS. TS. HOÀNG THỊ MỸ NHUNG

HÀ NỘI, 2016

ii
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến với:
TS. Nguyễn Xuân Cƣờng, người thầy hướng dẫn chính của tôi trong luận
văn tốt nghiệp của mình. Đối với tôi, lĩnh vực hóa sinh còn rất mới mẻ nhưng thầy
đã giúp tôi tiếp cận được một cách dễ dàng nhất; hỗ trợ tôi rất đúng lúc, kịp thời để
tôi có cái nhìn sâu sắc về lĩnh vực mới.Tuy vẫn còn rất nhiều kiến thức cần phải học
hỏi nhưng chắc chắn những gì thầy chỉ bảo sẽ là tiền đề vững chắc cho tôi có khả
năng tìm hiểu sâu hơn về các kỹ thuật hóa sinh.
PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, người thầy tôi vô cùng kính trọng và có
ảnh hưởng sâu sắc nhất đến tôi. Cô không chỉ là người lãnh đạo nhóm Ung thư học

thực nghiệm mà còn là phó chủ nhiệm bộ môn Sinh học tế bào.Với bao bộn bề công
việc, cô vẫn dành cho tôi những khoảng thời gian để giúp tôi giải quyết những khó
khăn trong công việc. Mỗi lần được cô chỉ dạy tận tình tôi lại thấy mình thật may
mắn khi được cô nhận vào nhóm nghiên cứu. Cô dạy tôi kiến thức và kỹ năng thực
hành, truyền lại cho tôi kinh nghiệm và tinh thần làm việc, cho tôi nơi làm thí
nghiệm và hỗ trợ tôi cả về vật chất.Cùng với những lời động viên nho nhỏ, đó là
động lực để tôi bước qua những rào cản lớn nhất trong công việc.
ThS. Bùi Thị Vân Khánh, người chị cả luôn gắn bó với các thế hệ sinh
viên, trong đó có cả thời sinh viên của tôi. Tôi đã luôn được nghe nói về sự nhiệt
tình của chị đối với sinh viên, nhưng khi được làm việc cùng chị tôi mới thấy hết
được sự năng nổ và nhiệt tình ấy của chị.Tôi muốn dành một lời cảm ơn đặc biệt
nhất đến với chị vì có thể nói không có sự giúp đỡ của chị tôi khó mà hoàn thành
được công việc của mình.Chị đã luôn động viên tôi mỗi khi nói chuyện và quan tâm
đến tôi cho đến những ngày cuối cùng trước khi hoàn thành công việc.
ThS. Nguyễn Đắc Tú, CN.Lê Thị Kim Anh, ThS. Nguyễn Thị Ngọc Ánh
như những người anh, người chị lớn trong một gia đình, gần gũi chăm lo cho nhóm
nghiên cứu.Các anh chị không chỉ quan tâm đến công việc và còn lo cả đời sống
tinh thần cho các em, luôn tạo không khí vui vẻ, môi trường làm việc thân thiện, tốt
nhất cho các em.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PhòngDƣợc liệu biển, Viện Hóa sinh
biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp tôi phân lập và xác
định cấu trúc các hợp chất saponin với sự tài trợ kinh phí từ Đề tài nghiên cứu khoa
học trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: “Nghiên cứu khai thác dược
iii
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

liệu Da gai ở vùng biển Đông bắc Việt Nam theo định hướng hoạt tính diệt tế bào
ung thư và kháng sinh", mã số VAST.TĐ.ĐAB.03/13-15.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Sinh học nói
chung và các thầy cô trong Bộ môn Sinh học tế bào nói riêng. Thầy cô đã giúp tôi
có được kiến thức vững vàng và kỹ năng để tìm hiểu các vấn đề quan tâm.Điều đó
giúp tôi rất nhiều trong việc hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, cảm ơn từ những gì bé nhỏ nhất mà
gia đình đã dành cho tôi. Tất cả đã luôn vui vẻ với những sự lựa chọn của tôi, ủng
con đường tôi đang đi, những gì tôi đang làm. Cảm ơn các anh chị đồng nghiệp, bạn
bè đã hỗ trợ tôi để tôi có thời gian hoàn thành luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2016
Học viên

Nguyễn Khắc Sinh

iv
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1.

Saponin .....................................................................................................3

1.1.1. Saponin và khả năng kháng u ...................................................3
1.1.2. Cơ chế kháng u của một số saponin ..........................................4
1.1.3. Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của
saponin .........................................................................................7

1.2.

Saponin từ hải sâm ..................................................................................7
1.2.1. Hải sâm ........................................................................................7
1.2.2. Nguồn saponin từ hải sâm..........................................................8

1.3.

Một số phƣơng pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học
...................................................................................................................9
1.3.1. Sắc ký cột .....................................................................................9
1.3.2. Sắc kí lớp mỏng .........................................................................10
1.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy NMR) ..................................................................10

1.4.

1.3.3.1.

Phổ 1H-NMR ................................................................................................ 10

1.3.3.2.

Phổ 13C-NMR ............................................................................................... 10

1.3.3.3.

Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) ........... 11

1.3.3.4.

Phổ 2D-NMR................................................................................................ 11

Ung thƣ ...................................................................................................12
.................................................................................................................13

1.5.

Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thƣ.........................................16
1.5.1. Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào .............................................16
1.5.2. Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ..........................................18
1.5.3. Mô hình động vật thí nghiệm...................................................18

Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................20
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................20
i

Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

2.1.1. Loài hải sâm Cercodemas anceps .............................................20
2.1.2. Mẫu chế phẩm sinh học............................................................21
2.1.3. Dòng tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 ......................21
2.1.4. Dòng tế bào ung thƣ vú MCF7 ................................................21
2.1.5. Dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 ....................22
2.1.6. Chuột nhắt trắng Swiss ............................................................22
2.2.

Hoá chất, thiết bị ....................................................................................23
2.2.1. Hoá chất .....................................................................................23
2.2.2. Thiết bị .......................................................................................24
2.2.3. Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao .......................................................25

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................26
2.3.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm ....................................26
2.3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm ..
....................................................................................................26
2.3.3. Phƣơng pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp ......27
2.3.4. Phƣơng pháp xác định tế bào apoptosis dƣới tác dụng của
CPSH ..........................................................................................30
2.3.5. Phƣơng pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm ..33
2.3.6. Phƣơng pháp thử tác dụng của chế phẩm trên chuột thí
nghiệm........................................................................................34
2.3.7. Các phƣơng pháp đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm
sinh học ......................................................................................35

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ ...........................................................................................38
3.1.

Kết quả phân lập các hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps ........38

3.2.

Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc ......39

............................................................................................................................39
3.3.

Kết quả thử độc tính với tế bào của hai chất phân lập ......................49

3.4.

Kết quả đánh giá tác động của CPSH trên mô hình in vitro và in vivo
.................................................................................................................52
ii

Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
KẾT LUẬN ..............................................................................................................64
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................65

iii
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1.1: Các đặc trƣng cơ bản của tế bào ung thƣ ...........................................13
Hình 1.2: Quá trình chết theo chƣơng trình (apoptosis) ....................................15
Hình 1.3: Sự biểu hiện sớm PS trên màng tế bào chết theo chƣơng trình .......16
Hình 1.4: Một số dòng tế bào ung thƣ và dạng sống của chúng .........................17
Hình 1.5: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin .. Error! Bookmark not defined.
Hình 2.1: Loài hải sâm Cercodemas anceps trong nghiên cứu ............................20
Hình 2.2: Tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 trong nghiên cứu ..............21
Hình 2.3: Tế bào ung thƣ vú MCF7 trong nghiên cứu ........................................22
Hình 2.4: Tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 trong nghiên cứu ............22
Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) trong nghiên cứu ...............23
Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS và sản phẩm màu Formazan ..............27
Hình 2.7: Tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lƣợng tế bào .............27
Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS ...........................................................................28
Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50 .............................................................................30
Hình 2.10: Annexin V gắn trên màng tế bào đang chết theo chƣơng trình.......30
Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da ..............................................................33
Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine) .................................35
Hình 2.13: Thƣớc kẹp caliper ................................................................................36
Hình 3.1: Phổ 13C-NMR của chất 1 .......................................................................39
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất 1 ........................................................................41
Hình 3.3: Phổ HSQC của chất 1 ............................................................................41
Hình 3.4: Phổ HMBC của chất 1 ...........................................................................42
Hình 3.5: Phổ COSY của chất 1 .............................................................................43

Hình 3.6: Phổ ROESY của chất 1 ..........................................................................44
Hình 3.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 – hợp chất colochiroside A ............44

iv
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của chất 2 .......................................................................45
Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất 2 ........................................................................45
Hình 3.10: Phổ HMBC của chất 2 .........................................................................47
Hình 3.11: Phổ HSQC của chất 2 ..........................................................................47
Hình 3.12: Phổ COSY của chất 2...........................................................................48
Hình 3.13: Phổ ROESY của chất 2 ........................................................................48
Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 – hợp chất philinopside A ...........49
Hình 3.15: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào HCT116 với hai chất .............50
Hình 3.16: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào Sar-180 với hai chất ...............51
Hình 3.17: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào MCF7 với hai chất .................51
Hình 3.18: Đƣờng cong đáp ứng liều của Sar.180 (A) và MCF7 (B) đối với
CPSH ....................................................................................................................53
Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V .................................................54
Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI .................................................................54
Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V ...................................................54
Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI ...................................................................55
Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH ..................56
Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH ........................56
Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH .....................57
Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH..........................57

Hình 3.27: U thực nghiệm dƣới da của một số chuột thí nghiệm .......................58
Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn sự tăng trọng lƣợng các lô ung thƣ trong quá trình
thí nghiệm ................................................................................................................59
Hình 3.29: Hình ảnh khối u ở chuột tại các lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau
cấy u
....................................................................................................................60
Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình của u rắn ở các lô thí
nghiệm ....................................................................................................................61

v
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ......................................................23
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ........................................................24
Bảng 2.3: Dụng cụ và vật tƣ dùng trong thí nghiệm ............................................25
Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS ............................28
Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS ..................................................29
Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chƣơng trình .................31
Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang...................31
Bảng 2.8: Lô và các thông số trong quá trình thí nghiệm ...................................35
Bảng 2.9: Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa ..............................37
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR 125
MHz, Pyridine-d5) phần aglycon của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo ...
....................................................................................................................40

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR (125
MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đƣờng của các hợp chất 1, 2 và các chất tham
khảo
....................................................................................................................46
Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình của chuột ở các lô thí nghiệm .....59
Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trong quá trình thử nghiệm ...................61
Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng kháng u của CPSH trên chuột
mang u rắn Sar.180 .................................................................................................62
Bảng 3.6: Các chỉ số huyết học của chuột ở các lô thí nghiệm và đối chứng .....63

vi
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

BẢNG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ đầy đủ

ADN

(DNA) Deoxyribonucleic acid

TBUT

Tế bào ung thư

PS

Phosphatidylserine

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

CPSH

Chế phẩm sinh học

UT

Ung thư

ĐCDM

Đối chứng dung môi

ĐCSH

Đối chứng sinh học

EGF

Epidermal growth factor

HeLa

Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line

IC50

Inhibited Concentration at 50%

LD50

Lethal Dose at 50%

TLCT

Trọng lượng cơ thể

MMP-9

Matrix metallopeptidase 9

MTS

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium)

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (Cổng hưởng từ hạt nhân)

OD

Optical Density

vii
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

MỞ ĐẦU
Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loại
bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới. Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ung
thư. Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó
đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên. Như vậy, bệnh ung
thư đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất
của bệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức
to lớn cho tất cả chúng ta.
Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học
về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý. Theo báo cáo của Tổ chức
Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu trên toàn thế giới. Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là
7,6 triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm
13%). Riêng ở Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư. Tổ chức Y tế
thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do
các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo
thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm

2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000
người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngày
càng tăng cao. Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K sẽ thấy rõ ung thư đã
trở thành vấn nạn của xã hội ra sao.
Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trên
thế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau. Trong đó, xu hướng
sàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bật
nhất. Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế
bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có
khả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phối
hợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc của
các tế bào ung thư. Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tác
động đến hầu khắp các cơ quan trong cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới
và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quan
trọng và được ưu tiên hàng đầu.
1
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có
tiềm năng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm
hợp chất có cấu trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp
chất saponin. Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ
Nguyễn Xuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang
nhiều hợp chất saponin. Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm,
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin
có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích:
1. Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải sâm
Cercodemas anceps
2. Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập được trên
một số dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo.

2
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1.

Saponin

1.1.1. Saponin và khả năng kháng u
Saponin là một nhóm hợp chất được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, có
đặc tính hoạt động bề mặt và không bay hơi. Cái tên saponin có nguồn gốc tiếng
Latin là từ “sapo”, có nghĩa là “xà phòng” vì chất này tạo bọt dạng như xà phòng
khi rung lắc mạnh với nước. Hiện tượng trên được giải thích về mặt cấu trúc là do
saponin gồm các aglycone không phân cực kết hợp với một hoặc nhiều gốc
monosaccharide. Sự kết hợp giữa thành phần cấu trúc phân cực và không phân cực
trong các phân tửcủa chúng giải thích vì sao chúng tạo bọt trong nước.
Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá,
hoa và hạt. Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật

và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư (anticancer) [11]. Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene
(Hình 1.1) đặc trưng bởi 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon,
saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là do
steroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khi
triterpenes có đủ 30 carbon. Các thành phần glycone của chúng thường là
oligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liên
kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16].
Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ra
triterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponin
khác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes,
taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình
1.1).Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khác
nhau. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sự
tương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơ
chế tác động hóa sinh học của saponin. Một số saponin đặc biệt với khả năng kháng
u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane đã cho thấy khả năng ức chế hình
thành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu
và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u. Dioscin là 1 thành
phần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông qua
ngăn cản chu trình tế bào và apoptosis. Nhiều phân tử quan trọng khác thuộc về
3
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
oleanane saponin như avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin cùng với
tubeimosides cũng cho thấy vai trò quan trọng của mình [11].
Các nghiên cứu hiện đại cho thấy saponin có khả năng kháng khối u trên

nhiều dòng tế bào ung thư như LA795 [13], MCF7 và MDA-MB-231 [10]. Vài loại
saponin ức chế sự phát triển của tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình và
kích thích apoptosis với giá trị IC50 khoảng 2,5 µM đến 5 µM [10]. Đối với động
vật, một số saponin được nghiên cứu có giá trị LD50 khác nhau như polyphyllin D
thuộc loại steroid có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ
Citrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24]. Trong khi đó, saponin kết
hợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều. Hơn
nữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin với
các yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn.
1.1.2. Cơ chế kháng u của một số saponin
Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớp
cũng rất đa dạng. Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đường
khác nhau.
Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém
nhưng chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u. Chúng làm
giảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là αfetoprotein và ngăn cản sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quá
trình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộc
ERK (ERK-independent NF-kB) [11].
Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung
thư.Những saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn
tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50
đối với tế bào ác tính. Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh,
saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của
cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyển
qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chương
trình thông qua canxi [11].
Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng
kháng ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kích
thích miễn dịch. Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở
4

Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
samạc Australia có khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ung
thư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiều
protein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF. Avincin D và G gây ức chế
sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chương
trình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có
hiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạn
hoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ức
chế trùng hợp tubulin. Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống và
khả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu
trình tế bào ở pha G1. Hay chất saponin được tách chiết từ cây Platycodon
grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào,
ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã
hTERT của telomere.
Spirostanes cho thấy khả năng kháng u mạnh và kích thích hệ miễn dịch.
Trong đó, chất Polyphyllin D trong nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tiềm năng
gây chết theo chương trình thông qua con đường ty thể và lưới nội chất như một số
chất khác. Bên cạnh đó, chất Dioscin trong nghiên cứu tiền lâm sàng lại cho thấy
khả năng ức chế hoạt động phân chia của hầu hết dòng tế bào ung thư máu và khối
u rắn. Phân tích proteomic cho thấy chất này thúc đẩy apoptosis thông qua con
đường ty thể và một số con đường khác. Trong thực tế, chất Formosanin C trong
nhóm này có tác động lên đáp ứng miễn dịch và được sử dụng hỗ trợ cho chất 5fluorouracil (chất đã được sử dụng trong điều trị ung thư). Con đường ảnh hưởng
của Formosanin C là do chất này hoạt hóa caspase-2, biến đổi hoạt động của ty thể
(trong tế bào ung thư ruột kết HT29) [11].

5
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học

Hình 1.1: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin

6
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
1.1.3. Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin
Sự khác nhau trong cấu trúc của saponin chính là khác nhau về loại, vị trí, và
số lượng gốc đường gắn trong liên kết glycoside tại các vị trí khác nhau trong vòng,
qua đó có thể quyết định đặc tính tác dụng đáp ứng sinh học của saponin đó, đặc
biệt là khả năng kháng u. Chúng ta có thể thấy một số mối liên quan giữa cấu trúc
và hoạt động như sau:
-

Tác dụng của aglycone trong khả năng kháng u của saponin: so sánh sự khác

nhau về vị trí và số lượng nhóm hydroxyl trong aglycone cho thấy khả năng khác
nhau của các saponin. TubeimosideII có C-16 nhóm hydroxyl đóng vai trò quan
trọng trong việc điều chỉnh hoạt động sinh học của tubeimosideII và giảm khả năng

gây độc của nó. Nhưng C-17 nhóm hydroxyl có khả năng gây độc kém hơn và C-27
hydroxyl có khả năng kháng u kém nhất [11].
Tác dụng của chuỗi đường trong cấu trúc của saponin: các liên kết đường, số
lượng và thứ tự sắp xếp đường ảnh hưởng đến khả năng của saponin. Ví dụ: với
cùng loại aglycone và độ dài chuỗi đường nhưng các cầu nối liên kết sẽ cho tiềm
năng kháng u khác nhau. 4 disaccharide với 1-3 cầu nối cho tác dụng kém hơn 1-2
hoặc 1-4 cầu nối. Số lượng gốc đường ảnh hưởng đến khả năng kháng u của
saponin. Hoạt động của các ginsenoside có tác động theo thứ tự: monosaccharide
glycoside > disaccharide glycoside > trisaccharide glycoside > tetrasaccharide
glycoside [11].
Tóm lại, sự phát hiện và phát triển của saponin đóng góp rất lớn vào các liệu
pháp ung thư và nhiều thành phần, trong số đó cho đến nay đã được ứng dụng trong
các thử nghiệm lâm sàng. Hầu hết tất cả saponin đều gây cảm ứng chết theo chương
trình cho tế bào khối u, chúng là thuốc được ưa dùng trong các liệu pháp chữa ung
thư vì loại trừ các tế bào khối u bằng apoptosis là biện pháp hữu ích để tăng hiệu
quả cho bệnh nhân, tránh việc bị hoại tử. Mảng kiến thức quan trọng của cơ chế
kháng u của saponin là cần thiết cho việc cải thiện trực tiếp các liệu pháp chống
khối u dựa trên saponin trong tương lai.Mặt khác, các nghiên cứu và thử nghiệm
nên được tập trung vào việc kết hợp giữa saponin và các thuốc kháng u khác.
1.2.

Saponin từ hải sâm

1.2.1. Hải sâm
Hải sâm hay còn được gọi là dưa biển, sâm biển, đỉa biển, là loài động vật
không xương sống. Thân có dạng ống dài như quả dưa, phình ra ở giữa và thon nhỏ
7
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm

Luận văn cao học
ở hai đầu với những gai thịt nhỏ. Phía trước có miệng với vành tua rõ rệt, phía sau
là hậu môn. Dọc thân là các dãy chân ống. Da mềm có các phiến xương nằm rải rác
dưới da. Hải sâm là động vật phân tính, trừ một số loài thuộc bộ Không chân
(Apoda). Trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ. Chúng sống bò trên nền đáy,
ở độ sâu khác nhau, chỉ có một số loài thuộc họ Pelagothuridae là bơi lội. Hải sâm
có khả năng tái sinh rất cao và sức chịu đựng bền bỉ (có thể sống dưới nước tới độ
sâu 6.000m).
Có nhiều loại hải sâm thuộc các chi Holothuria, Actinopyga, Stichopus.
Trong đó, hai loài hải sâm đen và trắng được sử dụng rộng rãi hơn:
 Hải sâm đen (Holothuria vagabunda) có thân màu đen, bụng nhạt màu hơn,
dài 30-40cm.
 Hải sâm trắng (H. scabra) có lưng màu xám, nhạt dần ở hai bên, bụng trắng,
dài 40-50cm, có khi đến 60-70cm.
Trên thế giới, hải sâm có hàng nghìn loài, phân bố ở nhiều nước như Trung
Quốc, Nhật Bản, Úc, Ấn Độ, Malaysia, vùng Đông Phi.... Ở Việt Nam, có bốn loài
đã được phát hiện phổ biến là hải sâm đen, hải sâm trắng, hải sâm vú (Microthele
nobilis Selenka) và hải sâm mít (Actinopyga echinites Jaeger). Chúng có ở khắp
tuyến biển từ bắc vào nam, nhiều nhất ở Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu, Côn Đảo,
Phú Quốc, Kiên Giang. Chúng thường sống ở các dải nông ven bờ đến độ sâu
khoảng 5-7m, chủ yếu ở vịnh và những nơi nhiều đá ngầm. Chúng di chuyển bằng
cách phụt nước hoặc co duỗi các cơ; ăn động vật, thực vật nhỏ ở đáy và chất bã hữu
cơ.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học đã cho thấy hải sâm chứa rất nhiều
chất có các hoạt tính quý báu như hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng
MAO. Đặc biệt là sự có mặt của các hợp chất triterpenes saponin (holothurin) có
hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh đối với nhiều dòng tế bào ung thư người, hứa hẹn
cho việc phát triển các dược phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh ung thư.

1.2.2. Nguồn saponin từ hải sâm
Trước đây, Saponin đã được phân tách từ nhiều loài sinh vật biển như hải
sâm (Nigrelli 1952; Yamanouchi 1955), sao biển (Mackie và Turner 1970), hải
miên (Thompson 1985).Trong hải sâm, saponin là chất chuyển hóa thứ cấp. Về mặt
cấu trúc , chúng là các glycoside triterpene được tạo thành từ các chuỗi
oligosaccharide và aglycone là các holostane-3b-ol, đóng vai trò quan trọng trong
8
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
tác dụng dược lý của hải sâm. Trên thế giới, các nhóm nghiên cứu đã tìm ra ít nhất
59 gylcoside tritecpen.Nhiều saponin xuất hiện trong nhiều loài hải sâm khác nhau
nhưng cũng có nhiều saponin rất đặc hiệu cho loài.
Trong cơ thể hải sâm, saponin phân bố khác nhau và nồng độ saponin cũng
khác nhau trong các khoang cơ thể. Saponin được tìm thấy trong các cơ quan tiêu
hóa, cơ, lớp biểu bì, buồng trứng và tinh hoàn (thay đổi theo chu kỳ sinh sản) và
ống Cuvierian. Saponin tách từ hải sâm thể hiện dược tính cao với khả năng kháng
u, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng nấm,..
Ở Việt Nam, một vài nhóm nghiên cứu đã phân lập saponin từ hải sâm.Trong
đó có nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hải Đăng thuộc viện Hóa học các hợp chất
thiên nhiên đã phân tách được hai hợp chất mới từ loài hải sâm Holothuria
scabravào năm 2007. Trong đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng khối phổ và cộng
hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của hai hợp chất Holothurin A3 và
Holothurin A4 với hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 với
IC50 lần lượt là 0,87 và 0,32 µg/ml (đối với chất Holothurin A3); 1,12 và 0,57 µg/ml
(đối với chất Holothurin A4).
1.3.

Một số phƣơng pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học

1.3.1. Sắc ký cột
Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ làpha
tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và phađảo
YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷtinh
hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rấtquan
trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Kích thước
của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năngtách càng cao, và
ngược lại.Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càngnhỏ thì tốc độ chảy
càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi khôngchảy được).Khi đó
người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC)hoặc áp suất cao
(HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quantrọng,
nó thể hiện khả năng tách của cột.Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,tức là phụ
thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần
tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf
khác nhau. Nhờvào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn
hợp.Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầutách
9
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinhthì tỉ lệ này
cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rfcủa các chất), mà
hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
Cách 1: Nhồi cột khô: Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào
cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp
xếp chặt trongcột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong
suốt.
Cách 2: Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột
trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần
thiết. Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí
gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt,
gãy, dò. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quáthấp thì
sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.3.2. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và địnhhướng
cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica geltrên đế
nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chấttrực tiếp.
Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica geldày hơn), có
thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, ngườita có thể cạo
riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằngdung môi thích hợp
để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trênbản mỏng bằng đèn tử
ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chấthoặc sử dụng dung dịch
H2SO4 10%.
1.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
SpectroscopyNMR)
1.3.3.1. Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR,độ dịch chuyển hoá học (δ) của các protonđược xácđịnh
trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mứcđộ lai hoá của nguyên tửcũng
nhưđặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào nhữngđặc trưng củađộ dịchchuyển hoá
học và tương tác spin mà ta có thể xácđịnhđược cấu trúc hoá họccủa hợp chất.
1.3.3.2.

Phổ 13C-NMR
10

Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon.Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộnghưởngở
một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.Thangđo củaphổ 13C-NMR là
ppm, với dải thangđo rộng 0-230ppm.
1.3.3.3.

Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.Trên
phổDEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất.Tín hiệu của CH và CH3
nằmvề một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350.Trên phổ DEPT
900chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.3.3.4.

Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xácđịnh các tương tác củacác hạt
nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ
yếuthườngđược sử dụng như sau:
-

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực

tiếp H-Cđược xácđịnh nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là
phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trênđỉnh các ô
vuông trên phổ.
Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shif Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép
lại với nhau.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu
diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà
từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tửđược xácđịnh về cấu trúc.
Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn
các tương tác xa trong không gian của các proton không kểđến các liên kết mà chỉ
tínhđến khoảng cách nhấtđịnh trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể
xácđịnh cấu trúc không gian của phân tử.
Như trênđãđề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết
hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phântích, so
sánh, kết hợp khác.Đặc biệtđối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài,tín hiệu phổ
NMR bị chồng lấp nhiều, khó xácđịnh chính xácđược chiều dàicác mạch, cũng
nhưđối với các phân tử có cácđơn vịđường thì việc xácđịnhchính xác loại đường
cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụngphương pháp thuỷ phân rồi
11
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
xácđịnh bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặcGC-MS với cácđường chuẩn dự

kiến.
1.4.

Ung thƣ

Ung thư là một nhóm bệnh liên quan đến phân chia tế bào, trong đó một số tế
bào thoát khỏi sự kiểm soát, sự biệt hoá sinh lý và tiếp tục nhân lên.Những tế bào
này có khả năng xâm lấn và phá huỷ các tổ chức xung quanh.Đồng thời chúng di trú
và đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau để hình thành nên khối u mới. Cuối
cùng ung thư gây tử vong do các biến chứng và rối loạn chức năng cơ thể[22, 23].
Quần thể tế bào ung thư có sự thay đổi khá rõ nét về mặt hình thái và chức
năng so với tế bào bình thường.Về mặt hình thái, tế bào ung thư có nhân lớn hơn
bình thường, nhân chia thùy hoặc có nhân khổng lồ phân chia mạnh gọi là nhân
quái. Tế bào chất có nhiều tổn thương thoái hóa như nhiều hang, hốc, chất chế tiết,
thể vùi. Qua đó, tỷ lệ giữa nhân và tế bào chất bị phá vỡ. Về mặt chức năng, tế bào
ung thư biệt hóa kém nên không thực hiện được những chức năng bình thường và
chúng tiết ra các chất đặc trưng của các dòng tế bào như µFP, CA125 (ung thư
buồng trứng), CA25 (ung thư đại tràng), HCG (ung thư nhau thai, tinh hoàn)…
Khi quan sát các quần thể tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã đưa ra ba
học thuyết để giải thích nguồn gốc của quần thể này:
 Thuyết đơn dòng: Là quan niệm kinh điển cho rằng khối u phát sinh từ một
tế bào mẹ nhân lên. Ví dụ: Ở bệnh bạch cầu tủy trên phụ nữ da đen thấy đồng
nhất loại tế bào thương tổn nhiễm sắc thể số 10. Các tế bào này đều tiết men
Glucose-6-phosphate dehydroglubuline.
 Thuyết đa dòng: Dựa trên kết quả quan sát hình thái và chức năng cho thấy
tổ chức ung thư có nhiều loại tế bào nên khi chuẩn đoán tế bào học dễ nhầm
lẫn và có nhiều dấu chuẩn sinh học (marker).
 Thuyết về kém ổn định gen của TBUT: Có thể ban đầu là một dòng, do gen
ung thư không ổn định nên có các tế bào biến dị sinh ra hàng loạt các tế bào
hỗn hợp. Ví dụ: u lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ hoặc các loại ung thư

phổi thể hỗn hợp, ung thư mô liên kết thể hỗn hợp.
Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thư thu nhận và
biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên đặc
tính phức tạp về mặt tổ chức của bệnh, bao gồm: duy trì tín hiệu tăng sinh; trốn
tránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân lên gần
như bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu; hoạt hóa quá trình xâm lấn và di
12
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
căn[7].Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn đánh giá tác động của chất đến quá
trình gây chết tế bào ung thư nên chúng tôi quan tâm nhiều đến đặc điểm chống lại
sự chết của tế bào ung thư.

Hình 1.2: Các đặc trƣng cơ bản của tế bào ung thƣ[7]
Có thể nói rằng, đặc điểm cơ bản nhất của tế bào ung thư liên quan đến khả
năng duy trì sự tăng sinh vô hạn của chúng. Các mô bình thường sẽ điều khiển các
chu kỳ phân chia một cách hợp lý và chính xác. Do đó, số lượng tế bàoluôn được
đảm bảo cân bằng, qua đó, cấu trúc cũng như chức năng của mô được đảm bảo ổn
định. Các tế bào ung thư có khả năng duy trì tín hiệu tăng sinh bằng một số con
đường khác nhau. Chúng có thể sản xuất các yếu tố tăng trưởng cho chính mình để
tự kích thích tăng sinh. Ngoài ra, chúng có thể gửi các tín hiệu kích thích các tế bào
thường để hỗ trợ hình thành chất nền khối u, cung cấp các yếu tố tăng trưởng cần
thiết khác cho khối u[27, 28].
Trong quá trình phát triển, các tế bào mới vẫn thường xuyên được sinh ra
thay thế cho các tế bào chết trong mô để đảm bảo về số lượng tế bào cho mô hoạt
động bình thường.Các tế bào có thể bị chết vì đã già, vì sai hỏng ADN, vì tác động

cơ học hay vì mô cần giảm số lượng tế bào.Trong thực tế, tất cả các tế bào đều có
sẵn chương trình để chết.Nhưng ở trạng thái hoạt động bình thường luôn có một
loạt các tín hiệu ngăn cản chúng thực hiện quá trình chết. Khi tín hiệu này mất đi,
hoặc có một tín hiệu gây chết nào đó mạnh hơn được hoạt hóa, tế bào sẽ đi vào chu
13
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm


Luận văn cao học
trình chết của chúng. Các tín hiệu này rất cần thiết để giữ tính cân bằng trong mô.
Các con đường chết cơ bản của tế bào là: chết hoại tử (necrosis) và chết theo
chương trình (apoptosis).
Sự chết tế bào theo cơ thế hoại tử (necrosis) xảy ra khi tế bào chịu nhiều áp
lực quá mức gây nên tình trạng sinh hóa không tương thích với sự tồn tại bình
thường của tế bào. Trong trường hợp này, các tế bào sẽ dừng chuyển hóa, ADN
nhân ngưng tụ, tập trung nhiều ở rìa nhân và các thành phần tế bào bắt đầu phân
hủy nhanh chóng không kiểm soát được.Nhiều chất nội bào phát tán ra khỏi tế bào,
gây ảnh hưởng đến môi trường xung quanh tế bào, tạo nên các tín hiệu tiêu cực cho
những tế bào xung quanh. Đối với khối u, chết theo cơ chết hoại tử có thể phát tín
hiệu gây viêm vào môi trường xung quanh, thu hút sự tập trung của các tế bào miễn
dịch. Bên cạnh việc tiêu diệt tế bào khối u, những tế bào này lại có tác động tích cực
đối với khối u như việc giúp hình thành mạch máu. Ngoài ra, khi một tế bào bị chết
hoại tử có thể giải phóng các yếu tố sinh học như IL-1a có khả năng kích thích các
tế bào lân cận phát triển, một lần nữa đã tạo điều kiện tốt cho tế bào ung thư phát
triển. Do vậy, việc chết theo cơ chế hoại tử của tế bào dường như có lợi cho tế bào
ung thư [29].
Sự chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) là một quá trình hoạt động
theo thứ tự được lập trình cho tế bào. Quá trình xảy ra bằng cách tháo dỡ dần các

cấu trúc tế bào nhưng không lan truyền đến các tế bào xung quanh. Tín hiệu ban
đầu có thể đến từ ngoại bào với sự tham gia của các thụ thể chết và các phối tử
(ligand), hoặc đến từ nội bào thông qua sự giải phóng các yếu tố tiền apoptosis như
cytochrome-c từ khoảng gian màng của ty thể. Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặc
trưng bởi sự phá vỡ mối liên hệ tế bào – tế bào.Những tế bào chết co tròn lại, màng
nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất.Trong nhân, chất
nhiễm sắc cô đặc tối đa, nằm sát vào màng nhân tạo các phần hình lưỡi liềm(Hình
1.3).Đây là sự kiện rất đặc biệt của apoptosis mà không thấy trong bất kỳ trường
hợp nào khác.

14
Nguyễn Khắc Sinh

K22-Sinh học thực nghiệm