Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để sản xuất enzyme lypase với canida sp 99 125

Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để sản
xuất enzyme Lypase với Canida sp. 99- 125


Tóm tắt lý thuyết
Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) được sử dụng để tối ưu hoá môi trường sản xuất
Lypase với Canida sp. 99- 125. Bước đầu, ma trận Plakett-Burmen đã được sử dụng để
đánh giá ảnh hưởng của các thành phần khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Dầu đậu
nành, bột đậu nành và K2HPO4 có ảnh hưởng đáng kể đến việc sản xuất lipase. Nồng độ
của ba yếu tố được lựa chọn ở mức phù hợp nhất sau đó tổng hợp lại và phân tích bề mặt
phản ứng. Điều kiện trên cho phép xuất lipase được tăng lên 5.000-6.230 IU / ml Trong
hệ thống bình lắc. Sự lên men lipase trong 5L lên men đạt 9.600 IU / ml.
© 2006 Nhà xuất bản Elsevier B.V.
Từ khoá: Lipase, Lên men, tối ưu hoá môi trường, phương pháp đáp ứng bề mặt.


1. Mở đầu:
Lipase (EC3.1.1.3) xúc tác cho quá trình thủy phân triglyceride các acid béo và glycerol,
được sử dụng rộng rãi trong việc thay đổi thành phần chất béo và các loại dầu. Trong
những thập kỷ gần đây, lipase được chứng minh rằng có thể được sử dụng trong tổng hợp
enzyme không chứa nước cho sản xuất hợp chất quang học tinh khiết. Lipase có tiềm
năng trong công nghiệp vì là chất xúc tác cho quá trình thủy phân, tổng hợp và chuyển vị
este của tri-acyglycerols do có nhiều ưu điểm như được sản xuất nhiều và đa dạng.
Lipase từ Canida sp. là lipase có tình thương mại hoá nhất. Nó rất hữu ích trong các chuỗi
chuyển hoá sinh học. Tiêu biểu không chỉ để thuỷ phân ester, trans-esterify triglycerides,
giải quyết các hỗn hợp racemic, mà còn có thể tổng hợp este và peptide.
Hoạt động của lipase và việc sản xuất phụ thuộc vào thành phần của môi trường lên men.
Việc tối ưu hóa chung bằng cách thay đổi một tham số trong khi vẫn giữ các biến còn lại
ổn định ở mức độ liên tục. Bất lợi duy nhất của việc tối ưu hóa là nó không phản ánh
những tác động tương tác giữa các biến được sử dụng và không biểu hiện chính xác hiệu
quả của các biến khác nhau dựa vào hoạt động của enzyme. Để khắc phục những vấn đề

lớn này, các nghiên cứu được thực hiện, nhờ vào việc sử dụng phương pháp đáp ứng bề
mặt (RSM), áp dụng thuật toán và kỹ thuật thống kê diện rộng để xác định tầm ảnh
hưởng của các biến, đồng thời tối ưu hóa các quy trình công nghệ sinh học khác nhau.
Ma trận Plackett-Burmen (P-B) được thiết kế như một ma trận cấp 2, yêu cầu phải chạy ít
nhất 1 phép so sánh, có thể được sử dụng để xác định các biến độc lập từ danh sách dài
các yếu tố, sau đó chọn biến tối ưu nhất. Đường kẻ biến thiên theo phương pháp gốc toạ
độ, dọc đường gốc mà đi lên, theo hướng tăng dần (giảm) tuỳ thuộc vào phản ứng.
Phương pháp đáp ứng bề mặt – Thiết kế cấu trúc có tâm có thể tìm ra các mối quan hệ
giữa các biến và phản ứng, hơn nữa, sự tối ưu của mỗi biến có thể thu được bằng sự khác
biệt xấp xỉ. Kỹ thuật này được sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa các thông số hóa lý và
các yếu tố của các quá trình lên men tầm trung với vi sinh vật khác nhau. Có một số
nghiên cứu dựa vào RSM để sản xuất lipase. Nhưng các phương pháp được sử dụng trong
thí nghiệm chỉ thay đổi nguồn cacbon.

Tan et al. đã thực hiện một nghiên cứu sơ bộ trong sản xuất lipase với Candida sp. 99125. Sản lượng lipase thu được tối đa đạt 8.300 IU / ml trong 30 l lên men. Hiện nay,
phương pháp bề mặt đáp ứng bao gồm ma trận Plackett-Burmen, con đường tối ưu hoá
nhất và thiết kế tổng hợp tối ưu nhằm so sánh và tối ưu hóa tiên tiến của các thành phần
môi trường bao gồm nguồn cacbon , nguồn nitơ và hợp chất vô cơ cho sản xuất lipase.


2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Vi sinh vật
Candida sp 99-125 được bảo quản trong môi trường thạch nghiêng ở nhiệt độ 4 oC trong
phòng thí nghiệm. Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường thạch chứa (W/v) 0,2% cao
nấm men, 0,5% peptone, 1% glucose và 2% agar. Môi trường nghiêng được ủ ở nhiệt độ
26oC trong 72 tiếng.
2.2 Hóa chất
Dầu oliu được sử dụng như một loại hóa chất. Tất cả các hóa chất khác được coi như chất
phân tích. Dầu đậu nành và bột đậu nành có thể mua được ở các chợ địa phương.
2.3 Chất truyền nhiễm

Giống được cấy trong môi trường chứa dầu đậu nành (4%), bột đậu tương (4%),
K2HPO4 (0,1%), KH2PO4 (0,1%). Sau khi cấy ở nhiệt độ 26 oC trong 220 rpm 48 tiếng,
2ml huyền phù (3 × 108 tế bào / ml) như là chất truyền nhiễm cho bình lắc 250ml có
50ml môi trường sản xuất
2.4 Sản xuất enzyme Lipase
2.4.1 Hệ thống bình lắc
Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 25 phút. Thành phần trong môi trường và các
cấu tử được sử dụng trong thành phần biến đổi theo sơ đồ ma trận. pH ban đầu trong
khoảng từ 6 đến 7. Mẻ cấy được ủ ở 26 oC trong 120 tiếng trong vòng lắc duy trì ở 20
rpm.
2.4.2 5 lít chấy lên men
5 lít chất lên men truyền trong môi trường thuận lợi được khử trùng ở 121 oC trong 25
phút. Sau khi làm lạnh ở nhiệt độ 26 oC, quá trình lên men được khởi tạo bằng cách truyền
7% (v/v). Môi trường được ủ ở 26oC và 220 rpm.
2.5 Khảo sát hoạt tính Lipase
Hoạt tính Lipase được xác định theo phương pháp nhũ hóa dầu oliu. Axit béo tạo ra được
xác định bằng cách chuẩn độ với 0.05 mol/L NaOH. Một đơn vị tính của lipase định
nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng axit béo 1 mol trong một phút dưới nhiệt
độ 40 ◦C.


2.6 Thiết kế thí nghiệm
Trong các thí nghiệm sơ bộ, chúng ta đánh giá nhiều loại carbon và nguồn nitơ, muối vô
cơ cho sự thích nghi của vi sinh vật để duy trì quá trình sản xuất Lipase do Candida sp.
99-125. Sơ bộ dữ liệu chỉ ra rằng các yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất nuôi cấy mẻ
Lipase là dầu đậu nành, bột đậu nành, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 and
Span 60. Vì thế, 7 thành phần được chọn để tối ưu hóa thông qua RSM.
2.6.1 Thiết kế Plackett-Burmen
Các ảnh hưởng của bảy yếu tố về năng suất lipase đã được nghiên cứu sử dụng phương
pháp luận của Plackett-Burmen. Mỗi yếu tố độc lập đã được thử nghiệm ở hai cấp độ,

mức cao (1) và (-1) ở mức độ thấp. Hai mức của bảy yếu tố là dầu đậu tương (X1): 3% và
4%; (NH4) 2SO4 (X2): 0,1% và 0,125%; K2HPO4 (X3): 0,3% và 0,4%; KH2PO4 (X4):
0,1% và 0,125%; bột đậu tương (X5): 5,5% và 6,5%; MgSO 4 (X6): 0,05% và 0,06%;
Span 60 (X7): 0,1% và 0,125%. Mười hai thí nghiệm đã được thực hiện trong thí nghiệm
này. Ba yếu tố giả được sử dụng để ước tính các lỗi thử nghiệm và kiểm tra tính đầy đủ
của các mô hình đầu tiên đặt ra. Các phần mềm calculational SAS (phiên bản 8.0) được
sử dụng để phân tích hồi quy của các dữ liệu thực nghiệm thu được. Chất lượng phù hợp
của phương trình mô hình đầu tiên đặt ra được thể hiện bằng hệ số xác định R2, và ý
nghĩa thống kê của nó được xác định bằng một chiếc F-test. Ý nghĩa của các hệ số hồi
quy đã được thử nghiệm bởi t-test.
2.6.2 Đường lên xuống sự thấm
Dựa trên các kết quả thu được từ các thiết kế P-B, phương trình mô hình đầu tiên đặt ra là

Y được phản ứng dự đoán, β0, βi, là các hệ số không đổi, và xi là các biến độc lập hoặc
các yếu tố. Các hướng đi lên mạnh nhất (gốc) là hướng trong trong đó Y tăng (giảm)
nhanh nhất. Đường thường lấy là con đường nhanh nhất đi lên (gốc) dòng qua trung tâm
của khu vực chủ yếu vs vùng xung quanh đến sát bề mặt. Như vậy, bước dọc theo con
đường là tỷ lệ thuận với hồi quy hệ số βi. Con đường đi lên mạnh nhất (gốc) bắt đầu từ
trung tâm của mô hình đầu tiên. Để di chuyển xa
trung tâm mô hình đầu tiên trên con đường dốc đi lên (gốc), ta chuyển 1,0575, -0,6925,
-0,037 trong dầu đậu nành, đậu tương bột, K2HPO4 trực tiếp, tương ứng. Các đơn vị này


mới được xác định theo phạm vi nồng độ của mức độ thống nhất từ mô hình đầu tiên và
tỷ lệ hệ số ước tính từ lần đầu tiên đặt ra mô hình phương trình. (1)
2.6.3. Thiết kế phức hợp trung tâm (CCD) và phản ứng phân tích bề mặt
Một CCD với năm cấp độ mã hóa được sử dụng để khám phá tiểu vùng của bề mặt phản
ứng trong khu vực xung quanh của việc tối ưu. Trong ba yếu tố, việc xét này thực chất là
đầy đủ 23 thiết kế thừa có sáu điểm dọc trục (hay gọi là điểm sao) và sáu nhân rộng các
điểm trung tâm, kết quả là tổng số 20 thí nghiệm. Các kết quả thực nghiệm của CCD là

trùng với một bậc hai phương trình đa thức bởi một nhiều kỹ thuật hồi quy.

Y là dự đoán phản ứng, β0, βi, βii, βij là các hệ số không đổi, và xi, xj là các biến mã hóa
độc lập hoặc các yếu tố. Hình dạng của phương trình mô hình thứ hai để được thể hiện
bằng hệ số xác định R2, và ý nghĩa thống kê của nó được xác định bằng một chiếc F-test.
Ý nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm tra bằng t-test.


3. Kết quả và thảo luận
3.1. Thiết kế Plackett-Burmen
BẢNG 1
Các kết quả thử nghiệm của sản xuất lipase bởi một Plackett-Burmen thiết kế được thể
hiện trong
bảng 1. Analysed bởi phần mềm SAS, một mô hình thứ tự đầu tiên được trang bị cho các
dữ liệu thu được từ cuộc thí nghiệm. Những ảnh hưởng của bảy yếu tố: dầu đậu nành
(X1), (NH4) 2SO4 (X2), K2HPO4 (X3), KH2PO4 (X4), bột đậu tương (X5), MgSO 4
(X6) và Span 60 (X7) được tính toán là 211,5,
-40,7, -74, 1, -138,5, 24, 42.7, tương ứng. Chúng tôi thu được theo mô hình trong các
biến mã hóa.
Thứ tự đầu tiên phương trình mô hình :
Y1 (IU/ml) = 493.3 + 211.5X1 − 40.7X2 − 74X3 + X4 − 138.5X5 + 24X6 + 42.7X7
3.2. Đường dốc lên (xuống).
Dựa trên các phương trình mô hình đầu tiên để thu được và ba yếu tố ảnh hưởng quan
trọng trên, con đường dốc đi lên (gốc) đã được xác định để tìm hướng thích hợp thay đổi
biến tăng hoặc giảm nồng độ theo các dấu hiệu của tác động chính để cải thiện sản xuất
lipase. Con đường đi lên dốc bắt đầu từ trung tâm của thiết kế Plackett-Burmen và di
chuyển dọc con đường, trong đó nồng độ của dầu đậu tương tăng, trong khi bột đậu
tương và K2HPO4 giảm. Thiết kế và kết quả của con đường đi lên của các thí nghiệm
mạnh nhất là thể hiện trong Bảng 3. Người ta thấy rằng các phản ứng cao nhất được 5980
IU / ml khi vừa là: (w / v) dầu đậu tương 4,56%, bột đậu tương 5,31% và K2HPO4

0,31%. Nó gợi ý rằng điểm là gần khu vực sản xuất tối đa phản ứng.


3.3. Thiết kế hợp chất trung tâm và nghiên cứu các phản ứng bề mặt
Thiết kế hợp chất trung tâm (CCD) được tiến hành trong vùng lân cận tối ưu để xác định
vị trí các nồng độ tối ưu thực sự của dầu đậu nành (U1), bột đậu tương (U2) và K2HPO4
(U3) cho sản xuất lipase. Các cấp độ của các biến cho các thí nghiệm CCD được lựa chọn
theo các kết quả trước đó.
Ma trận thiết kế và thử nghiệm tương ứng dữ liệu được thể hiện trong Bảng 4.
Thiết kế CCD được trang bị với đa thức bậc hai. Sự phù hợp của mô hình đã được kiểm
tra bởi hệ số xác định R2, mà đã được tính toán là 0,9108, chỉ ra rằng 91.08% của những
biến đổi trong các phản ứng có thể được giải thích bằng mô hình. Ý nghĩa thống kê của
bậc hai mô hình phương trình được đánh giá bởi các phân tích F-test phương sai trong đó
tiết lộ rằng hồi quy này có ý nghĩa thống kê (P <0,0004) ở mức 99% của mức độ tin cậy.
Nó chỉ ra rằng bột dầu đậu tương và đậu tương có tầm quan trọng cao (P = 0,0094 và
0,0042, tương ứng) trên sản xuất lipase, vì dầu đậu tương là carbon và năng lượng nguồn
lực cho sự căng thẳng và có hiệu lực quy nạp vào sản xuất lipase. Mặt khác, bột đậu
tương được cung cấp nitơ nguồn lực để hình thành các enzyme (lipase) trong sự căng
thẳng. Các tác động qua lại của mỗi yếu tố, tuy nhiên, không có ý nghĩa.
Các lô đường viền được mô tả bởi phương trình mô hình (Y2) làđại diện trong hình. 1-3.
Nó chỉ ra rằng lipase tối đa năng suất đạt 6200 IU / ml khoảng. Nồng độ tối ưu cho ba
thành tố như thu được từ tối đa điểm của mô hình được tính bằng các phần mềm SAS
được 4,187%, 5,840% và 0,284% đối với dầu đậu nành, bột đậu tương và K2HPO4,
tương ứng. Mô hình dự đoán tối đa phản ứng của 6218 IU / ml sản lượng lipase cho thời
điểm này.


3.4. Xác minh các điều kiện tối ưu
Để xác nhận các kết quả này, quá trình lên men lipase được thực hiện với một môi trường

nuôi cấy đại diện cho điểm tối đa và năng suất lipase 6230 IU / ml (trung bình của ba lần
lặp lại). Kết quả cải thiện khoảng 20% so với tối ưu hóa biến duy nhất của môi trường
nuôi cấy, trong đó sản lượng lipase là 5000 IU / ml. Các cũng tương quan giữa giá trị dự
đoán và đo các thí nghiệm biện minh cho tính hợp lệ của các mô hình phản ứng và sự tồn
tại của một điểm tối ưu. So với kết quả báo cáo trên, sản lượng lipase đạt 9.600 IU / ml
trong 5 l lên men (Thể hiện trong hình. 4.) cao hơn so với kết quả trong 30 l lên men đề
cập trong Ref. 15. Thời gian lên men, tuy nhiên, kéo dài đến khoảng 168 h. Người ta tin
rằng sản lượng lipase trong thang điểm 30 l lên men trong điều kiện tối ưu này sẽ cao
hơn.


4. Kết luận:
Các phương pháp đáp ứng bề mặt cho phép sàng lọc nhanh những yếu tố ảnh hưởng quan
trọng và phát triển của một mô hình đa thức để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy trong việc
sản xuất lipase từ Candida sp. 99-125. Giá trị R 2 là 0,91 cho thấy sự phù hợp của mô hình
với các dữ liệu thực nghiệm. Mô hình đã được dự đoán chính xác điểm sản xuất lipase tối
đa. Các môi trường nuôi cấy tối ưu là (w/v) dầu đậu tương 4,187%, bột đậu nành 5,840%,
K2HPO4 0,284%, KH2PO4 0,1%, (NH4) 2SO4 0,1%, MgSO4 0,05% và Span 60 0,1%.
Các mẻ lipase tăng lên đến 6230 và 9600 IU / ml trong hệ thống bình lắc và 5 l lên men
tương ứng, thực tế là cao hơn so với kết quả báo cáo.