báo cáo phân tích thực phẩm

MỤC LỤC
Bài 1; Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm vả các phương pháp
tiệt trùng vi sinh vật 3
Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 6
Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10
Bài 4: phương pháp quan sát ví sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16
Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19
Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20
Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật 23
Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35
Bài 14: Định lượng tồng vi khuẳn hiếu khí bằng
Bài 14: Định lượng tông VI khuẩn hiếu khí bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc 37
Bài 15: Định lượng Cohíorm bằng phương phápMPN 39
Bài 19: Phương pháp định lượng E.coìi trong thực phẩm 41
Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm 43
Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Baciỉỉus cereus trong thực phẩm....46
Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Slaphiỉococcus aureus
trong thực phẩm 48
Bài 24: Phưcmg pháp phân tích Cỉostridium perfringens trong thực phẩm 50
BÀI 1; THIÉT BỊ, DỤNG cụ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẶT VÀ
CÁC PHƯƠNG PHAP TIỆT TRÙNG VI SINH VẶT
Báo cáo thực tệp
ì. Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi ấy vi sink vật?
Yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi siỉib vật;
- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín
- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt.
- Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể
dùng hộp nhôm đê đựng các dụng cụ trên đê khử trùng.
2. Công dụng và cách sử dạng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh

vội?


Cồng dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí ngbỉệtn vi sinh
vật:
a. Nồi hấp ướt (autoclave):
a. Nồi bấp irơt (autoclave);
Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ờ áp suất cao, được sử dụng để hấp khử trùng
mò trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm.
b> Kíììb biển vi:
Còng dụng: dùng đề nghiền cửu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái,
sinh lý nhờ vào khả năng phỏng đại của kính,
c> Các dụng cụ tbí Iigbiệui
Dụng cụ thúy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác,ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que
trang, ống đong, cốc đong, bìnhđịnh mức...
- Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinhvật.
- Lá kính (lamelle): dùng để đậỵ lên vết bôi trên tiêu bản cố đính vi sinh vật trong qua trình nghiên cửu.
- Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy vàphân lập của te bào vi sinh vật.
- Que trãi: phân lập VI sinh vật theo phương pháp trãi đĩa.
- Que cấy:
+ Que cấy đầu tròn: dùng đê thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi khuẩn, nấm men.
+ Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trường rắn.
+ Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm.
- Micro pipette: sứ dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường.
4. Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cẩy vi sinh vội ?
Phinmg pháp tiệt trùng dụng cụ và môi tru-ÒTig nuôi cấy vi sinh vật:
a. PhưoTig pháp lý học:
Nhiệt khô:
- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thúy tinh, phương pháp thường dùng là đốt trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.
- Đối với dụng cụ thúy tinh có thể gói và sấy ờ 160°c trong 1 -2 giờ hoặc I80°c

trong 30 phút.
trong 30 phút.
Nhiệt ám:
- Phương pháp luộc: cho vặt khử trùng vảo nước sôi, nhiệt sẽ thẳm nhanh vào
mẫu vật làm cho proteín đông kết, dẫn đến giết chết VI Sinh vật, Chi diệt tế bào sinh
dương, bào tứ vẫn còn.


- Phương pháp Pasteur: chi diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tứ và vi
khuẳn hoại sinh. Phương pháp này thưởng dùng ờ nhiệt độ 70-75 c trong thời gian
10-15 phút.
- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80°C, mỗi lằn 3060 phút và liền tiếp trong ba ngày liền,
- Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Thường dùng ờ
nhiệt độ 121°c trong 15-30 phút,
Diệt trùng bức xạ:
- Tia tử ngoại haỵ UV: chi sát trung bề mặt, không xuỵên sâu vào mẫu vật.
- Tia âm cực dùng trong tiệt trung dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẳm. Vật khử
trùng phải bao gói kính.
4
Diệt trung bẵng cách ỉọc:
- Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sử, araimte, cellulose,... cỏ kích
thước lồ lọc từ 0,2-0,45thường dùng đê lọc những vặtphẳm lòng không khứ trùng
bằng nhiệt được.
- Đối với khứ trung không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang
bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẫn.
b> Phương pháp hóa học.
- Chi sát khuẳn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu.
- Chất diệt khuẳn và tẳỵ uế: phenol, formol? hợp chất clor...

BÀI 2: CÁCH PHA CHÉ CẮC LOẠI MÔI TRƯỜNG
I. TRẢ LỜI CÂU HỎI
1. Trình bày khái niệm môi trường vả phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vậi
• Khái niệm môi trường dinh dưỡng
Môi trường đinh dưỡng là hỗn hợp các chất đinh dưỡng và các chất này có
nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khứ, áp suất thẩm thấu cúa tế bào và sự ồn định cúapH
trong mồi trường, trong đỏ các chất đinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá
trình trao đồi chất nội bào.
• Phân loại môi trường dinh dưõng
o Theo nguồn gốc
Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa,
khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám.
Môi trường tồng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần cúa chúng được
Môi trường tồng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần cúa chúng được
xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen,
EMB
Môi trường bán tồng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,
ví dụ như: PGA, giá đậu đường
o Theo trạng thái vật lý
Môi trường lòng: thành phần mồi trường này không chứa agar và thường được
sứ dụng để nghiên cứu quá trình tồng hợp cúa vi sinh vật.
Môi trường đặc: cứ 1 OOOml mồi trường có 15-20 Agar
Môi trường bán lòng: chứa khoảng 0,3 -0,7% agar
o Theo công dung
Môi trường phân lập
Mỏi trường tăng sinh
Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng
Môi trường thứ nghiệm sinh hóa
2. Trình bày quỉ trình pha chế mỏi trường nuôi Cứy Ví sinh vật
Bao gồm các bước sau:

• Chuẳn bị dụng cụ
• Cân hóa chất
• Phối chế tạo môi trường nuôi cấỵ


• Điều chình độpH của môi trường
• Phân phối môi trường vào dụng cụ
• Khử trùng môi trường
• Làm thạch nghiên, thạch đứng, đô thạch vảo đĩa petri
• Làm thạch nghiên, thạch đứng, đô thạch vào đĩa petri
• Kiên tra độ vô trùng và bảo quản
3. Yêu cầu cùa mòi trường trong đĩa petrì, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch
đứng
• Làm thạch nghiêng:
Cần tiến hành ngay sau khi khứ trùng môi trường và môi trường chưa đông
đặc.
- Đặt ống nghiệm có môi trường lèn giá đặt nghiêng và không được
đê môi trường chạm vào nút bông.
- Đe yên cho đến khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng,
nhẵn và liền tục
• Làm thạch đứng:
- Đặt các ống nghiệm có môi trường là thạch đứng vào gí á, để yên cho môi
trường đông đặc
• Đô môi trường vào đĩa petri:
- Toàn bộ quá trình đô thạch vảo đĩa petri được thực hiện trong tủ cây vô
trung và gồm các thao tác sau:
G Mờ bao giấy gỏi các đĩa petri
G Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường
G Tay còn lại mờ nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn.
o Mờ hé nắp đĩapetrí. Nghiêng bình vảrỏt môi trường vảo đĩapetri.

o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trưởng được phân phối đều bên trong đĩa.
o Đê yên cho môi trường đông đặc,
G Lật ngược đĩa lại và bảo quản,
4. Giâi thích tại sao không phân phối tttôĩ trường vào đĩa petri trước khỉ khử
trừng
Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiẫm một số tạp
chất vì vậy sau quá trình nuôi cấỵ khó có thể xác định được kết quả. Có thể tránh được


hơi nước tiếp xúc vảo môi trường nuôi cấỵ và vì sau khi cấỵ phải để yên môi trường
đê cứng mối trường
5. Đĩa peưi chửa môi truửng trước khỉ cấy Ví* sình vặt nên úp hay ngửa? Tai
sao?
Nên để ngứa bời vì làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật
khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nước.
6. Ỷ nghĩa của việc pha chế môi ưường?
Chúng ta phải pha che môi trưởng cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng là hỗn
hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxỵ hóa- khứ, áp
suất thẳm thấu cua tế bào và sự ần định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể
sinh trường và phát triền một cách tối ưu nhất có thể.
Làm môi trường đề thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời đê nuôi cấỵ và nghiên cứu các đặc điêm sinh học của chúng
7. Yẻu cầu của mội mòi trường đỉnh đưỡiìg nuối cây
Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: cỏ đủ chất dinh dưỡng cằn thiết, cỏ độ pH
phù hợp. cỏ độ nhớt nhất định, không chửa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng,
đảm bảo sự phát triên ôn định của VI Sinh vặt.
8. Nêu ý nghĩa của các thành phần írong MÔỈ trường nuôi cấy?
Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, nắng lượng vả ni tơ. Cao
thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclềôtit, axit hữu cơ5 vitarain vả một số chất
khoáng. Cao nấm men là nguồn phong phủ các vítamín nhóm B cũng như nguồn ni tơ

và cacbon.
9. Có bao nhiêu loaipepíone?
Có 3 loại peptone
G Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò,
cazêin,... dùng lảm nguồn cacbon, năng lượng vả Tiítơ. Cao thịt bò chửa các
axứ amin, peptit, nuclêôtit, axứ hữu cơ, vitarain vả một số chất khoáng,
G Từ thực vặt: chiết xuất từ đậu nành,....
o Nấm men: cao nấm men, Cao nâm men là nguôn phong phũ các vitamin nhóm
B cũng như nguồn nítơ và cacbon).
lỡ. Cơ chế ỉànt trong nước của lòng trắng trứng


Cách làm trong nước bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước ti lệ 1:1 —►
đánh tan nôi bọt —► cho vào 1 lít môi trưởng —* đun sôi khoảng 5 phút —>áê nguội
—»■ lắng cặn -^lọc.
Cơ che: các proteìn trong lòng trắng trứng như albumín, ovalburnín dưới tác động
cua sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, các liên kết trong
protein được kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức —► hình thảnh lực hút tĩnh điện với
các ion, bụi bẳn cỏ trong nước —► sau khi lắng, lọc nước trong hơn.
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CÁY VI SINH VẶT
PHÂN LẶP SINH VẶT
I. Nguyên tắc
1. Mục đích của việcnuôi cấy
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cằn nghiên
cửu.
- Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng.
- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết.
- Nghiền cứu các đặc tính sinh học và sự phát triên từng loại của vi sinh vật.
2> Nguyên tắc nuôi cắy vi sinh vật
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp

nhiềm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài.
Môi trướng và dụng cụ nuôi cấy đều phải khứ trùng triệt để. Duy trì tốt các điều
kiện nuôi cây đê VI sinh vật phát triên thuận lợi.
n. Dụng cụ, môi triròng và hóa chất
m. Tiến bànb tbíiigbỉệm
1. Phưong pháp cấy truyền tbạch (môi trường thạch).
ỉ. ỉ. Cấy truyền trên thạch đĩa
Có thể cấy trên đĩa pêtrí theo 1 trong 2 cách sau:
* Dùng que cấy đẩu tròn và thực hiện theo trình tự sau:
- Đê đĩa pêtri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ớ
phương pháp chung.
- Tay trái hé mờ nắp đĩa pêtri vừa đú để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chỏng lướt que cấy lên mặt thạch theo một
trong các kiêu sau:


+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a)
+ Theo những đường song song (hình 3.3b)



Hình 3.2: Cách dằn vi sinh vật iền bê mật môi (rường
A — que gạt B — dằn bằng que gạt; C: Sự sinh (rường của vsv sau. khi dàn đêu
bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của vsv sau. khi dàn bằng que cấy
1.2. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
- Phương pháp này đùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
Sứ dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp
theo:

+ Hoà giống ớ đầu que cấy vào giọt nước ớ đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1)
- Hình chữ chi
- Hình vòng xoắn
- Hình vạch ngang song song

1.3. Phương pháp cây trên thạch đứng: cây sinh vật kị khí
• Sứ dụng que cấy hình kim
• Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch
hình trụ.
• Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường
sát thành ống tuỳ yèu cầu.
• Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường
rv. Trả lòi câu b ỏi.


/. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vạt
- Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lóng: cấy truyền bằng pipette Pasteur,
cấy truyền bằng que cấy vòng.
- Cấy truyền trên môi trường lòng: cấy truyền trên ống truyền thạch nghiêng,
trèn ống nghiệm thạch đứng, cấy truyền trên thạch đĩa.
2. Các phương pháp giữ ống vi sinh VỘI
a. Phương phấp cây truỵén định kỳ trên môi trường mới
ưu điêm: phương pháp này đơn giản, dề làm, thời gian bảo quản không làu.
Nhược điểm: tốn môi trướng, công sức và thời gian. Dề bị tạp nhiễm và dề dẫn đến
mất chúng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chúng trong quá trình bảo
quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp cho các chúng bảo
quản. Giống gốc có thể bị mất do sai sót khi dừng môi trường cấy truyền không thích
hợp. Chúng vi sinh vật đề bị thay đồi các đặc tính sinh học do đột biến xuất hiện sau
mồi làn cấy truyền.

b Phương pháp giữ giấỉỉg trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng
Ưu điểm: đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến
dưỡng và hô hấp nền vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trường không bị mất nước và
khô.
c. Phương pháp giữ giông trên đât, cát, hạt...
Ưu điểm: dề bảo quản các chúng bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản có thể kéo
dài đến 1 nãm.
Nhược điêm: khử trùng môi trường trước
d. Phương pháp lạnh đông
Ưu điểm: nhanh, thuận lợi cho việc bảo quản một số lượng lớn mẫu, vi sinh vật
được bảo quản từ 10-20 năm, tiết kiệm công sửcvà sai sót nhãn mác, tạp nhiễm.
Nhược điềm: giá thành thiết bị5 độ ồn đính của các chủng vi sinh vật bảo quản theo
các đợt bảo quản là khác nhau, Trước khí đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi
trường thích hợp một số lần đề đảm bảo phục hồi các đặc tính sinh học của chảng vi
sinh vật.
e. Phươngphảp bảo quản lạnh sâu
Ưu điềm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi
khuẩn, nấm mốc, vìut, tảo và các dòng te bảo động vật. thời gian bảo quản lâu.


Nhược điêra: đâu tư kinh phi cho thiêt bị, điện quá cao, rủi ro cháy nô, không thích
hợp cho các chủng VI Sinh vặt hay dùng đến thường xuyên.
Trình bày nguyên tắc và mục đích của quá trình phân lập,
- Nguyền tắc: tách rời các tế bào VI Sinh vặt, nuôi cấy các tế bào trong môi
trường dinh dương đề tạo khuẩn lạc riềng rẽ.
- Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vặt trong môi trường tự nhiên và cô lập
chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau.
4. Muốn phân lộp nấm nấn mốcT Ví khuẩn thì nguồn mẫu cằn chọn là gì?
Trả lời:
- Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cò khô cắt nhò.

- Nấm mốc: nguồn mẫu lả cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh rai để khô
Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái câỵ, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượu
nếp, bia, nước mía,
5. So sánh sự giong và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị
khí.
Trả lời:
- Giống nhau: nhằm phân tách các chủng VI Sinh vật trong môi trường tự nhiên
và cò lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau:
Phấn lập vi sinh vật hiếu Phấn lập vi sinh vật kị khí
khí
- Hút dịch ru ẩu đã pha ] - Dùng raôi trường đặc trong ống
oãng cho
nghiệm đem
vao dĩa petri có raôi
chung cách thủy để loại bỏ không
trirờng thích
khí.
hợp.
- Để nguội ra ôi trường còn 45- Dùng que gạt thủy tinh 50°c
phân phối
- Hút dịch nghiên cứu cho vào ống
dịch mẫu trài đều khắp ra ôi trường, đậy
mặt thạch.
nút lại, lắc tròn quanh trục ống
- Tiếp tục dùng que gạt nghiệm.
mẫu cho
- Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho
đều khắp mặt thạch đĩa ống nghiệm có
thứ 2 rồi
không khí.

đĩa thứ 3.
- Dùng paraíin hàn kín ph ẩn tiếp
- ủ ấm ở nhiệt độ thích xúc giữa 2 đĩa
hợp sau
petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp
một thời gian nhất định ta - Sau khi vi sinh vật phát triển,
sẽ nhận
chọn các khuẩn lạc
được các khuẩn lạc riêng riêng rẽ trong ra ôi trường, dùng
rẽ tù các
que cấy cắt cà khối
đĩa thứ 2, 3
raôi trirờng rồi cấy vào raôi trường
lỏng thích hợp.

6. Tại sao khi đi cân hoáchấ chỉ cần 2-3 người?
Do dụng cụ trong phòng hoá chât có hạn, đi cân hoá chất cần 2-3 Tigười đã đảm
bảo về thời gian,hiệu quả làm việc
BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIẺN VI BÀNG KÍNH
HIẺN VI QUANG HỌC
ì. Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển Ví* quang học
a. Cẩu tạo
Kính hiền vi quang học gồm có hai phần:
- Hệ thống cơ học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính,
0 gắn và xoay vật kính, bán kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ơc di chuyển thanh
trượt, kẹp giữ tiều bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chinh thô sơ cấp, ốc điều
chinh thứ cấp (vi cấp).
- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng,

nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ờ kính dùng
nguồn chiếu sáng lả đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây
điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) vả nút điều chinh cường độ chiếu sáng.
b. Nguyên tắc hoạt động
Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phỏng đại
mâu vật. Các thâu kính sằp xếp theo thử tự, thấu kính nhỏ ngoải cùng hướng vào tiêu
bản cỏ độ phỏng đại lớn nhất. Độ phỏng đại của kính phụ thuộc vào tiêu cự, tửc bán
kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng
đại càng lớn.


Có hai loại vật kính
• Vật kính khô độ phỏng đại nhò như x4,xl0,\15,\40.
• Vật kính dầu cỏ độ phỏng đại lớn như \90,xl 00.
Thị kính cũng cỏ độ phỏng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về phía
mắt người xem, một hướng về vật kính, Thí kính phỏng đại một lần nữa ảnh do vật
kính thu vào, làm ảnh to lêns xem rõ hcm.
Độ phỏng đại của kính = Độ phỏng đại của vật kỉnh X độ phỏng đại của thị kính.
Ví dụ: Độ phỏng đại của vặt kinh xioo, độ phỏng đại của thị kinh xl 0. Như vậy độ
phỏng đại của kính : 100x10=1000 lằn.
Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phỏng đại, và là tiêu chuẩn chỉnh để
chọn kính hiên vi.
2. Có bao nhiêu hại kính hiển vi? Đặc đỉểm của từng íoạỉ?
Có 5 loại kính hiên vi.
- Kính hiền vi viền đen
Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào
xung quanh tiêu bản, những tia sáng nàỵ bị tiêu bản làm khúc xạ rồí đưa vảo vật kính.
Tiều bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng
chiếu vào, giúp ta thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức
năng: quan sát hình thái vả đặc tính của một số vi khuần mà kính hiên vi thường khó

quan sát.
- Kính hiên vi đôi pha
Ánh sáng thường bị đồi pha vả biên độ dao động bời cấu trúc đặc biệt của tạ quang
kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ Tiẻt các cấu trúc nhò như tiên
mao, các lớp màng.
- Kính hiên vi huỳnh quang
Chùm tia tử ngoại chiếu vào các tiều bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh
quang. Trong te bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau.
Chức năng: quan sát vả phân biệt các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật.
- Kính hiền vi điện tử
Chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải
cao, giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau. Chức năng: quan sát viut, cấu trúc phân tứ
cúa tế bào.
- Kính hiên VI quang học


Dùng bước sóng 500 nm - 560 nm trong chùm ánh sáng thường đê tạo năng suât
phân li lớn giúp phãn biệt hai điêm cách nhau khoảng 0.2 ụm trờ lên, Hệ thống phóng
to cua kính hiền vi quang học gồm hai bộ phận: vật kính và thị kính, Mỗi bộ phận là
một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp. Chức năng của kính hiển vi quang học là dùng
đề quan sát te bào vi sinh vật, kí sinh trùng, tế bảo động vật, thực vật.
Tại sao khi quan sát ở vật kínk xĩôô phải cho ĩ giọt dầu Sới kỉnh?
Do chiết suất ánh sáng của không khí nhò hơn thuỷ tính, nên tia sáng khi đi qua
tiều bản thuỷ tinh sẽ bị khúc xạ một phần, Phần phía ngoài cuả tia sáng do bị khúc xạ
nên không đi vảo được vật kính, Vật kính cỏ độ phỏng đại càng lớn thì đường kính
cua thấu kính càng nhò5 lượng tia sáng đi vảo vật kính rất ít nên không nhìn rõ ảnh. Đe
hạn che nhược điềm nàỵ ta dùng dầu soi kính có chiết suất ánh sáng gần bằng thuỷ
tinh. Thuỷ tinh và dầu soi được xem là một môi trường đồng nhất, ánh sáng đi qua
không bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh.
BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VT SINH VẬT

Báo cáo thực tập
1. Sau khi nhuộm, vỉ khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tim, Gram ảm
có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích nguyên nhầtử
Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sê có màu xanh đen hay tím, còn vi
khuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl). Sờ dĩ
có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt về
thành phần hóa sinh cứa thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì
có nhiều peptidoglỵcan (phức chất protein-đường) và các peptiđoglycan này được liên
kết chặt chê với nhau từ đó có thể giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nèn sau khi
rứa bằng cồn thì crỵsta! violet không bị rứa trôi và vẫn giữ được màu tím, sau đó
nhuộm bồ sung bằng dung dịch saíranin o hoặc Fuchsin Ziehl, nhung không có sự
thay đổi màu nhiều. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ờ nồng độ
cao cho nèn chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (aceton, alcohol,...) và bị rửa
trôi cùng với crysta! violet (màu tím), sau khi nh ỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm them
bằng dung dịch saíranin o hoặc Fuchsin Zieh!, lúc này vi khuẩn Gram âm có màu đỏ
vàng hay đỏ tía.
2. Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thửsa/ranin hoặc/uchsin, rí khuẩn Gram
ăm có màu gì? Tại sao?


Nêu không nhuộm bô sung thuôc thử saíranin hoặc íuchsin, vi khuân Gram ằm sẽ
không có màu. Bời vì ờ giai đoạn tẳỵ màu bằng cồn đã rửa trôi crỵstal violet (có màu
tim) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu của crỵstal violet
được nhuộm ờ trước đỏ, Hoặc trưởng hợp vi khuẳn Gram âm sẽ có màu tím cung có
thề ờ giai đoạn tẳỵ rửa, ta không tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy ra
khòi phiến kính là khòng màu.
BÀI 6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẶP VI SINH V ẠT
ì. Trình bày nguyên tắc và phương pháp phàn iập vì khuẩn thuần khiết?
Nguyẽĩì tắc;
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dương đặc trưng (2%

thạch hay còn gọi là agar).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch
nghiêng đề thu nhận chúng vi khuẩn thuần khiết,
Phương pháp phân lặp vỉ khuẩn thuần khiẾt:
ì. ì. Phương pháp tạo khuẩn ỉạc đơn các vì sinh vội hiếu khí:
Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau đề thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một so
kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T, ky thuật ria bốn góc fkỷ thuật ria tia ,kỹ
thuật ria liên tục
Thao tác kỹ thuật tạo khuẳn lạc đơn được thực hiện như sau:
a. Kỹ thuật hộp ria:
- Dùng que cây vòng thao tác vô trùng thu giông.
- Ria các đường trên đĩa pêtri chửa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn
góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khithực hiện
đường ria tiếp theo.
- Bao gỏi đĩa pêtrí, ủ ờ nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
b. Kỹ thuật hộp trải:
- Dùng pipetman vả đằu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩapêtrí.
- Nhúng đằu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70°, hơ qua ngọn lứa để khứ
trùng. Đe đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trung của ngọn lửa.
- Mờđĩapêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩapetrí.
- Dùng đầu thanh gạt xoaỵ, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trài,


thực hiện \oay đĩa một vài lằn, mỗi lằn khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh
gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.
- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gỏi vả ủ ờ nhiệt độ và thời gian thích hợp trong
tú ấm.
c, Kỹ thuật hộp đô:

- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trưởng trong đĩapêtrí,
- Đồ khoảng 15 - 20 ml môi trưởng đã đun chảy vả để nguộ đến 45 - 55°c vào
đĩa petri đà cấy mẫu,
- Xoay nhẹ đia petri cùng chiều vả ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung
dịch giong được trộn đều trong môi trường cấỵ.
Đậỵ nấp đĩa pêtri, để đông tự nhiên.
1.2.
Phương pháp tạo khuân lọc đơn các vỉ sinh vật hỉêu khí:
- Dùng môi trường đặc trong ông nghiệm đem chưng cách thuý đê loại bò không
khí trong môi trường.
- Đề nguội môi trường còn 45 - 50°c.
- Hút 0J ml dịch nghiền cửu cho vào ống môi trường, đậy nũt lại, lắc tròn quanh
trục ống nghiệm.
- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri vả đậy thật
nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp vảmôí trường khôngcòn không khí.
- Dùng paraíin hàn kín phằn tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petĩí vả ả ờ nhiệt độ
thích hợp.
- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẳn lạc riêng rẽ trong khối môi
trường, dùng que cấỵ cắt cả khối môi trường rồi cấy vảo môi trường lòng thích hợp.
2. Nguyên tắc của việc nuôi úc tỉ lũy?
Nguyên tắc của việc nuôi tích luy: trường hợp số VI khuẳn có trong mẫu ít thì
phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bô sung chất dinh dương vả các điều kiện lý hóa
cần thiết hoặc bồ sung các chất ức chế sinh trường của các vi sinh vật đi kèm.
Thế nào là ckuẩn vi khuẩn thuần kkỉầ (ckủng sạck)?
Chuẳn vi khuẳn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con,
cháu, dòng có nguồn gốc tử một tế bào riềng lẻ, Các chủng vi sinh vật được thu nhận
từ khuẳn lạc phân lập lần đằu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được

hình thành bời một hoặc nhiều tế bào, bào tử, vì thế phải làm sạch nhiều lằn mới thu
được chúng vi sinh vật thuằn khiết.
BÀI 10; CẤC PHẢN ỨNG SINH HÓA
ỉ. Phản ứng tạo inđoỉ
Mục đích: Phát hiện các vsv có khả năng sính índol <=> các vsv có hệ emzỵm
tryptophanase
Sơ đồ:



Cơ chê phép thử; Vi Sinh vặt tiêt
enzỵme trỵptophannase chuyên hóa trỵptophan trong
THÔÍ trường thành Tndol. Tndol sẽ kết hợp vói para-dimethỵlaminbenzaldehỵd trong
thuốc thứ kovac’s tạo thành phức chất có màu hồng cánh sen.
Ý nghĩa:
• Phép thứ cho biết các chủng loại vi sinh vật có khả nắng tiết enzỵme
tryptophannase, giúp ta định danh được một số chủng loại vi sinh vật.
• Là phản ứng giúp phân biệt
° E, coỉi (+) với Klebsieĩĩa (-)
° Proteus mirabiỉis (-) với Proteus khác (+)
° Bacillus aỉvei (+) với Baciỉỉus khác (-)...
• Đoi chứng (+) Proteus rettgeri
(-) Serratia marcescens
2. Phản ứng MR ịmethyl red)
• Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình
lẻn men elucose.


Cơ ché:
• Cơ sờ sinh hóa:

° Chất chi thị pH: methỵl red

° MR (+) - càng kéo dài thời gian nuôi
cấy - môi trường càng acid
° MR (-) - càng kéo dài thời gian nuôi cấy -các chất có tính acid bị
chuyền hóa - môi trường dằn trung tính
■=> Thời gian ủ 2 - 5 ngày ờ 37°c
Cơ che: một số vi sinh vật có khả năng chuyển hỏa Glucose qua quá trình đường
phân tạo thành acid pyruvic, rồi tử Atid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzỵme
A, đi qua chu trình Kreps tạo ra các atid: atidcitric, atid succinic, acid fomic, a cid
malic, a cid oxalic... hoặc từ Àcid pỵruvic chuyển trực tiếp thành các acid lactic, acid
ÍOTHÌC,...
Trong môi trường MR-VP có PH= 6.9±0.2 cỏ K2HP04 (đệm phosphat) giúp ôn
định PH, khi có mặt các acid hữu cơ mạnh sẽ tấn công và phá vỡ thePH ồn đính làm
choPH giảm mạnh, PH<4.3> Với sự có mặt của thuốc thử MR (Methỵl Red) sẽ làm
môi trường chuyên sang màu đò (Phản ứng dương tính)
Ý nghĩa: Định danh một số VI Sinh vặt có khả năng chuyển hỏa Glucose (thường là
gram -)3. Phản ứng VP
Mục đỉch: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men
glucose.


Quỵ trình hóa học:


Ý nghĩa: Định danh VI Sinh vặt tạo sản phẳm trung tính (acetoin) trong quá trình
lên men glucose, thường là gram (-)
4. Thử nghiệm Cỉtrate

Mục đích: Xác định khả nấng vi sinh vặt sử dụng nguồn citrat như lả nguồn
cacbon duy nhất.
• Cơ sờ sinh hóa:
° vsv sử dụngcitrate, sinh ra CO2 làm kiểm hóa MT


0

vsv sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm
kiềm hóa MT
• Môi trường Simnioii ritrateagar
Ammonìum dìhỵdrogen phosphate l.Og
Dipotassium hỵdrogen phosphate 1 .Og
NaCl
5g
Sodiumcitrate 2g
MgSQ, 0,2g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 13g